KR102186011B1 - Abl1 유전자의 다형성 소위성을 이용한 dna 타이핑 키트 및 암 진단용 키트 - Google Patents

Abl1 유전자의 다형성 소위성을 이용한 dna 타이핑 키트 및 암 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ABL1(Abelson murine leukemia viral oncogene 1) 유전자의 다형성 소위성을 이용한 DNA 타이핑 키트 및 암 진단용 키트 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다. 본 발명의 ABL1 유전자 내의 다형성 소위성 ABL1-MS1(minisatellite)은 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되므로, 이를 DNA 타이핑함으로써 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, ABL1-MS1 다형성 소위성 영역에서 14, 15 또는 16번 반복되는 대립형질을 가지는 경우 암에 대하여 그 감수성이 정상인보다 높게 나타남에 따라, ABL1-MS1 다형성 소위성은 암에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서 예측 진단에 중요한 자료로 유용하게 사용될 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ABL1 유전자의 다형성 소위성을 이용한 DNA 타이핑 키트 및 암 진단용 키트{DNA Typing Kits and Diagnostic Kits for Detecting Cancer using Minisatellites of ABL1 Gene}
본 발명은 ABL1 유전자의 다형성 소위성을 이용한 DNA 타이핑 키트 및 암 진단용 키트 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다.
ABL1 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog1) 유전자는 다른 단백질을 인산화 시켜 활성을 변화시키는 효소인 kinase로서 기능을 하며 인간의 백혈병과 관련하여 종양 유전자(Oncogene)으로도 알려져 있다. 최근에는 ABL1의 활성 수준이 여러 고형 암에서 높게 나타나 있다는 것이 확인되어져있으며, 고형 암 발생에 영향을 줄 수 있다는 보고가 되고 있다. 또한 염색체 9번에 존재하는 ABL1은 염색체 22번에 있는 BCR과 상호 전좌에 의해 필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome)를 만들어서 만성 골수성 백혈병(Chronic myeloid leukemia)을 발병시킨다.
이러한 ABL1은 염색체 9q34.12 영역에 위치하고 있으며, ABL1 유전자 내에는 유전자 전좌로 끊어지는 영역이 밀집되어 있는 절단점(breakpoint)이 존재한다. 이 영역에는 많은 반복 서열이 분포되어 있으며 이러한 반복 서열들이 유전자를 불안정하게 만들어 질병을 일으킬 수 있다고 알려져 있다.
인간의 게놈에서 약 45% 정도의 많은 부분을 차지하고 있는 반복서열 (repeated sequence)은 새로운 유전자의 발생과 다양성의 변이를 포함한 전체 게놈의 진화를 이해하는데 중요한 역할을 하며, 이 영역에서의 변이는 여러 난치병과 높은 연관성을 지닌다. 다양한 반복서열 중 연쇄반복(tandem repeat, TR) 서열은 인간의 유전체에서 10% 이상을 차지하고 있으며, 여기에 속하는 다형성 소위성(minisatellite, MS)은 길이가 주로 10~100 bp의 반복단위로 구성되며, 반복 횟수에 따라 길이가 수 백 bp에서 약 20 kb 이상까지 매우 다양하다. 이 반복서열은 주로 유전자 조절영역과 인트론 부분에 존재하여 유전자 발현에 영향을 미치지만, Mucin 유전자와 같이 엑손 부분에 존재하여 유전자의 기능에 직접적인 영향을 미치는 경우도 있다. 이러한 영역에서의 변이는 많은 질병과 높은 연관성을 가지며, 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 하여 진단 마커로 사용이 가능하다.
