KR20210063347A - 세균성 핵산을 검출하고 세균성 질염을 진단하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

세균성 질증을 대상체에서 진단하는 방법으로서, 대상체 시료에서 락토바실러스 종, 아토포비움 버지내 및 가르드네렐라 버지날리스 중 임의의 하나 이상의 검출을 위한 검정법을 수행하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 또한 시료에서 락토바실러스 종, 아토포비움 버지내 및/또는 가르드네렐라 버지날리스 핵산을 검출하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

세균성 핵산을 검출하고, 세균성 질증을 진단하기 위한 조성물 및 방법
세균성 질증을 대상체에서 진단하는 방법으로서, 대상체 시료에서 락토바실러스 종, 아토포비움 버지내 및 가르드네렐라 버지날리스 중 임의의 하나 이상의 검출을 위한 검정법을 수행하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 또한 시료에서 락토바실러스 종, 아토포비움 버지내 및/또는 가르드네렐라 버지날리스 핵산을 검출하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
국립 건강 및 영양 검사 조사 (National Health and Nutrition Examination Survey)에 따르면 14세 내지 49세의 여성 중 거의 1/3이 세균성 질증 (BV)에 걸린다. (Allsworth and Peipert, Obstetrics and Gynecology 109: 114-120, 2007 참조). BV는 질 분비물의 가장 공통적 원인이고, 많은 여성들이 치료를 받는 이유이다. 또한 조산, 저체중 출생, 골반 염증성 질환, HIV를 포함한 STD의 증가 및 섹스 파트너에게 HIV를 전염시킬 더 큰 위험성과 관련된다. Srinivasan and Fredricks, Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, Vol. 2008, Article ID 750479, 22 pages, 2008 참조. 세균성 질증에 걸린 여성은 냄새나는 질 분비물 또는 가려움을 포함한 증상을 겪을 수 있지만, 진단가능한 BV에 걸린 여성 중 절반 정도는 분명한 증상이 없다 (Srivinvasan and Fredricks, 상기 참조).
BV의 원인으로 알려진 단일한 병인체는 없다. 대부분의 연구자와 CDC는 세균성 질증을 질의 정상 세균총이 파괴된 결과인 것으로 생각한다. 보편적 감염과 달리, 이러한 생명부전 (dysbiosis)은 개별 세균 종의 결과가 아니다. CDC Factsheet, 2014 (CDC 웹사이트로부터의 BV-Fact-Sheet-March-2014.pdf) 참조. 생명부전은 질과 같은 신체 환경 내에서 정상 미생물총의 파괴이다. Nibali et al., Journal of Oral Microbiology 6: 22962, 2014 참조.
BV는 암셀 (Amsel) 판정기준을 사용하는 병원 및 뉴전트 (Nugent) 점수매김 시스템을 사용하는 연구실에서 진단된다. 후자는 그램 염색의 도움으로 세균의 형태형 (morphotype)을 계수하는데 의존한다. 이런 방식으로 뉴전트 점수는 생명부전의 시각적 평가이고, 좋은 세균 대비한 나쁜 세균의 점수를 부여한다. Nugent et al., Journal of Clinical Microbiology 29: 297-301, 1991 참조. 암셀 판정기준은 BV와 관련된 핵심 증상인 단서 세포, pH, 색상 및 냄새의 존재에 대해 시료를 평가한다. Amsel et al., Am. J. Med. 74: 14-22, 1983 참조. 시료의 습윤 마운트는 현미경으로 검사하여 우세하게 G. 버지날리스로 구성된 것으로 생각되는 세균으로 도포된 인간 상피 세포인 단서 세포를 검출한다.
분자 테스트는 일반적으로 세균성 질증과 강한 상관 관계가 있는 다수의 유기체를 대상으로 한다. 대상이 되는 유기체는 테스트마다 달라진다. 거의 모든 경우에 아토포비움 (Atopobium), 가르드넬라 (Gardnerella) 및 메가스파에라 (Megasphaera) 종과 같은 고농축 혐기성 세균이 대상이 된다.
BV에 대한 FDA 승인을 받은 테스트는 단지 BD AffirmTM VPⅢ 미생물 동정 테스트 (2010) 및 BD MAXTM 질 패널 (2016)뿐이다. Affirm 및 MAX 제품 둘 다는 BV의 유일한 지시인자인 G. 버지날리스를 검출한다. BD Affirm VPⅢ 테스트는 카트라이트 등의 연구에서 67.6%의 민감도 및 76.4%의 특이도를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Cartwright et al., Journal of Clinical Microbiology 51: 3694-3699, 2013). BD Affirm VⅢ 패키지 삽입물은 점수가 매겨진 그램 염색 방법과 비교할 때 Affirm 제품이 95.1% 민감하고 83.3% 특이적임을 나타내는 반면, BD MAX 패키지 삽입물은 MAX 제품이 90.5% 민감하고 85.8% 특이적임을 나타낸다.
상기 카트라이트 등은 BV의 진단을 위해 아토포비움 버지내, BVAB-2 및 메가스파에라 -1의 검출에 대한 다중복합 (multiplex) 검정법을 사용하였다. 이들은 323명의 여성 (아프리카계 미국인 93%, 비-히스패닉 백인 7%)의 모집단에서 뉴전트 및 암셀 결과의 조합에 대한 본 검정법의 성능을 측정하였다. 이들은 이 테스트가 뉴전트 및 암셀 점수의 조합과 비교할 때 96.9% 민감하고 92.6% 특이적임을 보고하였다. 이들은 뉴전트 점수 단독과 비교하는 이 검정법의 결과를 보고하지 않았다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2018년 8월 24일에 제출된 미국 가특허출원 62/722,627의 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적으로 본원에 이의 전문이 참조문헌으로 통합된다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 세균성 질증 (BV)의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 일반적으로 (a) BV에 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터의 시료를 제공하는 단계; (b) 시료에서 락토바실러스 종 (Lactobacillus sp.), A 버지내 (A. vaginae) 및 G. 버지날리스 (G. vaginalis)의 검출을 위한 검정법을 수행하는 단계; (c) 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대해 검출 검정법을 기초로 하는 정량적 값을 할당하는 단계; (d) A. 버지내의 정량적 값 및 G. 버지날리스의 정량적 값 중 더 큰 값으로부터 락토바실러스 종의 정량적 값을 차감하는 단계; (e) 단계 (d)를 기초로 하여 단일한 BV 점수를 할당하는 단계; 및 (f) BV 점수와 컷오프 값의 비교를 기초로 하여 대상체에서 BV의 존재 또는 부재를 결정하는 단계:를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서 락토바실러스 종 및/또는 A 버지내 및 G. 버지날리스에 대해 최소의 정량적 값이 부여된다. 전형적으로, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대한 정량적 값은 표준화되거/거나 가중치가 부여된다. 표준화된 정량적 값을 포함하는 일부 변형에서, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대한 정량적 값은 로그 사본의 단위이며, 표준화는 검출 검정법으로부터 결정된 값으로부터 중앙 모집단 값을 차감하는 것을 포함한다. 단계 (d)는 조정 상수의 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단계 (d)는 검출 검정법의 시료 억제를 보상하는 내부 대조군 (IC) 조정 인자를 첨가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 IC 조정 인자는 (i) 검출 검정법으로부터 생성된 관찰된 IC 값 대비 (ii) 검출 검정법에 대한 예상된 IC 값의 비율을 기초로 한다. 상세한 변형에서, BV 점수는 공식을 사용하여 할당된다:
BV 점수 = C0 + WL최대값(LS, FLS) + WGA최대값(AS, GS, FGAS) + WIC로그2(IC비율),
여기서 C0은 조정 상수이고; WL은 락토바실러스 종에 대한 가중치 상수이고; 최대값(LS, FLS)는 LS 및 FLS보다 크고, LS는 락토바실러스 종의 관찰된 표준화된 정량적 값이고, FLS는 락토바실러스 종의 부여된 최소의 표준화된 정량적 값이며; WGA는 A 버지내 및 G. 버지날리스에 대한 가중치 상수이고; 최대값(AS, GS, FGAS)는 AS, GS 및 FGAS보다 크고, AS는 A 버지내의 관찰된 표준화된 정량적 값이고, GS는 G. 버지날리스의 관찰된 표준화된 정량적 값이며, FGAS는 A 버지내 및 G. 버지날리스의 부여된 최소의 표준화된 정량적 값이고 (예로, 0); WIC는 내부 대조군 (IC) 가중치 상수이고; IC비율은 (i) 검출 검정법으로부터 생성된 관찰된 내부 대조군 (IC) 값 대비 (ii) 검출 검정법에 대한 예상된 IC 값의 비율이다.
상기와 같은 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스의 검출을 위한 검정법은 핵산 기반의 검출 검정법이다. 구체적으로, 적합한 핵산 기반의 검출 검정법은 증폭 기반의 검정법 예컨대 예를　들면 등온 증폭 반응 (예로, 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응)을 포함하는 검정법을 포함하며, 이는 실시간으로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 기반의 검출 검정법은 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스의 16S rRNA를 표적한다. 구체적인 변형에서, 핵산 기반의 검출 검정법은 (i) 약 뉴클레오티드 위치 40번 내지 약 뉴클레오티드 위치 265번의 서열번호 1의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역; (ii) 약 뉴클레오티드 위치 43번 내지 약 뉴클레오티드 위치 247번의 서열번호 2의 영역에 상응하는 L. 젠세니 16S rRNA 영역; (iii) 약 뉴클레오티드 위치 93번 내지 약 뉴클레오티드 위치 298번의 서열번호 3의 영역에 상응하는L. 가세리 16S rRNA 영역; (iv) 약 뉴클레오티드 위치 540번 내지 약 뉴클레오티드 위치 625번의 서열번호 4의 영역에 상응하는 A. 버지내 16S rRNA 영역; 및/또는 (v) 약 뉴클레오티드 위치 172번 내지 약 뉴클레오티드 위치 227번의 서열번호 5의 영역에 상응하는 G. 버지날리스 16S rRNA 영역을 표적한다.
핵산 기반의 검출 검정법을 포함하는 상기와 같은 BV를 진단하는 방법의 특정 구현예에서, 검정법은 다음의 단계를 포함하는 증폭 기반의 검정법이다:
(1) 시료를
락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기와 같은 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 버지내 특이적 증폭 올리고머; 및
G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산이 시료에 존재하는 경우, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
상기와 같은 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 일부 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
상기와 같은 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머, 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머 중 적어도 하나는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 구체적으로 적합한 프로모터 서열은 예를 들면 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번 (또한 예로, 서열번호 18의 잔기 1번 내지 27번 또는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 35번과 같이 나타냄)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 서열과 같은 T7 프로모터 서열이다. 특정한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. SEQ일부 구현예에서, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 시료는 락토바실러스 종 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 포획 프로브 올리고머, 및 A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열와 접촉될 수 있고, 여기서 제 1 및 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열 각각은 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착되며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 상기와 같은 제 1 및 제 2 표적 포획 프로브를 포함하는 상세한 변형에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 일부 구현예에서, 제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 (i) 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브, 및 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 임의의 표적-혼성화된 락토바실러스 특이적, A 버지내 특이적 및 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고, 방법은 하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브의 사용을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 특정 구현예에서, 각각의 프로브는 표지를 포함한다. 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브의 사용을 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 표지를 포함한다. 구체적으로 적합한 표지는 화학발광성 및 형광성 표지를 포함한다.
상기와 같이 표지된 검출 프로브의 사용을 포함하는 Bv를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 증폭화 단계 (2) 동안 발생한다. 이러한 일부 변형에서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함한다. 구체적으로, 형광성 표지 및 소광제를 포함하는 적합한 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 및 TaqMan 검출 프로브를 포함한다.
상기와 같은 검출 프로브의 사용을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 특정 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브의 사용을 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 일부 이러한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 A 버지내 특이적 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각 (또는 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 A 버지내 특이적 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각)은 분자 토치 또는 분자 비콘이다.
상기와 같은 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 방법은 BV와 관련된 10개 이하의 세균 속의 검출을 포함한다. 예를 들면, 특정 변형에서 방법은 BV와 관련된 5개 이하의 세균 속의 검출을 포함한다. 상세한 변형에서, 방법은 락토바실러스, 아토포비움, 가르드넬라 이외의 BV와 관련된 세균 속의 검출을 포함하지 않는다.
