WO2000032763A1 - Synthese d'adn complementaire - Google Patents

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WO2000032763A1
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dna polymerase
cdna
reverse transcription
activity
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PCT/JP1999/006560
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Junko Yamamoto
Kazue Miyake
Hiroyuki Mukai
Fumitsugu Hino
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a novel cDNA synthesis method useful in the field of genetic engineering, and a kit used for the method.
  • the conventional reverse transcription method stops cDNA synthesis reaction halfway, cannot synthesize long cDNAs, has low fidelity, and requires a long reaction time. There were many problems such as receiving.
  • RNA forms a complex secondary structure during the reaction, and the cDNA synthesis reaction stops at such a secondary structure site.
  • a method using a thermostable reverse transcriptase has been proposed. However, the method is not satisfactory in reactivity.
  • the proofreading activity of reverse transcriptase in the reverse transcription reaction is not known, the fidelity is high, and the cDNA synthesis method is not known.
  • the present invention has been made in view of the above prior art, and an object of the present invention is to provide a method for overcoming the problems of the prior art, achieving high reaction efficiency, and performing accurate cDNA synthesis. It is in. Summary of the Invention
  • the first invention of the present invention provides an enzyme having a reverse transcription activity and an enzyme different from the enzyme and having a 3′-5 ′ exonuclease activity.
  • the present invention relates to a method for synthesizing cDNA characterized by performing reverse transcription activity.
  • the second invention of the present invention relates to a method for amplifying a cDNA, which comprises carrying out a gene amplification reaction using the cDNA synthesized by the method of the first invention as type III.
  • the third invention of the present invention relates to a kit for synthesizing cDNA, comprising an enzyme having a reverse transcription activity, and an enzyme having a 3′-5 ′ exonuclease activity that is different from the enzyme. It relates to a cDNA synthesis kit characterized by containing.
  • a fourth invention of the present invention relates to a kit used for amplifying a cDNA, wherein the kit synthesized by the method of the first invention is subjected to a gene amplification reaction using the cDNA as a type III to amplify the cDNA.
  • a kit for use comprising an enzyme having reverse transcription activity, an enzyme different from said enzyme and having 3'-5 'exonuclease activity, and a reagent for gene amplification reaction And a cDNA amplification kit.
  • the present inventors have found that, in a cDNA synthesis reaction, performing a reverse transcription reaction in the presence of an enzyme having a 3′-5 ′ exonuclease activity increases cDNA synthesis efficiency and fidelity.
  • the present invention has been completed. Detailed description of the invention
  • a major feature of the cDNA synthesis method of the present invention is that cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction system containing an RNA having type III and an enzyme having 3′-5 ′ ′′ exonuclease activity.
  • the sample containing RNA that can be used in the method of the present invention is not particularly limited, Examples include biological samples such as cells, tissues, and blood, and samples that may contain organisms such as food, soil, and wastewater. Further, it may be a nucleic acid-containing preparation obtained by treating the sample or the like by a known method. As the preparation, for example, a cell lysate or a sample obtained by fractionating the same, total RNA in the sample, or a specific RNA molecule group, for example, an mRNA-enriched sample can be used in the present invention. .
  • RNA molecules such as total RNA, mRNA, tRNA, and rRNA in a sample, or specific RNA molecules (for example, a common base sequence motif RNA molecules, RNA polymerase transcripts, and RNA molecules enriched by the subtradition method), and any RNA capable of producing a primer used in the reverse transcription reaction.
  • the primer used for cDNA synthesis from type I RNA is an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to type II RNA, and depending on the reaction conditions used, the primer is There is no particular limitation as long as it anneals.
  • the primer may be an oligonucleotide such as oligo (dT) ⁇ an oligonucleotide having a random sequence (random primer).
  • the length of the primer is preferably at least 6 nucleotides, more preferably at least 10 nucleotides, and from the viewpoint of oligonucleotide synthesis, preferably at most 100 nucleotides. Preferably it is 30 nucleotides or less.
  • the oligonucleotide can be synthesized, for example, by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer Model 394 of ABI (Applied Biosystem In). In addition, it may be synthesized by any method such as the phosphoric acid triester method, the H-phosphonate method, and the thiophosphonate method. Oligonucleotides derived from biological samples may also be used.
  • the concentration of the primer in the reverse transcription reaction solution is preferably 0.5 ⁇ m or more, more preferably 0.5 ⁇ m or more, from the viewpoint of cDNA synthesis from type I RNA, From the viewpoint of reaction inhibition, the amount is preferably 10 ⁇ M or less, more preferably 5 ⁇ M or less.
  • the enzyme having reverse transcription activity to be used in the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing RNA-type cDNA, but for the purpose of the present invention, Enzymes having reverse transcription activity at temperatures (ie, thermostable reverse transcriptases) are preferred.
  • Enzymes having reverse transcription activity at temperatures ie, thermostable reverse transcriptases
  • an enzyme for example, thermus, The recitations, genus bacteria-derived DNA polymerase (such as Tth DNA polymerase), and thermophilic Bacillus bacterium-derived DNA polymerase can be used.
  • Tth DNA polymerase genus bacteria-derived DNA polymerase
  • thermophilic Bacillus bacterium-derived DNA polymerase can be used.
  • the presence of manganese ions in the reaction solution is essential.
  • Manganese ions are known to cause a decrease in fidelity in the PCR reaction, and it is necessary to remove manganese ions when using a reverse transcription reaction solution with Tth DNA polymerase for PCR. In the case of thermophilic Bacillus-derived DNA polymerase, the addition of manganese ions for reverse transcription activity and its removal in PCR is not necessary.
  • thermophilic Bacillus bacterium-derived DNA polymerase is preferable, and a Bacillus caldotenax-derived DNA polymerase (hereinafter, referred to as Bca DNA polymerase), a Bacillus' stear mouth, Preferred is a DNA polymerase derived from Thermophilus Bacillus stearothermophilu (hereinafter referred to as Bst DNA polymerase).
  • Bca DNA polymerase Bacillus caldotenax-derived DNA polymerase
  • Bst DNA polymerase a DNA polymerase derived from Thermophilus Bacillus stearothermophilu
  • Bacillus cardotenax is a thermophilic bacterium with an optimum growth temperature of about 70 ° C.
  • Bca DNA polymerase derived from this bacterium has DNA-dependent DNA polymerase activity, RNA-dependent DNA bolimerase activity (reverse transcription activity), 5'- It is known to have 3 'exonuclease activity and 3,-5' exonuclease activity.
  • enzymes may be either those obtained by purifying them from their original sources or recombinant proteins produced by genetic engineering.
  • the enzyme may be modified by substitution, deletion, addition, insertion or the like by genetic engineering or other techniques.
  • Examples of the modified enzyme include 5′-3 ′ exonuclease. DNA polymerase, Large fragment (New England) using BcaBEST DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), which is a Bca DNA polymerase lacking the protease activity, and Bst DNA polymerase lacking the 5'-3 'exonuclease activity Biolabs) etc .;
  • the above enzyme deficient in 5'-3 'exonuclease activity can be particularly preferably used in the present invention.
  • the amount of the enzyme having the reverse transcription activity is not particularly limited.
