CN110387399A

CN110387399A - 一种线性扩增双链dna的方法及应用

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Publication number: CN110387399A
Application number: CN201810361588.1A
Authority: CN
Inventors: 王力刚
Original assignee: Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Current assignee: Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN110387399B

Abstract

本发明的目的之一是提供一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以快速稳定的将目标DNA进行线性转录为RNA，以实现线性扩增，并通过逆转录方法转化为DNA文库。本发明的目的之二是提供一种肿瘤低频率突变检测的应用，使用该应用可以检测低于1%的低水平突变。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增为大量RNA，并逆转录成DNA。

Description

一种线性扩增双链DNA的方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种线性扩增双链DNA的方法及其应用。

背景技术

在自然界，基因突变是经常发生的，突变如果发生在与细胞增殖有关的基因，就可能导致细胞摆脱正常的生长控制，表现出恶性细胞的表型性状。许多致癌物都是致突变物。它们大多数能引起DNA的损伤。这些损伤可以修复，也可以导致细胞死亡。如果DNA的修复不正常，细胞虽可继续存活，但却成了潜在的癌细胞。

对肿瘤细胞突变的检测主要技术难点在于肿瘤突变的频率很低，尤其是当突变频率在低于1%时，容易由PCR扩增系统产生的误差导致检测不准确。

而针对这个技术难点，较为常见的方法有数字液滴PCR技术和深度测序技术。深度测序技术包括捕获测序与线性扩增和分子标签技术。数字液滴PCR技术是通过将每个DNA模板分散到单独的液滴中进行扩增检测，检测灵敏度高，准确性好，但是检测位点通量较少。捕获测序是通过设计目标区域的探针，针对性的捕获靶向区域；目前的线性扩增方法主要是将待检的DNA形成单链结构，通过接头、或环化酶的作用将单链DNA连接成环，此方法成环效率低，步骤繁琐，反应条件要求严格。分子标签技术是通过在PCR扩增中对原始模板初级产物添加唯一的标签序列，但是缺点也没明显，要合成含有百万种以上的分子标签的相同引物，价格昂贵，且在扩增中容易丢失不完整扩增子的DNA片段，导致检测信息丢失，扩增过程中因扩增偏好性，产物扩增水平不一致。

因此，寻找一种检测通量高，成功率高，检测准确，可靠、经济、快速的技术尤为重要

发明内容

本发明的目的之一是提供一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以快速稳定的将目标DNA进行线性转录为RNA，以实现线性扩增，并通过逆转录方法转化为DNA文库。

本发明的目的之二是提供一种肿瘤低频率突变检测的应用，使用该应用可以检测低于1%的低水平突变。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增为大量RNA，并逆转录成DNA。

进一步，所述的双链DNA末端为平末端，或特定的粘性末端，如3’A结构。

进一步，所述的RNA聚合酶识别的启动子序列可以为T7 RNA聚合酶启动子序列、T3RNA聚合酶启动子序列，SP6 RNA聚合酶启动子序列等。

进一步，所述的逆转录是指通过逆转录酶，及特异性通用引物，将扩增产生的RNA为模板转化为DNA序列。

进一步，所述的特异性通用引物为特定的核苷酸序列。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以纠正因PCR扩增系统误差导致低水平突变检测不准确的问题，且扩增效率高，操作简单，成本低，便于应用于肿瘤突变DNA的检测，尤其是游离肿瘤DNA。

附图说明

图1是双链DNA线性扩增步骤示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold SpringHarborLaboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 一种游离DNA中基因突变在illumina测序平台检测应用

1、血浆游离DNA的制备

使用血浆游离DNA提取试剂盒（天根，DP339）提取2mL血浆中的游离DNA，步骤如下：

1）取2mL血浆到15ml的离心管中加入40 µl Proteinase K溶液，涡旋混匀。

2）加入4ml的缓冲液GB ，轻轻颠倒混匀，56℃孵育10 min，并不时摇动样品。

3）加入4ml的乙醇（96-100%）。

4）将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中，重复此步骤直至全部溶液添加完毕。

5）向吸附柱CR2中加入500 µl缓冲液GD，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

6）向吸附柱CR2中加入600 µl 漂洗液PW12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

7）重复操作步骤6。

8）12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9）将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20 µl 洗脱缓冲液 TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。

2、样本的检测

1）合成接头序列，并退火使序列1与序列2，序列3与序列4形成双链。序列如下：

caggtaatacgactcactatagggagacgctcttccgatctacggccagt（SEQ ID NO.1）

ctggccgtagatcggaagagcgtctccctatagtgagtcgtattacc（SEQ ID NO.2）

caggaattaaccctcactaaagggagacgctcttccgatctactatagggt（SEQ ID NO.3）

ccctatagtagatcggaagagcgtctccctttagtgagggttaattcc（SEQ ID NO.4）

合成逆转录引物：

caagcagaagacggcatacgagatatcgcagggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctactataggg（SEQ ID NO.5）