상기와 같은 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, BV의 존재가 대상체에게 나타나는 경우, 방법은 대상체에게 BV에 대한 치료 섭생을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
상기와 같은 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 방법은 대상체에서 BV를 모니터링하는 방법이고 대상체는 단계 (a) 이전에 BV에 대한 치료 섭생을 받고 있다. 이러한 일부 변형에서, BV의 존재가 대상체에게 나타나는 경우, 방법은 (i) 대상체에게 BV에 대한 치료 섭생을 투여하거나, (ii) 대상체에게 BV에 대한 상이한 치료 섭생을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각의 존재 또는 부재를 결정하는 다중복합 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 다음의 단계를 포함한다:
(1) 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의심되는 시료를,
(a) 락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
(b) A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 버지내 특이적 증폭 올리고머; 및
(c) G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머와 접촉시키는, 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산이 시료에 존재하는 경우, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
상기와 같은 다중복합 방법의 일부 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
상기와 같은 다중복합 방법의 일부 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머, 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머 중 적어도 하나는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 구체적으로 적합한 프로모터 서열은 예를 들면 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번 (또한 예로, 서열번호 18의 잔기 1번 내지 27번 또는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 35번과 같이 나타냄)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 서열과 같은 T7 프로모터 서열이다. 특정한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 다중복합 방법의 특정 구현예에서, 방법은 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 시료는 락토바실러스 종 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 포획 프로브 올리고머, 및 A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열와 접촉될 수 있고, 여기서 제 1 및 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열 각각은 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착되며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 상기와 같은 제 1 및 제 2 표적 포획 프로브를 포함하는 상세한 변형에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 일부 구현예에서, 제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 다중복합 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 (i) 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브, 및 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 임의의 표적-혼성화된 락토바실러스 특이적, A 버지내 특이적 및 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고, 방법은 하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브의 사용을 포함하는 다중복합 방법의 특정 구현예에서, 각각의 프로브는 표지를 포함한다. 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브의 사용을 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 표지를 포함한다. 구체적으로, 적합한 표지는 화학발광성 및 형광성 표지를 포함한다.
상기와 같은 표지된 검출 프로브의 사용을 포함하는 다중복합 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 증폭화 단계 (2) 동안 발생한다. 이러한 일부 변형에서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함한다. 구체적으로, 형광성 표지 및 소광제를 포함하는 적합한 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 및 TaqMan 검출 프로브를 포함한다.
상기와 같은 검출 프로브의 사용을 포함하는 다중복합 방법의 특정 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브의 사용을 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 일부 이러한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 A 버지내 특이적 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각 (또는 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 A 버지내 특이적 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각)은 분자 토치 또는 분자 비콘이다.
상기와 같은 다중복합 방법의 일부 구현예에서, 단계 (2)에서 증폭 반응은 등온 증폭 반응이다. 구체적인 변형에서 등온 증폭 반응은 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응이다. 특정 구현예에서, 등온 증폭 반응은 실시간 증폭 반응이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다. 조성물 또는 키트는 일반적으로 다음의 올리고머를 포함한다:
(a) 락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
(b) A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 버지내 특이적 증폭 올리고머; 및
(c) G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머.
상기와 같은 조성물 또는 키트의 일부 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고; 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
상기와 같은 조성물 또는 키트의 일부 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머, 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머 중 적어도 하나는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 구체적으로 적합한 프로모터 서열은 예를 들면 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번 (또한 예로, 서열번호 18의 잔기 1번 내지 27번 또는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 35번과 같이 나타냄)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 서열과 같은 T7 프로모터 서열이다. 특정한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 조성물 또는 키트의 특정 구현예에서, 조성물 또는 키트는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머를 추가로 포함한다. 예를 들면, 조성물 또는 키트는 락토바실러스 종 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 포획 프로브 올리고머, 및 A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열을 포함할 수 있고, 여기서 제 1 및 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열 각각은 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착되며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 상기와 같은 제 1 및 제 2 표적 포획 프로브를 포함하는 상세한 변형에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 일부 구현예에서, 제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 조성물 또는 키트의 일부 구현예에서, 조성물 또는 키트는 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브, 및 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고, 조성물 또는 키트는 하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브를 추가로 포함하며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 포함하는 조성물 또는 키트의 특정 구현예에서, 각각의 프로브는 표지를 포함한다. 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브를 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 표지를 포함한다. 구체적으로 적합한 표지는 화학발광성 및 형광성 표지를 포함한다. 일부 변형에서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하고; 구체적으로, 형광성 표지 및 소광제를 포함하는 적합한 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 및 TaqMan 검출 프로브를 포함한다.
상기와 같은 검출 프로브를 포함하는 조성물 또는 키트의 특정 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브를 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 일부 이러한 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 A 버지내 특이적 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각 (또는 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 락토바실러스 특이적, 제 1 A 버지내 특이적 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각)은 분자 토치 또는 분자 비콘이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시료에서 락토바실러스 종의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 다음의 단계를 포함한다:
(1) 락토바실러스 종을 포함하는 것으로 의심되는 시료를 락토바실러스 종의 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, 락토바실러스 종 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 락토바실러스 종의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
상기와 같은 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 일부 변형에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나; 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나; 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나; 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
상기와 같은 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 구체적으로 적합한 프로모터 서열은 예를 들면 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 서열과 같은 T7 프로모터 서열이다. 상세한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 락토바실러스 종 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 락토바실러스 종 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하고; 일부 이러한 변형에서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고; 보다 상세한 구현예에서, 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 (i) 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 검출 프로브와 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 임의의 표적-혼성화된 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.일부 구현예에서, 제 1 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고, 방법은 하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 특이적 검출 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나, 제 2 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하며; 보다 상세한 변형에서, 제 1 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 제 1 검출 프로브의 사용을 포함하는 경우, 제 1 검출 프로브는 표지를 포함한다. 하나 이상의 증폭 올리고머를 제 2 검출 프로브와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 검출 프로브는 표지를 포함한다. 구체적으로 적합한 표지는 화학발광성 및 형광성 표지를 포함한다.
상기와 같이 표지된 검출 프로브의 사용을 포함하는 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 증폭화 단계 (2) 동안 발생한다. 이러한 일부 변형에서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함한다. 구체적으로, 형광성 표지 및 소광제를 포함하는 적합한 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 및 TaqMan 검출 프로브를 포함한다.
상기와 같이 검출 프로브(들)의 사용을 포함하는 락토바실러스 종을 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 제 1 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 제 2 검출 프로브의 사용을 추가로 포함하는 일부 구현예에서, 제 2 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 일부 이러한 변형에서, 제 1 검출 프로브 (또는 제 1 및 제 2 검출 프로브 각각)는 분자 토치 또는 분자 비콘이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시료에서 A. 버지내의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 다음의 단계를 포함한다:
(1) A. 버지내를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 A. 버지내 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, A. 버지내 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 A. 버지내의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
상기와 같은 A. 버지내를 검출하는 방법의 일부 변형에서, 제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; 제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나; 제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
상기와 같은 A. 버지내를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 구체적으로 적합한 프로모터 서열은 예를 들면 서열번호 18의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 서열과 같은 T7 프로모터 서열이다. 상세한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 A. 버지내를 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 A. 버지내 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 A. 버지내 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 보다 상세한 변형에서, 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 A. 버지내를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 검출 프로브와 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및 임의의 표적-혼성화된 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 보다 상세한 변형에서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 A. 버지내를 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 검출 프로브의 사용을 포함하는 경우, 검출 프로브는 표지를 포함한다. 구체적으로 적합한 표지는 형광성 및 화학발광성 표지를 포함한다.
상기와 같이 표지된 검출 프로브의 사용을 포함하는 A. 버지내를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 증폭화 단계 (2) 동안 발생한다. 일부 이러한 변형에서, 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함한다. 구체적으로, 형광성 표지 및 소광제를 포함하는 적합한 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 및 TaqMan 검출 프로브를 포함한다.
상기와 같이 검출 프로브의 사용을 포함하는 A. 버지내를 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 일부 이러한 변형에서, 검출 프로브는 분자 토치 또는 분자 비콘이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시료에서 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 다음의 단계를 포함한다:
(1) G. 버지날리스를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 G. 버지날리스 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
상기와 같은 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 일부 변형에서, 제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; 제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나; 제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
상기와 같은 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 구체적으로 적합한 프로모터 서열은 예를 들면 서열번호 15의 잔기 9번 내지 36번의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 서열과 같은 T7 프로모터 서열이다. 상세한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 G. 버지날리스 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 G. 버지날리스 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 보다 상세한 변형에서, 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 검출 프로브와 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및 임의의 표적-혼성화된 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 보다 상세한 변형에서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기와 같은 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 검출 프로브의 사용을 포함하는 경우, 검출 프로브는 표지를 포함한다. 구체적으로 적합한 표지는 형광성 및 화학발광성 표지를 포함한다.
상기와 같이 표지된 검출 프로브의 사용을 포함하는 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 단계 (3)는 증폭화 단계 (2) 동안 발생한다. 일부 이러한 변형에서, 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함한다. 구체적으로, 형광성 표지 및 소광제를 포함하는 적합한 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 및 TaqMan 검출 프로브를 포함한다.
상기와 같이 검출 프로브의 사용을 포함하는 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 특정 구현예에서, 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함한다. 일부 이러한 변형에서, 검출 프로브는 분자 토치 또는 분자 비콘이다.
상기와 같은 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스를 검출하는 방법의 일부 구현예에서, 단계 (2)에서 증폭 반응은 등온 증폭 반응이다. 구체적인 변형에서 등온 증폭 반응은 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응이다. 특정 구현예에서, 등온 증폭 반응은 실시간 증폭 반응이다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 다음의 본 발명의 상세한 설명을 참조하면 명백해질 것이다. 추가적으로 개시된 구현예는 다음과 같다.
구현예 1은 시료에서 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, A. 버지내 (A. vaginae) 및 G. 버지날리스 (G. vaginalis) 각각의 존재 또는 부재를 결정하는 다중복합 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법이다:
(1) 락토바실러스 종, A. 바지내 및 G. 바지날리스 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의심되는 시료를,
(a) 락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
(b) A. 바지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 바지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 바지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 바지내 특이적 증폭 올리고머; 및
(c) G. 바지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 바지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 G. 바지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 바지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 G. 바지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 바지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 바지날리스 특이적 증폭 올리고머와 접촉시키는, 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
구현예 2는 구현예 1의 방법으로서,
(1) 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(2) 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(3) 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(4) 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(5) 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(6) 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(7) 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(8) 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 3은 구현예 1 또는 2의 방법으로서,
(1) 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(2) 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(3) 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(4) 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(5) 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(6) 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(7) 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
(8) 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 방법이다.
구현예 4는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머, 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머 중 적어도 하나는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자인, 방법이다.
구현예 5는 구현예 4의 방법으로서, 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인, 방법이다.
구현예 6은 구현예 5의 방법으로서, 프로모터 서열이 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법이다.
구현예 7는 구현예 4의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 8은 구현예 7의 방법으로서, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 9는 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 10은 구현예 9의 방법으로서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법이다.
구현예 11은 구현예 10의 방법으로서, 시료는 제 1 및 제 2 포획 프로브 올리고머와 접촉되고,
제 1 포획 프로브 올리고머는 락토바실러스 종 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 각각 A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고,
제 1 및 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열 각각은 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착되는, 방법이다.
구현예 12는 구현예 11의 방법으로서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니, 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 방법이다.
구현예 13은 구현예 12의 방법으로서,
제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 14는 구현예 12 또는 13의 방법으로서, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 15은 구현예 14의 방법으로서,
제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나,
제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 16은 구현예 1 내지 15 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 단계 (3)는 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브, 및 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및
임의의 표적-혼성화된 락토바실러스 특이적, A 버지내 특이적 및 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 17은 구현예 16의 방법으로서,
제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 상응하는, 방법이다.
구현예 18은 구현예 17의 방법으로서,
제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 상응하는, 방법이다.
구현예 19는 구현예 16 내지 18 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고,
방법은 하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 20은 구현예 19의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 21은 구현예 20의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 22는 구현예 16 내지 18 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 23은 구현예 19 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 24은 구현예 22 또는 23의 방법으로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 방법이다.
구현예 25는 구현예 22 또는 23의 방법으로서, 검출 단계 (3)가 증폭화 단계 (2) 동안 발생하는, 방법이다.
구현예 26은 구현예 25의 방법으로서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 방법이다.
구현예 27은 구현예 26의 방법으로서, 각 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 방법이다.
구현예 28은 구현예 16 내지 18 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 29는 구현예 28의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 30은 구현예 19 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 31는 구현예 30의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 32는 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2)에서 증폭 반응은 등온 증폭 반응인, 방법이다.