  • the amount used in the conventional reverse transcription reaction may be used.
  • by increasing the amount of the enzyme having the reverse transcription activity as compared with the conventional case a more efficient cDNA synthesis reaction can be performed, and the reaction time can be shortened.
  • the amount of the enzyme in the reaction solution is 0.5 U or more, and preferably 22 U or more from the viewpoint of cDNA synthesis efficiency. And more preferably 42U or more.
  • the activity of the DNA polymerase described in this specification is based on the designation of a commercially available enzyme.Under the reaction conditions suitable for the DNA polymerase, 10 nmol of all nucleotides is incorporated into the acid-insoluble precipitate in 30 minutes. Activity is defined as 1 U. ⁇ DNA and reaction temperature that are suitable for the DNA polymerase are used. For example, in the case of the above BcaBEST DNA polymerase, the activity of incorporating 10 nmol of all nucleotides into an acid-insoluble precipitate in 30 minutes at 60 ° C. using polydeoxy (ATP-TTP) as a type 7 primer is defined as 1 U.
  • ATP-TTP polydeoxy
  • the cDNA synthesis method of the present invention is characterized in that a reverse transcription reaction is performed in the presence of an enzyme having 3'-5 'exonuclease activity.
  • the enzyme having 3'-5 'exonuclease activity used in the present invention is not particularly limited as long as it has the activity, and examples thereof include DNA polymerase having 3'-5' exonuclease activity. Can be used. Examples of such enzymes include Pyrococcus (Pyrococcus) bacteria-derived DNA polymerase (Pfu DNA polymerase (Stratagene), Pyrobest DNA polymerase— (Takara Shuzo), Deep Vent DNA polymerase (New England Biolabs),
  • K0D DNA polymerase (manufactured by Toyobo), Pwo DNA polymerase (manufactured by Boehringer), etc.
  • ⁇ ⁇ -type DNA polymerase such as DNA polymerase derived from bacteria belonging to the genus Thermococcus (Vent DNA polymerase (manufactured by New England Biolabs)), DNA derived from Escherichia coli Polymerases such as polymerase (polymerase I, Klenow fragment, etc.) and pol I type DNA polymerase such as bacteriophage-derived DNA polymerase ( ⁇ 4 DNA polymerase, etc.), preferably having a strong 3′-5 ′ exonuclease activity
  • the template DNA polymerase shown is used.
  • Pol I type DNA polymerase and template DNA polymerase both refer to a group of enzymes classified by their amino acid sequence homology, and their amino acid sequence characteristics are characterized by Nucleic Acids Research, Vol. 15, pp. 4045-16
  • an enzyme that acts on the 3 ′ end of DNA hybridized with RNA is used, and an enzyme that exhibits 3′-5 ′ exonuclease activity at a high temperature is preferable.
  • a template DNA volimerase derived from a hyperthermophilic archaeon is preferable.
  • the hyperthermophilic archaeon-derived DNA polymerase include, for example, Pyrococcus bacterium-derived DNA volimerase.
  • the cDNA can be amplified by performing a nucleic acid amplification reaction using the cDNA obtained by the above method as type III.
  • the nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, but, for example, a polymerase chain reaction (PCR) method is used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the cDNA obtained by the above method is synthesized with high fidelity from mirror-type RNA, and from the viewpoint of replicating the sequence derived from the RNA as accurately as possible, it is desirable that PCR be performed with high fidelity. It is.
  • a DNA polymerase having the highest fidelity such as ⁇ -type DNA volimerase derived from thermophilic archae
  • a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity for example, ⁇ -type DNA polymerase derived from thermophilic archae
  • the enzyme is directly used in PCR. It can also be used in the process.
  • the fidelity of the cDNA synthesis / amplification reaction was modified from the method of J. Crine et al. (J. Crine et al., Nucleic Acids Research, Vol. 24, pp. 3546-3551, (1996)). It can be measured based on the method.
  • These enzymes may be either those obtained by purifying from their original sources or recombinant proteins produced by genetic engineering. In addition, those modified by substitution, deletion, addition, insertion or the like by genetic engineering or other techniques may be used. DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity,
  • the amount of the enzyme to be used is preferably 1 U or less, more preferably 0.5 U or less, from the viewpoint of cDNA synthesis efficiency in 20 ⁇ l of a reaction solution as a polymerase activity. From the viewpoint of proofreading activity, it is preferably 0.01 U or more, more preferably 0.02 U or more.
  • the cDNA synthesis kit of the present invention is a kit used in the above-described cDNA synthesis method, and is a kit for efficiently performing high-fidelity cDNA synthesis.
  • kits include those containing an enzyme having the above reverse transcription activity and an enzyme having a 3′-5 ′ exonuclease activity.
  • the kit may contain a reaction buffer used for a cDNA synthesis reaction using the enzyme, nucleotides and other reagents. By using such a kit, cDNA synthesis with high efficiency and high fidelity can be easily performed.
  • the cDNA amplification kit of the present invention is a kit used for the above-described cDNA amplification method, and is a kit for efficiently performing high-fidelity cDNA amplification.
  • a kit include an enzyme having the above-mentioned reverse transcription activity, an enzyme having a 3′-5 ′ exonuclease activity, and a kit containing a reagent for performing a gene amplification reaction.
  • the reagents used in the amplification reaction include a heat-resistant DNA polymerase, a reaction buffer, nucleotides and other reagents.
  • thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity for example, a template DNA polymerase derived from thermophilic archae
  • the enzyme can be used as it is as a DNA polymerase for an amplification reaction in a PCR step.
  • Example 2 Effect of Combination of BcaBEST DM Polymerase and Pyrobest DNA Polymerase
  • the 5 'exonuclease was examined using Pyrococcus species ( ⁇ KTOCOCCiAS sp.) DNA polymerase (Pyrobest DNA polymerase, Takara Shuzo).
  • the cDNA synthesis reaction was performed using BcaBEST RNA PCR Kit (Ver. 1.1) (Takara Shuzo). According to the kit's manual, the following enzymes and oligo dT
  • reaction solution 20 / l containing the primer was prepared. These reaction solutions were set in PCR Thermocycler Personal (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and reverse transcription was performed at 60 ° C for 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, and 4 minutes. Heat treatment was performed at ° C for 5 minutes. Enzyme 1 BcaBEST DNA polymerase 22 U / reaction system
  • PCR was performed using Pyrobest DNA polymerase, targeting 20 kb of the above reverse transcription reaction solution as a sample and targeting 4.4 kb of transferrin receptor mRNA.
  • PCR was performed according to the manual of Pyrobest DNA Polymerase, containing 20 ⁇ l of the above reverse transcription reaction solution, primer 1 for transferrin receptor amplification (SEQ ID NO: 1), and primer 1 for transferrin receptor amplification (SEQ ID NO: 2).
  • SEQ ID NO: 1 primer 1 for transferrin receptor amplification
  • SEQ ID NO: 2 primer 1 for transferrin receptor amplification
  • cDNA synthesis was performed using Titan RT-PC Kit from Boehringer.
  • the kit contains AMV-RTase as an enzyme having reverse transcription activity and Pwo DNA volimerase derived from Pyrococcus woesii) as an enzyme having 3′-5 ′ exonuclease activity.
