CN117701699A - 一种x性连锁鱼鳞病检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种X连锁鱼鳞病相关STS基因的拷贝数检测引物组及使用方法、试剂盒，所述引物组包括针对STS基因的扩增引物和探针，以及针对内参基因rpp40的扩增引物和探针。所述寡核苷酸探针为SEQ ID NO.1～xx所示的核苷酸序列；所述使用方法包括如下步骤：(a)制备样品DNA片段，(b)配置数字PCR反应体系并上机检测，(c)根据STS与内参基因的检出数量计算STS相对拷贝数；本发明还涉及包含前述引物组的试剂盒。本发明的操作步骤简单，从样本抽提到结果判读可在8个小时内完成；反应体系不涉及复杂的连接酶或者大量探针，成本低；适用于临床患者辅助诊断、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是利用数字PCR技术对STS基因拷贝数进行检测，用于X-性连锁鱼鳞病的检测及相关基因携带人群的筛查。
背景技术
X-连锁鱼鳞病为X染色体连锁隐性遗传性鱼鳞病的重要类型，又称隐形遗传X-连锁鱼鳞病(recessive X-linked ichthyosis，XLI)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(steroidsulfatase deficiency)、黑鱼鳞病，该病主要发生于男性，仅由异性合子的母亲传给男性胎儿，女性仅属携带者发病极少。全球范围男性新生儿发病率约1/2 000～1/9 500。常于出生时或出生后不久发病，表现为全身皮肤干燥、粗糙、黑褐色鳞屑，主要累及肢体伸侧和躯干侧面，颈部、面及耳部。
目前对X-连锁鱼鳞病的发病机制有较深入的研究，是由编码类固醇硫酸盐的类固醇硫酸酯酶基因(STS)的缺失或突变引起的遗传病，该基因位于Xp22.31，共有10个外显子，编码类固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase，STS)。STS广泛分布于包括胎盘、皮肤、阴道、乳腺、血液、肝脏、脑等人体各组织器官，并被证实与XLI的发病机制相关。
发明内容
本发明在于提供一种基于微滴数字PCR(ddPCR)的引物探针组合及试剂盒，用于STS基因拷贝数检测。为X-连锁鱼鳞病的检测或STS拷贝数变异携带者的筛查的提供一种灵敏度高、特异性强、检测通量高、检测流程快速便捷的检测方法。
一方面，本发明提供了一组引物探针组合，所述的引物探针组合包括检测STS基因第一外显子扩增和检测组合PCR_Exon1_F(SEQ ID NO:1)、PCR_Exon1_R(SEQ ID NO:2)和Probe_Exon1(SEQ ID NO:3)；第二外显子扩增和检测组合PCR_Exon2_F(SEQ ID NO:4)、PCR_Exon2_R(SEQ ID NO:5)和Probe_Exon2(SEQ ID NO:6)；第三外显子扩增和检测组合PCR_Exon3_F(SEQ ID NO:7)、PCR_Exon3_R(SEQ ID NO8)和Probe_Exon3(SEQ ID NO:9)；第四外显子扩增和检测组合PCR_Exon4_F(SEQ ID NO:10)、PCR_Exon4_R(SEQ ID NO:11)和Probe_Exon4(SEQ ID NO:12)；第五外显子扩增和检测组合PCR_Exon5_F(SEQ ID NO:13)、PCR_Exon5_R(SEQ ID NO:14)和Probe_Exon5(SEQ ID NO:15)；第六外显子扩增和检测组合PCR_Exon6_F(SEQ ID NO:16)、PCR_Exon6_R(SEQ ID NO:17)和Probe_Exon6(SEQ ID NO:18)；第七外显子扩增和检测组合PCR_Exon7_F(SEQ ID NO:19)、PCR_Exon7_R(SEQ ID NO:20)和Probe_Exon7(SEQ ID NO:21)；第八外显子扩增和检测组合PCR_Exon8_F(SEQ ID NO:22)、PCR_Exon8_R(SEQ ID NO:23)和Probe_Exon8(SEQ ID NO:24)；第九外显子扩增和检测组合PCR_Exon9_F(SEQ ID NO:25)、PCR_Exon9_R(SEQ ID NO:26)和Probe_Exon9(SEQ IDNO:27)；第十外显子扩增和检测组合PCR_Exon10_F(SEQ ID NO:28)、PCR_Exon10_R(SEQ IDNO:29)和Probe_Exon10(SEQ ID NO:30)；所述引物探针涉及STS基因(Genbank登录号：NG_021472.2)10个外显子区域，具体序列如下表一所示：