구현예 33은 구현예 32의 방법으로서, 증폭 반응은 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응인, 방법이다.
구현예 34는 구현예 32 또는 33의 방법으로서, 증폭 반응은 실시간 증폭 반응인, 방법이다.
구현예 35는 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 조성물 또는 키트로서, 다음을 포함하는 조성물 또는 키트이다:
(a) 락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
(b) A. 바지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 바지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 바지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 바지내 특이적 증폭 올리고머; 및
(c) G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머.
구현예 36은 구현예 35의 조성물 또는 키트로서,
제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 37은 구현예 35 또는 36의 조성물 또는 키트로서,
제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 38은 구현예 35 내지 37 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서,
제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머, 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머 중 적어도 하나는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자인, 조성물 또는 키트이다.
구현예 39는 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인 구현예 38의 조성물 또는 키트이다.
구현예 40은 구현예 39의 조성물 또는 키트로서, 프로모터 서열이 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 41은 구현예 38의 조성물 또는 키트로서,
제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 42는 구현예 41의 조성물 또는 키트로서, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머가 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 43은 구현예 35 내지 42 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머를 추가로 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 44는 구현예 43의 조성물 또는 키트로서 제 1 및 제 2 포획 프로브 올리고머를 포함하고,
제 1 포획 프로브 올리고머는 락토바실러스 종 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 각각 A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고,
제 1 및 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열 각각은 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착되는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 45는 구현예 44의 조성물 또는 키트로서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니, 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 46은 구현예 45의 조성물 또는 키트로서,
제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 47은 구현예 45 또는 46의 조성물 또는 키트로서, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 48은 구현예 47의 조성물 또는 키트로서,
제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나,
제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 49는 구현예 35 내지 48 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브, 및 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 추가로 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 50은 구현예 49의 조성물 또는 키트로서,
제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 상응하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 51은 구현예 50의 조성물 또는 키트로서,
제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 52는 구현예 49 내지 51 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고,
조성물 또는 키트는 L. 가세리 표적 핵산의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브를 추가로 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 53은 구현예 52의 조성물 또는 키트로서,
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 54는 구현예 53의 조성물 또는 키트로서,
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 55는 구현예 49 내지 51 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 56은 구현예 52 내지 54 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 57은 구현예 55 또는 56의 조성물 또는 키트로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 조성물 또는 키트이다.
구현예 58은 구현예 55 또는 56의 조성물 또는 키트로서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 59은 구현예 58의 조성물 또는 키트로서, 각 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 조성물 또는 키트이다.
구현예 60은 구현예 49 내지 51 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 61은 구현예 60의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 조성물 또는 키트이다.
구현예 62는 구현예 52 내지 54 중 어느 하나의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 63은 구현예 62의 조성물 또는 키트로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 조성물 또는 키트이다.
구현예 64는 대상체에서 세균성 질증 (BV)의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법이다:
(a) BV에 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 검출을 위한 검정법을 수행하는 단계;
(c) 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대해 검출 검정법을 기초로 하는 정량적 값을 할당하는 단계;
(d) A. 버지내의 정량적 값 및 G. 버지날리스의 정량적 값 중 더 큰 값으로부터 락토바실러스 종의 정량적 값을 차감하는 단계;
(e) 단계 (d)를 기초로 하여 단일한 BV 점수를 할당하는 단계; 및
(f) BV 점수와 컷오프 값의 비교를 기초로 하여 대상체에서 BV의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
구현예 65는 구현예 64의 방법으로서, 단계 (c)에서 락토바실러스 종에 대해 최소의 정량적 값이 부여되는, 방법이다.
구현예 66은 구현예 64 또는 65의 방법으로서, 단계 (c)에서 A. 버지내 및 G. 버지날리스에 대해 최소의 정량적 값이 부여되는, 방법이다.
구현예 67은 구현예 64 내지 66 중 어느 하나의 방법으로서, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대한 정량적 값은 표준화되는, 방법이다.
구현예 68은 구현예 67의 방법으로서, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대한 정량적 값은 로그 사본의 단위이며, 표준화는 검출 검정법으로부터 결정된 값으로부터 중앙 모집단 값을 차감하는 것을 포함하는, 방법이다.
구현예 69는 구현예 64 내지 68 중 어느 하나의 방법으로서, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대한 정량적 값은 가중치가 부여되는, 방법이다.
구현예 70은 구현예 64 내지 69 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (d)는 조정 상수를 추가로 첨가하는, 방법이다.
구현예 71은 구현예 64 내지 69 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (d)는 검출 검정법의 시료 억제를 보상하는 내부 대조군 (IC) 조정 인자를 첨가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 IC 조정 인자는 (i) 검출 검정법으로부터 생성된 관찰된 IC 값 대비 (ii) 검출 검정법에 대한 예상된 IC 값의 비율을 기초로 한다.
구현예 72는 구현예 64의 방법으로서, BV 점수는 다음의 공식을 사용하여 할당되고,
BV 점수 = C0 + WL최대값(LS, FLS) + WGA최대값(AS, GS, FGAS) + WIC로그2(IC비율),
여기서 C0은 조정 상수이고;
WL은 락토바실러스 종에 대한 가중치 상수이고;
최대값(LS, FLS)는 LS 및 FLS보다 크고, LS는 락토바실러스 종의 관찰된 표준화된 정량적 값이고, FLS는 락토바실러스 종의 부여된 최소의 표준화된 정량적 값이며;
WGA는 A. 버지내 및 G. 버지날리스에 대한 가중치 상수이고;
최대값(AS, GS, FGAS)는 AS, GS 및 FGAS보다 크고, AS는 A 버지내의 관찰된 표준화된 정량적 값이고, GS는 G. 버지날리스의 관찰된 표준화된 정량적 값이며, FGAS는 A 버지내 및 G. 버지날리스의 부여된 최소의 표준화된 정량적 값이고;
WIC는 내부 대조군 (IC) 가중치 상수이고;
IC비율은 (i) 검출 검정법으로부터 생성된 관찰된 내부 대조군 (IC) 값 대비 (ii) 검출 검정법에 대한 예상된 IC 값의 비율이다.
구현예 73은 FGAS가 0인, 구현예 72의 방법이다.
구현예 74는 구현예 64 내지 73 중 어느 하나의 방법으로서, 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스의 검출을 위한 검정법은 핵산 기반의 검출 검정법인, 방법이다.
구현예 75는 구현예 74의 방법으로서, 핵산 기반의 검출 검정법은 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스의 16S rRNA를 표적하는, 방법이다.
구현예 76은 구현예 75의 방법으로서, 핵산 기반의 검출 검정법은 다음을 표적한다:
(a) 서열번호 1의 약 뉴클레오티드 위치 40번 내지 약 뉴클레오티드 위치 265번의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역;
(b) 서열번호 2의 약 뉴클레오티드 위치 43번 내지 약 뉴클레오티드 위치 247번의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역;
(c) 서열번호 3의 약 뉴클레오티드 위치 93번 내지 약 뉴클레오티드 위치 298번의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역;
(d) 서열번호 4의 약 뉴클레오티드 위치 540번 내지 약 뉴클레오티드 위치 625번의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역; 및/또는
(e) 서열번호 5의 약 뉴클레오티드 위치 172번 내지 약 뉴클레오티드 위치 227번의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역.
구현예 77은 구현예 74 내지 76 중 어느 하나의 방법으로서, 핵산 기반의 검출 검정법은 증폭 기반의 검정법인, 방법.
구현예 78은 증폭 기반의 검정법이 등온 증폭 반응을 포함하는, 구현예 77의 방법이다.
구현예 79는 구현예 78의 방법으로서, 증폭 반응은 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응인, 방법이다.
구현예 80은 구현예 78 또는 79의 방법으로서, 증폭 반응이 실시간 증폭 반응인, 방법이다.
구현예 81은 구현예 79의 방법으로서, 핵산 기반의 검출 검정법은 다음의 단계를 포함하는 증폭 기반의 검정법인, 방법이다:
(1) 시료를
락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기와 같은 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 BV를 진단하는 방법의 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 버지내 특이적 증폭 올리고머; 및
G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
구현예 82는 구현예 81의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 83은 구현예 81 또는 82의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 방법이다.
구현예 84는 구현예 81 내지 83 중 어느 하나의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머, 제 1 A 버지내 특이적 증폭 올리고머 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머 중 적어도 하나는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자인, 조성물 또는 키트이다.
구현예 85는 구현예 84의 방법으로서, 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인, 방법이다.
구현예 86은 구현예 85의 방법으로서, 프로모터 서열이 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법이다.
구현예 87은 구현예 84의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 88은 구현예 87의 방법으로서, 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 89는 구현예 81 내지 88 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 락토바실러스 종, A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 90은 구현예 89의 방법으로서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법이다.
구현예 91은 구현예 90의 방법으로서, 시료는 제 1 및 제 2 포획 프로브 올리고머와 접촉되고,
제 1 포획 프로브 올리고머는 락토바실러스 종 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 각각 A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고,
제 1 및 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열 각각은 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착되는, 방법이다.
구현예 92는 구현예 91의 방법으로서, 제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니, 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 방법이다.
구현예 93은 구현예 92의 방법으로서,
제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 94는 구현예 92 또는 93의 방법으로서, 제 2 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 95는 구현예 94의 방법으로서,
제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나,
제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 96은 구현예 81 내지 95 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 단계 (3)는 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브, 및 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브를 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및
임의의 표적-혼성화된 락토바실러스 특이적, A 버지내 특이적 및 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 97은 구현예 96의 방법으로서,
제 1 A. 버지내 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 상응하는, 조성물 또는 키트이다.
구현예 98은 구현예 97의 방법으로서,
제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열은 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 99는 구현예 96 내지 98 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고,
방법은 하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 100은 구현예 99의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 101은 구현예 100의 방법으로서,
제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 102는 구현예 96 내지 98 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 103은 구현예 99 내지 101 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 104은 구현예 102 또는 103의 방법으로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 방법이다.
구현예 105는 구현예 102 또는 103의 방법으로서, 검출 단계 (3)가 증폭화 단계 (2) 동안 발생하는, 방법이다.
구현예 106은 구현예 105의 방법으로서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 방법이다.
구현예 107은 구현예 106의 방법으로서, 각 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 방법이다.
구현예 108은 구현예 96 내지 98 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 109는 구현예 108의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 110은 구현예 99 내지 101 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 111는 구현예 110의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브, 제 1 A 버지내 특이적 검출 프로브 및 제 1 G. 버지날리스 특이적 검출 프로브 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 112는 구현예 81 내지 111 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2)에서 증폭 반응은 등온 증폭 반응인, 방법이다.
구현예 113은 구현예 112의 방법으로서, 증폭 반응은 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응인, 방법이다.
구현예 114는 구현예 112 또는 113의 방법으로서, 증폭 반응이 실시간 증폭 반응인, 방법이다.
구현예 115는 구현예 64 내지 114 중 어느 하나의 방법으로서, BV와 관련된 10개 이하의 세균 속의 검출을 포함하는, 방법이다.
구현예 116은 구현예 64 내지 114 중 어느 하나의 방법으로서, BV와 관련된 5개 이하의 세균 속의 검출을 포함하는, 방법이다.
구현예 117은 구현예 64 내지 114 중 어느 하나의 방법으로서, 락토바실러스, 아토포비움, 가르드넬라이외의 BV와 관련된 세균 속의 검출을 포함하지 않는, 방법이다.
구현예 118은 구현예 64 내지 117 중 어느 하나의 방법으로서, BV의 존재가 대상체에게 나타나는 경우, 대상체에게 BV에 대한 치료 섭생을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 119는 구현예 64 내지 117 중 어느 하나의 방법으로서, 대상체에서 BV를 모니터링하는 방법이고 대상체는 단계 (a) 이전에 BV에 대한 치료 섭생을 거치는, 방법이다.
구현예 120은 구현예 119의 방법으로서, BV의 존재가 대상체에게 나타나는 경우, (i) 대상체에게 BV에 대한 치료 섭생을 투여하거나, (ii) 대상체에게 BV에 대한 상이한 치료 섭생을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 121은 시료에서 락토바실러스 종의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법이다:
(1) 락토바실러스 종을 포함하는 것으로 의심되는 시료를 락토바실러스 종의 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 제 3 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 제 4 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, 락토바실러스 종 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 락토바실러스 종의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
구현예 122는 구현예 121의 방법으로서,
제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 3 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 4 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 123은 구현예 122의 방법으로서,
제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 3 표적-혼성화 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 4 표적-혼성화 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 방법이다.