  • a cDNA synthesis reaction was performed at 50 ° C for 30 minutes according to the manual of the kit. After heat treatment at 94 ° C for 2 minutes according to the manual, PCR targeting 4.4 kb in transferrin receptor 11 ⁇ was performed according to the manual of the kit, and then Taq DNA polymerase was used. This was performed using / Pwo DNA volimerase. 94t :, 30 seconds to 55 D C, 30 seconds to 68 ° C, 4 minutes one cycle and the PCR after 10 cycles, 94 ° C, 30 seconds and 55.
  • the reverse transcription reaction was performed in the same manner as in Example 2 except that the reverse transcription reaction time was changed to 10 minutes.
  • RNA for cDNA synthesis lacIOZa RNA synthesized by SP6 RNA polymerase (Takara Shuzo) as follows was used.
  • lacIOZa is part of the E. coli (£ coli) rata tosperon and contains a repressor one region (I), an operator region (0), and a lacZa factor region (Z).
  • PCR was performed using the lacIOZ-F primer (SEQ ID NO: 4) and the lacIOZa-R primer (SEQ ID NO: 5) to obtain an amplified fragment of the lacIOZ region.
  • the obtained amplified fragment (about 1.9 kb) was TA cloned into plasmid pSCREEN-T 'TM -1 T-Vector (Novagen) having SP6 promoter, and the lacIOZa region was ligated downstream of one SP6 promoter.
  • the obtained plasmid was obtained.
  • This plasmid was digested with the restriction enzyme Xhol (Takara Shuzo), and the linear DNA obtained was used as type I.
  • RNA was synthesized from the SP6 promoter region using SP6 RNA polymerase as follows.
  • RNA was synthesized. After the reaction, 10 U of DNasel (manufactured by Takara Shuzo) was added, and the mixture was left still at 37 ° C. for 1 hour to decompose DNA. Thereafter, the synthetic RNA was purified by phenol-form mouth treatment and ethanol precipitation.
  • the 1991-based lacIOZ a RNA SP6 promoter, repressor region (I), operator region
  • a reaction solution containing 450 ng of lacIOZ RNA, 20 pmol of lacIOZ HI-R primer, and the enzyme described below was prepared in an amount of 20 ⁇ l.
  • the reverse transcription reaction was performed by keeping the temperature at 65 ° C for 15 minutes, and finally, a heat treatment was performed at 98 ° C for 5 minutes.
  • Enzyme 1 BcaBEST DNA volimerase 42 U / reaction system Enzyme 2 BcaBEST DNA polymerase 42 U / reaction system + Pyrobest DNA volumease 0.033 U / reaction system
  • reverse transcriptase reaction 2.5 ⁇ l was used as a sample, and the lacIOZa region 1 PCR was performed targeting 9 kb.
  • PCR was performed according to the manual of Pyrobest DNA polymerase, preparing 2.5 ⁇ l of the above-mentioned reverse transcription reaction solution, 100 ⁇ l of a reaction solution containing lacIOZ-F primer and lacIOZ-F primer, and PCR PCR. The PCR was carried out for 28 cycles, each cycle consisting of 94 ° C, 30 seconds to 68 ° C, and 2 minutes.
  • the resulting reaction solution was treated with phenol-form in mouth and precipitated with ethanol, and the amplification product was purified.
  • the restriction enzyme EcoR I (Takara Shuzo)
  • the whole amount is subjected to agarose gel electrophoresis, and after the electrophoresis, the band of the EcoRI treated fragment is cut out, and EcoR I is used with EasyTrap (Takara Shuzo).
  • the treated fragment was recovered.
  • This EcoRI treated fragment is ligated with gt10O EcoR 1 Arms (Takara Shuzo) using a Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo) and in vitro tested using Gigapack III gold packaging extract (Stratagene).
  • Packaging in vitro packaging was performed.
  • Add the entire volume of this culture medium to 0.7% LB soft agar (IPTG (+)) containing X-gal (1 mg / ml) and IPTG (1.5 mM), or IPTG containing X-gal. It was added to 0.7% LB soft agar (IPTG (-)) containing no, mixed, and overlaid on an LB plate. The plate was cultured at 37 C- C, and the number of plaques appeared was counted.
  • the reverse transcription reaction was performed in the presence of BcaBEST DNA polymerase and Pyrobest DNA polymerase, whereas the mutation rate (mf) when the reverse transcription reaction was performed in the presence of only BcaBEST DNA polymerase was 0.229. In this case, the mutation rate (mf) was 0.133, indicating a fidelity of about twice that in the absence of Pyrobest DNA polymerase.
  • the present invention is a method that enables high-efficiency and high-fidelity cDNA synthesis.
  • This method can be combined with related technologies, for example, cloning technology, PCR technology, etc., which enables more efficient and accurate cDNA library production and RT-PCR than before. This leads to an improvement in the method of analyzing mRNA. Sequence listing free text
  • c5i £ Q ID NO: 1 Designed oligonucleotide primer designated as Primer 1 to amplify transferrin receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 2 Designed oligonucleotide primer designated as Primer 2 to amplify transferrin receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 3 Designed oligonucleotide primer designated as Primer 3 to amplify transferrin receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 4 Designed oligonucleotide primer designated as lacIOZH-F to amplify lacIOZ a region of E. coli.
  • SEQ ID NO: 5 Designed oligonucleotide primer designated as lacIOZHiichi R to amplify lacIOZ a region of E. coli.

