KR20020002358A - ｃＤＮＡ 합성 방법 - Google Patents

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오미야 히사시
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Abstract

역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 전자와는 다른 또다른 효소의 존재하에 역전사 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 cDNA 합성 방법.

Description

ｃＤＮＡ 합성 방법{Method for synthesizing cDNA}
다양한 유전자로부터 유래된 mRNA 분자의 분석은 생물현상을 밝혀내기 위해 매우 중요하다. 레트로바이러스로부터 RNA-의존 DNA 폴리머라아제, 이른바 역전사 효소를 발견함으로써 주형으로 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하는 역전사 반응이 가능해졌다. 결과적으로, mRNA 분자를 분석하는 방법이 급속하게 진전되어 왔다. 이 후, 현재 역전사 효소를 사용한 mRNA 분자 분석 방법이 유전자 연구를 위한 필수적인 실험 방법이 되었다. 또한, 클로닝 기술 및 PCR 기술에 적용된 이들 방법은 유전자 연구 및 생물학, 의약품 및 농업을 포함한 다양한 분야에서 필수적인 기술이 되었다.
그러나, 통상의 역전사 방법은 cDNA 합성 반응의 방해, 불가능한 긴 cDNA 합성, 저성능, 및 긴 반응 시간에 기인한 주형 RNA의 손상과 같은 많은 문제점들을 갖고 있다.
cDNA 합성 반응의 방해는 주형으로서 RNA에 의해 형성된 2차 구조에 기인하다고 사료된다. 레트로바이러스로부터의 역전사 효소를 위한 최적의 반응 온도는낮다. 상기 온도에서 반응하는 동안, RNAs는 엉킨 2차 구조를 형성한다. 이어서, cDNA 합성 반응은 그러한 2차 구조 부위(site)에서 방해를 받는다. 상기 언급된 문제를 해결하기 위해 열-내성 역전사 효소를 사용하는 방법이 제안되어 왔다. 그러나, 이 방법의 반응성은 만족스럽지 못하다. 또한, 역전사 효소는 역전사 반응하는 동안 프루프리딩(proofreading) 활성을 나타낸다고 공지된 바 없으며, 고성능의 cDNA 합성 방법도 공지되지 있지 않다.
상기 기재한 바, 통상의 방법으로 고효율 및 고성능으로 cDNA를 합성하는 것은 어려웠다. 따라서, 보다 효율적으로 cDNA를 합성하는 방법이 요구되어 왔다.
발명의 목적
본 발명은 상기 기재된 바와 같은 선행 기술과 관련하여 고안되어 왔다. 본 발명의 주 목적은 선행 기술과 관련된 문제점들은 해결하고 고반응효율로 정확하게 cDNA를 합성하는 방법를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 하기와 같이 요약된다.
본 발명의 제 1면은 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 갖는 또다른 효소의 존재하에 역전사 반응을 수행하는 것을 포함함을 특징으로 하는 cDNA 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 2면은 주형으로서 제 1면의 방법에 따라 합성된 cDNA를 사용하여 유전자 증폭 반응을 수행하는 것을 포함함을 특징으로하는 cDNA 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 3면은 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 또다른 효소를 포함하는 cDNA 합성용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 4면은 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 또다른 효소 및 유전자 증폭 반응용 시약을 포함하는, 주형으로 제 1면의 방법에 따라 합성된 cDNA를 사용하여 유전자 증폭 반응을 수행하는 cDNA증폭용 키트에 관한 것이다.
본 발명자들은 cDNA 합성 반응중 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소의 존재하에서 역전사 반응을 수행하므로써 cDNA 합성의 효율 및 성능이 증가되었음을 발견하였다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.
본 발명은 유전 공학 분야에 유용한 cDNA 합성 방법 및 상기 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 cDNA 합성 방법의 주된 특징중 하나는 cDNA를 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 포함하는 역전사 반응 시스템에서 주형으로 RNA를 사용하여 합성한다는 점이다.
본 발명의 방법에 사용할 수 있는 RANs를 포함하는 샘플의 예로는, 제한하는 것은 아니지만, 세포, 조직 및 혈액과 같은 유기체로부터의 샘플, 및 식품, 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 공지된 방법에 따라 상기 언급된 샘플을 공정하여 얻은 핵산을 포함한 표본일 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 표본의 예로는, 세포 분해 생성물 또는 상기 생성물을 분획하여 얻은 샘플, 상기 샘플중의 총 RNA, 또는 mRNAs와 같은 특정 RNA 분자가 풍부한 샘플을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용할 수 RNAs는, 제한하는 것은 아니지만, 샘플중의 전체 RNA, mRNA, tRNA 및 rRNA, 및 특정 RNA 분자(예: 각각 공통 염기 서열 모티프(motif)를 갖는 RNA 분자, RNA 폴리머라아제를 사용하여 얻은 트랜스크립트 및 감법(subtraction method)에 의해 농축된 RNA 분자)와 같은 RNA 분자를 포함한다. 역전사 반응에 사용되는 프라이머를 제조할 수 있는 어느 RNAs가 사용될 수 있다.