表一STS基因外显子检测引物探针组合及序列表
在一些实施例中，根据不同型号数字PCR仪的荧光通道数，可以从上述10组外显子检测引物探针组合中任意选择1种，或2种，或3种，或4种，或5种外显子扩增检测引物探针组合。
另一方面，本发明还提供了用于人内参基因rpp40的扩增和检测，包括：PCR_rpp40_F(SEQ ID NO:31)、PCR_rpp40_R(SEQ ID NO:32)和Probe_rpp40(SEQ ID NO:33)，具体序列如下表二所示。以rpp40的检出数量作为参考对象可以计算出STS基因外显子的拷贝数。
表二rpp40基因外显子检测引物探针组合及序列表
| 序列编号 | 序列名称 | 核苷酸序列 |
| SEQ ID NO:31 | PCR_rpp40_F | CAGCGTAATCTGCCTAAA |
| SEQ ID NO:32 | PCR_rpp40_R | GCTTCCTATCCTCCAAAA |
| SEQ ID NO:33 | Probe_rpp40 | ACACCATAATTCCTGATGACTTGATCC |
另一方面，本发明提供了一种试剂或试剂组合，其包含前述发明内容中的引物探针和/或其组合。
另一方面，本发明提供了一种用于STS基因的拷贝数检测的试剂盒，其包含前述试剂或试剂组合及数字PCR反应预混液。
在一些优选的实施例中，所述数字PCR反应预混液，包括：Buffer、Mg2+、dNTPs、热启动Taq酶中的一种或多种。
另一方面，本发明提供了一种X连锁鱼鳞病或其携带人群的筛查方法：首先，使用核酸抽提试剂对样本进行DNA抽提；其次用前述发明方案中的检测试剂或试剂盒对STS基因外显子以及内参基因进行数字PCR检测；然后根据TS基因外显子以及内参基因的比值确定STS基因的拷贝数，进而对X连锁鱼鳞病或其携带人群进行风行评估。
相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
1、STS基因全长约136kb，基因片段长度长，外显子数量多，少量患者仅存在部分基因缺失。本发明采用微滴数字PCR方法检测STS基因外显子以及内参基因，通过多通道的荧光探针标记实现了对3到5个STS基因外显子及1个内参基因点的同时检测，兼顾了检测对象覆盖的全面性和检测结果的准确性。
2、独特的引物设计，避免Y染色体上STS假基因的干扰。
3、相比现有的STS基因的拷贝数检测方法，如MLPA、基因芯片、高通量测序等，本技术方案操作简便、检测速度快、成本低，有利于X连锁鱼鳞病检测或其携带人群筛查的大规模推广。
附图说明
图1为女性基因组DNA STS基因第一到第四号外显子检测图；
图2为男性基因组DNA STS基因第一到第四号外显子检测图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1 STS基因拷贝数检测
1.引物探针设计
在NCBI网站查找并下载STS基因(Genbank登录号：NG_021472.2)中第一到第四个外显子序列设计引物探针，对外显子长度较小的二、三、四号外显子适当拓展两侧内含子序列便于进行引物设计。在NCBI网站查找并下载rpp40基因(Genbank登录号：NM_006638.4)序列并进行引物设计。具体引物探针信息如下：
2.正常人STS基因拷贝数检测
(1)配置20μL ddPCR扩增体系：2×ddPCR SuperMix(no UNG)10μL，100μmol/L上下游引物各0.15μL，10μmol/L的探针各0.6μL，DNA模板1μL，加蒸馏水补足至20μl。其中DNA模板分别采用男性基因组DNA(G1471，Promega)和女性基因组DNA(G1521，Promega)。