구현예 124는 구현예 121 내지 123 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자인, 방법이다.
구현예 125는 구현예 124의 방법으로서, 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인, 방법이다.
구현예 126은 구현예 125의 방법으로서, 프로모터 서열이 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법이다.
구현예 127은 구현예 124의 방법으로서,
제 1 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 128은 구현예 121 내지 127 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 락토바실러스 종 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 129는 구현예 128의 방법으로서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 락토바실러스 종 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 방법이다.
구현예 130은 구현예 129의 방법으로서, 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스, L. 젠세니, 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 방법이다.
구현예 131은 구현예 130의 방법으로서,
제 1 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 132는 구현예 131의 방법으로서, 포획 프로브 올리고머 서열이 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 133은 구현예 121 내지 132 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 단계 (3)는 락토바실러스 종 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 검출 프로브와 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및
임의의 표적-혼성화된 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 134는 구현예 133의 방법으로서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고,
하나 이상의 증폭 산물을 L. 가세리 표적 핵산의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 검출 프로브와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 135는 구현예 134의 방법으로서,
제 1 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열에 상응하고/거나,
제 2 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 136은 구현예 135의 방법으로서,
제 1 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 137은 구현예 133의 방법으로서, 제 1 검출 프로브는 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 138은 구현예 137의 방법으로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 방법이다.
구현예 139는 구현예 137의 방법으로서, 검출 단계 (3)가 증폭화 단계 (2) 동안 발생하는, 방법이다.
구현예 140은 구현예 139의 방법으로서, 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 방법이다.
구현예 141은 구현예 140의 방법으로서, 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 방법이다.
구현예 142는 구현예 134 내지 136 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 및 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브 각각은 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 143은 구현예 142의 방법으로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 방법이다.
구현예 144는 구현예 142의 방법으로서, 검출 단계 (3)가 증폭화 단계 (2) 동안 발생하는, 방법이다.
구현예 145는 구현예 144의 방법으로서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 방법이다.
구현예 146은 구현예 145의 방법으로서, 각 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 방법이다.
구현예 147은 구현예 133의 방법으로서, 제 1 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 148은 구현예 147의 방법으로서, 제 1 검출 프로브는 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 149는 구현예 134 내지 136 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 및 제 2 검출 프로브 중 적어도 하나는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 150은 구현예 149의 방법으로서, 제 1 및 제 2 검출 프로브는 각각은 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 151은 시료에서 A. 버지내의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법이다:
(1) A. 버지내를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 A. 버지내 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, A. 버지내 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 A. 버지내의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
구현예 152는 구현예 151의 방법으로서,
제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 153은 구현예 151 또는 152의 방법으로서,
제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 방법이다.
구현예 154는 구현예 151 내지 153 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자인, 방법이다.
구현예 155는 구현예 154의 방법으로서, 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인, 방법이다.
구현예 156은 구현예 155의 방법으로서, 프로모터 서열이 서열번호 18의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법이다.
구현예 157은 구현예 154의 방법으로서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 158은 구현예 151 내지 157 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 A. 버지내 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 159는 구현예 158의 방법으로서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 A. 버지내 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 방법이다.
구현예 160은 구현예 159의 방법으로서, 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 161은 구현예 160의 방법으로서, 포획 프로브 올리고머가 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 162는 구현예 151 내지 161 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 단계 (3)는 A. 버지내 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 검출 프로브와 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및
임의의 표적-혼성화된 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 163은 구현예 162의 방법으로서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 164는 구현예 163의 방법으로서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 165는 구현예 162 내지 164 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 프로브는 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 166은 구현예 165의 방법으로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 방법이다.
구현예 167은 구현예 165의 방법으로서, 검출 단계 (3)가 증폭화 단계 (2) 동안 발생하는, 방법이다.
구현예 168은 구현예 167의 방법으로서, 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 방법이다.
구현예 169는 구현예 168의 방법으로서, 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 방법이다.
구현예 170은 구현예 162 내지 164 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 171은 구현예 170의 방법으로서, 검출 프로브는 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 172는 시료에서 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법이다:
(1) G. 버지날리스를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 증폭 올리고머로서, (i) 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
(2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 G. 버지날리스 표적 핵산은 시료에 존재하는 경우, G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
(3) 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 시료에서 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
구현예 173는 구현예 172의 방법으로서,
제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 174는 구현예 172 또는 173의 방법으로서,
제 1 표적-혼성화 서열은 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나;
제 2 표적-혼성화 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 방법이다.
구현예 175는 구현예 172 내지 174 중 어느 하나의 방법으로서, 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자인, 방법이다.
구현예 176은 구현예 175의 방법으로서, 프로모터 서열이 T7 프로모터 서열인, 방법이다.
구현예 177은 구현예 176의 방법으로서, 프로모터 서열이 서열번호 15의 잔기 9번 내지 36번의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법이다.
구현예 178은 구현예 175의 방법으로서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 179는 구현예 178의 방법으로서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 180은 구현예 172 내지 179 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2) 이전에 시료에서, 존재하는 경우 G. 버지날리스 표적 핵산을 다른 구성성분으로부터 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 181은 구현예 180의 방법으로서, 정제화 단계는 고정화된 프로브에 결합하는 서열 또는 모이어티에 공유 부착된 표적-혼성화 서열을 포함하는 적어도 하나의 포획 프로브 올리고머와 시료를 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 G. 버지날리스 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는, 방법이다.
구현예 182는 구현예 181의 방법으로서, 포획 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 183은 구현예 182의 방법으로서, 포획 프로브 올리고머가 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 184는 구현예 172 내지 183 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 단계 (3)는 G. 버지날리스 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 검출 프로브와 하나 이상의 증폭 산물과 접촉시키는 단계; 및
임의의 표적-혼성화된 검출 프로브의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 185는 구현예 184의 방법으로서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는, 방법이다.
구현예 186은 구현예 185의 방법으로서, 검출 프로브 표적-혼성화 서열은 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법이다.
구현예 187은 구현예 184 내지 186 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 프로브는 표지를 포함하는, 방법이다.
구현예 188은 구현예 187의 방법으로서, 표지는 화학발광성 표지 또는 형광성 표지인, 방법이다.
구현예 189는 구현예 187의 방법으로서, 검출 단계 (3)가 증폭화 단계 (2) 동안 발생하는, 방법이다.
구현예 190은 구현예 189의 방법으로서, 각 검출 프로브는 형광성 표지 및 소광제를 포함하는, 방법이다.
구현예 191은 구현예 190의 방법으로서, 각 검출 프로브는 분자 토치, 분자 비콘 또는 TaqMan 검출 프로브인, 방법이다.
구현예 192는 구현예 184 내지 186 중 어느 하나의 방법으로서, 검출 프로브는 비-표적-혼성화 서열을 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 193은 구현예 192의 방법으로서, 검출 프로브는 분자 토치 또는 분자 비콘인, 방법이다.
구현예 194는 구현예 121 내지 193 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (2)에서 증폭 반응은 등온 증폭 반응인, 방법이다.
구현예 195는 구현예 194의 방법으로서, 증폭 반응은 전사 매개된 증폭 (TMA) 반응인, 방법이다.
구현예 196은 구현예 194 또는 195의 방법으로서, 증폭 반응이 실시간 증폭 반응인, 방법이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 설명된 방법 및 조성물과 관련하여 당업자가 공통적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용되는 바와 같이, 다음의 용어 및 어구는 달리 명시되지 않는 한 이들에 속하는 의미를 갖는다.
용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥 상 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
접속사 "또는"은 포괄적인 의미, 즉 문맥 상 달리 포괄적인 의미가 불합리하지 않는 한 "및/또는"과 동등한 것으로서 해석되어야 한다.
용어 "약"은 조성물의 활성 또는 안정성에 미치는 어떤 유의한 효과도 없는 조성물의 구성성분의 양의 실질적이지 않은 변동을 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 진술된 값의 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5％ 내의 변동을 포함한다.
모든 범위는 "종결점을 포함하지 않음"과 같은 명시적 제외가 없는 경우 종결점을 포함하는 것으로서 해석되어야 하고, 따라서 예를 들면, "10 내지 15 이내"는 값 10 및 15, 뿐만 아니라 종결점 사이의 모든 정수 및 (가능한 곳에서) 정수가 아닌 값, 예로 11, 11.5, 12 및 1/3, 4π등을 포함한다.
용어 "포함하다", "포함하다", "포함하는", "포함하다 (contain)", "포함하다", "포함하는", "포함하다 (include)", "포함하다" 및 "포함하는"은 제한하려는 의도가 아니다.
"시료"는 락토바실러스 종, 아토포비움 버지내 또는 가르드네렐라 버지날리스 또는 이들의 구성성분, 예컨대 핵산 또는 핵산의 단편을 포함할 수 있는 임의의 표본을 포함한다. 시료는 예로 질 면봉 시료, 자궁경부 브러쉬 시료, 기관지경 검사와 같은 호흡기 조직 또는 삼출물, 기관지폐포 세척물 (BAL) 또는 폐 생검, 가래, 타액, 말초 혈액, 혈장, 혈청, 림프절, 위창자 조직, 대변, 소변, 정액 또는 기타 체액 또는 물질을 포함하는, 락토바실러스 종, 아토포비움 버지내 또는 가르드네렐라 버지날리스 또는 이들의 구성성분 (예로, 이들로부터 유래한 표적 핵산)을 포함할 수 있는 생존 또는 사망한 인간으로부터 유래한 임의의 조직 또는 물질을 포함하는 "생물학적 시료"를 포함한다. 생물학적 시료는 조직 또는 세포 구조를 물리적으로 또는 기계적으로 파괴하도록 처리될 수 있고, 따라서 표준 방법을 사용하여 분석용 생물학적 시료를 준비하는데 사용되는 효소, 완충액, 염 및 세제 등을 추가로 포함할 수 있는 용액으로 세포내 성분을 방출할 수 있다. 또한, 시료는 여과 장치 위로 또는 이에 시료의 통과 또는 이어진 원심분리로부터, 또는 배지, 매트릭스 또는 지지체에 부착에 의해 획득된 시료와 같은 프로세싱된 시료를 포함할 수 있다.
“핵산"은 둘 이상의 공유 결합된 뉴클레오시드 또는 질소성 헤테로고리 염기를 갖는 뉴 클레오시드 유사체 또는 염기 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 말하며, 여기서 뉴클레오시드는 포스포디에스테르 결합 또는 기타 연결에 의해 다함께 결합되어 폴리뉴클레오티드를 형성한다. 핵산은 RNA, DNA 또는 키메라 DNA-RNA 중합체 또는 올리고뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함한다. 핵산 "골격"은 당-포스포디에스테르 결합, 펩티드-핵산 결합 ("펩티드 핵산" 또는 PNA에서, PCT 국제출원 WO 95/32305 참조), 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 다양한 결합으로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스, 또는 공지된 치환, 예로 2' 메톡시 치환 및 2' 할로겐화물 치환 (예로, 2'-F)을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 질소성 염기는 통상적인 염기 (A, G, C, T, U), 이들의 유사체 (예로, 이노신, 5-메틸리소사이토신, 이소구아닌; The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 제 11판, 1992, Abraham et al., 2007, BioTechniques 43: 617-24)일 수 있고, 이는 퓨린 또는 피리미딘 염기의 유도체를 포함한다 (예로, N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자 또는 아자-피리미딘, 5번 또는 6번 위치에 치환기를 갖는 피리미딘 염기, 2번, 6번 및/또는 8번 위치에 변경되거나 대체된 치환을 갖는 퓨린 염기, 예컨대 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸하이드라진-피리미딘 및 O4-알킬-피리미딘, 그리고 피라졸로 화합물, 예컨대 치환되지 않은 또는 3-치환된 피라졸로[3,4-d]피리미딘; 미국 특허 US 5,378,825, US 6,949,367 및 PCT 국제특허출원 WO 93/13121). 핵산은 골격이 하나 이상의 잔기에 대해 질소성 염기를 포함하지 않는 "무염기성" 잔기를 포함할 수 있다 (미국 특허 US 5,585,481). 핵산은 RNA 및 DNA에서 발견되는 통상적인 당, 염기 및 결합만을 포함할 수 있거나, 통상적인 구성성분 및 치환 (예로, 2' 메톡시 골격에 의해 연결된 통상적인 염기 또는 통상적인 염기 및 하나 이상의 염기 유사체의 혼합물을 포함하는 핵산)을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드 단량체가 RNA 모방하는 당 입체구조에서 잠기는 이중고리 퓨라노스 단위를 갖는 "잠금 핵산" (LNA)을 포함할 수 있으며, 이는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 단일 가닥 DNA (ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA (dsDNA)에서 상보적 서열에게로 혼성화 친화도를 증진시킨다 (Vester et al., Biochemistry 43: 13233-41, 2004). 핵산은 핵산의 기능 또는 거동을 변경하도록 변형된 염기, 예로 추가적인 뉴클레오티드가 핵산에 첨가되는 것을 차단하는 3' 말단 디데옥시뉴클레오티드의 첨가를 포함할 수 있다. 핵산을 일상적인 기술을 사용하여 천연 공급원으로부터 정제할 수 있지만, 시험관내에서 핵산을 제조하는 합성 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 핵산 사슬을 의미한다. 본 출원 전반에 걸쳐, 핵산은 5' 말단부터 3' 말단까지로 지정된다. 표준 핵산, 예로 DNA 및 RNA는 전형적으로 "5' 내지 3'", 즉 성장하는 핵산의 3' 말단에 뉴클레오티드를 추가하여 합성된다.