본 발명에서 주형 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 프라이머는 주형 RNA의 것과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖고 사용되는 반응 조건하에서 주형 RNA에 어닐링(anneal)될 수 있는 올리고뉴클레오타이드인 한, 특정의 것으로 제한되지 않는다. 프라이머는 올리고(dT)와 같은 올리고뉴클레오타이드 또는 랜덤한(random) 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(랜덤 프라이머서열)일 수 있다.
특정의 어닐링과 관련하여, 프라이머 길이는 바람직하게 6 뉴클레오타이드이상, 더욱 바람직하게 10 뉴클레오타이드이상이다. 올리고뉴클레오타이드의 합성과 관련하여, 길이는 100 뉴클레오타이드이하, 더욱 바람직하게 30 뉴클레오타이드이하이다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 포스포라미다이트(phosphoramidite) 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc.(ABI))로부터 구입한 DNA 합성기 타입 394를 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르(phosphate triester) 방법, H-포스포네이트(H-phosphonate) 방법 및 티오포스포네이트(thiophosphonate) 방법을 포함한 어느 방법도 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 이것은 제한 핵산중간가수분해효소(endonuclease)로 분해된(digested) 천연 샘플로부터 제조된 DNA로부터 분리되고 제조될 수 있다. 주형 RNA로부터 cDNA의 합성과 관련하여, 역전사 반응 혼합물중 프라이머의 농도는 바람직하게 0.1μm 이상, 더욱 바람직하게는 0.5μm 이상이다. 반응의 억제와 관련하여, 농도는 10μm 이하, 더욱 바람직하게 5μm 이하이다.
본 발명에서 역전사 활성을 갖는 효소가 주형으로 RNA를 사용하여 cDNAs를 합성하는 활성을 갖고 있는 한 어느 효소도 사용될 수 있다. 그러나, 고온에서 역전사 활성을 갖는 효소(즉, 열-내성 역전사 효소)가 본 발명의 목적을 위해 바람직하다. 사용할 수 있는 그러한 효소의 예로는 써머스속(Thermus)세균으로부터의 DNA 폴리머라아제(예: Tth DNA 폴리머라아제) 및 바실러스속(Bacillus)속의 고온균으로부터의 DNA 폴리머라아제를 포함한다. 반응 혼합물중의 마그네슘 이온의 존재가 Tth DNA 폴리머라아제의 역전사 활성의 작용에 필수적이다. 마그네슘 이온이 PCR의 성능을 감소시킨다고 공지되어 있다. 따라서, Tth DNA 폴리머라아제가 사용되는 역전사 반응 혼합물이 PCR에 사용되는 경우 마그네슘 이온을 제거하는 것이 필요하다. 바실러스속의 고온균으로부터의 DNA 폴리머라아제는 그의 역전사 활성 작용을 위해 마그네슘 이온을 가하고 PCR상에서 제거할 필요가 없다. 이와 관련하여, 바실러스속의 고온균으로부터의 DNA 폴리머라아제가 본 발명에 바람직하다. 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)로부터의 DNA 폴리머라아제(이하, Bca DNA 폴리머라아제로 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus strearotheromophilus)로부터의 DNA 폴리머라아제(이하, Bst DNA 폴리머라아제로언급함)가 바람직할 수 있다. 이들 효소는 상기 반응을 위해 마그네슘 이온을 필요로 하지 않는다. 또한, 이들은 고온 조건하에서 주형 RNA의 2차 구조 형성을 억제하면서 cDNA를 합성하는데 사용될 수 있다.
바실러스 칼도테낙스는 약 70℃의 최적 성장 온도를 갖는 고온균이다. 이 세균으로부터의 Bca DNA 폴리머라아제는 DNA-의존 DNA 폴리머라아제 활성, RNA-의존 DNA 폴리머라아제 활성(역전사 활성), 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다고 공지되어 있다.
상기 효소는 원공급원으로부터 정제된 효소이거나 유전 공학 기술에 의해 제조된 재조합 단백질일 수 있다. 상기 효소는 유전 공학 기술 또는 다른 방법에 의해 치환, 결실, 첨가 또는 삽입과 같이 변형시킬 수 있다. 그러한 변형된 효소의 예로는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Bca DNA 폴리머라아제인 BcaBEST DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo), 및 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Bst DNA 폴리머라아제인 Bst DNA 폴리머라아제, 라지 프래그먼트(Large fragment(New England Biolabs))를 포함한다. 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 상기 언급된 효소들이 특히 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다.