(2)微滴制备：将配好的20μL ddPCR反应体系转移至微滴发生卡上，微滴发生器(Bio-Rad)在2.5分钟内将每个20μL反应液分成20000个微滴。
(3)ddPCR扩增：将步骤(2)生成的微滴转移到96孔板上，并置于A300 PCR扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)上，按照表3所列的条件进行PCR扩增，变温速率设置为2℃/s。
表三ddPCR扩增反应条件
(4)信号收集：PCR扩增完成后，将96孔板放入plate holder中组装好，平稳放入微滴读取仪进行检测。其中女性基因组DNA检测结果如图1所示，男性基因组DNA检测结果如图2所示。
(5)数据分析：分别将Exon1、Exon2、Exon3、Exon4检出reads数与rpp40检出reads数相除计算比值，从而确定各个外显子的拷贝数。以第一外显子拷贝数计算公式举例说明上述计算方法：
根据上述方法计算得到，女性基因组DNA中STS基因第一道第四号外显子拷贝数分别为1.87、2.11、2.10、1.96；男性基因组DNA中STS基因第一道第四号外显子拷贝数分别1.18、1.07、0.93、0.92。
实施例2人血液样本X性连锁鱼鳞病检测
1.全血样本的收集和DNA提取
收集正常人、x性连锁鱼鳞病人(STS基因拷贝数为0)、x性连锁鱼鳞携带者(STS基因拷贝数为)的全血样本，采用天根“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)”提取KYSE150细胞株和HEEC细胞株DNA，具体实验步骤参考试剂盒说明书，抽提的DNA，使用NanoDrop 2000测定DNA浓度，DNA浓度需满足以下要求：1)浓度≥5ng/μL；2)纯度1.6≤A260/280≤2.1；3)A260/230≥0.4。可替代的，样本类型还可以是血斑、唾液、口腔拭子中的样本。
2.引物探针的选择
考虑到有患者缺失基因位于外显子10、2-5、5-10、7-10等不同片段，选取外显子一、外显子三、外显子五、外显子七和外显子十作为检测对象，具体引物探针信息如下：
3.STS基因拷贝数检测
使用上述引物探针组合，按照实施例1中STS基因拷贝数检测方法对提取的DNA样本进行检测，检测结果如下表所示：
绝对拷贝数和计算拷贝数的对应关系如下表所示：
| 计算拷贝数(CN) | 绝对拷贝数 |
| CN＜0.3 | 0拷贝 |
| 0.76＜CN＜1.22 | 1拷贝 |
| CN＞1.77 | 2拷贝 |
| 其余 | 无法判断 |
4.根据上述计算关系及疾病致病原理，X连锁鱼鳞病患病或携带情况的判读标准如下表所示：
| 检测结果 | 患病风险判别 |
| 所有被检测外显子拷贝数均大于1.77 | 极有可能是健康人 |
| 任意一个被检测外显子拷贝数介于0.76和1.22之间 | 极有可能是X连锁鱼鳞病携带者 |
| 任意一个被检测外显子拷贝数介于小于0.3 | 极有可能是X连锁鱼鳞病患者 |
最后应说明的是，上述技术方案只是本发明的一种实施方式，对于本领域内的技术人员而言，在本发明公开了应用方法和原理的基础上，很容易做出各种类型的改进或变形，而不仅限于本发明上述具体实施方式所描述的方法，因此前面描述的方式只是优选的，而并不具有限制性的意义。
Claims (8)
1.一种X连锁鱼鳞病相关STS基因的拷贝数检测引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合用于STS基因第一外显子到第十外显子的扩增和检测，包括：
第一外显子扩增和检测组合PCR_Exon1_F(SEQ ID NO:1)、PCR_Exon1_R(SEQ ID NO:2)和Probe_Exon1(SEQ ID NO:3)；
第二外显子扩增和检测组合PCR_Exon2_F(SEQ ID NO:4)、PCR_Exon2_R(SEQ ID NO:5)和Probe_Exon2(SEQ ID NO:6)；