이에 본 발명자들은 다형성 소위성 (minisatellite, MS)을 이용한 암 진단용 키트를 개발하고자 예의 노력한 결과, ABL1의 인트론 영역에 존재하는 다형성 소위성(minisatellite, MS)이 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되고, 그 중 ABL1-MS1 영역은 대립형질의 길이에 따른 암과의 관련성을 확인하여 개인 식별 마커로서 이용 가능함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 개인 식별용 다형성 소위성 ABL1-MS1(minisatellite)을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출을 위한 DNA 타이핑 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 DNA 타이핑 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 암 진단용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 암의 감수성 진단을 위한 정보 제공방법을 제공할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ABL1(Abelson murine leukemia viral oncogene 1) 유전자(Genbank No. NC_000009.12)의 63472번째에서 64520번째의 염기서열로 표시되는 개인 식별용 다형성 소위성 ABL1-MS1(minisatellite)을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는, 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출을 위한 DNA 타이핑 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 따른 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 다형성 소위성 ABL1-MS1를 동정하는 단계; 를 포함하는 DNA 타이핑 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 다형성 소위성 ABL1-MS 검출용 프라이머 세트를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출용 프라이머 세트를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리, 동정하여 다형성 소위성 ABL1-MS1 대립형질의 길이를 분석하는 단계;를 포함하는 암의 감수성 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 ABL1(Abelson murine leukemia viral oncogene 1) 유전자 내의 다형성 소위성 ABL1-MS1(minisatellite)은 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되므로, 이를 DNA 타이핑함으로써 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, ABL1-MS1 다형성 소위성 영역에서 14, 15 또는 16번 이 반복되는 대립형질을 가지는 경우 암에 대하여 그 감수성이 정상인보다 높게 나타남에 따라, ABL1-MS1 다형성 소위성은 암에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서 예측 진단에 중요한 자료로 유용하게 사용될 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 인간 9번 염색체에 위치하는 ABL1 유전자의 위치 및 방향을 나타내는 개략도이다. (A)는 1번 염색체의 밴드 구조를 NCBI 웹사이트의 MAP Viewer에 의해 분석한 결과이다. (B)는 9q34.12 염색체상의 ABL1 유전자를 나타낸 도이다.
도 2는 ABL1 유전자의 구조 및 유전자 내의 소위성(minisatellite, MS)의 위치를 보여주는 개략도이다(엑손(exon)은 검은색 선으로 표시하였고, Tandem Repeats Finder Program에 의해 검출된 소위성(minisatellite)의 위치를 별표(*)로 표시)
도 3은 ABL1 내에 존재하는 절단점 영역을 분석하여 반복 서열의 분포도를 나타낸 도이다.
도 4은 대조군에서 ABL1-MS1의 다형성 소위성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 유방암 환자군에서 ABL1-MS1의 다형성 소위성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 방광암 환자군에서 ABL1-MS1의 다형성 소위성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 ABL1-MS1 영역이 부모와 자손 간에 있어서 유전적으로 전달되는 것을 보여주는 전기영동 사진이다. 첫 번째 레인은 사이즈 마커이다. (A)에서 1은 할아버지, 2는 할머니를 의미하고, 3은 아버지, 4는 어머니를 의미하며, 자손의 DNA 샘플은 5, 6으로 나타내었다. (B)에서 1은 아버지, 2는 어머니를 의미하며, 자손의 DNA 샘플은 3, 4, 5로 나타내었다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 ABL1(Abelson murine leukemia viral oncogene 1) 유전자(Genbank No. NC_000009.12)의 63472번째에서 64520번째의 염기서열로 표시되는 개인 식별용 다형성 소위성 ABL1-MS1(minisatellite)을 제공한다.
본 발명에서 용어, "소위성(minisatellite)"은 약 10~100 bp개의 뉴클레오티드로 이루어진 기본 단위가 동일한 방식으로 수차례 반복되어 있는 서열을 의미하며, 이러한 구조를 "연쇄반복서열(tandem repeat sequences) "이라고 부른다.
본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미한다.
본 발명에서 용어, "다형성 소위성(polymorphic minisatellites)"이란 연쇄반복 서열에 해당하는 소위성이 모든 사람에서 2개 이상의 대립형질(allele)을 가지고 사람마다 다르게 나타나는 다형성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위(locus) 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다.