역전사 활성을 갖는 효소의 사용량은 특정하게 제한되지 않는다. 효소는 예를 들면, 통상의 역전사 반응에서 사용되는 양으로 사용될 수 있다. 역전사 활성을 갖는 효소의 사용량은 cDNA 합성 반응을 더욱 효율적으로 수행하고 반응 시간을 단축시키기 위해 통상의 방법과 비교하여 증가될 수 있다. 예를 들면, BcaBEST DNA 폴리머라아제가 역전사 반응을 수행하기 위해 20㎕의 반응 부피로 사용되는 경우,반응 혼합물중 효소의 양은 0.5U 이상이다. cDNA 합성 효율과 관련하여, 바람직하게는 22U 이상, 더욱 바람직하게는 42U 이상이다. 본 명세서에 기재된 DNA 폴리머라아제의 활성은 상업적으로 이용가능한 효소에 대한 예시에 기초한다. DNA 폴리머라아제에 적절한 반응 조건하에서 30분 경과 후 전체 뉴클레오타이드중 10nmol을 불용성 산 침전물에 혼입시키는 활성을 1U로 정의한다. 주형으로 DNA 및 각 DNA 폴리머라아제에 적절한 반응 온도를 사용한다. 예를 들면, BcaBEST DNA 폴리머라아제의 경우, 주형/프라이머로서 폴리데옥시(ATP-TTP)를 사용하여 60℃에서 30분 경과 후 전체 뉴클레오타이드중 10nmol을 불용성 산 침전물에 혼입시키는 활성을 1U로 정의한다.
본 발명의 cDNA 합성 방법은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소의 존재하에 역전사 반응을 수행하는 것을 포함한다는 것을 특징으로한다. 본 발명에서 사용되는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 상기 활성을 갖는 한 특정의 것으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 3'-5' 엑소뉴클레아제를 갖는 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있다. 그러한 효소의 예로는 피로코커스속(Pyrococcus) 세균으로부터의 DNA 폴리머라아제(Pfu DNA 폴리머라아제(Stratagene), Pyrobest DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo), Deep vent DNA 폴리머라아제(New England Biolabs), KOD DNA 폴리머라아제(Toyobo), Pwo DNA 폴리머라아제(Boehringer) 등) 및 써모코커스속(Thermococcus) 세균으로부터의 DNA 폴리머라아제(Vent DNA 폴리머라아제(New England Biolabs) 등)과 같은 α형 DNA 폴리머라아제, 및 에쉐리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라아제(폴리머라아제 I, KlewFragment, 등) 및 박테리오파지로부터의 DNA 폴리머라아제(T4DNA 폴리머라아제, 등)과 같은 폴-I 형 DNA 폴리머라아제를 포함한다. 바람직하게, 강한 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 α형 DNA 폴리머라아제가 사용된다. 폴-I 형 DNA 폴리머라아제 또는 α형 DNA 폴리머라아제는 아미노산 서열 상동성에 기초하여 분류된 일련의 효소를 언급한다. 아미노산 서열의 특성은 [Nucleic Acids Research, 15:4045-4657(1991))에 기재되어 있다.
본 발명의 목적을 위해, RNA와 혼성화하는 DNA의 3'-말단부상에서 작용하는 효소가 사용된다. 또한, 고온에서 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 효소가 바람직하다. 이와 관련하여, 고온성 아캐박테리움(archaebacterium)으로부터 유래된 α형 DNA 폴리머라아제가 바람직할 수 있다. 고온성 아캐박테리움으로부터 유래된 α형 DNA 폴리머라아제는 피로코커스속(Pyrococcus) 세균으로부터의 DNA 폴리머라아제에 의해 구체화된다.
cDNA는 주형으로 상기 기재된 방법으로 수득된 cDNA를 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 증폭될 수 있다. 본 발명을 제한하려는 것은 아니지만, 예를 들면, 중합효소연쇄 반응(PCR)이 핵산 증폭 반응으로서 사용된다. PCR용 효소는 특정의 것으로 제한되지 않는다. 통상적으로 사용되는 PCR용 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있다. 상기 기재된 방법으로 수득한 cDNA는 고성능으로 주형 RNA로부터 합성된다. 서열을 RNA로부터 가능한 정확하게 제조하기 위하여, 고성능의 PCR을 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 고성능의 DNA 폴리머라아제, 예를 들면, 고온성아캐박테리움으로부터의 α형 DNA 폴리머라아제가 본 발명의 cDNA 증폭을 위해 바람직하게 사용된다. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 열-내성 DNA 폴리머라아제(예: 고온성 아캐박테리움으로부터의 α형 DNA 폴리머라아제)가 cDNA 합성 단계에서 사용되는 경우, 동일한 효소가 또한 PCR 단계에서 사용될 수 있다. cDNA 합성/증폭 반응의 성능은 변형된 제이. 클린 등(J.Cline et al)(J. Cline et al., Nucleic Acids Research, 24:3546-3551(1996))의 방법으로 측정할 수 있다.
