ES2268809T3 - Un metodo de amplificacion basada en la transcripcion de dianas de adn de doble hebra. - Google Patents
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Abstract
Método para la amplificación de ADN de doble hebra con un método de amplificación basado en la transcripción, en donde el ADN de doble hebra es puesto en contacto con: - al menos, un oligonucleótido comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la primera de las dos hebras de ADN comprendidas en el ADN de doble hebra, comprendiendo adicionalmente dicho oligonucleótido la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa; - un oligonucleótido adicional comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la segunda hebra comprendida en el ADN de doble hebra; - una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ARN; - una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ADN; - una enzima poseyendo actividad RNasa H; - una enzima poseyendo actividad ARN polimerasa; y la mezcla de reacción así creada es mantenida bajo las condiciones isotérmicas adecuadas durante una cantidad de tiempo suficiente como para que tenga lugar una reacción de amplificación basada en la transcripción, sin someter la mezcla a ningún tratamiento de calentamiento después de que cualquiera de las enzimas haya sido añadida a la mezcla.
Description
Un método de amplificación basado en la
transcripción de dianas de ADN de doble hebra.
La presente invención está relacionada con un
método de amplificación basada en la transcripción para la
amplificación de dianas de ADN.
Los métodos de amplificación de ácido nucleico
son utilizados en el campo de la biología molecular y en la
tecnología de ADN recombinante. Estos métodos son utilizados para
incrementar el número de copias de una secuencia determinada de
ácido nucleico presente en pequeñas cantidades y, a menudo, en un
medio en el cual se encuentran presentes también una amplia
variedad de otras secuencias de ácido nucleico, tanto de ARN como de
ADN. En particular, los métodos de amplificación del ácido nucleico
son utilizados para facilitar la detección o cuantificación de
ácido nucleico, y son importantes a la hora de diagnosticar, por
ejemplo, enfermedades infecciosas, enfermedades heredadas y varios
tipos de cáncer. Los métodos de amplificación del ácido nucleico han
encontrado aplicación también en otros campos, donde son
investigadas muestras en las cuales el ácido nucleico puede estar
presente en cantidades muy pequeñas, tales como las ciencias
forenses, la arqueología o para establecer la paternidad.
Son conocidas algunas técnicas de amplificación
del ácido nucleico basadas en diferentes mecanismos de acción. Un
método para la amplificación del ácido nucleico, conocido como la
"Reacción en cadena de la Polimerasa" (PCR), es descrito en
las solicitudes de patente europeas EP 200362 y EP 201148. La PCR es
un proceso cíclico, el cual tiene como diana al ADN de doble hebra.
Cada ciclo en el proceso de PCR comienza con la separación de una
diana de ADN de doble hebra en sus dos hebras complementarias. A
cada hebra se empalma un iniciador y los ADN polimerasas presentes
extenderán los iniciadores a lo largo de la hebra de ADN a la cual
están empalmados, formando de esta manera dos nuevos dúplex de ADN.
Cuando es calentada la mezcla de la reacción las hebras de los
dúplex de ADN son separadas de nuevo y puede comenzar un nuevo ciclo
de PCR. De esta forma, el proceso de PCR produce múltiples copias
de ADN de una diana de ADN. Si la diana deseada para la PCR es el
ARN de hebra sencilla, éste tiene que ser convertido primero en ADN
de hebra doble por medio de transcriptasa reversa.
La presente invención está relacionada con una
clase diferente de métodos de amplificación del ácido nucleico, es
decir las "técnicas de amplificación basadas en la
transcripción". Las técnicas implican la transcripción de copias
múltiples de ARN procedentes de un templete comprendiendo un
promotor reconocido por una ARN polimerasa. Con estos métodos son
transcritas múltiples copias de ARN procedentes de un templete de
ADN que comprende un promotor funcional reconocido por la ARN
polimerasa. Dichas copias son utilizadas de nuevo como una diana,
de las cuales es obtenida una nueva cantidad del templete de ADN,
etc. Tales métodos han sido descritos por Gingeras et al. en
WO88/10315 y Burg et al. en WO89/1050. Han sido descritas
técnicas de amplificación basadas en transcripción isotérmica por
Davey et al. en EP 323822 (en relación con el método NASBA),
por Gingeras et al. en EP 373960 y por Kacian et al.
en EP 408295. Las reacciones de amplificación basadas en la
transcripción pueden ser realizadas también con enzimas
termoestables. Las amplificaciones basadas en la transcripción son
llevadas a cabo usualmente a una temperatura de alrededor de 41
grados Celsius. Estas enzimas termoestables permiten que la
reacción sea llevada a cabo a temperaturas más elevadas. Un método
termoestable de este tipo es descrito en la EP 682121, inscrita a
nombre de Toyo Boseki KK.