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Description

明 細 書 cDNAの合成方法 発明の分野
本発明は遺伝子工学分野において有用な、 新規の cDNA合成方法、 並びに該方法 に使用されるキットに関する。 発明の背景
生命現象を解明するためには、 様々の遺伝子の mRNA分子の解析が非常に重要で ある。 レトロウィルス由来の RNA依存性 DNAポリメラーゼ、 即ち逆転写酵素の発見 により、 RNAを铸型に cDNAを合成する逆転写反応が可能となり、 mRNA分子の解析 法は長足の進歩を遂げ、 逆転写酵素を用いた mRNA分子の解析法は現在、 遺伝子に 関する研究において必須の実験法となっている。 更に該方法はクローユング技術 や PCR技術にも応用され、 遺伝子に関する研究のみならず、 生物学、 医学、 農業 等、 幅広い分野において不可欠の技術となっている。
しかしながら、 従来の逆転写方法には、 cDNA合成反応が途中で止まってしまう、 長い cDNAが合成出来ない、 フィデリティーが低い、 反応に要する時間が長いため 反応の進行中に铸型 RNAが損傷を受けてしまう等の多くの問題点があった。
cDNA合成反応が途中で止まってしまうのは、 铸型となる RNAが形成する二次構 造のためと考えられる。 レトロウイルス由来の逆転写酵素の反応至適温度は低い ため、 反応時に RNAが複雑な二次構造を形成し、 このような二次構造の部位で cDNA合成反応は止まってしまう。 この問題点を解決する方法として、 耐熱性の逆 転写酵素を用いる方法が提案されている。 し力 し、 該方法は反応性において満足 できるものではない。 また、 逆転写酵素の逆転写反応における校正活性は知られ ておらず、 フィデリティーの高レ、cDNA合成方法も知られていなレ、。
このように従来の技術では cDNA合成を効率良く高いフィデリティーで行うこと は困難であり、 より効率の良い cDNA合成方法が求められていた。 発明の目的
本発明は前記従来技術に鑑みて行われたものであり、 本発明の目的は、 従来技 術の問題点を克服し、 反応効率が高く、 かつ正確な cDNA合成を行う方法を提供す ることにある。 発明の要旨
本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は、 逆転写活性を有する酵素、 及び、 該酵素とは異なる酵素であって 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存 在下で逆転写活性を行うことを特徴とする cDNAの合成方法に関する。
本発明の第 2の発明は、 第 1の発明の方法によって合成された cDNAを铸型とし て遺伝子増幅反応を実施することを特徴とする cDNAの増幅方法に関する。
本発明の第 3の発明は、 cDNAを合成するためのキットに関し、 逆転写活性を有 する酵素、 及び、 該酵素とは異なる酵素であって 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性 を有する酵素を含有することを特徴とする cDNA合成キットに関する。
本発明の第 4の発明は、 cDNAを増幅するために用いられるキットに関し、 第 1 の発明の方法によつて合成された cDNAを铸型として遺伝子増幅反応を実施し、 cDNAを増幅するために用いられるキットであって、 逆転写活性を有する酵素、 及 び、 該酵素とは異なる酵素であって 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、 並びに遺伝子増幅反応のための試薬を含有することを特徴とする cDNA増幅キット に関する。
本発明者らは、 cDNA合成反応において、 3' - 5'ェキソヌクレアーゼ活性を有す る酵素の存在下で逆転写反応を行うことにより cDNAの合成効率、 並びにフィデリ ティーが上昇することを見出し、 本発明を完成した。 発明の詳細な説明
本発明の cDNA合成方法は、 RNAを铸型とし、 3' - 5' 'ェキソヌクレアーゼ活性を 有する酵素を含んだ逆転写反応系によって cDNAを合成することを大きな特徴とす る。
本発明の方法に使用することができる RNAを含む試料には特に限定はないが、 例えば細胞、 組織、 血液のような生体由来試料、 食品、 土壌、 排水のような生物 を含有する可能性のある試料が挙げられる。 また、 前記試料等を公知の方法で処 理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。 該調製物としては、 例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、 該試料中の全 RNA、 あるいは 特定の RNA分子群、 例えば、 mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。
本発明の方法に適用することができる RNAとしては特に制限はなく、 試料中の 全 RNA、 mRNA, tRNA、 rRNA等の RNA分子群、 あるいは特定の RNA分子群 （例えば、 共通の塩基配列モチーフを有する RNA分子群、 RNAポリメラ一ゼによる転写物、 サ ブトラタション法によって濃縮された RNA分子群） が挙げられ、 逆転写反応に使 用されるプライマ一が作製可能な任意の RNAが挙げられる。
本発明において铸型 RNAからの cDNA合成に使用されるプライマ一は、 铸型 RNAに 相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、 使用される反応条件にお レ、て铸型 RNAに対してァニールするものであれば特に限定されるものではない。 該プライマ一はオリゴ （dT) 等のオリゴヌクレオチドゃランダムな配列を有する オリゴヌクレオチド （ランダムプライマー） であっても良い。
前記プライマーの長さは、 特異的なアニーリングを行う観点から、 好ましくは 6ヌクレオチド以上であり、 更に好ましくは 10ヌクレオチド以上であり、 オリゴ ヌクレオチドの合成の観点から、 好ましくは 100ヌクレオチド以下であり、 更に 好ましくは 30ヌクレオチド以下である。 前記オリゴヌクレオチドは、 例えば ABI 社 （Appl ied Biosystem In ） の DNAシンセサイザー 394型を用いて、 ホスホアミ ダイ ト法により合成出来る。 他にもリン酸トリエステル法、 H-ホスホネート法、 チォホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。 また、 生 物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、 例えば天然の試料より調製し た DNAの制限ェンドヌクレアーゼ消化物から単離して作成しても良い。 前記ブラ イマ一の逆転写反応液中の濃度は、 铸型 RNAからの cDNA合成の観点から、 好まし くは 0. Ι μ Μ以上であり、 更に好ましくは 0. 5 ζ Μ以上であり、 反応阻害の観点から、 好ましくは 10 μ Μ以下であり、 更に好ましくは 5 μ Μ以下である。
本発明に用いられる逆転写活性を有する酵素としては、 RNAを鎵型とした cDNA 合成活性を有するものであれば特に限定はないが、 本発明の目的のためには、 高 温で逆転写活性を有する酵素 （すなわち、 耐熱性の逆転写酵素） が好適である。 このような酵素としては、 例えばサーマス 、The誦 s、 属細菌由来 DNAポリメラー ゼ （Tth DNAポリメラーゼ等） 、 好熱性バチルス Bacillus) 属細菌由来 DNAポリ メラーゼ等を使用できる。 Tth DNAポリメラ一ゼの逆転写活性を発揮させるため には、 反応液中にマンガンイオンの存在が必須である。 マンガンイオンは PCR反 応においてはフィデリティーの低下を招くことが知られており、 Tth DNAポリメ ラーゼでの逆転写反応液を PCRに使用する場合には、 マンガンイオンを除去する 必要がある。 好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼの場合は、 逆転写活性 のためのマンガンイオンの添加および PCRにおけるその除去は必要ではない。 こ のような観点から、 本発明には好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼが好 ましく、 更にバチルス ·カルドテナタス Bacillus caldotenax) 由来 DNAボリメ ラーゼ （以下、 Bca DNAポリメラーゼと記載する） 、 バチルス 'ステア口サーモ フィラス Bacillus stearothermophilu ) 由来の DNAポリメラーゼ （以下、 Bst DNAポリメラ一ゼと記載する） が好ましい。 これらの酵素は反応にマンガンィォ ンを必要とせず、 また、 高温条件下で铸型 RNAの二次構造形成を抑制しながら cDNAを合成することが出来る。