상기 효소는 원공급원으로부터 정제된 효소이거나 유전 공학 기술에 의해 제조된 재조합 단백질일 수 있다. 상기 효소는 유전 공학 기술 또는 다른 방법에 의해 치환, 결실, 첨가 또는 삽입과 같이 변형될 수 있다. RNA가 주형으로 사용되는 경우에도 3'- 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제는 합성된 cDNA중에 잘못 혼입된 염기를 제거하는데 효과적인 프루프리딩 활성을 나타낸다. 따라서, 상기는 고성능으로 cDNA를 합성하는데 사용될 수 있다. cDNA 합성 효율과 관련하여, 부피 20㎕의 시약중에 사용되는 효소의 양(폴리머라아제 활성에 관련됨)은 바람직하게 1U이하, 더욱 바람직하게는 0.5U이하이다. 프루프리딩 활성과 관련하여, 양은 0.01U이상, 더욱 바람직하게는 0.02U 이상이다.
본 발명의 방법을 사용하여, 합성된 cDNA의 양은 증가될 수 있고, 더 긴 cDNA가 합성될 수 있고, 통상의 역전사 방법과 비교할 때 cDNA는 고성능으로 합성될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 클로닝 기술 및 PCR 기술과 같은 관련 기술과 결합하여, 통상의 방법과 비교할 때 더욱 효율적으로 cDNA 라이브러리를 제조하거나 RT-PCR을 수행할 수 있으며, 이로써 낮은 발현 수준 때문에 통상의 방법으로 분석하기 어려웠던 mRNAs를 더욱 정확하게 분석할 수 있다.
본 발명의 cDNA 합성용 키트는 상기 기재된 바와 같이 cDNA를 합성하는 방법에 사용되는 키트이다. 이는 고성능 및 고효율로 cDNA를 합성용 키트이다. 상기 키트는 상기 기재한 바와 같이, 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 포함하는 것에 의해 구체화된다. 키트는 상기 기재된 효소를 사용하는 cDNA 합성 반응을 위해 사용되는 반응 완충액, 뉴클레오타이드 및 다른 시약을 포함할 수 있다. cDNA는 상기 키트를 사용하여 효율적이고, 고성능으로 용이하게 합성될 수 있다.
본 발명의 cDNA 증폭용 키트는 상기 기재된 바와 같이 cDNA를 증폭시키는 방법에 사용되는 키트이다. 이는 고성능 및 고효율로 cDNA를 증폭용 키트이다. 상기 키트는 상기 기재한 바와 같이 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 유전자 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 것에 의해 구체화된다. PCR을 주형으로 cDNA를 사용하여 유전자 증폭 반응으로 사용하는 경우, 증폭 반응을 위해 사용되는 시약은 열-내성 DNA 폴리머라아제, 반응 완충액, 뉴클레오타이드 및 다른 시약들이다. cDNA는 상기 키트를 사용하여 효율적이고, 고성능이며 용이하게 증폭될 수 있다. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 열-내성 DNA 폴리머라아제(예: 고온성 아캐박테리움으로부터의 α형 DNA 폴리머라아제)가 cDNA 합성 단계에 사용되는 경우, 상기 효소가 또한 상기 기재된 바와 같은 증폭 반응을 위해 DNA 폴리머라아제로서 PCR 단계에서 사용될 수 있다.
하기 실시예는 또한 본 발명을 상세히 설명하려는 것이며, 그의 범위를 한정시키고자 함은 아니다.
하기 실시예에서, 각 효소의 활성은 효소에 첨부된 지침서중의 지시에 따라 나타낸다.
실시예 1: RNA의 제조
달리 언급하지 않는 하, 하기 실시예에서 사용되는 RNA는 시약에 첨부된 지침서에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies)를 사용하여 배양된 인간 U-937 세포(ATCC CRL-1593)로부터 제조하였다. 이어서, 농도를 0.66μg/㎕로 조정하였다. RNA의 순도는 OD260/OD280= 1.7.이었다.
실시예 2:BcaBEST DNA 폴리머라아제 및 Pyrobest DNA 폴리머라아제의 결합의 효과
역전사 효소로서 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 바실러스 칼도테낙스로부터 유래된 DNA 폴리머라아제(BcaBEST DNA 폴리머라아제, Takara Shuzo) 및 3'-5' 엑소뉴클레아제로서 피로코커스 스테아로써모필러스로부터 유래된 DNA 폴리머라아제(Pyrobest DNA 폴리머라아제, Takara Shuzo)를 사용하여 cDNA 합성시 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소 첨가의 효과를 조사하였다.
cDNA 합성 반응을 BcaBEST RNA PCR 키트(Ver. 1.1)(Takara Shuzo)를 사용하여 수행하였다. 각각 하기 기재된 효소(들) 및 올리고 dT 프라이머를 포함하는 20㎕의 반응 혼합물을 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 제조하였다. 반응 혼합물을 1,2, 3 또는 4분동안 60℃에서 역전사 반응용 PCR Thermal Cycler PERSONAL(Takara Shuzo)에 놓았다. 예정된 시간동안 반응시킨 후, 이들을 5분동안 98℃에서 가열하였다.