Los métodos, como los descritos en la EP 323822,
EP 373960 y EP 408295, son métodos continuos isotérmicos. Con estos
métodos son necesarias cuatro actividades enzimáticas para conseguir
la amplificación: una actividad ADN polimerasa dependiente de ARN,
una actividad ADN polimerasa dependiente de ADN, una actividad RNasa
(H) y una actividad ARN polimerasa. Algunas de estas actividades
pueden ser combinadas en una enzima, por ello usualmente son
necesarias únicamente 2 o 3 enzimas. Las enzimas poseyendo
actividades ADN polimerasa dependiente de ARN son enzimas que
sintetizan ADN de un templete de ARN. De esta forma, una polimerasa
ADN dependiente de ADN sintetiza ADN procedente de un templete de
ADN. En las reacciones de amplificación basadas en la transcripción
puede ser utilizada una transcriptasa reversa, como una
transcriptasa reversa de AMV (Virus de la Mieloblastosis Aviar) o
de MMLV (Virus de la Leucemia Murina de Moloney). Tales enzimas
poseen tanto actividad ADN polimerasa dependiente de ARN como
dependiente de ADN, pero también una actividad RNasa inherente.
Adicionalmente, puede ser añadida una RNasa a la mezcla de la
reacción de una reacción de amplificación basada en la
transcripción, como la RNasa H de E. coli.
Las ARN polimerasas dependientes de ADN
sintetizan múltiples copias de ARN procedente de un templete de ADN
incluyendo un promotor reconocido por la ARN polimerasa. Ejemplos de
ARN polimerasas son las polimerasas procedentes de E. coli y
de los bacteriófagos T7, T3 y SP6. Un ejemplo de una ARN polimerasa
utilizada usualmente en los métodos de amplificación basados en la
transcripción es la polimerasa T7. De esta manera, el promotor que
es incorporado en el templete utilizado para transcribir copias
múltiples del ARN sería entonces el promotor T7. Usualmente, el
templete comprendiendo el promotor tiene que ser creado comenzando
por el ácido nucleico comprendiendo la secuencia diana. Dicho ácido
nucleico puede estar presente en el material inicial que es
utilizado como material para la reacción de amplificación. El ácido
nucleico presente en el material inicial contendrá usualmente la
secuencia diana como una parte de una secuencia mucho mayor. Las
secuencias de ácido nucleico adicionales pueden estar presentes
tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia diana. La
reacción de amplificación puede ser iniciada al juntar este ácido
nucleido procedente del material inicial, las enzimas apropiadas
que juntas proporcionan las actividades anteriormente mencionadas y,
al menos, un oligonucleótido (pero usualmente dos). Al menos uno de
estos oligonucleótidos debe comprender la secuencia del
promotor.
Los métodos de amplificación basados en la
transcripción son particularmente útiles si el material de inicio
es ARN de hebra sencilla, aunque puede ser utilizado igualmente ADN
de hebra sencilla o doble como material de inicio. Cuando es
practicado un método de amplificación basado en la transcripción
sobre una muestra con ARN de hebra sencilla (de sentido
"plus") con secuencias adicionales tanto en el extremo 3' como
en el extremo 5' de la secuencia diana, un par de oligonucleótidos
utilizados convenientemente con los métodos, según es descrito en
las técnicas previamente existentes, consistiría en:
- un primer oligonucleótido (usualmente referido
como un "promotor-oligonucleótido") que es
capaz de hibridizar con el extremo 3' de la secuencia diana,
oligonucleótido que tiene la secuencia de un promotor
(preferiblemente el promotor T7) acoplado a su extremo 5' (la parte
hibridizante de este oligonucleótido posee polaridad opuesta a la
del ARN positivo utilizado como material de inicio).
- un segundo oligonucleótido ("iniciador"),
el cual comprende el extremo 3' de la secuencia diana (este
oligonucleótido posee la misma polaridad que el ARN positivo).