상기 다형성 소위성 ABL1-MS1은 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으며, 상기 다형성 소위성은 인트론(intron) 1번 영역에서 연쇄 반복(tandem repeat)을 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 개인 식별 마커로 이용할 수 있는 다형성 소위성 규명을 위하여, 먼저 상기와 같은 특징을 갖는 ABL1 유전자에 초점을 맞추어 이의 유전자 구조적 특징을 BLAST를 이용하여 분석하였으며, 그 결과 ABL1 유전자 내에 1개의 소위성이 존재함을 최초로 규명하면서 이를 "ABL1-MS1"로 명명하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 다형성 소위성 ABL1-MS1은 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는, 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있으며, 본 발명의 목적상 다형성 소위성 ABL1-MS1을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다.
본 발명의 프라이머 세트는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의변형이 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출을 위한 DNA 타이핑 키트를 제공한다.
상기 키트에는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 따른 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 다형성 소위성 ABL1-MS1를 동정하는 단계; 를 포함하는 DNA 타이핑 방법을 제공한다.
본 발명의 DNA 타이핑 방법에서 단계 (a)는 검체로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적 서열(서열번호 1의 다형성 소위성 ABL1-MS1)을 증폭하는 단계이다.
상기 검체는 피검자의 검사를 위한 시료로서, 세포, 조직(생검 샘플 등), 혈액, 머리카락, 타액, 표피, 정액, 질 채취물, 분리된 세포, 조직샘플, 비듬 및 유골로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, ABL1 유전자 다형성 소위성의 14, 15 또는 16번 영역이 부모와 자손 간에 감수분열을 통해 유전적으로 정확히 전달되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 ABL1 유전자 내의 소위성이 멘델의 법칙에 의해 유전되며 친자 확인 또는 법의학적 감정에 효율적인 마커로 사용함을 확인하였다(실시예 6, 도 7).
본 발명의 DNA 타이핑 방법에서 단계 (b)는 상기와 같은 과정을 거쳐 수득한 PCR 증폭 산물을 전기영동으로 분리하여 서열번호 1의 다형성 소위성 ABL1-MS1을 검출하는 단계이다.
PCR 증폭 산물의 식별을 용이하게 하기 위하여, PCR 증폭 산물의 경우 방사성동위원소 또는 형광으로 표지할 수 있다. 표지는 프라이머의 5' 말단에 형광물질이나 동위원소를 부착하여 얻을 수 있고 혹은 PCR 후 3' 말단에 터미날 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(terminal deoxynucleotidyl transferase)의 반응을 이용하여 첨가할 수도 있다. 표지하지 않는 경우에는 전기영동 후 은염색(silver staining)하여 절편을 확인할 수 있다.
전기영동으로 분리한 PCR 증폭 산물은 본 발명의 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출을 위해 PCR에 의해 증폭된 DNA 절편의 길이를 측정하는 전기영동 검사나 증폭된 단편의 질량을 측정하는 질량측정기(mass spectrometer)를 이용하는 방법, 보합(hybridization)에 의한 염기서열의 차이를 측정하는 방법 및 염기서열을 직접 결정하는 방법을 이용할 수 있다. 상기 보합을 측정하는 검사의 범주에는 DNA 칩과 같이 특성이 미리 알려진 표준 DNA를 기질의 표면에 부착시킨 후 검체의 DNA와 반응시켜 검체 DNA의 특성을 알아내는 DNA 배열(array) 등이 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출을 위해 검체의 DNA에 부착된 표지를 감지하는 장치나 혹은 DNA 절편을 감지할 수 있도록 처리할 수 있다. 이때 바람직한 탐지 방법으로는 방사성동위원소로 표지된 DNA는 자가방사기록법(autoradiography)과 섬광계수법(scintillation counting methods)이 있으며, 형광으로 표지된 경우에는 어플라이드 바이오시스템즈사의 ABI 자동염기분석기나 히타치사(Hitachi)의 FMBIO와 같은 형광을 감지할 수 있는 장치를 사용하고 아무런 표지가 되지 않은 경우에는 은염색법이 있다.