효소 1: BcaBEST DNA 폴리머라아제 22U/반응 시스템
효소 2: BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U/반응 시스템
효소 3 : BcaBEST DNA 폴리머라아제 22U/반응 시스템 + Pyrobest DNA 폴리머라아제 0.017U/반응 시스템
효소 4 : BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U/반응 시스템 + Pyrobest DNA 폴리머라아제 0.033U/반응 시스템
트랜스페린 수용체에 대한 mRNA중의 4.4kb 부위를 증폭하기 위한 PCRs를 Pyrobest DNA 폴리머라아제 및 역전사 반응 혼합물 각 20㎕를 사용하여 수행하였다. PCRs은 하기와 같이 Pyrobest DNA 폴리머라아제에 첨부된 매뉴얼에 따라 수행하였다. 각각 20㎕의 상기 언급된 역전사 반응 혼합물 중 하나, 트랜스페린 수용체를 증폭시키기 위한 프라이머 1(SEQ ID NO: 1), 및 트랜스페린 수용체를 증폭시키기 위한 프라이머 2(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 100㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 PCR Thermal Cycler PERSONAL에 놓고 PCRs 시켰다(30초동안 94℃, 30초동안 65℃ 및 5분동안 72℃에서 30회 반복).
PCRs 후, 생성된 혼합물 각 8㎕를 아가로스 LO3(Agarose L03(Takara Shuzo))를 사용하여 1% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. PCR 생성물의 양은, 전기 영동 후, 아가로스 겔을 에티디움 브로마이드 염색한 후, 형광 이미지분석기(fluorescence image analyzer) FMBIO II 멀티-뷰(FMBIO II Multi-View(Takara Shuzo))로 형광의 세기를 수치화하여 평가하였다. 효소 1로 역전사 반응 시간 3분동안 RT-PCR 증폭하여 얻은 생성물로부터의 형광 세기를 1로 정의하면서, 전환된 모든 샘플의 결과를 표 1에 나타낸다.
표 1
반응 시간 1분 2분 3분 4분
효소 1 검출되지않음 검출되지않음 1.00 1.27
효소 2 검출되지않음 1.03 2.05 2.05
효소 3 검출되지않음 검출되지않음 1.02 1.53
효소 4 검출되지않음 2.31 2.88 3.19
22U 또는 42U의 BcaBEST DNA 폴리머라아제가 사용된 경우, cDNA 합성 효율은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 Pyrobest DNA 폴리머라아제(표 1의 효소 3 또는 4)의 첨가에 의해 증가되었다. 42U의 BcaBEST DNA 폴리머라아제가 사용된 경우(표 1의 효소 4), 효율은 특히 현저하게 증가하였다.
이들 결과는 역전사 반응시 cDNA 합성 효율은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 첨가함으로써 증가된다는 것 및 역전사 활성을 갖는 효소를 다량으로 사용하는 것이 또한 효율을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
대조 실험으로서, cDNA를 베링거(Boehringer)사로부터 구입한 타이탄 RT-PCR(Titan RT-PCR) 키트를 사용하여 합성하였다. 이 키트는 역전사 활성을 갖는 효소로서 AMV-RTase 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로서 피로코커스 우에시(Pyrococcus woesii)로부터의 Pwo DNA 폴리머라아제를 포함한다. 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 cDNA 합성 반응을 30분동안 50℃에서 수행하였다. 매뉴얼에 따라 2분동안 94℃에서 가열한 후, 트랜스페린 수용체에 대한 mRNA중의 4.4kb부위를 증폭시키기 위한 PCR를 하기와 같이 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 Taq DNA 폴리머라아제/Pwo DNA 폴리머라아제를 사용하여 수행하였다: 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 4분동안 68℃에서 10회 반복; 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 4분 5초동안 68℃에서 11회 반복; 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 4분 10초동안 68℃에서 12회 반복; 30초동안 94℃, 30초동안 55℃ 및 4분15초동안 68℃에서 13회 반복; 각 1회 반복시마다 5초씩 연장하면서 25회까지 반복한다.
RT-PCR 생성물을 1% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 역전사 반응을 30분동안 수행하였지만 관심의 4.4kb-증폭 생성물을 검출하지 못했다.
실시예 3: BcaBEST DNA 폴리머라아제 및 Deep Vent DNA 폴리머라아제 결합의 효과
3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로서 피로코커스 스테아로써모필러스 GB-D(New England Biolabs)로부터 구입한 Deep Vent DNA 폴리머라아제를 사용한 효과를 조사하였다.
하기 효소(들)를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다.