Cuando un par de tales oligonucleótidos, junto
con todas las enzimas que poseen las actividades apropiadas y una
fuente suficiente de los ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos
necesarios son juntados en una mezcla de reacción, y son mantenidos
bajo las condiciones apropiadas (es decir, bajo las condiciones de
tamponado apropiadas y a la temperatura adecuada) durante un
periodo de tiempo suficiente, dará comienzo una reacción de
amplificación continua isotérmica. La figura 1 proporciona un
mecanismo propuesto para parte de una reacción de amplificación
basada en la transcripción conocida en este campo. El proceso
continuo isotérmico de amplificación es representado en la Figura 1
como un proceso cíclico. Sin embargo, de hecho todas las fases de
este proceso tendrán lugar al mismo tiempo ya que todos los
ingredientes se encuentran presentes en el recipiente de la
reacción. De esta forma, el representar el proceso como una
secuencia determinada de sucesos podría ser beneficioso para una
mejor comprensión de un posible mecanismo subyacente en el proceso
de amplificación, aunque podría no ser un reflejo auténtico de lo
que realmente sucede en la mezcla de la reacción durante la
amplificación. El ciclo representado en la Figura 1 puede
considerarse que comienza con una primera cantidad de ARN de hebra
sencilla. El ARN representado en el ciclo es ARN de sentido
negativo. De esta manera, será capaz de hibridizar con el segundo
oligonucleótido del par de oligonucleótidos mencionados más arriba.
Este ARN negativo usualmente no se encontrará presente como tal en
el material de inicio para la reacción de amplificación, pero será
derivado, por ejemplo, del ARN positivo presente en el material de
inicio, a través de la reacción con los oligonucleótidos y enzimas
cuando son juntados todos los ingredientes de la mezcla de
reacción.
Han sido descritas muchas variantes del tema
anterior en la literatura relativa a los procedimientos ya
existentes. Partiendo del esquema de reacción representado en la
Figura 1 puede ser visto que el segundo oligonucleótido (conforme
es descrito más arriba) sirve como un iniciador para iniciar la
síntesis de una hebra de ADN complementaria del ARN negativo. El
oligonucleótido comprendiendo la secuencia promotora es capaz de
empalmarse al extremo 3' del producto de extensión del segundo
oligonucleótido. La parte promotora de este oligonucleótido sirve
como un templete para el alargamiento del producto de extensión del
segundo oligonucleótido, con el fin de proporcionar un promotor de
doble hebra. El extremo 3' del oligonucleótido promotor puede ser
extendido por medio de la enzima poseyendo actividad ADN polimerasa
dependiente de ADN (transcriptasa reversa), pero esto no es
necesario. Para reflejar la función que tiene como un templete de un
oligonucleótido conteniendo una secuencia promotora, es referido
como un "templete de empalme" en alguna literatura previa
existente en relación con la amplificación basada en la
transcripción (por ejemplo, EP 408295 de Genprobe Inc.). El extremo
3' de un "templete de empalme" de este tipo puede incluso ser
bloqueado. En ese caso, la capacidad del "templete de empalme"
de servir como un iniciador se ve eliminada por completo.
La Figura 1 proporciona un esquema propuesto
para una amplificación basada en la transcripción. Este esquema
comprende la síntesis de transcriptos de ARN de hebra sencilla.
Conforme es mencionado más arriba, el material de inicio
conteniendo el ácido nucleico a ser amplificado puede que no
contenga el ácido nucleico en esta forma determinada. No contendrá
ARN negativo de una longitud definida. Ello es por lo que este ciclo
propuesto de sucesos, conforme es representado en la Figura 1, es
precedido probablemente por una secuencia de eventos que llevan
desde el ácido nucleico en el material de inicio hasta la primera
fase de transcripción del ARN. Conforme es explicado anteriormente,
los métodos de amplificación basados en la transcripción son
particularmente útiles para la amplificación que comienza con ARN
de hebra sencilla. Uno de los oligonucleótidos, el que tiene la
secuencia promotora, será empalmado presumiblemente entonces a este
ARN de hebra sencilla, y será alargado por medio de la enzima con
ADN polimerasa dependiente de ARN (como la transcriptasa reversa).