バチルス ·カルドテナクスは生育至適温度が約 70°Cである好熱性細菌であり、 この細菌由来の Bca DNAポリメラーゼは、 DNA依存 DNAポリメラーゼ活性、 RNA依存 DNAボリメラーゼ活性 （逆転写活性） 、 5' -3'ェキソヌクレアーゼ活性、 3， - 5'ェ キソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。
これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、 あるいは遺伝子 工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。 また、 該酵素は、 遺 伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、 欠失、 付加、 挿入等の改変を加 えたものであっても良く、 該改変された酵素として例えば 5' -3'ェキソヌクレア ーゼ活性を欠損させた Bca DNAポリメラーゼである BcaBEST DNAポリメラーゼ （宝 酒造社製） 、 5' -3'ェキソヌクレア一ゼ活性を欠損させた Bst DNAポリメラーゼで める Bst DNA polymerase, Large fragment (New England Biolabs社 ) 等;^挙 げられる。 5' - 3'ェキソヌクレアーゼ活性を欠損した上記酵素は本発明に特に好 適に使用できる。 前記逆転写活性を有する酵素の使用量は、 特に限定はないが、 例えば従来の逆 転写反応において使用されていた量を使用すれば良い。 また、 従来よりも逆転写 活性を有する酵素の量を増加させることにより、 より効率の高い cDNA合成反応を 行う事が出来、 反応時間を短縮する事も出来る。 例えば BcaBEST DNAポリメラー ゼを用いて反応液量 20 μ 1で逆転写反応を行う場合、 反応液中の該酵素量は 0. 5 U 以上であり、 cDNA合成効率の観点から、 好ましくは 22 U以上であり、 更に好まし くは 42U以上である。 なお、 本明細書に記載の DNAポリメラーゼの活性は市販の 酵素の表示に基づくものであり、 当該 DNAポリメラーゼに適した反応条件におい て、 30分間に 10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を 1 Uと 定義する。 铸型となる DNAや反応温度は DNAポリメラ一ゼに応じて適したものが使 用される。 例えば、 上記 BcaBEST DNAポリメラーゼの場合、 ポリデォキシ （ATP - TTP) を铸型 7プライマーとして用い 60°Cにおいて 30分間に 10 nmolの全ヌクレオ チドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を 1 Uと定義する。
本発明の cDNA合成方法は、 3' -5'ェキソヌクレア一ゼ活性を有する酵素の存在 下で逆転写反応を行うことを特徴とする。 本発明に用いられる 3' -5'ェキソヌク レアーゼ活性を有する酵素としては、 該活性を有していれば特に限定はなく、 例 えば 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラ一ゼを使用することがで きる。 このような酵素としては、 ピロコッカス (Pyrococcus) 属細菌由来 DNAポ リメラーゼ （Pfu DNAポリメラーゼ （Stratagene社製） 、 Pyrobest DNAポリメラ —ゼ （宝酒造社製） 、 Deep Vent DNAポリメラーゼ （New England Biolabs社製） 、
K0D DNAポリメラーゼ （東洋紡社製） 、 Pwo DNAポリメラーゼ （Boehringer社製） 等） ゃサーモコッカス属細菌由来 DNAポリメラーゼ （Vent DNAポリメラーゼ （New England Biolabs社製） 等） 等の α型 DNAポリメラーゼ、 大腸菌由来 DNAポリメラ —ゼ （ポリメラーゼ I、 クレノーフラグメント等） 、 バクテリオファージ由来 DNAポリメラーゼ （Τ4 DNAポリメラーゼ等） 等のポル I型 DNAポリメラーゼ等が挙 げられ、 好ましくは強い 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を示すひ型 DNAポリメラー ゼが用いられる。 尚、 ポル I型 DNAポリメラーゼ、 ひ型 DNAポリメラーゼはともに そのアミノ酸配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、 そのアミノ酸配 列上の特徴はヌクレイック ァシッズ リサーチ （Nucleic Acids Research) 、 第 15巻、 第 4045- 4657頁 （1991) に記載されている。
本発明の目的のためには、 RNAとハイブリッドを形成した DNAの 3 ' 末端に作用 する酵素が使用され、 更に、 高温で 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を示す酵素が 好適である。 以上の観点から超好熱性古細菌由来のひ型 DNAボリメラーゼが好ま しい。 超好熱 ¾1古細菌由来のひ型 DNAポリメラーゼとしては、 例えばピロコッカ ス属細菌由来 DNAボリメラーゼが挙げられる。
上記方法で得られた cDNAを铸型として核酸増幅反応を実施することにより、 cDNAを増幅することが出来る。 核酸増幅反応としては、 特に限定するものではな レ、が、 例えばポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法が使用される。 PCR法に使用される 酵素に特に限定はなく、 通常の PCRに使用される DNAポリメラーゼを使用すること が出来る。 上記方法で得られた cDNAは鏡型 RNAから高いフィデリティーで合成さ れたものであり、 該 RNA由来の配列を出来るだけ正確に複製する観点から、 PCRも 高いフィデリティーで行われることが望まれる。 このため、 本発明の cDNAの増幅 にはフィデリティ一の高レ、DNAポリメラーゼ、 例えば好熱性古細菌由来の α型 DNA ボリメラーゼが好適に使用される。 更に、 cDNAの合成工程において 3' -5'ェキソ ヌクレアーゼ活性を有する耐熱性の DNAポリメラーゼ （例えば、 好熱性古細菌由 来の α型 DNAポリメラーゼ） が使用される場合には、 該酵素をそのまま PCR工程に おいて使用することも可能である。 cDNA合成/増幅反応のフィデリティーは、 J. Cl ineらの方法 （ J. Cl ineら、 ヌクレイック ァシッズ リサーチ （Nucleic Acids Research) 、 第 24巻、 第 3546〜3551頁、 （1996) ) を改変した方法に基づ いて測定することができる。
これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、 あるいは遺伝子 工学的に生産された組み換えタンパク質のいずれであっても良い。 また、 遺伝子 工学的あるいはその他の手法によって置換、 欠失、 付加、 挿入等の改変を加えた ものであっても良い。 3' - 5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼは、
RNAを铸型とした場合にも、 合成される cDNAに誤って取り込まれた塩基を除去す るのに有効な校正活个生を示すことからフィデリティ一の高レ、cDNA合成が可能であ る。 前記酵素の使用量は、 ポリメラーゼ活性として、 反応液 20 μ 1中、 cDNA合成 効率の観点から好ましくは 1 U以下であり、 更に好ましくは 0. 5U以下であり、 校正活性の観点から好ましくは 0. 01 U以上であり、 更に好ましくは 0. 02U以上で ある。
本発明の方法を用いれば、 従来の逆転写方法に比べ、 cDNA合成量を増加させる ことができ、 また、 従来よりも長い鎖長の cDNAの合成が可能であり、 更に、 フィ デリティーの高い cDNA合成が可能である。 また、 本方法を関連する技術、 例えば クローニング技術、 PCR技術等と組合わせることにより、 従来よりも効率の良い cDNAライブラリー作製、 RT - PCR等が可能であり、 これにより、 従来困難であった 発現量の少なレ、mRNAのより正確な解析が可能となる。