효소 1: BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U/반응 시스템
효소 2: BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U + Deep Vent DNA 폴리머라아제 0.033U/반응 시스템
효소 3 : BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U + Deep Vent DNA 폴리머라아제 0.067U/반응 시스템
결과를 표 2에 나타낸다(효소 1로 역전사 반응 시간 2분동안 반응시켜 얻은 생성물로부터의 결과를 1로 정의함)
표 2
반응 시간 1분 2분 3분 4분
효소 1 검출되지않음 1.0 2.4 2.4
효소 2 검출되지않음 1.5 4.7 7.6
효소 3 검출되지않음 2.3 5.0 8.9
이들 결과는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로 Pyrobest DNA 폴리머라아제를 대신하여 Deep Vent DNA 폴리머라아제를 사용함으로써 효과가 증가되었음을 나타낸다.
실시예 4 : Bst DNA 폴리머라아제, 라지 단편 및 Pyrobest DNA 폴리머라아제 결합의 효과
역전사 활성을 갖는 효소로서 5'-3' 엑소뉴클레어제 활성이 결여된 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유래된 DNA 폴리머라아제(Bst DNA 폴리머라아제, 라지 단편, New England Biolabs)를 사용한 효과를 조사하였다.
하기 효소(들)을 사용하여 역전사 반응을 10분동안 수행하는 것을 제외한 실시예 2에 기재된 방법으로 수행하였다.
효소 1: BcaBEST DNA 폴리머라아제, 라지 단편 8U/반응 시스템
효소 2: BcaBEST DNA 폴리머라아제, 라지 단편 8U + Pyrobest DNA 폴리머라아제 0.01U/반응 시스템
효소 3 : BcaBEST DNA 폴리머라아제, 라지 단편 8U + Pyrobest DNA 폴리머라아제 0.005U/반응 시스템
효소 4 : BcaBEST DNA 폴리머라아제, 라지 단편 8U + Pyrobest DNA 폴리머라아제 0.0033U/반응 시스템
트랜스페린에 대한 mRNA중의 2.4kb 부위를 증폭시키기 위한 PCRs을 수행하였다. 하기 반응 조건하에서 트랜스페린 수용체를 증폭시키기 위한 프라이머 2(SEQ ID NO:2) 및 트랜스페린 수용체를 증폭시키기 위한 프라이머 3(SEQ ID NO:3)을 프라이머로서 사용한 것을 제외하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 PCRs를 수행하였다. 결과를 표 3에 나타낸다(효소 1에 대하여 얻은 결과를 1.00으로 정의한다)
표 3
효소 1 1.00
효소 2 1.61
효소 3 1.67
효소 4 1.92
이들 결과는 Bst DNA 폴리머라아제, 라지 단편을 역전사 반응을 위해 BcaBEST DNA 폴리머라아제를 대신하여 역전사 활성을 갖는 효소로서 사용하는 경우, cDNA 합성의 효율은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 첨가하므로써 증가된다는 것을 나타낸다.
실시예 5: cDNA 합성시 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성의 성능에 대한 효과
cDNA 합성시 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성의 성능에 대한 효과를 제이.클린 등(J. Cline et al.(J. Cline et al., Nucleic Acids Research, 24:3456-3551(1996))) 방법을 수정하여 역전사 활성을 갖는 효소로서 BcaBEST DNA 폴리머라아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로서 Pyrobest DNA 폴리머라아제를 사용하여 조사하였다.
하기와 같이, SP6 RNA 폴리머라아제(Takara shuzo)를 사용하여 합성한 lacIOZα RNA를 cDNA 합성용 주형 RNA로 사용하였다.
lacIOZα 는 E.Coli 락토오스 오페론의 일부이고 억제자 부위(I), 작동자 부위(O) 및 lacZα 인자 부위(Z)를 포함한다.
lacIOZα 부위에 대한 증폭된 단편은 주형으로 E.Coli 유전자 DNA, 및 lacIOZα-F 프라이머(SEQ ID NO:4) 및 lacIOZα-R 프리이머(SEQ ID NO:5)를 사용하여 PCR로 수득하였다. 생성된 증폭된 단편(약 1.9kb)을 TA 클로닝에 의해 pSCREEN-TTM-1 T-Vector(Novagene), SP6 작동자를 갖는 플라스미드내로 클로닝하여 lacIOZα부위가 SP6 작동자의 하류에 연결된 플라스미드를 수득하였다. RNA는 하기와 같이 제한 효소 XhoI(Takara shuzo)로 플라스미드를 분해하여 얻은 선형 DNA를 주형으로 사용하여 컴피티티스 RNA 트랜스크립션 키트(Competitive RNA Transcription Kit(Takara shuzo)) 및 SP6 RNA 폴리머라아제로 SP6 작동자로부터 합성하였다.