Es obtenido de esta forma un dúplex de ADN-ARN,
pudiendo ser digerida la hebra de ARN del mismo por medio de RNasa
H. El otro oligonucleótido se empalmará a la hebra restante de ADN
y será alargado, utilizando esta hebra como un templete. De esta
manera puede ser creado un templete de ADN de hebra doble incluyendo
un promotor de hebra doble funcional para la ARN polimerasa, a
partir del cual puede tener lugar la primera fase de la
transcripción. Los transcriptos obtenidos de esta forma pueden
entrar en el esquema de reacción propuesto, conforme es representado
en la Figura 1. En la práctica, esta secuencia completa de sucesos
-comenzando desde el ARN de hebra sencilla en la muestra- tendrá
lugar tan pronto como todos los ingredientes sean juntados, y la
mezcla sea llevada hasta la temperatura adecuada para que todas las
enzimas se encuentren activas. El practicante de este método no
necesita intervenir para realizar ninguna de estas fases. Sin
embargo, cuando un método de amplificación basado en la
transcripción ha de ser realizado sobre material de inicio
comprendiendo la secuencia diana únicamente como ADN de hebra doble
-tanto circular como lineal-, el experto no pretenderá ser capaz de
amplificar nada sin que primeramente tenga que llevar a cabo un
método, por ejemplo un método de desnaturalización química,
conforme es descrito en la DE 4238699, para conseguir primero ácido
nucleico de hebra sencilla del ADN de hebra doble presente en el
material de inicio. No pretenderá que ninguno de sus
oligonucleótidos sea capaz de empalmarse al ADN, ya que éste se
encuentra en una configuración de doble hebra. Basándonos en los
conocimientos del experto, lo más lógico aquí sería separar las
hebras del ADN de hebra doble por medio de la aplicación de una
temperatura elevada (hasta unos 100 grados Celsius), con el fin de
separar el ADN y permitir que uno de los oligonucleótidos se
empalme a una de las hebras sencillas. Las enzimas utilizadas con
los métodos usuales de amplificación basados en la transcripción no
serían capaces de soportar una temperatura tan alta y, en tales
casos, pueden ser añadidas únicamente después de que hayan sido
separadas las hebras de ADN. Cuando uno de los nucleótidos se
empalma a un ADN de hebra sencilla y es alargado, es creado de nuevo
ADN de doble hebra, y la mezcla de la reacción tendrá que ser
sometida a una temperatura elevada lo suficientemente alta como
para separar de nuevo el ADN de doble hebra en sus dos hebras. De
nuevo este aumento de temperatura destruirá las enzimas presentes,
y tendrán que ser añadidas nuevas enzimas después de que la fase de
calentamiento haya sido aplicada de nuevo. A continuación, el
segundo oligonucleótido puede ser añadido y empalmado a la hebra
que fue creada procedente del oligonucleótido (promotor) alargado en
la primera fase, creando de esta manera el templete de ADN de doble
hebra incluyendo un promotor funcional de doble hebra a partir del
cual puede tener lugar una primera fase de transcripción de ARN.
Los transcriptos de ARN resultantes pueden entrar en un ciclo igual
al representado en la Figura 1 y el proceso puede ser también
isotérmico.
De lo anterior se deduce que el comenzar un
método de amplificación basado en la transcripción partiendo de ADN
de doble hebra puede ser un proceso tedioso. Éste requiere que el
practicante lleve a cabo varias acciones específicas; la muestra
tiene que ser calentada y enfriada repetidamente y las enzimas
tienen que ser repuestas después de cada fase de calentamiento.
Alternativamente, el ADN de doble hebra en el
material de inicio puede ser transcrito en ARN antes del comienzo
de la amplificación. Tal fase extra puede estar basada en una
enzima, por ejemplo la ARN polimerasa de E. coli, que
transcribe el ADN de doble hebra en ARN sin la presencia de una
secuencia promotora, también referida como un sitio de unión a la
polimerasa. Ha sido descrito en la solicitud de patente PCT nº
WO9602668 un proceso de este tipo de fases extras, para facilitar
la amplificación de ADN de doble hebra por medio de métodos de
amplificación basados en la transcripción. Las fases extras
descritas en este procedimiento no incluye únicamente fases de
manejo adicionales, sino también la utilización de ingredientes
adicionales, i.e. la ARN polimerasa de E. coli.
Se ha descubierto ahora que, en los casos donde
la muestra comprende ADN de doble hebra, puede ser aplicado un
proceso de amplificación basado en la transcripción, el cual es
esencialmente isotérmico, y da como resultado grandes cantidades de
transcriptos de ARN comprendiendo la secuencia del ADN.