本発明の cDNA合成キットは、 上記 cDNA合成方法に用いられるキットであり、 フ ィデリティーの高い cDNA合成を効率よく行うためのキットである。 このようなキ ットとしては、 上記の逆転写活性を有する酵素及び 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活 性を有する酵素を含有するもの等が挙げられる。 該キットは、 前記酵素を用いた cDNA合成反応に使用する反応緩衝液、 ヌクレオチドやその他の試薬を含有するも のであっても良い。 このようなキットを使用することによって、 効率が良く、 フ ィデリティーの高い cDNA合成を容易に行うことができる。
本発明の cDNA増幅キットは、 上記 cDNA増幅方法に用いられるキットであり、 フ ィデリティーの高い cDNA増幅を効率よく行うためのキットである。 このようなキ ットとしては、 上記の逆転写活性を有する酵素、 3'- 5'ェキソヌクレアーゼ活性を 有する酵素並びに遺伝子増幅反応を行うための試薬を含有するものが挙げられる。 cDNAを鍀型とする遺伝子増幅反応として PCRを用いる場合、 増幅反応に使用する 試薬としては、 耐熱性の DNAポリメラーゼ、 反応緩衝液、 ヌクレオチドやその他 の試薬、 が挙げられる。 このようなキットを使用することによって、 効率が良く、 フィデリティーの高い cDNA増幅を容易に行うことができる。 上記のように、 cDNA の合成工程において 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性の DNAポリメラ ーゼ （例えば、 好熱性古細菌由来のひ型 DNAポリメラーゼ） が使用される場合に は、 該酵素をそのまま PCR工程における増幅反応のための DNAポリメラーゼとして 使用することも可能である。 実施例 次に、 本発明を実施例により更に具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施 例によって限定されるものではない。
尚、 下記実施例において、 各酵素の活性は各酵素に添付の説明書の表示に基づ レ、 - 実施例 1 RNAの調製
以下の実施例に使用する RNAは、 特に断らない限り、 ヒ ト培養細胞 U - 937 (ATCC CRL-1593) 力 らトライゾール試薬 （ライフテック社製） を使用し、 該試薬添付の 説明書記載の操作により調製後、 濃度を 0. 66 μ § / μ 1に調製したものである。 RNAの純度は、 0D Z0D28Q= L 7であった。 実施例 2 BcaBEST DMポリメラーゼ及び Pyrobest DNAポリメラーゼの組合わせ による効果
cDNA合成における 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の添加の効果を、 逆転写酵素として 5' -3'ェキソヌクレアーゼ活性を欠損させたバチルス .力ルド テナクス由来 DNAポリメラーゼ （BcaBEST DNAポリメラーゼ 宝酒造社製） 、 3' -
5'ェキソヌクレアーゼとしてピロコッカス スピーシーズ （ ^KTOCOCCiAS sp. ) 由 来 DNAポリメラーゼ （Pyrobest DNAポリメラーゼ 宝酒造社製） を用いて検討し た。
cDNA合成反応は BcaBEST RNA PCR Kit (Ver. 1. 1) (宝酒造社製） を使用して 行った。 当該キッ トのマニュアルに従って、 下記に記載の酵素とオリゴ dT
(ol igo dT) プライマーを含む反応液 20 / lを調製した。 これらの反応液を PCRサ 一マルサイクラ一 パーソナル （宝酒造社製） にセットし、 60°Cで 1分、 2分、 3 分、 4分で逆転写反応を行い、 各々の反応時間の後、 98°C、 5分間の熱処理を行つ た。 酵素 1 BcaBEST DNAポリメラーゼ 22 U /反応系
酵素 2 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42 U /反応系
酵素 3 BcaBEST DNAポリメラーゼ 22 U + Pvrobest DNAポリメラ一ゼ 0. 017 UZ反応系
酵素 4 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42 U + Pyrobest DNAポリメラ一ゼ
0. 033 UZ反応系 次に Pyrobest DNAポリメラーゼを用いて、 上記逆転写反応液 20 μ 1をサンプル としてトランスフェリンレセプター mRNA中の 4. 4 kbを標的とする PCRを行った。 PCRは Pyrobest DNAポリメラーゼのマニュアルに従って、 上記逆転写反応液 20 μ 1 , トランスフェリンレセプター増幅用プライマー 1 (配列番号 1 ) 及びトランスフ エリンレセブター増幅用プライマ一 2 (配列番号 2 ) を含む ΙΟΟ μ Ιの反応液を調 製し、 PCRサーマルサイクラ一 パーソナルにセットし、 94°C、 30秒〜 65°C、 30 秒〜 72°C、 5分を 1サイクルとした 30サイクルの PCRを実施した。
PCR後、 得られた反応液の 8 μ 1をァガロース L03 (宝酒造社製） を使用した 1 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 PCR産物の量は、 電気泳動後のァガ口一 スゲルをェチジゥムブ口マイ ド染色した後、 蛍光イメージアナライザ一である FMBI0 II Multi-View (宝酒造社製） にて蛍光の強度を数値化して評価した。 酵 素 1、 逆転写反応時間 3分の条件で得られた RT-PCR増幅産物の蛍光強度を 1. 00と して全サンブルについての値を換算した結果を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000011_0001
n . d . ：検出限界以下
BcaBEST DNAポリメラーゼ 22 し 42 U何れの場合も、 3' -5'ェキソヌクレア一 ゼ活性を有する Pyrobest DNAボリメラーゼを添加する事により、 cDNA合成効率が 上昇した （表 1、 酵素 3および 4 ) 。 又、 その効率の上昇は BcaBEST DNAポリメ ラーゼを 42 U使用した場合 （表 1、 酵素 4 ) 、 特に顕著であった。 これらのこと力、ら、 逆転写反応時に 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵 素を添加する事で cDNA合成効率が上昇する事が示された。 更に、 逆転写活性を有 する酵素を大量に用いる事で更に効率が高まる事が示された。
対照実験として、 ベーリンガ一社製の Ti tan RT-PC Ki tを使用した cDNA合成を 行った。 該キットは逆転写活性を有する酵素として AMV- RTase、 3' -5'ェキソヌク レアーゼ活性を有する酵素としてピロコッカス · ゥォェシィ Pyrococcus woesii) 由来の Pwo DNAボリメラーゼを含んでいる。
該キットのマニュアルにしたがって 50°C、 30分の cDNA合成反応を行なった。 次 いでマニュアルに従って 94°C、 2分間の熱処理を行なった後、 トランスフェリン レセプ'ター11^ 中の4. 4 kbを標的とする PCRを該キットのマニュアルにしたがつ て、 Taq DNAポリメラ一ゼ /Pwo DNAボリメラーゼを用いて行なった。 94t：、 30秒 〜55DC、 30秒〜 68°C、 4分を 1サイクルとした PCRを 10サイクル行った後、 94°C、 30秒〜 55。C、 30秒〜 68°C、 4分 5秒 （11サイクル目） 、 94°C、 30秒〜 55°C、 30秒〜 68°C、 4分 10秒 （12サイクル目） 、 94°C、 30秒〜 55°C、 30秒〜 68°C、 4分 15秒 ( 13サイクル目） 、 のように、 伸長ステップの時間を 1サイクル毎に 5秒ずつ長 く した PCRを 25サイクル行なった。
RT-PCR産物は 1 %ァガロースゲル電気泳動に供したが、 逆転写反応を 30分間行 なっているにも関わらず、 ターゲットである 4. 4 kbの増幅産物は検出されなかつ た。 実施例 3 BcaBEST DNAポリメラーゼと Deep Vent DNAボリメラーゼとの組合わせ の効果
3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素として、 ピロコッカス スピーシ ーズ GB- D由来の Deep Vent DNAポリメラーゼ （ニューイングランド バイオラボ社 製） を用いた場合の効果を検討した。
下記の酵素を使用し、 実施例 2と同様の実験を行った。
BcaBEST DNAボリメラーゼ 42 U /反応系
酵素 2 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42 U + Deep Vent DNAポリメラーゼ 0. 033 UZ反応系