상기 DNA 타이핑 방법은 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 이용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 다형성 소위성 ABL1-MS 검출용 프라이머 세트를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 암은 유방암, 방광암, 전립선암, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 바람직하게는 유방암 및/또는 방광암이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 키트에는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 뿐 만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리, 동정하여 다형성 소위성 ABL1-MS1 대립형질의 길이를 분석하는 단계;를 포함하는 암의 감수성 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
상기 다형성 소위성 ABL1-MS1 대립형질의 반복이 14, 15 또는 16번의 길이인 경우, 암 발생에 대한 감수성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암은 유방암, 방광암, 전립선암, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 바람직하게는 유방암 및/또는 방광암이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, ABL1 다형성 소위성과 유방암과의 연관성 측정하기 위하여, 정상인과 유방암 환자간의 일배체형 패턴(haplotype pattern)을 비교 분석한 결과, 약 1,113 bp, 약 1,189 bp, 약 1,265 bp, 약 1,341 bp 크기의 4개의 대립형질이 확인되었다. 이는 유방암 환자에서 ABL1 다형성 소위성 ABL1-MS1의 76bp의 반복단위가 13번, 14번, 15번, 16번 나타남을 확인하여, 상기 ABL1 다형성 소위성 ABL1-MS1과 유방암의 연관성을 확인하였다(실시예 3).
또한, ABL1-MS1의 경우 유방암 환자에서 14, 15번 길이의 희귀대립형질이 있는 패턴이 암과 관련 없는 대조군에서 보다 증가하는 경향을 확인하였다(실시예 4).
또한, 방광암 환자에서 14, 16번 길이의 희귀대립형질이 있는 패턴이 암과 관련 없는 대조군에서 보다 증가하는 경향을 확인하였다(실시예 5).
상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.
상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한,방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquidscintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: ABL1 유전자의 구조적 분석
ABL1 (NC_000009.12 REGION: 63472-64520) 유전자의 구조적 특징을 BLAST를 이용하여 분석하였다. 표 1에서 보여주는 색인(indices)의 위치번호는 NC_000009.12 REGION 내에서 분석한 결과를 보여준 것이다. 프로모터 영역과 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF) 내에 존재하는 엑손(exon) 및 인트론(intron) 영역을 조사하고, 각 영역에 존재하는 연쇄반복(tandem repeats, TR)의 위치를 결정한 다음, 반복되는 서열 크기가 10~100bp 정도의 소위성(minisatellite, MS)의 위치를 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 인간 9번 염색체에 위치하는 ABL1 유전자의 위치 및 방향을 나타내었으며, (A)는 1번 염색체의 밴드 구조를 NCBI 웹사이트의 MAP Viewer에 의해 분석한 결과이다. (B)는 9q34.12 염색체상의 ABL1 유전자를 확인하였다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, ABL1 유전자의 구조 및 유전자 내의 소위성(minisatellite, MS)의 위치를 확인하였다. 엑손(exon)은 검은색 선으로 표시하였고, Tandem Repeats Finder Program에 의해 검출된 소위성(minisatellite)의 위치를 별표(*)로 표시하였다.
ABL1은 약 173Kb 크기이며 11개 엑손으로 이루어져 있고, ABL1 유전자 내에 존재하는 연쇄반복(tandem repeat, TR) 영역의 위치는 표 1에 나타난 바와 같이, 1번 인트론 영역에 1개 존재함을 확인하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, ABL1 내에 존재하는 절단점 영역을 분석하여 반복 서열의 분포도를 확인하였다.
ABL1 유전자 내에 존재하는 1개의 소위성(minisatellite, MS, 표 1)의 다형성 소위성을 PCR을 이용하여 분석하였다. PCR분석에 사용된 프라이머의 염기서열은 하기 표 2과 같다.