Con el método de la presente invención es
proporcionado un método de amplificación isotérmico basado en la
transcripción para la amplificación de ADN de doble hebra. El método
de la presente invención para la amplificación de ADN de doble
hebra comprende las fases de puesta en contacto de dicho ADN de
doble hebra con:
- al menos, un oligonucleótido comprendiendo una
secuencia complementaria de una parte de la primera de las dos
hebras de ADN comprendidas en el ADN de doble hebra, comprendiendo
adicionalmente dicho oligonucleótido la secuencia de un promotor
reconocido por una ARN polimerasa,
- un oligonucleótido adicional comprendiendo una
secuencia complementaria de una parte de la segunda hebra
comprendida en el ADN de doble hebra,
- una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa
dependiente de ARN,
- una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa
dependiente de ADN,
- una enzima poseyendo actividad RNasa H,
- una enzima poseyendo actividad ARN
polimerasa,
y manteniendo la mezcla de reacción así creada
bajo las condiciones adecuadas durante una cantidad de tiempo
suficiente como para que tenga lugar la amplificación, sin someter
la mezcla a ningún tratamiento de calentamiento después de que
cualquiera de las enzimas haya sido añadida a la mezcla.
El método conforme a la invención es
particularmente útil para la amplificación de moléculas pequeñas de
ADN, e.g. ADN plásmido.
El método es particularmente útil para la
detección de pequeñas moléculas de ADN de microorganismos
patogénicos, haciendo posible el diagnóstico. En particular, pueden
ser detectadas por medio de este método las moléculas circulares de
ADN del VIH-1, que son formadas durante el replicado
del virus VIH-1. La detección de tales moléculas
circulares de ADN del VIH-1 indica el replicado
activo del virus, lo cual puede ser relacionado con la progresión
de la enfermedad, i.e. el desarrollo del SIDA. En otra aplicación el
método puede ser utilizado para la detección de moléculas de ADN
plásmido, presentes de manera natural en especies de Clamidia. Los
plásmidos de Clamidia pueden codificar ciertos factores de
virulencia, lo cual significa que la detección del plásmido no solo
muestra la presencia de la infección por Clamidia, sino que también
muestra que las células de Clamidia que causan la infección portan
ciertos factores de virulencia.
Incluso en otras aplicaciones, el método puede
ser utilizado para la amplificación de secuencias genómicas después
de la degradación parcial y del aislamiento del ADN. Esto posee una
amplia gama de aplicaciones, de las cuales muchas pueden estar
asociadas con la detección e identificación de mutaciones en el ADN
genómico. Estas mutaciones pueden estar asociadas al diagnóstico
del cáncer, enfermedad hereditaria o predisposición a la
enfermedad.
Sorprendentemente, la amplificación basada en la
transcripción puede partir de ADN de doble hebra, sin la necesidad
de tratar el ADN con enzimas de restricción o, lo que es más
importante, de separar las hebras con anterioridad por medio de la
aplicación de calor. Todos los reactivos utilizados
convencionalmente en reacciones de amplificación isotérmicas
basadas en la transcripción pueden ser utilizados simplemente sobre
el material de inicio conteniendo ADN de doble hebra, como si éste
fuera ARN de hebra sencilla.
Las enzimas utilizadas con el método conforme a
la invención puede ser cualquier tipo de enzimas de las conocidas
en este campo como enzimas adecuadas para los métodos de
amplificación basados en la transcripción, y las condiciones de la
reacción son esencialmente las mismas que las de los métodos
antiguos ya existentes de amplificación basados en la
transcripción, usualmente utilizados para amplificar ARN de hebra
sencilla. Con la presente invención ha sido descubierto ahora que
pueden ser utilizados esencialmente los mismos protocolos para la
amplificación isotérmica basada en la transcripción del ADN de doble
hebra, incluso cuando, basándose en el conocimiento de los
mecanismos conforme a los cuales las reacciones de amplificación
basadas en la transcripción se suponía que funcionaban, el experto
en este campo no hubiera esperado que este método fuera
factible.
En una realización preferida el ADN es calentado
hasta los 65 grados Celsius en presencia de los oligonucleótidos de
amplificación, pero no en presencia de las enzimas de amplificación.