酵素 3 BcaBEST DNAポリメラ一ゼ 42 U + Deep Vent DNAポリメラーゼ 0. 067 Uノ反応系 得られた結果を表 2に示す。 （酵素 1、 逆転写反応時間 2分での結果を 1. 0と した。 ） 表 2
Figure imgf000013_0001
n . d . ：検出限界以下 以上の結果より、 3' - 5'ェキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素として Pyrobest DNAポリメラーゼに代えて Deep Vent DNAポリメラーゼを用いた場合にも、 cDNA合 成効率が上昇することが示された。 実施例 4 Bst DNA polymerase, Large fragment Pyrobest 腿ポリメラーゼの 組合わせの効果
逆転写活性を有する酵素として、 5' - 3'ェキソヌクレアーゼ活性を欠損させた バチルス ' ステアロサ一モフィラス由来 DNAポリメラーゼ （Bst DNA polymerase, Large fragment ニューイングランド バイオラボ社製） を用いた場合の効果を 検討した。
下記の酵素を使用し、 逆転写反応時間を 10分とした以外は実施例 2と同様に逆 転写反 I：、を ί"丁った。 酵 1 Bst DNA polymerase, Large fragment 8 U /反 糸
酵素 2 Bst DNA polymerase, Large fragment 8 U + Pyrobest DNAポジメラ ーゼ 0. 01 U /反応系 酵素 3 Bst DNA polymerase, Large fragment 8 U + Pyrobest DNAポリメラ ーゼ 0. 005 U ノ反応系
酵素 4 Bst DNA polymerase, Large fragment 8 U + Pyrobest DNAポリメラ ーゼ 0. 0033 U /反応系 次に、 トランスフェリンレセプター mRNA中の 2. 4 kbを標的とする PCRを行った。 プライマーとしてトランスフェリンレセプター増幅用プライマー 2 (配列番号 2 ) 及びトランスフェリンレセブター増幅用プライマー 3 (配列番号 3 ) を用い、 反応条件を 94"C、 30秒〜 65°C、 30秒〜 72°C、 3分の温度サイクルを 30サイクルと した以外は、 実施例 2と同様に行った。 得られた結果を表 3に示す。 （酵素 1で の結果を 1. 00とした。 ） 表 3
Figure imgf000014_0001
以上の結果より、 逆転写活性をもつ酵素として BcaBEST DNAポリメラーゼに代 えて Bst DNA polymerase, Large fragmentを用いた逆転写反応の場合にも、 3' - 5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加する事で cDNA合成効率が上昇する ことが示された。 実施例 5 cDNA合成におけるフィデリティーに対する 3' -5'ェキソヌクレアーゼ 活性の効果
cDNA合成におけるフィデリティ一に対する 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性の効 果を、 逆転写活性を有する酵素として BcaBEST DNAポリメラーゼ、 3' - 5'ェキソヌ クレアーゼ活^を有する酵素として Pyrobest DNAポリメラーゼを用いて、 J. Cl ineらの方法 （ J. Cl ineら、 ヌクレイック ァシッズ リサーチ （Nucleic
Acids Research) 、 第 24卷、 第 3546〜3551頁、 （1996) ) を改変した方法に基づ いて検討した。
cDNA合成の鎵型 RNAとしては、 SP6 RNAポリメラ一ゼ （宝酒造社製） によって以 下のように合成した lacIOZ a RNAを使用した。
lacIOZ aは大腸菌 （£ coli) ラタ トースォペロンの一部であり、 リプレッサ 一領域 （I) 、 オペレーター領域 （0) 、 lacZ a因子領域 （Z) を含む。
大腸菌のゲノム DNAを铸型として lacIOZひ- Fプライマー （配列番号 4 ) 、 及び lacIOZ a - Rプライマー （配列番号 5 ) を用いた PCRを行い、 lacIOZひ領域の増幅 断片を得た。 得られた増幅断片 （約 1. 9 kb) を SP6プロモーターを持つプラスミ ド pSCREEN- T'™-1 T- Vector (Novagen社製） に TAクローニングし、 SP6プロモータ 一の下流に lacIOZ a領域が結合したプラスミ ドを得た。 このプラスミ ドを制限酵 素 Xho l (宝酒造社製） で消化して得られた直鎖状 DNAを錄型として用い、
Competitive RNA Transcription Kit (宝酒造社製） を使用して、 以下のように SP6 RNAポリメラーゼを用いて SP6プロモーター領域からの RNA合成を行った。
Competitive RNA Transcription Kitのマ二ユアノレに従って、 直鎖状 lacIOZひ— pSCREEN-T DNA 200 ngを含む反応液 50 μ 1を調製し、 37°Cで 2時間反応させ、
RNAを合成した。 反応後、 DNase l (宝酒造社製） を 10U添加し、 さらに 37°Cで 1 時間静置し DNAを分解させた。 その後、 フエノール'クロ口ホルム処理、 ェタノ ール沈殿により合成 RNAを精製した。 このようにして得られた 1991ベースの lacIOZ a RNA (SP6プロモーター、 リプレッサー領域 （I) 、 オペレーター領域
(0) 、 lacZ a因子領域 （Z) を含む） を铸型 RNAとして用いて、 以下の実験を行 つた。
BcaBEST RNA PCR Kitのマニュアルに従って、 lacIOZひ RNA 450 ng、 lacIOZ ひ - Rプライマー 20pmol 、 及び下記に記載の酵素を含む反応液 20 μ ΐを調製した。 これらの反応液を PCRサーマルサイクラ一 パーソナル （宝酒造社製） にセット し、 65°Cで 1分間、 30°Cで 1分間保温した後、 15分かけて温度を 30°Cから 65°Cま で上昇させ、 その後 65°Cで 15分間保温して逆転写反応を行い、 最後に 98°C、 5分 間の熱処理を行った。 酵素 1 BcaBEST DNAボリメラーゼ 42 U/反応系 酵素 2 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42 U/反応系 + Pyrobest DNAボリメラー ゼ 0. 033 U/反応系 次に Pyrobest DNAポリメラーゼを用いて、 上記逆転写反応 2. 5 μ 1をサンブルと して、 lacIOZ a領域 1. 9 kbを標的とする PCRを行った。 PCRは Pyrobest DNAボリ メラーゼのマニュアルに従って、 上記逆転写反応液 2. 5 μ 1、 lacIOZひ - Fプライマ 一、 lacIOZひ - Rプライマーを含む反応液 100 μ 1を調製し、 PCRサ一マルサイクラ 一 パーソナルにセットし、 94°C、 30秒〜 68°C、 2分を 1サイクルとした 28サイ クルの PCRを実施した。
PCR後、 得られた反応液をフエノール 'クロ口ホルム処理、 エタノール沈殿し、 増幅産物を精製した。 この増幅産物を制限酵素 EcoR I (宝酒造社製） で処理した 後、 全量をァガロースゲル電気泳動し、 泳動後、 EcoR I処理断片のバンドを切 り出し、 EasyTrap (宝酒造社製） を用いて EcoR I処理断片を回収した。 この EcoR I処理断片とえ gt lO EcoR 1 Arms (宝酒造社製） を Ligation Kit ver. 2 (宝酒造 社製) を用レヽて連結させ、 Gigapack III gold packaging extract (Stratagene 社製） を用いてインビトロノ ッケージング （in vitro packaging) を行った。 得られた各パッケージング溶液を段階希釈した稀釈液 ΙΟΟ μ Ιを、 大腸菌 （£ coll) DH5 a株 （lacZ AM15) 培養液 （0D600= 1) ΙΟΟ μ Ιに添加し、 37°Cで 15分間 静置した。 次のこの培養液全量を X- gal ( 1 mg/ml) 及び IPTG (1. 5 mM) を含む 0. 7%LBソフトァガー （soft agar) (IPTG (+) ) 、 又は X- galを含み IPTGを含ま ない 0. 7%LBソフトァガー （IPTG (—） ) に加え、 混和後 LBプレート上に重層し た。 このプレートを 37CCでー晚培養し、 出現したプラーク数を数えた。