전체 부피 50㎕의 200ng 선형 lacIOZα-pSREEN-T DNA를 포함하는 반응 혼합물을 컴피티티스 RNA 트랜스크립션 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 제조하였다. 반응 혼합물을 2시간동안 37℃에서 인큐베이션하여 RNA를 합성하였다. 반응 후, 10U의 DNase(Takara shuzo)를 첨가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 방치하여 DNA를 감소시켰다. 이어서, 혼합물을 페놀/클로로포름 처리한 후, 에탄올 침전시켜합성된 RNA를 정제하였다. 상기와 같이 얻은, SP6 작동자, 억제자 부위(I), 작동자 부취(O) 및 lacZα인자 부위(Z)를 포함하는 1991 염기의 lacIOZαRNA를 주형으로 사용하여 하기 실험을 수행하였다.
전체 20㎕의 450ng의 lacIOZαRNA, 20 pmol의 lacIOZα-R 프라미어 및 하기 기재된 효소(들)를 포함한 반응 혼합물을 BcaBEST RNA PCR 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 제조하였다. 반응 혼합물을 PCR Thermal Cycler PERSONAl(Takara Shuzo)에 놓고, 1시간동안 65℃, 이어서 1분동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 15분후, 온도를 30℃내지 65℃로 상승시켰다. 이어서 혼합물을 역전사 반응을 위해 15분동안 65℃에서 인큐베이션시키고, 최종적으로 5분동안 98℃에서 가열하였다.
효소 1: BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U/반응 시스템
효소 2: BcaBEST DNA 폴리머라아제 42U + Pyrobest DNA 폴리머라아제 0.033U/반응 시스템
Pyrobest DNA 폴리머라아제 및 각 2.5㎕의 역전사 반응 혼합물을 사용하여 1.9-kb 부위의 lacIOZα를 증폭시키기 위한 PCR을 수행하였다. 하기와 같이 Pyrobest DNA 폴리머라아제에 첨부된 매뉴얼에 따라 PCRs을 수행하였다. 전체 부피 100㎕의 2.5㎕의 상기 언급된 역전사 반응 혼합물중 하나, lacIOZα-F 프라이머 및 lacIOZα-R 프라이머를 각각 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 PCR Thermal Cycler PERSONAL에 놓고 PCRs 시켰다(30초동안 94℃, 2분동안 68℃에서 28회 반복).
PCRs 후, 생성된 반응 혼합물을 페놀/클로로포름을 처리한 후, 에탄올 침전시켜 증폭 생성물을 정제하였다. 증폭 생성물을 제한효소 EcoRI(Takara Shuzo)로 처리한 후, 전체 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시켰다. EcoRI-처리된 단편의 밴드를 전기영동 후 잘라내고, EcoRI-처리된 단편을 이지트랩(EasyTrap(Takara Shuzo))을 사용하여 회수하였다. 이렇게 얻은 EcoRI-처리된 단편을 리게이션 키트 ver.2(Ligation Kit ver.2(Takara Shuzo))를 사용하여 λgt10 EcoRI 암(λgt10 EcoRI Arms(Takara Shuzo))와 결찰시켰다(ligate). 이어서, 결찰 혼합물 각각을 시험관내에서 기가팩 III 골드 팩킹 추출물(Gigapack III gold packaging extract) (stratagene)을 사용하여 팩킹시켰다.
이렇게 얻은 팩킹 혼합물의 일련의 희석액 각 100㎕에 E. Coli DH5α(lacZΔM15)의 100㎕ 배양액을 가하였다(OD600=1). 혼합물을 15분동안 37℃에서 방치하였다. 전체 혼합물을 X-gal (1mg/㎖) 및 IPTG(1.5mM)를 포함하는 0.7% LB 소프트 아가(IPTG(+)) 또는 IPTG(1.5mM)를 포함하지 않고 X-gal만을 포함하는 0.7% LB 소프트 아가(IPTG(-))에 가하고, 혼합하고, LB 플레이트상에 오버레이(overlay)시켰다. 플레이트를 밤새도록 37℃에서 인큐베이션시켰다. 형성된 플라크(plaque)의 수를 계수하였다.
lacIOZ 부위중의 lacI가 돌연변이가 아닌 경우, IPGT의 부재시 lacI에 의해 발현된 억제자의 활성에 의해 β-갈락토시다아제는 발현되지 않았고, 백색의 플라크를 생성하였다. IPGT의 존재시 β-갈락토시다아제는 청색의 플라크를 생성하면서 발현되었다. 한편, lacIOZ 부위내 lacI가 돌연변인 경우, IPGT의 부재시에도 lacI에 의해 발현된 억제자의 불활성에 의해 β-갈락토시다아제는 발현되었다. 결과, 청색 플라크는 IPTG(+) 및 IPTG(-)상에서 형성되었다.
IPTG(+) IPTG(-)
돌연변이가 아닌경우 청색 백색
돌연변이인 경우 청색 청색
IPTG(-) 플레이트상에 형성된 청색 플라크는 돌연변이화된 클론을 나타낸다. 돌연변이 빈도(mf)를 하기 식에서와 같이 IPTG(-) 플레이트상에서 형성된 청색 플라크의 수를 IPTG(+) 플레이트상에서 형성된 청색 플라크의 수로 나누어 측정할 수 있다.
mf =
mf: 돌연변이 빈도
결과를 표 4에 나타낸다.