서열번호 소위성
(minisatellite)		 색인
(indices)		 위치 반복 크기
(repeat size)		 대표 복사수
(copy no.)		 대표 크기
(bp)
1 ABL1-MS1 63472-64520 Int1 76 14 1,189
GGAATCGAGGAACCTCTCAGGGCTTTGTGTTGGGACGCTGACACACTGCATTAGTACTTTCTAGACTGTGAGCAGG
다형성 소위성 프라이머 서열번호 염기서열
ABL1-MS1 ABL1-MS1 F 서열번호 2 GGAATGGAAGGGGTGTTGGG
ABL1-MS1 R 서열번호 3 ACCCACTTCTCCACCTCCTC
실시예 2. ABL1 유전자의 소위성 (minisatellite, MS)의 다형성 (polymorphism) 분석
100명의 성인 남성과 여성의 혈액으로부터 추출한 게놈 DNA를 이용하여 ABL1 유전자 내에 존재하는 1개의 TR의 대립형질 양상을 PCR을 사용하여 비교하였다.
게놈 DNA를 표준 PCR 조건(50mM Tris-HCl(pH 9.0), 50mM MgCl2, 0.2mM dTTP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dGTP 및 0.2mM dATP, 최종 부피 30㎕)에서 ABL1-MS1는 서열번호 2과 3의 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
DNA 샘플의 PCR 분석은 게놈 DNA 100 ng을 주형으로 Coregen taq DNA polyerase, Coregen 10X buffer를 사용하여 수행하였다. 사이클의 조건은 ABL1-MS1의 경우 94℃에서 2분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 30초 및 68℃에서 20초로 30 사이클을 수행한 다음, 마지막 신장 단계는 72℃에서 10분간 연장하였다.
상기 PCR 산물을 ABL1-MS1의 경우, 2% SeaKem LE 아가로스젤에 주입한 후 TAE 버퍼에서 전기영동(1볼트/㎝)에 의해 분석하였다. 그 결과, 1 개의 영역이 다형성을 나타내었기 때문에 개인 식별 마커로 사용이 가능하다.
또한, 모두 다형성 소위성을 나타내었기 때문에 개체수를 늘려 하기와 같이 추가적인 분석을 실시하였다(표 3~9). 이때 N은 대립형질의 수로, 사람마다 2개의 대립형질을 가지므로 샘플 수의 두 배가 된다.
실시예 3. 암과 관련없는 여성 대조군 및 유방암 환자의 ABL1-MS1 (minisatellite 1)의 일배체형 패턴(haplotype pattern) 분석
본 발명에서는 ABL1 유전자의 TR 영역의 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 정상인과 유방암 환자의 게놈 DNA를 추출하여 상기 실시 예 1과 같은 방법으로 PCR을 수행함으로써 정상인과 유방암 환자간의 일배체형 패턴(haplotype pattern)을 비교 분석하였다.
암과 관련 없는 여성 대조군 468명을 조사한 결과, 약 1,037 bp, 약 1,113 bp, 약 1,189 bp, 약 1,265 bp, 약 1,341 bp 크기의 5개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 76 bp의 반복단위가 12번, 13번, 14번, 15번, 16번 반복된 것으로 나타나 다형성 소위성이 확인되었다 (표 3, 도 4). 도 4은 ABL1-MS1의 다형성 소위성을 나타낸 것으로, 암과 관련 없는 여성 대조군에서 7가지 패턴의 다양한 밴드가 확인되었다. 또한, 도 5는 유방암 환자에서 6가지 패턴의 밴드가 확인되었다.