lacIOZ領域の lac Iに変異がない場合、 lac Iにコードされているリブレッサー の働きにより IPTG非存在下では βガラク トシダーゼが発現せず、 白いプラークを 生じ、 IPTG存在下で初めて ガラク トシダーゼが発現し、 青いプラークを生じる 一方、 lacIOZ領域の lac Iに変異が導入された場合、 lac Iにコードされているリ プレッサーがその活性を失い、 IPTG非存在下においても i3ガラク トシダーゼが発 現するため、 ITPG ( + ) 、 IPTG (―) 何れのプレートにおいても青いプラークを 生じる。 IPTG (+)
変異なし 冃 白
変異あり 冃 冃 従って、 IPTG (—） プレートに生じる青プラークは変異が導入されたクローン であり、 変異率 （m f ) は下記式に示すように IPTG (—） プレートに生じた青プ ラーク数を IPTG ( + ) プレートに生じた青プラーク数で除することによって求め ることができる。 変異率 （m f ) = IPTG (—） プレートに生じた青プラーク数
IPTG ( + ) プレートに生じた青プラーク数 結果を表 4に示す 表 4
Figure imgf000017_0001
逆転写反応を BcaBEST DNAポリメラーゼのみの存在下で行った場合の変異率 (m f ) 力 0. 229であるのに対して、 逆転写反応を BcaBEST DNAポリメラーゼ及 び Pyrobest DNAポリメラーゼの存在下で行った場合の変異率 （m f ) は 0· 133で あり、 Pyrobest DNAポリメラーゼが存在しない場合の約 2倍のフィデリティ 一を示した。
このことから、 逆転反応時に 3' -5'ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を存 在させることで cDNAの合成効率のみならずフイデリティーも上昇することが明ら かとなつた。 産業上の利用の可能性
本発明は、 反応効率が良く、 かつフィデリティーが高い cDNA合成を可能にする 方法である。 本方法は、 関連する技術、 例えばクローニング技術、 PCR技術等と 組合わせることが可能であり、 このことによって従来よりも効率の良く、 かつ正 確な cDNAライブラリ一作製、 RT-PCR等が可能となり、 mRNAの解析方法の向上をも たらす。 配列表フリーテキスト
c5i£Q ID NO: 1: Designed oligonucleotide primer designated as Primer 1 to amplify transferrin receptor mRNA.
SEQ ID NO: 2： Designed oligonucleotide primer designated as Primer 2 to amplify transferrin receptor mRNA.
SEQ ID NO: 3： Designed oligonucleotide primer designated as Primer 3 to amplify transferrin receptor mRNA.
SEQ ID NO: 4: Designed oligonucleotide primer designated as lacIOZひ - F to amplify lacIOZ a region of E. coli.
SEQ ID NO: 5: Designed oligonucleotide primer designated as lacIOZひ一 R to amplify lacIOZ a region of E. coli.

Claims

請 求 の 範 囲
I . 逆転写活性を有する酵素、 及び、 該酵素とは異なる酵素であって 3 ' —
5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写反応を行うことを特 徴とする c DNAの合成方法。
2. 逆転写活性を有する酵素が耐熱性の逆転写酵素である、 請求項 1記載の c DN Aの合成方法。
3. 逆転写活性を有する酵素が好熱性バチルス属細菌由来の DN Aポリメラー ゼであることを特徴とする請求項 2記載の c D N Aの合成方法。
4. 逆転写活性を有する酵素が、 バチルス ·力ルドテナタス由来の DNAポリ メラーゼ又はバチルス ·ステアロザーモフィラス由来の DNAポリメラーゼであ ることを特徴とする請求項 3記載の c D N Aの合成方法。
5. 3 ' - 5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、 DN Aボリメラーゼ であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか 1項記載の c DN A合成方法。
6. 3 ' - 5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、 好熱性古細菌由来の ひ型 DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項 5記載の c DNA合成方 法。
7. 請求項 1〜6のいずれか 1項記載の方法で合成された c DNAを铸型とし て遺伝子増幅反応を実施することを特徴とする c DN Aの増幅方法。
8. 遺伝子増幅方法が P C Rであることを特徴とする請求項 7記載の c D N A の増幅方法。
9. P C Rのための DNAポリメラーゼが 3 ' — 5 ' ェキソヌクレアーゼ活性 を有する酵素と同じであることを特徴とする請求項 8記載の c DNAの増幅方法。
1 0. P CRのための DNAポリメラーゼが古細菌由来の α型 DNAポリメラ ーゼであることを特徴とする請求項 9記載の c D Ν Αの増幅方法。
I I . c DNAを合成するためのキットであって、 逆転写活性を有する酵素、 及び、 該酵素とは異なる酵素であって 3 ' - 5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有す る酵素を含有することを特徴とする c DNA合成キット。
1 2. 逆転写活性を有する酵素が耐熱性の逆転写酵素である、 請求項 1 1記載 の c DNA合成キット。
1 3. 逆転写活性を有する酵素が好熱性バチルス属細菌由来の D N Aボリメラ ーゼであることを特徴とする請求項 1 2記載の cDN A合成キット。
14. 逆転写活性を有する酵素がバチルス ·力ルドテナクス由来の DN Aポリ メラーゼ又はバチルス ·ステアロサーモフィラス由来の DNAポリメラーゼであ ることを特徴とする請求項 1 3記載の c DN A合成キット。
1 5. 3， 一 5， ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が DNAポリメラーゼ であることを特徴とする請求項 1 1〜14のいずれか 1項記載の c DN A合成キ ッ卜
1 6. 3 ' —5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が古細菌由来のひ型 D
NAボリメラーゼであることを特徴とする請求項 1 5記載の c DNA合成キット
1 7. 請求項 1〜6のいずれか 1項記載の方法で合成された c DN Aを铸型と して遺伝子増幅反応を実施し、 c DN Aを増幅するために用いられるキットであ つて、 逆転写活性を有する酵素、 及び、 該酵素と異なる酵素であって 3 ' — 5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、 並びに遺伝子増幅反応のための試薬を含 有することを特徴とする cDNA増幅キット。
1 8. 遺伝子増幅反応が PC Rであることを特徴とする請求項 1 7記載の c D N A増幅キット。
1 9. 遺伝子増幅反応のための試薬として PC Rのための DN Aポリメラーゼ を含有することを特徴とする請求項 1 8記載の c DNA増幅キット。
20. PCRが 3' — 5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラ一 ゼで行われ、 該 3' —5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と PC Rのため の DNAポリメラーゼとが同一であることを特徴とする請求項 1 9記載の c DN A増幅キット。
21. 3' — 5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する DN Aポリメラーゼが古細 菌由来の α型 D N Aボリメラーゼであることを特徴とする請求項 20記載の c D N A増幅キット。
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