第三外显子扩增和检测组合PCR_Exon3_F(SEQ ID NO:7)、PCR_Exon3_R(SEQ ID NO8)和Probe_Exon3(SEQ ID NO:9)；
第四外显子扩增和检测组合PCR_Exon4_F(SEQ ID NO:10)、PCR_Exon4_R(SEQ ID NO:11)和Probe_Exon4(SEQ ID NO:12)；
第五外显子扩增和检测组合PCR_Exon5_F(SEQ ID NO:13)、PCR_Exon5_R(SEQ ID NO:14)和Probe_Exon5(SEQ ID NO:15)；
第六外显子扩增和检测组合PCR_Exon6_F(SEQ ID NO:16)、PCR_Exon6_R(SEQ ID NO:17)和Probe_Exon6(SEQ ID NO:18)；
第七外显子扩增和检测组合PCR_Exon7_F(SEQ ID NO:19)、PCR_Exon7_R(SEQ ID NO:20)和Probe_Exon7(SEQ ID NO:21)；
第八外显子扩增和检测组合PCR_Exon8_F(SEQ ID NO:22)、PCR_Exon8_R(SEQ ID NO:23)和Probe_Exon8(SEQ ID NO:24)；
第九外显子扩增和检测组合PCR_Exon9_F(SEQ ID NO:25)、PCR_Exon9_R(SEQ ID NO:26)和Probe_Exon9(SEQ ID NO:27)；
第十外显子扩增和检测组合PCR_Exon10_F(SEQ ID NO:28)、PCR_Exon10_R(SEQ IDNO:29)和Probe_Exon10(SEQ ID NO:30)。
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括用于人内参基因rpp40的扩增和检测，包括：PCR_rpp40_F(SEQ ID NO:31)、PCR_rpp40_R(SEQ ID NO:32)和Probe_rpp40(SEQ ID NO:33)。
3.一种X连锁鱼鳞病相关STS基因的拷贝数检测的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)从样本中提取基因组DNA；
(2)配置数字PCR反应体系并上机测试，数字PCR反应体系中的引物探针组合来自权利要求1中1种、或2种、或3种、或4种、或5种外显子扩增检测引物探针组合，和权利要求2中的引物探针组合；
(3)根据不同外显子的检测与内参基因检测数量的比值判断STS基因的拷贝数。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，样本类型是全血、血斑、唾液、口腔拭子中的一种或多种。
5.一种用于STS基因的拷贝数检测的试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1到2任一项所述的引物探针组合。
6.如权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，还包含样本保存试剂、样本DNA提取试剂、数字PCR扩增试剂中的一种或多种。
7.如权利要求1到2所述的引物探针组合在制备用于X连锁鱼鳞病辅助诊断或STS拷贝数变异携带者筛查的试剂盒中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述X连锁鱼鳞病辅助诊断或STS拷贝数变异携带者筛查包含以下步骤：
(1)利用权利要求3所述方法检测样本中STS基因外显子和内参基因rpp40的数量；
(2)假设内参基因rpp40拷贝数为2，STS基因不同外显子和内参基因rpp40数量的比值换算STS基因不同外显子的拷贝数；
(3)X连锁鱼鳞病或携带者风险评估：任意一个STS基因外显子拷贝数小于0.3，则X连锁鱼鳞病患病风险高；任意一个STS基因外显子拷贝数介于0.76与1.22之间，则X连锁鱼鳞病携带风险高；所有STS基因外显子拷贝数大于1.77，则X连锁鱼鳞病患病或携带风险低。
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