Las enzimas son añadidas a la reacción únicamente después de que la
mezcla de la reacción es enfriada hasta la temperatura de incubación
para la reacción de amplificación, i.e., 41 grados Celsius. En otra
realización del método de la presente invención el ADN puede ser
calentado hasta los 100 grados Celsius en presencia de los dos
oligonucleótidos de amplificación. Una persona experta en este
campo seguiría sin esperar que este método fuera factible, debido a
que después del empalme y extensión del oligonucleótido, la hebra
recién confeccionada de ADN tiene que ser separada de la hebra del
templete de ADN original antes de que el segundo oligonucleótido
pueda empalmarse y ser extendido. En esta segunda realización
preferida, únicamente con una fase de calentamiento, las enzimas son
añadidas únicamente después de que la mezcla de la reacción es
enfriada hasta la temperatura de incubación de la amplificación,
i.e., 41 grados Celsius.
Preferiblemente son utilizados en el método
conforme a la invención dos oligonucleótidos;
- un primer oligonucleótido (usualmente referido
como un "promotor-iniciador", que es capaz de
hibridizar con una secuencia específica en la primera hebra del ADN
de doble hebra, cuyo nucleótido posee la secuencia de un promotor
(por ejemplo, el promotor T7) unida a su extremo 5' y
- un segundo oligonucleótido ("iniciador"),
el cual comprende una secuencia suficientemente complementaria de
una secuencia específica en la segunda hebra del ADN de doble hebra.
Las secuencias de los oligonucleótidos deben ser escogidas de tal
manera que no puedan hibridizar entre sí.
Es sorprendente que al poner en contacto el ADN
de doble hebra con los dos oligonucleótidos y las enzimas
apropiadas, pueda ser llevado a cabo un proceso de amplificación
basado en la transcripción en donde no haya necesidad de distintas
fases de separación de hebras para separar las dos hebras que
componen el ADN de doble hebra. El método dará como resultado
copias múltiples de ARN lineal comprendiendo la secuencia diana que
es parte de la secuencia del ADN de doble hebra.
Figura 1: esquema de reacción para
amplificaciones basadas en la transcripción.
Los siguientes ejemplos demuestran el mecanismo
y utilidad de la presente invención. No son limitadores y no deben
ser considerados como tales. Las enzimas utilizadas en los
siguientes ejemplos son la transcriptasa reversa del virus de la
mieloblastosis aviar (AMV), la ARN polimerasa T7 y la RNasa H del
E. coli. Pueden ser utilizadas otras enzimas con actividades
similares y enzimas procedentes de otras fuentes. Pueden ser también
útiles para su utilización otras ARN polimerasas con diferente
especificidad de promotor.
Las condiciones de reacción NASBA utilizadas en
los siguientes ejemplos fueron 40 mM de Tris, pH 8.5, 42 mM de KCl
(o en experimentos posteriores 70 mM de KCl), 12 mM de MgCl_{2}, 5
mM de DTT, 1 mM de cada dNTP, 2 mM de rATP, 2mM de rCTP, 2 mM de
rUTP, 1,5 mM de rGTP, 0,5 mM de ITP, 0,2 \muM de cada
oligonucleótido, 375 mM de sorbitol, 0,105 g/l de BSA, 6,4 unidades
de AMV-RT, 32 unidades de ARN polimerasa T7, 0,08
unidades de RNasa H de E. coli, y una cantidad especificada
de templete en 20 \mul de volumen. Las secuencias de
oligonucleótido utilizadas son un ejemplo, y no son limitadoras, ya
que han sido utilizadas otras secuencias para éstas y otras
secuencias diana.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
de una diana de ADN con NASBA, sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los dos siguientes
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
gag1P1 del VIH-1:
- 5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG
- CTA TGT CAC TTC CCC TTG-GTTCTC TCA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
gag1P2 del VIH-1:
- 5' AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA
- AA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la
amplificación parte de la región gag del genoma del
VIH-1. Como material de inicio para la amplificación
del ADN plásmido fue utilizado pUCp24 comprendiendo la región gag
del genoma del VIH-1 en diferentes cantidades
iniciales. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el
ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el
prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC,
enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC
durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a
electrofóresis en gel de agarosa, secado en un filtro de nylon e
hibridizado con la sonda 5' GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTG CAT G
3' de la región gag del VIH-1 marcada con P^{32}.