대조군 유방암 환자
반복단위×반복수 N=936 횟수(frequency) N=822 횟수(frequency)
76×12 1 0.001 0 0
76×13 202 0.215 154 0.187
76×14 1 0.001 4 0.005
76×15 730 0.779 663 0.807
76×16 2 0.002 1 0.001
** "횟수(frequency)= 각 N값/전체 N값"으로 계산되며, 그 값이 0.01 미만인 경우 희귀 다형성 소위성에 해당함.
실시예 4. ABL1-MS1 영역의 유방암과의 연관성 측정
ABL1-MS1의 총 8개의 대립형질을 빈도에 따라 일반대립형질(Common allele; 출현빈도가 1% 이상일 경우)과 희귀대립형질(Rare allele; 출현빈도가 1% 미만일 경우)로 나누어 비교하였다.
그 결과, 암과 관련 없는 대조군과 유방암 환자간의 ABL1-MS1의 유전형질 패턴 비교한 결과, ABL1-MS1의 경우 유방암 환자에서 14, 15번 길이의 희귀대립형질이 있는 패턴이 암과 관련 없는 대조군에서보다 증가하는 경향을 확인하였다(표 4).
또한, ABL1-MS1 희귀 대립형질의 연령에 따른 패턴 비교 결과, 유방암 환자 50세 기준으로 나누었을 때 50세 미만의 환자들에서 희귀 대립형질이 대조군에 비해 많은 것을 확인할 수 있었다(표 5).
상기와 같은 결과는 ABL1-MS1이 유방암에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서, 예측 및 진단에 중요한 자료로 사용될 수 있음을 의미한다.
유전형질 대조군 유방암 환자
TR N=468 횟수(Frequency) N=411 횟수(Frequency)
12/15 1 0.002 0 0
13/13 20 0.043 11 0.027
13/14 1 0.002 1 0.002
13/15 160 0.342 130 0.316
13/16 1 0.002 0 0
14/15 0 0 3 0.007
15/15 284 0.607 265 0.645
15/16 1 0.002 1 0.002
* Statistically significant (P < 0.05)
나이 대조군 유방암환자 OR (95% CI) P
common rare common rare
<50 374 0 338 4 - 0.036*
≥50 582 4 479 1 0.30 (0.03-2.73) 0.26
* Statistically significant (P < 0.05)
실시예 5. ABL1-MS1 영역의 방광암과의 연관성 측정
ABL1-MS1와 방광암과의 연관성을 측정하기 위해 상기 실시예 1과 같은 방법으로 PCR을 수행함으로써 정상인과 방광암 환자간의 일배체형 패턴(haplotype pattern)을 비교하였다(표 6).
대조군 방광암 환자
반복단위×반복수 N=414 횟수(frequency) N=394 횟수(frequency)
76×13 92 0.222 84 0.213
76×14 0 0 3 0.008
76×15 322 0.778 304 0.772
76×16 0 0 3 0.008
ABL1-MS1의 총 4개의 대립형질을 빈도에 따라 일반대립형질(Common allele; 출현빈도가 1% 이상일 경우)과 희귀대립형질(Rare allele; 출현빈도가 1% 미만일 경우)로 나누어 비교하였다.
그 결과, ABL1-MS1의 경우 방광암 환자에서 14, 16번 길이의 희귀 대립형질이 있는 패턴이 암과 관련 없는 대조군에서보다 증가하는 경향을 확인하였다(표 7). 또한, 방광암 환자 60세 기준으로 나누어 비교했을 때, 60세 이상인 환자들에서 희귀 대립형질이 대조군보다 많은 것을 확인할 수 있었으며(표 8) 또한 14, 16번 길이의 희귀 대립형질이 방광암 환자들에서만 나타나는 것을 확인할 수 있었다(표 9).