본원에 사용된 "뉴클레오티드"는 포스페이트기, 5개 탄소 당 및 질소성 염기로 구성된 핵산의 소단위체이다. RNA에서 발견되는 5개 탄소 당은 리보스이다. DNA에서 5개 탄소 당은 2'-데옥시리보스이다. 이 용어는 또한 이러한 소단위체의 유사체, 예컨대 리보스 (2'-O-Me)의 2' 위치에서 메톡시기를 포함한다.
본원에 사용된 "핵산 기반의 검출 검정법"은 표적 핵산 내의 표적 서열을 검출하고, 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 검정법이다.
본 발명에 따른 특정 구현예에서, 핵산 기반의 검출 검정법은 "증폭 기반의 검정법", 즉 핵산 표적 서열을 증폭하는 하나 이상의 단계를 이용하는 검정법이다. 검출 검정법에 사용되는 다양한 증폭 방법이 당 업계에 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 본원에 추가로 요약된다. 명확하게, 증폭 기반의 검정법은, 예를 들면 비-증폭 기반의 검정 방법에 사용되는 단계 (예로, 혼성화 검정법 또는 절단 기반의 검정법)과 같은 표적 서열을 증폭하지 않는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산 기반의 검출 검정법은 "비-증폭 기반의 검정법, 즉 핵산 표적 서열을 증폭하는 임의의 단계에 의존하지 않는 검정법이다. 명확하게, 임의의 상응하는 하류 증폭 올리고머가 없이 프라이머의 연장을 위한 반응을 포함하는 (예로, RNA : DNA 이중체를 생성하도록 역전사효소에 의한 프라이머의 연장, 이어지는 RNA의 RNase 소화로 cDNA 사본을 생성하지 않고도 RNA 표적에 상보적인 단일 가닥 cDNA를 생성함) 핵산 기반의 검출 검정법은 비-증폭 기반의 검정법인 것으로 이해된다.
예시적인 비-증폭 기반의 검정법은 "절단 기반의 검정법"이며, 이는 표적 핵산에 대한 중첩 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화에 의해 형성되는 선형 이중체 절단 구조의, 플랩 엔도뉴클레아제 (flap endonuclease)에 의한 특이적 절단에 의존하는 검정법이다. 이러한 검정법에서, 비-표적-혼성화 플랩 영역을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드는 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 중첩 의존적 방식으로 절단되어, 다음에 검출되는 절단 산물을 방출한다. 절단 기반의 검정법의 원리는 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 예시적인 검정법은 예를 들면 Lyamichev et al., Nat. Biotechnol. 17: 292-296, 1999; Ryan et al., Mol. Diagn. 4: 135-144, 1999; Allawi et al., J. Clin. Microbiol. 44: 3443-3447, 2006; Brow et al.의 미국 특허 US 5,846,717 및 US 6,706,471 및 Dahlberg et al.의 미국 특허 US 5,614,402에 기술된다. 절단 기반의 검정법은 예로 시판되는 인베이더® 검정법 (Hologic, Inc., Madison, WI)을 포함한다.
본원에 사용된 "표적 핵산"은 검출될 표적 서열을 포함하는 핵산이다. 표적 핵산은 본원에 기술된 바와 같은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 표적 핵산은 표적 서열 이외의 다른 서열을 포함할 수 있다.
"단리된"은 표적 핵산을 포함하는 시료가 자연 환경에서 수집된 것을 의미하지만, 이 용어는 임의의 정제 정도를 의미하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 검출될 표적 핵산의 특정한 뉴클레오티드 서열을 말한다. "표적 서열"은 검출 과정 (예를 들면 TMA 또는 PCR과 같은 증폭 기반의 검출 검정법 또는 예를 들면 절단 기반의 검정법과 같은 비-증폭 기반의 검출 검정법) 동안 올리고뉴클레오티드 (예로, 프로브 올리고뉴클레오티드, 프라이밍 올리고뉴클레오티드 및/또는 프로모터 올리고뉴클레오티드)가 복합체를 형성하는 복합화 서열을 포함한다. 표적 핵산이 원래 단일 가닥인 곳에서, 용어 "표적 서열"은 또한 표적 핵산에 존재하는 "표적 서열"에 상보적인 서열을 말할 것이다. 표적 핵산이 원래 이중 가닥인 곳에서, 용어 "표적 서열"은 센스 (+) 및 안티센스 (-) 가닥 둘 다를 말한다. 표적 서열을 선택할 때, 당업자라면 관련이 없거나 밀접하게 관련된 표적 핵산을 구별하도록 "독특한"서열이 선택되어야 함을 이해할 것이다.
"표적-혼성화 서열"은 본원에서 표적 핵산 서열과 혼성화하도록 구성된 올리고머의 부분을 말하는데 사용된다. 바람직하게, 표적-혼성화 서열은 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하도록 구성된다. 표적-혼성화 서열은 이들이 혼성화하도록 구성된 표적 서열의 부분에 100％ 상보적일 수 있지만, 반드시 이런 것은 아니다. 표적-혼성화 서열은 또한 표적 서열과 비교하여 삽입, 결실 및/또는 치환된 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다. 표적 서열에 대한 표적-혼성화 서열의 100％ 미만의 상보성은, 예를 들면 표적 핵산이 종 내의 다수 균주의 것일 때, 예컨대 락토바실러스의 다양한 균주에 혼성화하도록 구성된 올리고머의 경우일 때 발생할 수 있다. 표적 핵산에 대해 100％ 미만의 상보성을 갖도록 표적-혼성화 서열을 구성하는 다른 이유가 있는 것으로 이해된다.
락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 핵산의 영역과 관련하여 본원에 사용되는 용어 "서열을 표적하다"는 올리고뉴클레오티드가 본원에 설명된 바와 같이 검출을 허용하는 방식으로 표적 서열에 혼성화하는 과정을 말한다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 표적화된 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 핵산 서열과 상보적이며, 미스매칭을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 표적화된 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 핵산 서열과 상보적이지만, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 미스매칭을 포함한다. 바람직하게는, 표적 핵산 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 상보적인 적어도 10개 내지 50개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 적어도 10개 내지 50개 이하는 포괄적 범위로, 10개, 50개 및 이들 사이의 각 정수가 포함되는 것으로 이해된다. 바람직하게, 올리고머는 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다.
용어 "구성된 (configured to)"은 기준 올리고뉴클레오티드 표적-혼성화 서열의 폴리뉴클레오티드 서열 입체구조의 실제 배열을 나타낸다. 예를 들면, 표적 서열에 특이적으로 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 기준 서열에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화하도록 구성된"은 올리고뉴클레오티드의 표적-혼성화 영역이 기준 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 표적 영역의 서열을 표적할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖도록 설계된 것을 의미한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 상응 서열만을 표적화하는데 한정되지 않고, 오히려 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 표적 핵산을 표적하기 위한 키트에서 또는 방법에서 조성물로서 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 시료로부터 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스의 검출을 위한 검정법의 구성성분으로서 기능하도록 설계되고, 따라서 테스트 시료에서 보편적으로 발견되는 다른 핵산의 존재 시 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스를 표적하도록 설계된다. "특이적으로 혼성화하다"는 당 업계에서 이해되는 바와 같이, 비-표적 핵산에 대한 약간의 혼성화 수준이 발생할 수 있기 때문에 배타적으로 혼성화하는 것을 의미하지는 않는다. 오히려, "특이적으로 혼성화하다"는 올리고뉴클레오티드가 표적을 주로 혼성화하는 검정법에서 기능하도록 구성되어, 시료에서 표적 핵산의 정확한 검출이 결정될 수 있음을 의미한다. 용어 "구성된"은 올리고뉴클레오티드 표적-혼성화 서열의 폴리뉴클레오티드 서열 입체구조의 실제 배열을 나타낸다.
락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 표적화된 핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "단편"은 연접한 핵산의 일부를 말한다. 특정 구현예에서, 단편은 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 16S 리보좀 RNA로부터의 연접한 뉴클레오티드를 포함하며, 단편에서 16S 연접한 뉴클레오티드의 수는 전체 16S에 대한 수보다 적다.
본원에 사용된 용어 "영역"은 핵산의 일부를 말하며, 상기 부분은 전체 핵산보다 더 작다. 예를 들면, 기준 핵산이 올리고뉴클레오티드 프로모터 프라이머일 때, 용어 "영역"은 전체 올리고뉴클레오티드의 더 작은 프로모터 부분을 말하는데 사용될 수 있다. 유사하게 또한 단지 예로서, 핵산이 16S 리보좀 RNA일 때, 용어 "영역"은 핵산의 더 작은 영역을 말하는데 사용될 수 있으며, 더 작은 영역은 본 발명의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화된다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 기준 핵산이 앰플리콘일 때, 용어 영역은 프로브의 표적-혼성화 서열에 의한 혼성화를 위해 확인된 더 작은 뉴클레오티드 서열을 말하는데 사용될 수 있다.
상호교환가능한 용어 "올리고머", "올리고" 및 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 약 5개의 뉴클레오티드 (nt) 잔기의 하한 및 약 500개 내지 900개 nt 잔기의 상한을 갖는 범위의 중합체를 포함하는 1,000개 미만의 뉴클레오티드 잔기를 갖는 핵산을 말한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 12개 내지 15개 nt의 하한 및 약 50개 내지 600개 nt의 상한을 갖는 크기 범위이고, 다른 구현예는 약 15개 내지 20개 nt의 하한 및 약 22개 내지 100개 nt의 상한을 갖는 범위이다. 올리고뉴클레오티드는 자연 발생 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 다양한 잘 공지된 효소적 또는 화학적 방법 중 임의의 것을 사용하여 합성될 수 있다. 용어 올리고뉴클레오티드는 시약에 대한 임의의 특정한 기능을 말하지 않고, 오히려 본원에 설명된 이러한 시약 모두를 포괄하도록 일반명으로 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 다양한 상이한 기능을 부여할 수 있다. 예를 들면, 상보적 가닥에 특이적이고 이에 혼성화할 수 있으며 핵산 중합효소의 존재 시 추가로 연장될 수 있는 경우 프라이머로서 기능할 수 있고; RNA 중합효소에 의해 인식되는 서열을 포함하고 전사를 허용하는 경우 프라이머로서 기능하고 프로모터를 제공할 수 있으며 (예로, T7 프라이머); 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘에 혼성화할 수 있는 경우 표적 핵산을 검출하도록 기능할 수 있고, 검출가능한 모이어티 (예로, 아크리디늄-에스테르 화합물)를 추가로 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정된 기준 핵산 서열에 "실질적으로 상응하는" 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 기준 핵산 서열과 충분히 유사하여 올리고뉴클레오티드가 엄격한 혼성화 조건 하에서 동일한 표적 핵산 서열과 혼성화할 것이라는 점에서 기준 핵산 서열과 유사한 혼성화 성질을 갖는 것을 의미한다. 당업자라면 "실질적으로 상응하는 올리고뉴클레오티드"가 기준 서열로부터 달라질 수 있고, 동일한 표적 핵산 서열에 여전히 혼성화할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 제 2 핵산에 상응하는 제 1 핵산은 RNA 및 DNA를 포함하고, 문맥 상 달리 분명하게 진술하지 않는 한 이의 상보체를 포함하는 것으로 이해된다. 핵산으로부터의 이러한 변이는 서열 내의 동일한 염기의 백분율 또는 프로브 또는 프라이머와 이의 표적 서열 사이의 완벽하게 상보적인 염기의 백분율의 견지에서 진술될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 염기 동일성 또는 상보성의 이러한 백분율이 100％ 내지 약 80％인 경우 올리고뉴클레오티드는 기준 핵산 서열에 "실질적으로 상응한다". 바람직한 구현예에서, 백분율은 100％ 내지 약 85％이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 이 백분율은 100％ 내지 약 90％이고; 다른 바람직한 구현예에서, 이 백분율은 100％ 내지 약 95％이다. 유사하게, 핵산 또는 증폭된 핵산의 영역은 본원에 기준 핵산 서열에 상응하는 것으로 언급될 수 있다. 당업자라면 허용가능하지 않은 수준의 비-특이적 혼성화를 유발하지 않고도 특이적 표적 서열에 대한 혼성화를 허용하도록 다양한 상보성 백분율에서 요구될 수 있는 혼성화 조건에 대한 다양한 변형을 이해할 것이다.