Pudo ser obtenido en la amplificación un resultado positivo con una
sensibilidad de 10^{5} moléculas de material de inicio de ADN
plásmido. Los mismos resultados pudieron ser obtenidos siguiendo el
mismo protocolo sin la incubación a 65ºC.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
P1 del HPV16:
- 5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA
- AAA ATA AAC TGT AAA TCA-TATTC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del HPV16:
- 5' TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la
amplificación parte del genoma del HPV16. Como material de inicio
para la amplificación del ADN plásmido fue utilizado pHPV16
conteniendo un genoma completo del HPV16 en diferentes cantidades
iniciales. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el
ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el
prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC,
enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC
durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a
electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e
hibridizado con la sonda 5' AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT GC 3' del
HPV16 marcada con P^{32}. Pudo ser obtenido en la amplificación
un resultado positivo con una sensibilidad de 1 pg de material de
inicio de ADN plásmido.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
\newpage
P1 del plásmido natural de la Clamidia
trachomatis:
- 5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GCA
- AGA GTA CAT CGG TCA ACG-A 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del plásmido natural de la Clamidia
trachomatis:
- 5' TCA CAG CGG TTG CTC GAA GCA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la
amplificación parte del plásmido natural de la Clamidia
trachomatis. Como material de inicio para la amplificación fueron
utilizados preparados plásmidos procedentes de la Clamidia
trachomatis en diferentes cantidades iniciales en relación con la
cantidad de Unidades Formadoras de Inclusión de Clamidia trachomatis
(IFUs). El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN
plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el
prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC,
enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC
durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a
electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e
hibridizado con la sonda plásmida natural de la Clamidia trachomatis
5' CGT GCG GGG TTA TCT TAA AAG GGA T 3' marcada con P^{32}. Pudo
ser obtenido en la amplificación un resultado positivo con una
cantidad de ADN plásmido correspondiente a 0,01 IFU.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
P1 del Factor Tisular:
- 5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GAG
- GGA ATC ACT GCT TGA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del Factor Tisular:
- 5' GAC CGT AGA AGA TGA ACG GA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la
amplificación parte del gen del Factor Tisular humano. Como
material de inicio para la amplificación del ADN plásmido fue
utilizado pUC13-TF conteniendo parte del gen del
Factor Tisular en diferentes cantidades iniciales. El protocolo que
fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido diana con los
ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de
las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC,
añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El
material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de
agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda
del Factor Tisular 5' GTT CAG GAA AGA AAA CAG CCA 3' marcada con
P^{32}. Pudo ser obtenido un resultado positivo en la
amplificación con una sensibilidad de 10^{3} moléculas de
material de inicio de ADN plásmido.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
P1 del CD14:
- 5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG
- ATC TCC ACC TCT ACT GCA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del CD14:
- 5' GAA GCT AAA GCA CTT CCA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la
amplificación parte del gen CD14 humano. Como material de inicio
para la amplificación del ADN plásmido fue utilizado p\piH3M
conteniendo parte del gen CD14 en diferentes cantidades iniciales.
El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido
diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con
excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando
hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90
minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en
gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con
la sonda del CD 14 5' CCA TGG AGC GCG CGT CCT 3' marcada con
P^{32}. Pudo ser obtenido en la amplificación un resultado
positivo con una sensibilidad de 10^{3} moléculas de material
inicial de ADN plásmido.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
P1 de la Actina:
- 5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG A
- (AG)G GGC C(CG)G (AC)CT-CGTC(AG)T ACT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 de la Actina:
- 5' ATC AT(TC) GC(ATC) CC(GTC) CC(GAT) GAG
- CGC A 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Los nucleótidos entre paréntesis indican posición
"degenerada", donde cualquiera de los nucleótidos entre
paréntesis puede tener lugar. Estos iniciadores tienen como diana
para la amplificación parte del gen humano de la Actina. Como
material de inicio para la amplificación fue utilizado ADN genómico
humano completo (ADN placentario humano obtenido comercialmente)
tratado con RNasa A, en una cantidad inicial de material de 400 ng.
El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN genómico
placentario humano diana con los ingredientes descritos más arriba
en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los
65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a
41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a
electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e
hibridizado con la sonda de Actina 5' CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG
TGG A 3' marcada con P^{32}. Pudo ser mostrado un resultado
positivo en la amplificación utilizando el ADN genómico humano como
material inicial.