유전형질 대조군 방광암 환자
TR N=207 횟수(Frequency) N=197 횟수(Frequency)
13/13 12 0.058 10 0.051
13/15 68 0.329 64 0.325
14/15 0 0 3 0.015
15/15 127 0.614 117 0.594
15/16 0 0 3 0.015
* Statistically significant (P < 0.05)
나이 대조군 방광암환자 OR (95% CI) P
common rare common rare
<60 50 0 44 2 - 0.136
≥60 157 0 147 4 - 0.040*
* Statistically significant (P < 0.05)
희귀
대립형질		 대조군 방광암환자 OR (95% CI) P
common rare common rare
14, 16 207 0 191 6 - 0.011*
* Statistically significant (P < 0.05)
실시예 6. 감수분열을 통한 다형성 소위성(minisatellite, MS)의 유전적 전달 측정
자손의 DNA는 아버지와 어머니로부터 정확히 50%씩 물려받아 형성된다. 따라서 자손의 DNA에는 아버지의 DNA 패턴의 반을, 그리고 어머니의 DNA 패턴의 반을 가지게 되므로, 친자 관계규명 유전자 검사에는 아버지/어머니의 DNA 패턴이 자손에게도 같은 DNA 패턴으로 나타내는가를 조사하게 된다. 그러므로 이러한 영역은 감수분열을 통해 재조합이 일어나지 않는 안정적인 영역을 포함하여야 한다.
본 발명에서는 조부모, 부모, 자손의 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하여 상기 실시예와 같은 방법으로 PCR을 수행함으로써, ABL1-MS1의 대립형질 양상을 확인하였다.
그 결과, 모든 영역이 부모와 자손 간에 감수분열을 통해 유전적으로 정확히 전달되는 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 이는 ABL1 유전자 내의 소위성이 멘델의 법칙에 의해 유전되며 친자 확인 또는 법의학적 감정에 효율적인 마커로 사용할 수 있다는 것을 나타내고, 이러한 DNA 타이핑 마커 (DNA typing marker)를 이용하여 가족에서의 동일 질환 발생 여부를 예측할 수 있다는 것을 의미한다.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> DNA Typing Kits and Diagnostic Kits for Detecting Cancer using Minisatellites of ABL1 Gene <130> PN1903-151 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABL1-MS1 <400> 1 ggaatcgagg aacctctcag ggctttgtgt tgggacgctg acacactgca ttagtacttt 60 ctagactgtg agcagg 76 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABL1-MS1 F primer <400> 2 ggaatggaag gggtgttggg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABL1-MS1 R primer <400> 3 acccacttct ccacctcctc 20

Claims (14)

  1. ABL1(Abelson murine leukemia viral oncogene 1) 유전자(Genbank No. NC_000009.12)의 63472번째에서 64520번째의 염기서열로 표시되고, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 개인 식별용 다형성 소위성 ABL1-MS1(minisatellite).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다형성 소위성은 인트론(intron) 1번 영역에서 연쇄 반복(tandem repeat)을 나타내는 것인, 개인 식별용 다형성 소위성 ABL1-MS1.
  4. 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는, 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출용 프라이머 세트 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는, 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출을 위한 DNA 타이핑 키트.
  6. (a) 검체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제5항에 따른 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (b) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 다형성 소위성 ABL1-MS1를 동정하는 단계;를 포함하는 DNA 타이핑 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 검체는 혈액, 머리카락, 타액, 표피, 정액, 질 채취물, 분리된 세포, 조직샘플, 비듬 및 유골로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 DNA 타이핑 방법은 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 이용되는 것인, 방법.
  9. 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 다형성 소위성 ABL1-MS1 검출용 프라이머 세트를 포함하는 유방암 또는 방광암 진단용 조성물.
  10. 삭제
  11. 제9항의 조성물을 포함하는 유방암 또는 방광암 진단용 키트.
  12. (a) 검체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제11항의 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (b) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리, 동정하여 다형성 소위성 ABL1-MS1 대립형질의 길이를 분석하는 단계;를 포함하는 유방암 또는 방광암의 감수성 진단을 위한 정보 제공방법.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서,
    상기 다형성 소위성 ABL1-MS1 대립형질의 반복이 14, 15 또는 16번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 길이인 경우, 유방암 또는 방광암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것인, 정보 제공 방법.
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Krowcznska et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Vol.18., No.5., pp.1121-1127 (1990) 1부.*
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