"증폭 올리고머"는 적어도 3' 말단이 표적 핵산에 상보적이고, 표적 핵산 또는 이의 상보체에 혼성화하며, 핵산 증폭 반응에 참여하는 올리고머이다. 증폭 올리고머의 예는 표적 핵산에 혼성화하고, 증폭 과정에서 중합효소에 의해 연장되는 3' OH 말단을 포함하는 "프라이머"이다. 증폭 올리고머의 또 다른 예는 중합효소에 의해 연장되지 않지만 (예로, 3' 차단된 말단을 갖기 때문임), 증폭에 참여하거나 이를 용이하게 하는 올리고머이다. 예를 들면, 증폭 올리고뉴클레오티드의 5' 영역은 표적 핵산에 상보적이지 않은 프로모터 서열 ("프로모터 프라이머" 또는 "프로모터 제공자"로 지칭될 수 있음)을 포함할 수 있다. 당업자라면 프라이머로서 기능하는 증폭 올리고머가 5' 프로모터 서열을 포함하도록 변형되고, 따라서 프로모터 프라이머로 기능할 수 있음을 이해할 것이다. 3' 차단된 말단을 혼입하는 것은 프로모터 프라이머를 추가로 변형하고, 이는 이제 표적 핵산을 혼성화하고, 전사를 개시하도록 작용하지만 올리고 연장용 프라이머를 제공하지는 않는 상류 프로모터 서열을 제공할 수 있다. 이러한 변형된 올리고는 본원에서 "프로모터 제공자" 올리고머로서 지칭된다. 증폭 올리고뉴클레오티드의 크기 범위는 약 10개 내지 약 70개 nt 길이이고 (임의의 프로모터 서열 또는 폴리-A 말단을 포함하지 않음), 표적 핵산 서열 (또는 이의 상보적 가닥)의 영역에 상보적인 적어도 약 10개의 연접한 염기 또는 심지어 적어도 12개의 연접한 염기를 포함하는 범위를 포함한다. 연접한 염기는 증폭 올리고머가 결합하는 표적 서열에 대해 적어도 80％ 또는 적어도 90％, 또는 완벽하게 상보적이다. 증폭 올리고머는 선택적으로 변형된 뉴클레오티드 또는 유사체, 또는 증폭 반응에 참여하지만 표적 핵산 또는 주형 서열에 상보적이지 않거나 포함되지 않는 추가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 증폭 올리고머는 프라이밍 효율을 조정하도록 헤어핀을 형성할 목적으로 이의 3' 말단에 상보적인 추가적인 뉴클레오티드를 이의 5' 말단에 포함할 수 있다 (예로, 프로모터 프라이머는 이러한 목적으로 프로모터 서열의 상류에 추가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있음). 올리고뉴클레오티드, 앰플리콘 또는 기타 핵산의 길이에 대한 범위를 언급할 때, 범위는 모든 정수를 포함하는 것으로 이해된다 (예로, 19개 내지 25개 길이의 연접한 뉴클레오티드는 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 및 25개를 포함함).
본원에 사용된 "프로모터"는 핵산에 결합하고 특이적 부위에서 RNA의 전사를 시작하는 신호로서 DNA-의존성 RNA 중합효소 ("전사효소")에 의해 인식되는 특이적 핵산 서열이다.
본원에 사용된 "프로모터 제공자" 또는 "제공자"는 제 1 및 제 2 영역을 포함하고, 이의 3' 말단으로부터 DNA 합성의 개시를 방지하도록 변형된 올리고뉴클레오티드를 말한다. 프로모터 제공자 올리고뉴클레오티드의 "제 1 영역"은 DNA 주형에 혼성화하는 염기 서열을 포함하며, 여기서 혼성화 서열은 프로모터 영역에 반드시 인접하지는 않지만 3'에 위치한다. 프로모터 올리고뉴클레오티드의 혼성화 부분은 전형적으로 10개 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 최대 50개 이상의 뉴클레오티드 길이로 연장될 수 있다. "제 2 영역"은 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함한다. 프로모터 올리고뉴클레오티드는 RNA- 또는 DNA-의존성 DNA 중합효소, 예로 바람직하게 상기 설명된 바와 같이 이의 3' 말단에 차단 모이어티를 포함하는 역전사효소에 의해 연장될 수 없도록 조작된다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "T7 제공자"는 T7 RNA 중합효소에 의해 인식되는 올리고뉴클레오티드 서열을 제공하는 차단된 프로모터 제공자 올리고뉴클레오티드이다.
“증폭"은 표적 핵산 서열 또는 이의 상보체 또는 이들의 단편의 다중 사본을 획득하기 위한 임의의 공지된 절차를 말한다. 다중 사본은 앰플리콘 또는 증폭 산물로서 지칭될 수 있다. 공지된 증폭 방법은 열 순환 및 등온 증폭 방법을 둘 다 포함한다. 일부 구현예에서, 등온 증폭 방법이 바람직하다. 복제효소 매개된 증폭, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 라이게이즈 연쇄반응 (LCR), 가닥 치환 증폭 (SDA) 및 전사 매개된 또는 전사 관련된 증폭은 핵산 증폭 방법의 비-제한적인 예이다. 복제효소 매개된 증폭은 자가-복제 RNA 분자 및 QB-복제효소와 같은 복제효소를 사용한다 (예로, 미국 특허 US 4,786,600). PCR 증폭은 DNA 중합효소, 프라이머 쌍 및 열 순환을 사용하여 dsDNA의 2개 상보적 가닥의 또는 cDNA로부터의 다중 사본을 합성한다 (예로, 미국 특허 US 4,683,195, US 4,683,202 및 US 4,800,159). LCR 증폭은 4개 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 혼성화, 라이게이션 및 변성의 다수의 순환을 사용함으로써 표적 및 이의 상보적 가닥을 증폭시킨다 (예로, 미국 특허 US 5,427,930 및 US 5,516,663). SDA는 제한 엔도뉴클레아제 및 표적 서열을 포함하는 반-변형된 DNA 이중체의 한 가닥을 자르는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하는 프라이머를 사용하고, 이로써 증폭이 일련의 프라이머 연장 및 가닥 치환 단계로 발생한다 (예로, 미국 특허 US 5,422,252; US 5,547,861; 및 US 5,648,211). 바람직한 구현예는 전사 매개된 증폭 (TMA) 또는 NASBA와 같은 RNA 표적 핵산의 증폭에 적합한 증폭 방법을 사용하지만, 본원에 개시된 올리고머가 다른 증폭 방법의 프라이머로서 쉽게 사용될 수 있음이 당업자에게라면 자명할 것이다.
본원에서 “전사 매개된 증폭" (TMA)으로도 지칭되는 "전사 관련된 증폭"은 핵산 주형으로부터 다수의 RNA 전사체를 생산하도록 RNA 중합효소를 사용하는 핵산 증폭을 말한다. 이들 방법은 일반적으로 RNA 중합효소, DNA 중합효소, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 프로모터 서열을 포함하고 선택적으로 하나 이상의 다른 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있는 주형 상보적인 올리고뉴클레오티드를 채용한다. TMA 방법은 본원에 기재된 바와 같은 표적 서열을 증폭 및 검출하는데 사용되는 증폭 방법의 구현예이다. 전사 관련된 증폭의 변형은 이전에 자세하게 개시된 바와 같이 당 업계에 잘 알려져 있다 (예로, 미국 특허 US 4,868,105; US 5,124,246; US 5,130,238; US 5,399,491; US 5,437,990; US 5,554,516; 및 US 7,374,885; 및 PCT 국제특허출원 WO 88/01302, WO 88/10315 및 WO 95/03430). 당업자라면 개시된 조성물이 중합효소에 의한 올리고머 서열의 연장을 기초로 하는 증폭 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "실시간 TMA"는 실시간 검출 수단에 의해 모니터링되는 표적 핵산의 전사 매개된 증폭 ("TMA")을 말한다.
"증폭 산물"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "앰플리콘"은 표적 서열 내에 포함된 서열에 상보적 또는 상동성인 증폭 절차 동안 생성된 핵산 분자를 말한다. 이들 용어는 단일 가닥 증폭 산물, 이중 가닥 증폭 산물 또는 이중 가닥 증폭 산물의 가닥 중 하나를 말하는데 사용될 수 있다.
“프로브", "검출 프로브", "검출 올리고뉴클레오티드" 및 "검출 프로브 올리고머"는 본원에서 표적 서열 또는 증폭된 핵산의 검출을 허용하도록 혼성화를 촉진하는 조건 하에 핵산 또는 증폭된 핵산에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 올리고머를 말하는데 상호교환적으로 사용된다. 검출은 직접적 (예로, 표적 서열에 직접 혼성화된 프로브) 또는 간접적 (예로, 중간체 분자 구조를 통해 표적에 연결된 프로브)일 수 있다. 프로브는 DNA, RNA, 이들의 유사체 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이들은 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 프로브의 "표적 서열"은 일반적으로 표준 염기 쌍에 의해 프로브 올리고머의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화하는 더 큰 핵산 서열 내의 더 작은 핵산 서열을 말한다. 프로브는 프로브의 3차원 입체구조에 기여하는 표적 특이적 서열 및 기타 서열을 포함할 수 있다 (예로, 미국 특허 US 5,118,801; US 5,312,728; US 6,849,412; US 6,835,542; US 6,534,274; 및 US 6,361,945; 및 미국 특허출원공개 US 20060068417). 바람직한 구현예에서, 검출 프로브는 더 높은 신호를 생성할 수 있는 2' 메톡시 골격을 포함한다.
용어 "TaqMan® 프로브"는 전형적으로 5' 염기 상에 형광성 염료 및 전형적으로 3' 염기 상에 비-형광성 소광 염료 (소광제)를 포함하는 검출 올리고뉴클레오티드를 말한다. 광조사될 때, 여기된 형광 염료는 형광을 내기보다는 근처의 소광 염료 분자로 에너지를 전달하여 비-형광성 기질을 생성한다. 증폭 동안, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 TaqMan 프로브를 절단하여 소광제로부터 형광단을 분리하고, 이로써 증폭의 지시인자로서 형광단으로부터 소광되지 않은 신호가 방출되도록 한다.
본원에서 사용되는 "표지"는 검출되거나 검출가능한 신호로 이어지는 프로브에 직접 또는 간접적으로 연결된 모이어티 또는 화합물을 말한다. 직접적 표지화는 공유 결합 또는 비공유 상호작용, 예로 수소 결합, 소수성 및 이온 상호작용, 킬레이트 또는 배위 복합체의 형성을 포함하여 표지를 프로브에 연결하는 결합 또는 상호작용을 통해 발생할 수 있다. 간접적 표지화는 결합 쌍 구성원, 항체 또는 추가적인 올리고머와 같은 가교 모이어티 또는 "링커"의 사용을 통해 발생할 수 있으며, 이는 직접 또는 간접적으로 표지되고, 검출가능한 신호를 증폭할 수 있다. 표지는 방사성 핵종, 리간드 (예로, 바이오틴, 아비딘), 효소 또는 효소 기질, 반응성 기 또는 발색단 (예로, 검출가능한 색상을 부여하는 염료, 입자 또는 비드), 발광성 화합물 (예로, 생체발광성, 인광성 또는 화학발광성 표지) 또는 형광단과 같은 임의의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 표지는 혼합물에서 결합된 표지된 프로브가 결합되지 않은 표지된 프로브의 변화와는 상이한 검출가능한 변화, 예로 불안정성 또는 차별적 분해 성질을 나타내는 균질한 검정법에서 검출가능할 수 있다. "균질한 검출가능한 표지"는 표지 또는 표지된 프로브의 결합되지 않은 형태로부터 물리적으로 제거하지 않고도 검출될 수 있다 (예로, 미국 특허 US 5,283,174, US 5,656,207 및 US 5,658,737). 표지는 화학발광성 화합물, 예로 표준 AE 및 유도체를 포함하는 아크리디늄 에스테르 ("AE") 화합물을 포함한다 (예로, 미국 특허 US 5,656,207, US 5,658,737 및 US 5,639,604). 표지를 핵산에 부착하고 표지를 검출하는 합성 및 방법은 잘 공지되어 있다 (예로, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제 2판 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), 제 10장; 미국 특허 US 5,658,737, US 5,656,207, US 5,547,842, US 5,283,174 및 US 4,581,333). 하나 이상의 표지 및 하나 이상의 표지 유형은 특정한 프로브 상에 존재할 수 있거나, 검출은 각 프로브가 검출가능한 신호를 생성하는 화합물로 표지된 프로브의 혼합물을 사용할 수 있다 (예로, 미국 특허 US 6,180,340 및 US 6,350,579).