표 4
IPTG(-) 플레이트상에서 형성된 청색 플라크의 수 IPTG(+) 플레이트상에서 형성된 청색 플라크의 수 돌연변이 빈도(mf)
효소 1 24 105 0.229
효소 2 27 203 0.133
BcaBEST DNA 폴리머라아제 단독으로 존재하는 경우 역전사 반응을 수행할 때, 돌연변이 빈도(mf)는 0.229였다. 한편, BcaBEST DNA 폴리머라아제 및 Pyrobest DNA 폴리머라아제의 존재시 역전사 반응을 수행하는 경우, 돌연변이 빈도(mf)는 0.133이였고, 이는 Pyrobest DNA 폴리머라아제부재시 얻은 결과보다 2배 높은 성능을 나타내었다.
이 결과는 역전사 반응하는 3'-5' 엑소뉴틀레아제 활성을 갖는 효소의 존재로 cDNA 합성 효율 및 성능이 증가된다는 것을 증명한다.
본 발명은 반응의 고효율 및 고성능으로 cDNA를 합성하는데 사용될 수 있는 방법이다. 클로닝 기술 및 PCR 기술과 같은 관련된 기술과 결합시켜, 통상의 방법과 비교할 때 더욱 효율적이고 정확하게 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있거나 RT-PCR를 수행할 수 있고, 결과적으로 mRNA 분석 방법을 개선시킬 수 있다.
서열 목록 프리 텍스트
SEQ ID NO : 1: 트랜스페린 수용체 mRNA를 증폭시키기 위한 프라이머 1로서 합성된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO : 2: 트랜스페린 수용체 mRNA를 증폭시키기 위한 프라이머 2로서 합성된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO : 3: 트랜스페린 수용체 mRNA를 증폭시키기 위한 프라이머 3로서 합성된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO : 4: E.Coli의 lacIOZα부위를 증폭시키기 위한 lacIOZα-F 로서 합성된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO : 5: E.Coli의 lacIOZα부위를 증폭시키기 위한 lacIOZα-R 로서 합성된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머

Claims (21)

  1. 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 또다른 효소의 존재하에 역전사 반응을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 합성 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 역전사 활성을 갖는 효소가 열-내성 역전사 효소인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 역전사 활성을 갖는 효소가 바실러스속(Bacillus)의 고온균으로부터 유래된 DNA 폴리머라아제인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 역전사 활성을 갖는 효소가 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)로부터 유래된 DNA 폴리머라아제 또는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 유래된 DNA 폴리머라아제인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 DNA 폴리머라아제인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 고온성 아캐박테리움(archaebacterium)으로부터 유래된 α형 DNA 폴리머라아제인 방법.
  7. 주형으로 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 의해 정의된 방법에 따라 합성된 cDNA를 사용하여 유전자 증폭 반응을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 증폭 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 유전자 증폭 반응이 PCR인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, PCR을 위한 DNA 폴리머라아제가 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소인 방법.
  10. 제 9항에 있어서, PCR을 위한 DNA 폴리머라아제가 아캐박테리움 (archaebacterium)으로부터 유래된 α형 DNA 폴리머라아제인 방법.
  11. 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 또다른 효소를 포함하는 cDNA 합성용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 역전사 활성을 갖는 효소가 열-내성 역전사 효소인 키트.
  13. 제 12항에 있어서, 역전사 활성을 갖는 효소가 바실러스속(Bacillus)의 고온균으로부터 유래된 DNA 폴리머라아제인 키트.
  14. 제 13항에 있어서, 역전사 활성을 갖는 효소가 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)로부터 유래된 DNA 폴리머라아제 또는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 유래된 DNA 폴리머라아제인 키트.
  15. 제 11항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 DNA 폴리머라아제인 키트.
  16. 제 15항에 있어서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 아캐박테리움 (archaebacterium)으로부터 유래된 α형 DNA 폴리머라아제인 키트.
  17. 역전사 활성을 갖는 효소 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 또다른 효소 및 유전자 증폭 반응용 시약을 포함하는, 주형으로서 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 의해 정의된 방법에 따라 합성된 cDNA를 사용하여 유전자 증폭 반응을 수행하여 cDNA를 증폭시키는 키트.
  18. 제 17항에 있어서, 유전자 증폭 반응이 PCR인 키트.
  19. 제 18항에 있어서, 유전자 증폭 반응용 시약로서 PCR용 DNA 폴리머라아제를 포함하는 키트.
  20. 제 19항에 있어서, PCR을 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 수행하고, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 PCR용 DNA 폴리머라아제와 동일한 효소인 키트.
  21. 제 20항에 있어서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 아캐박테리움 (archaebacterium)으로부터 유래된 α형 DNA 폴리머라아제인 키트.
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