合成二链合成引物：

aatgatacggcgaccaccgagatctacacactctgcaacactctttccctacacgacgctcttccgatctacggccagt（SEQ ID NO.6）

2）实验步骤：

A．线性扩增及建库

使用天根文库构建试剂盒连接模块进行连接接头，步骤如下：

1）取游离DNA20uL，加入10×ERA Buffer 5uL，5×ERA Enzyme Mix 10uL，补充15uL双蒸水。在PCR仪上20℃ 30分钟，65℃ 30分钟进行末端修复及加A。

2）加入5×Ligation Buffer 20uL，接头3uL，TIANSeq DNA Ligasex 17uL，补充17uL 双蒸水。在PCR仪上20℃ 30分钟进行连接。

3）将AMPure XP磁珠置于室温平衡。涡旋使磁珠充分悬浮，加入60 μl磁珠至100 μl的连接产物，充分吸打混匀。室温孵育5 min，将反应管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。入200 μl 80%乙醇，轻轻震荡混匀，洗涤磁珠，并用磁力架回收磁珠，弃上清。重复200 μl 80%乙醇洗涤一次。开盖室温放置5～10 min至晾干。加入18 μl 纯水重悬磁珠，洗脱连接产物。

4）加入10×RNAPol Buffer 2uL，rNTP（25mM）0.4μL，T7 RNA聚合酶2uL，加入连接产物15.6uL，在PCR仪上37℃ 60分钟进行转录扩增，所得产物备用。

5）加入10×RTplus Buffer（300mM Tris-HCl，95mM DTT，750mM KCl） 4uL，dNTP（2.5mM each）8uL，逆转录引物（序列5）4uL，补充双蒸水3uL。在PCR仪上65℃ 5分钟，57℃ 1分钟，立即转移至冰上。

6）加入1uL MMLV逆转录酶，在PCR仪上42℃ 60分钟，75℃ 5分钟。

7）加入10×SS Buffer（300mM Tris-HCl，95mM DTT，750mM KCl） 5uL，dNTP（2.5mMeach）4uL，二链合成引物（序列6）4uL。在PCR仪上95℃ 1分钟，64℃ 1分钟，60℃ 1分钟，58℃ 1分钟，56℃ 1分钟，立即转移至冰上。

8）加入T4 DNA聚合酶1uL，DNA聚合酶I 2uL，在PCR仪上16℃ 120分钟。

B．捕获富集测序

（1）使用xGENPan-Cancerpanelv1.5（IDT）进行捕获富集文库，捕获后在Hiseq2500测序仪（illumina）上进行测序，平均测序深度2000×。

（2）测序结果进行数据分析，经过去重read是后，通过对比不同reads中相同的突变进行确定cfDNA的变异。表1为此样本在Hiseq2500平台的检测结果。

表1 ctDNA测序结果

基因名称	突变位点	突变频率
			EGFR	T790M	0.5%

序列表

<110> 北京全谱医学检验实验室有限公司

<120> 一种线性扩增双链DNA的方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 1

caggtaatac gactcactat agggagacgc tcttccgatc tacggccagt 50

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 2

ctggccgtag atcggaagag cgtctcccta tagtgagtcg tattacc 47

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 3

caggaattaa ccctcactaa agggagacgc tcttccgatc tactataggg t 51

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 4

ccctatagta gatcggaaga gcgtctccct ttagtgaggg ttaattcc 48

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agatatcgca gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatctacta taggg 75

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 6

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctctgcaaca ctctttccct acacgacgct 60

cttccgatct acggccagt 79

Claims

1.本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增产生大量RNA，并逆转录成DNA。

2.据权利要求1所述，双链DNA为平末端或粘性末端DNA片段，其长度在150bp至300bp之间。

3.据权利要求1所述，RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶等。

4.据权利要求1所述，启动子序列为RNA聚合酶转录RNA识别的序列。

5.据权利要求1所述，RNA聚合酶扩增为，RNA聚合酶以带有启动子片段的DNA序列为模板，重复合成RNA的过程。

6.据权利要求1所述，逆转录为使用逆转录酶以RNA为模板，使用特异性通用引物合成DNA的过程。

7.据权利要求6所述，逆转录酶包括MMLV，AMV等。

8.据权利要求6所述，特异性通用引物为特定的核酸序列。