본원에 사용된 "분자 토치"로서 지칭되는 구조는 결합 영역 ("표적 결합 도메인")에 의해 연결되고, 선결정된 혼성화 검정 조건 하에 서로에게 혼성화하는 자가-상보성의 구분된 영역 ("폐쇄 도메인")을 포함하도록 설계되었다. 표적 폐쇄 도메인을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부는 또한 표적 결합 도메인으로서 기능할 수 있다. 따라서, 표적 폐쇄 서열은 표적 결합 서열, 비-표적 결합 서열 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
“포획 프로브", "포획 올리고뉴클레오티드", "표적 포획 올리고뉴클레오티드" 및 "포획 프로브 올리고머"는 본원에서 표준 염기 쌍에 의해 표적 핵산의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하고, 고정된 프로브 상의 결합 파트너에 연결하여 지지체에 표적 핵산을 포획하는 핵산 올리고머를 말하는데 상호교환적으로 사용된다. 포획 올리고머의 하나의 예는 2개의 결합 영역, 표적 혼성화 서열 및 고정화된 프로브 결합 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 예의 변형으로, 2개의 영역은 하나 이상의 링커에 의해 다함께 결합된 2개의 상이한 올리고머에 존재할 수 있다. 포획 올리고머의 또 다른 구현예, 표적 혼성화 서열은 표적 핵산에 비-특이적으로 결합하고 이를 지지체 상에서 고정화된 프로브에 연결하도록 무작위 또는 비-무작위 폴리-GU, 폴리-GT 또는 폴리 U 서열을 포함하는 서열이다 (예로, PCT 국제특허출원 WO 2008/016988 참조). 고정화된 프로브 결합 영역은 미단으로서 지칭되는 핵산 서열일 수 있다. 미단은 지지체 입자 또는 지지체 매트릭스에 부착된 상보적인 고정화된 서열에 결합하는 약 10개 내지 40개의 뉴클레오티드 (예로, A10 내지 A40), 또는 약 14개 내지 33개 nt (예로, T3A14 내지 T3A30)의 실직적으로 동종중합체 미단을 포함한다. 따라서, 바람직한 핵산 미단의 비-제한적인 예는 일부 구현예에서 T0-4 A10-40 서열을 포함할 수 있다. 포획 올리고머의 또 다른 예는 2개의 영역, 표적 혼성화 서열 및 핵산 서열이 아닌 결합 쌍 구성원을 포함한다.
본원에 사용된 "고정화된 올리고뉴클레오티드", "고정화된 프로브" 또는 "고정화된 핵산"은 포획 올리고머를 지지체에 직접 또는 간접적으로 연결하는 핵산 결합 파트너를 말한다. 지지체에 연결된 고정화된 프로브는 시료의 결합되지 않은 물질에서 포획 프로브 결합된 표적의 분리를 용이하게 한다. 고정화된 프로브의 일 구현예는 시료의 결합되지 않은 물질로부터 결합된 표적 서열의 분리를 용이하게 하는 지지체에 연결된 올리고머이다. 지지체는 용액에 없는 매트릭스 및 입자와 같은 공지된 재료를 포함할 수 있으며, 이는 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리, 폴리아크릴레이트, 혼합된 중합체, 폴리스티렌, 실란, 폴리프로필렌, 금속 또는 기타 조성물로 만들어질 수 있고, 이 중 일 구현예는 자기적으로 유인가능한 입자이다. 지지체는 고정화된 프로브가 직접적으로 (공유 결합, 킬레이트화 또는 이온 상호작용을 통해) 또는 간접적으로 (하나 이상의 링커를 통해) 연결되고, 프로브와 지지체 간의 결합 또는 상호작용은 혼성화 조건 동안 안정적인, 단분산 자성 구체 (예로, 균일한 크기 ± 5％)일 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 일반적으로 시료에서 선택된 세균 유기체의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 세균성 질증 (BV)을 진단하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상호 배타적이지 않은 다른 구현예에서, 본 발명은 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 임의의 하나 이상의 검출 방법으로서, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 하나 이상로부터 16S rRNA 표적 핵산의 증폭 기반의 검출을 수행하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 임의의 하나 이상을 검출하기 위한 올리고머의 조합을 포함하는 조성물 (반응 혼합물을 포함함) 및 키트를 제공한다. 올리고머 조합은 일반적으로 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 하나 이상을 검출하기 위한 적어도 2개의 증폭 올리고머를 포함하고, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 증폭 기반의 검출을 수행하기 위해, 예로 포획 프로브 및/또는 검출 프로브와 같은 본원에 기재된 하나 이상의 추가 올리고머를 추가로 포함할 수 있다.
BV를 진단하는 방법은 일반적으로 BV에 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터의 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 하나 이상의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각의 시료에서 특이적 검출을 위해 수행된다. 검출 검정법의 결과를 기초로 하여, 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대해 정량적 값이 할당되고, 다음으로 이러한 정량적 값을 사용하여 단일한 BV 점수가 결정된다. 다음으로 BV의 존재 또는 부재는 전형적으로 선결정되는 컷오프 값과 BV 점수의 비교를 기초로 하여 결정된다. 일반적으로, 컷오프 값을 초과하는 BV 점수가 BV 양성 상태를 나타내고, 정량적 값이 로그사본의 단위 인 경우, BV 점수 결정은 A. 버지내 및 G. 버지날리스 값 중 더 큰 값으로부터 락토바실러스 종 정량적 값을 차감하는 것을 포함한다. 컷오프 값의 결정은 임상 표본의 코호트의 결과를 사용한 예측 모델화를 기반으로 할 수 있다. 임상 기준 방법에 의해 확립된 BV 환자 감염 상태과 비교하여 부합을 최대화하거나 임상적 민감도 또는 특이도의 비율을 목표로 하기 위해 컷오프 값을 선택할 수 있다 (예로, 암셀의 판정기준에 의해 분석된 중간값을 갖는 뉴전트 점수). 일부 구현예에서, 최소의 정량적 값이 락토바실러스 종 및/또는 A. 버지내 및 G. 버지날리스에 대해 부여되고, 이로써 검출 검정법에 의해 측정된 정량적 값이 각각 부여된 최소의 값보다 작은 경우, 최소의 값은 BV 점수를 결정하는 정량적 값으로서 사용된다.
락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스에 대한 정량적 값도 표준화되고/거나, 가중치가 부여될 수 있다. 예를 들면, 표준화는 BV 점수 계산에 참여하는 A. 버지내 및 G. 버지날리스 정량적 값 각각의 가능성의 균형을 맞추는데 사용될 수 있으며, BV 점수 결정이 단지 이러한 2가지 중 최대값 및 임상 표본 모집단에서 해당 A. 버지내 농도보다 높은 관찰된 G. 버지날리스 농도의 경향만을 사용하기 때문이다. 일부 변형에서, 표준화는 예로 모집단 중앙값과 같은 모집단 통계에 의한 검출 검정법에 의해 측정된 정량적 값을 조정하는 것을 포함한다 (예를 들면, 사본 단위의 농도를 모집단 중앙값으로 나누거나, 정량적 데이터가 로그사본 단위인 곳에서, 로그사본 중앙값을 차감함). 가중치 부여는 조건 값 (예로, 락토바실러스 종 정량적 값, A.버지내 또는 G.버지날리스 정량적 값 또는 예측 공식에서 또 다른 항의 정량적 값)의 변화 효과가 점수 값에 영향을 미치는데 사용할 수 있다. 가중치가 높을수록 조건 값의 변화가 점수에 미치는 효과를 증가시킬 수 있는 반면, 비율이 낮을수록 이러한 효과가 감소될 수 있다.
BV 점수의 계산 공식에는 추가적인 항이 더 포함될 수 있다. 일부 변형에서, BV 점수의 계산은 원하는 컷오프 값 (예로, 컷오프 값 0)을 조정하기 위해 조정 상수를 더하거나 차감하는 것을 추가로 포함한다. 일부 변형에서, BV 점수의 계산은 검출 검정법에서 시료 억제를 보상하는데 사용될 수 있는 내부 대조군 (IC) 조정 인자를 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 구체적으로 적합한 IC 조정 인자는 검출 검정법으로부터 생성된 관찰된 IC 값 대비 검출 검정법에 대한 예상된 IC 값의 비율을 기초로 한다.
BV를 진단하는 방법의 상세한 변형에서, BV 점수는 다음의 공식을 사용하여 할당된다:
BV 점수 = C0 + WL최대값(LS, FLS) + WGA최대값(AS, GS, FGAS) + WIC로그2(IC비율),
여기서 공식 요소는 표 1에 설명된 바와 같다.
Figure pct00001
BV 점수가 상기 공식에 의해 결정되는 BV를 진단하는 방법의 일부 특정한 구현예에서, A. 버지내 / G. 버지날리스 항 (FGA)에 대해 부여된 최소값은 표준화 이전에 0으로 설정된다.
락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스는 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출될 수 있지만, 현재 이러한 세균은 핵산 기반의 검출 검정법을 사용하여 검출하는 것이 바람직한다. 본 발명에 따른 핵산 기반의 검출 검정법은 일반적으로 시료에 존재하는 것으로 의심되는 다른 핵산과 최소의 교차-반응성을 갖는, 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스의 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 따라서, 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스의 선별된 종의 핵산 기반의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 Trichomonas 종; Trichomonas vaginalis; Candida 종; Clostridiales 강으로부터의 세균; Clostridium-유사 종; Eggerthella 종; Enterobacteria; Peptostreptococcus micros; Aerococcus christensenii; Leptotrichia amnionii; Peptoniphilus 종; Dialister 종; Mycoplasma hominis; Sneathia sanguinegens; Anaerococcus tetradius; Mobiluncus 종; Mobiluncus hominis; 메가스파에라 종; Prevotella 종; Leptotrichia sanguinegens; 및 Finegoldia magna를 포함하는 다른 세균 속 내의 종과 최소의 교차-반응성을 갖을 것이다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 기반의 검출 검정법은 이들 유기체 중 하나 이상 또는 BV와 관련된 다른 세균 속을 검출하기 위한 구성성분을 추가로 포함한다.