Para demostrar la viabilidad de la amplificación
sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a
temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos
oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción
NASBA anteriormente descritos:
P1 del exón 4 del CMV:
- 5' AAT TCT AAT ACT CAC TAT AGG GAG ATC
- CTC AAT GCG GCG CTT CA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del exón 4 del CMV:
- 5' GCT TGT ATG ATG ACC ATG TA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada
en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la
amplificación parte del genoma del CMV. Como material de inicio
para la amplificación fue utilizado ADN completo de células HEL
infectadas con CMV, tratado con RNasa A, con una cantidad de
material inicial equivalente a 0,1 células. El protocolo que fue
utilizado consistió en mezclar el ADN con los ingredientes descritos
más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando
hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e
incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue
sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro
de nylon e hibridizado con la sonda de CMV 5' CTG CTA TGT CTT AGA
GGA GA 3' marcada con P^{32}. Pudo ser mostrado un resultado
positivo en la amplificación utilizando el ADN de un equivalente de
0,1 células como material inicial.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Akzo Nobel N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Arnhem
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0412 666379
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0412 650592
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Amplificación basada en la transcripción de dianas de ADN de doble hebra.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disco floppy.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0,
\vskip0.500000\baselineskip
- Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGTGCTA TGTCACTTCC CCTTGGTTCT CTCA
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGGGATA GAGTGCATCC AGTGCATG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGGAAAA ATAAACTGTA AATCATATTC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTTACTG TGGTAGATAC TAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTACAAATA TGTCATTATG TGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCAAGA GTACATCGGT CAACGA
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCACAGCGGT TGCTCGAAGC A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGCGGGGT TATCTTAAAA GGGAT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGGA ATCACTGCTT GA
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCGTAGAA GATGAACGGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTCAGGAAA GAAAACAGCC A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGGGATC TCCACCTCTA CTGCA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGCTAAAG CACTTCCA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGGAGCG CGCGTCCT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGGGAAG GGGCCCGGAC CTCGTCAGTA CT
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCATTCGCA TCCCGTCCCG ATGAGCGCA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTCCACCT TCCAGCAGAT GTGGA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CTCACTATAG GGAGATCCTC AATGCGGCGC TTCA
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTGTATGA TGACCATGTA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCTATGTC TTAGAGGAGA
\hfill20
Claims (10)
1. Método para la amplificación de ADN de doble
hebra con un método de amplificación basado en la transcripción, en
donde el ADN de doble hebra es puesto en contacto con:
- -
- al menos, un oligonucleótido comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la primera de las dos hebras de ADN comprendidas en el ADN de doble hebra, comprendiendo adicionalmente dicho oligonucleótido la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa;
- -
- un oligonucleótido adicional comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la segunda hebra comprendida en el ADN de doble hebra;
- -
- una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ARN;
- -
- una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ADN;
- -
- una enzima poseyendo actividad RNasa H;
- -
- una enzima poseyendo actividad ARN polimerasa;
y la mezcla de reacción así creada es mantenida
bajo las condiciones isotérmicas adecuadas durante una cantidad de
tiempo suficiente como para que tenga lugar una reacción de
amplificación basada en la transcripción, sin someter la mezcla a
ningún tratamiento de calentamiento después de que cualquiera de las
enzimas haya sido añadida a la mezcla.
2. El método conforme a la reivindicación 1, en
donde el ADN es calentado una vez en presencia de los
oligonucleótidos, pero antes de que sean añadidas las enzimas.
3. El método conforme a la reivindicación 2, en
donde el ADN es calentado hasta 65 grados Celsius.
4. El método conforme a la reivindicación 2, en
donde la mezcla es calentada hasta los 100 grados Celsius.
5. El método conforme a la reivindicación 1, en
donde el ADN de doble hebra es un ADN plásmido o un ADN
genómico.
6. El método conforme a la reivindicación 5, en
donde el ADN es ADN genómico, el cual ha sido degradado
parcialmente.
7. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde es utilizada una
transcriptasa reversa.
8. El método conforme a la reivindicación 7, en
donde la transcriptasa reversa es la transcriptasa reversa AMV.
9. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia promotora es la
secuencia promotora T7, y la ARN polimerasa utilizada es la ARN
polimerasa T7.
10. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde es utilizada una enzima RNasa
H por separado.
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