구체적인 구현예에서, 핵산 기반의 검출 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 16S rRNA 또는 16S rRNA를 인코딩하는 유전자를 표적으로 한다. 16S rRNA 또는 인코딩하는 유전자의 구체적으로 적합한 표적 영역은 (i) 약 뉴클레오티드 위치 40번 내지 약 뉴클레오티드 위치 265번의 서열번호 1의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역; (ii) 약 뉴클레오티드 위치 43번 내지 약 뉴클레오티드 위치 247번의 서열번호 2의 영역에 상응하는 L. 젠세니 16S rRNA 영역; (iii) 약 뉴클레오티드 위치 93번 내지 약 뉴클레오티드 위치 298번의 서열번호 3의 영역에 상응하는L. 가세리 16S rRNA 영역; (iv) 약 뉴클레오티드 위치 540번 내지 약 뉴클레오티드 위치 625번의 서열번호 4의 영역에 상응하는 A. 버지내 16S rRNA 영역; 및 (v) 약 뉴클레오티드 위치 172번 내지 약 뉴클레오티드 위치 227번의 서열번호 5의 영역에 상응하는 G. 버지날리스 16S rRNA 영역을 표적으로 한다. 상기와 같이 16S rRNA 영역을 표적하는 핵산 기반의 검출 검정법의 특정한 변형에서, (a) 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7의 서열에 실질적으로 상응하는 서열, 서열번호 8의 서열에 실질적으로 상응하는 서열, 서열번호 9의 서열에 실질적으로 상응하는 서열, 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열, 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열 또는 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나; (b) A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17의 서열에 실질적으로 상응하는 서열, 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열 또는 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나; (c) G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호 14의 서열에 실질적으로 상응하는 서열, 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열 또는 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 표적-혼성화 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, (a) 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7의 서열, 서열번호 8의 서열, 서열번호 9의 서열, 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 서열, 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 서열 또는 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나; (b) A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17의 서열, 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 서열 또는 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나; (c) G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호 14의 서열, 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 서열 또는 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 서열을 포함하거나 이로구성되는 표적-혼성화 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 기반의 검출 검정법은 적어도 2개 또는 3개의 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드, 적어도 2개 또는 3개의 A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드 및/또는 적어도 2개 또는 3개의 G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 이는 상기에 특정된 것으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
핵산 기반의 검출 검정법의 사용을 포함하는 방법의 일부 구현예에서, 증폭 기반의 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스를 검출하는데 사용된다. 이러한 변형은 일반적으로 시험 내 핵산 증폭 반응을 이용하여 세균성 표적 핵산 내의 표적 서열을 증폭시키고, 증폭된 산물을 예를 들면 증폭된 산물을 세균에서 세균성 표적의 존재를 나타내는 신호를 제공하는 핵산 검출 프로브와 특이적으로 혼성화함으로써 검출하는 것을 포함한다. 증폭 단계는 표적 핵산이 시료에 존재하는 경우 증폭된 산물을 생성하도록 시료를 표적 핵산 (예로, 16S rRNA의 표적 서열)에서 표적 서열에 특이적인 2개 이상의 증폭 올리고머와 접촉시키는 것을 포함한다. 증폭은 표적 서열 또는 그 상보체의 추가적인 사본을, 예컨대 주형 가닥을 사용하여 증폭 올리고머 (프라이머)로부터 서열을 연장하는데 적어도 하나의 핵산 중합효소를 사용함으로써 합성한다. 증폭된 산물을 검출하기 위한 일 구현예는 증폭된 산물을 선택된 증폭 올리고머에 의해 증폭된 서열, 예로 한 쌍의 선택된 증폭 올리고머가 인접하는 (flanking) 표적 서열에 포함된 서열에 특이적인 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 것을 포함하는 혼성화 단계를 사용한다. 적합한 증폭 방법은 예를 들면 복제효소 매개된 증폭, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 라이게이즈 연쇄반응 (LCR), 가닥 치환 증폭 (SDA) 및 전사 매개된 또는 전사 관련된 증폭 (TMA)를 포함한다. 이러한 증폭 방법은 당 업계에 잘 알려져 있고 (예로, 상기 정의 섹션의 증폭 방법의 논의 참조), 본 발명의 방법에 따라 쉽게 사용된다.
예를 들면, TMA 증폭을 사용하는 일부 증폭 방법은 다음의 단계를 포함한다. 간략하게, 증폭될 서열을 포함하는 표적 핵산은 단일 가닥 핵산 (예로, ssRNA 또는 ssDNA)으로서 제공된다. 당업자라면 이중 가닥 핵산 (예로, dsDNA)의 통상적인 용융이 사용하여 단일 가닥 표적 핵산을 제공하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 프로모터 프라이머는 이의 표적 서열에서 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 역전사효소 (RT)는 표적 가닥을 주형으로서 사용하여 프로모터 프라이머의 3' 말단을 연장하고, 표적 서열 가닥의 cDNA 사본을 만들어 RNA : DNA 이중체를 생성한다. RNase는 RNA : DNA 이중체의 RNA 가닥을 소화하고, 제 2 프라이머는 프로모터 프라이머 말단으로부터 하류의 cDNA 가닥에 위치한 이의 표적 서열에 특이적으로 결합한다. RT는 제 1 cDNA 주형을 사용하여 제 2 프라이머의 3' 말단을 연장하여 기능적 프로모터 서열을 포함하는 dsDNA를 생성함으로써 새로운 DNA 가닥을 합성한다. 다음으로 프로모터 서열에 특이적인 RNA 중합효소는 전사를 개시하여 반응에서 초기 표적 가닥의 약 100개 내지 1000개의 증폭된 사본 ("앰플리콘")인 RNA 전사체를 생산한다. 제 2 프라이머가 각 앰플리콘의 표적 서열에 특이적으로 결합하고 RT가 앰플리콘 RNA 주형으로부터 DNA 사본을 생성하여 RNA : DNA 이중체를 생산할 때 증폭이 계속된다. 반응 혼합물의 RNase는 RNA : DNA 이중체로부터 앰플리콘 RNA를 소화하고, 프로모터 프라이머는 새로이 합성된 DNA의 상보적 서열에 특이적으로 결합한다. RT는 프로모터 프라이머의 3' 말단을 연장하여 RNA 중합효소가 결합하여 표적 가닥에 상보적인 추가적인 앰플리콘을 전사하는 기능적 프로모터를 포함하는 dsDNA를 생성한다. 더 많은 앰플리콘 사본을 만드는 자가촉매 주기는 반응 과정에서 반복되어, 시료에 존재하는 표적 핵산을 약 10억 배 증폭시킨다. 증폭된 산물은 증폭하는 동안 실시간으로 또는 증폭된 산물에 포함된 표적 서열에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용하여 증폭 반응의 종결 시 검출될 수 있다. 결합된 프로브로부터 발생하는 신호의 검출은 시료에서 표적 핵산의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 방법은 "역" TMA 반응을 이용한다. 이러한 변형에서, 초기 또는 "정방향" 증폭 올리고머는 표적 영역의 3' 말단 근처에서 표적 핵산에 혼성화하는 프라이밍 올리고뉴클레오티드이다. 역전사효소 (RT)는 표적 핵산을 주형으로tj 사용하여 프라이머의 3' 말단을 연장함으로써 cDNA 가닥을 합성한다. 제 2 또는 "역" 증폭 올리고머는 합성된 cDNA 가닥 내에 포함된 표적 서열에 혼성화하도록 구성된 표적-혼성화 서열을 갖는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 제 2 증폭 올리고머가 프로모터 프라이머인 곳에서, RT는 cDNA 가닥을 주형으로 사용하여 프로모터 프라이머의 3' 말단을 연장하여 표적 서열 가닥의 제 2 cDNA 사본을 생성하고, 이로써 기능적 프로모터 서열을 포함하는 dsDNA를 생성한다. 다음으로 증폭은 RNA 중합효소를 사용하여 프로모터 서열로부터 전사의 개시를 위해 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 계속된다. 대안적으로, 제 2 증폭 올리고머가 프로모터 제공자인 곳에서, 표적 영역의 5' 말단 근처에 있는 표적 서열에 혼성화하는 종결 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 종결 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 프라이밍 올리고머의 연장을 종결하는데 사용되고, 이로써 프라이밍 올리고머로부터의 연장에 의해 합성된 초기 cDNA 가닥의 정의된 3' 말단을 제공한다. 다음으로 프로모터 제공자의 표적-혼성화 서열은 초기 cDNA 가닥의 정의된 3' 말단에 혼성화하고, cDNA 가닥의 3' 말단이 연장되어 프로모터 제공자의 프로모터 서열에 상보적인 서열을 추가한 결과, 이중 가닥 프로모터 서열을 형성한다. 다음으로 초기 cDNA 가닥은 이중 가닥 프로모터를 인식하고 이로부터 전사를 개시하는 RNA 중합효소를 사용하여 프로모터 부분을 포함하지 않고 초기 cDNA 가닥에 상보적인 다수의 RNA 전사체를 전사하는데 주형으로서 사용된다. 다음으로 이러한 RNA 전사체 각각은 제 1 프라이밍 증폭 올리고머로부터 추가의 증폭을 위한 주형으로서 작용하도록 사용가능하다.
증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 특정 구현예에서, 적어도 2개의 증폭 올리고머의 조합이 락토바실러스 종 16S rRNA 또는 락토바실러스 종 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출에 사용된다. 올리고머 조합은 약 뉴클레오티드 위치 40번 내지 약 뉴클레오티드 위치 265번의 서열번호 1의 영역에 상응하는 L. 크리스파투스 16S rRNA 영역, 약 뉴클레오티드 위치 43번 내지 약 뉴클레오티드 위치 247번의 서열번호 2의 영역에 상응하는 L. 젠세니 16S rRNA 영역, 및/또는 약 뉴클레오티드 위치 93번 내지 약 뉴클레오티드 위치 298번의 서열번호 3의 영역에 상응하는L. 가세리 16S rRNA 영역을 증폭하기 위한 제 1 및 제 2 증폭 올리고머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고; 일부 이러한 변형에서 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 올리고머 조합은 제 3 및 제 4 증폭 올리고머를 추가로 포함하고, 여기서 제 3 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 4 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다. 보다 구체적인 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 표적-혼성화 서열을 포함하고; 일부 이러한 구현예에서 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 올리고머 조합은 제 3 및 제 4 증폭 올리고머를 추가로 포함하고, 여기서 제 3 증폭 올리고머는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 제 4 증폭 올리고머는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 표적-혼성화 서열을 포함한다. 상기와 같은 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자 (예로, 예를 들면 서열번호 10의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열과 같은 T7 프로모터 서열)이고; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 보다 구체적인 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되며; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 올리고머 조합은 제 3 및 제 4 증폭 올리고머를 추가로 포함하며, 여기서 제 3 증폭 올리고머는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성되고 제 4 증폭 올리고머는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 특정 구현예에서, 적어도 2개의 증폭 올리고머의 조합이 A. 버지내 16S rRNA 또는 A. 버지내 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출에 사용된다. 올리고머 조합은 서열번호 4의 약 뉴클레오티드 위치 540번 내지 약 뉴클레오티드 위치 625번의 영역에 상응하는 A. 버지내 핵산 표적 영역을 증폭하기 위한 제 1 및 제 2 증폭 올리고머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나; 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다. 보다 특정한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 표적-혼성화 서열을 포함하고 /하거나, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 표적-혼성화 서열을 포함한다. 상기와 같은 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자 (예로, 예를 들면 서열번호 18의 잔기 1번 내지 27번의 뉴클레오티드 서열과 같은 T7 프로모터 서열)이고; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 보다 상세한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 구성되고 /되거나, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 특정 구현예에서, 적어도 2개의 증폭 올리고머의 조합은 G. 버지날리스 16S rRNA 또는 G. 버지날리스 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출에 사용된다. 올리고머 조합은 서열번호 5의 약 뉴클레오티드 위치 172번 내지 약 뉴클레오티드 위치 227번의 영역에 상응하는 G. 버지날리스 핵산 표적 영역을 증폭하기 위한 제 1 및 제 2 증폭 올리고머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나; 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다. 보다 특정한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 표적-혼성화 서열을 포함하고 /하거나, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 표적-혼성화 서열을 포함한다. 상기와 같은 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제 1 증폭 올리고머는 각각의 표적 혼성화 서열의 5'에 위치하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자 (예로, 예를 들면 서열번호 15의 잔기 9번 내지 35번의 뉴클레오티드 서열과 같은 T7 프로모터 서열)이고; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 증폭 올리고머는 프로모터 프라이머 또는 프로모터 제공자이다. 보다 상세한 변형에서, 제 1 증폭 올리고머는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되고/거나, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 15의 잔기 9번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (예로, 제 2 증폭 올리고머는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 구성됨).
증폭된 산물의 검출은 증폭된 표적 서열과 특이적으로 관련된 신호를 검출하도록 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 핵산은 검출가능한 전기적 변화와 같은 물리적 변화를 일으키는 표면과 연관될 수 있다. 증폭된 핵산은 매트릭스에 또는 위에 농축하고, 이들과 관련된 핵산 또는 염료 (예로, 에티듐 브로마이드 또는 사이버그린과 같은 삽입화제)를 검출하거나, 용액상에서 핵산과 관련된 염료의 증가를 검출함으로써 검출될 수 있다. 다른 검출 방법은 증폭된 산물의 서열에 특이적으로 혼성화하도록 구성된 핵산 검출 프로브를 사용하여 프로브 : 산물 복합체의 존재를 검출하거나, 증폭된 산물과 관련된 검출가능한 신호를 증폭할 수 있는 프로브의 복합체를 사용함으로써 검출할 수 있다 (예로, 미국 특허 US 5,424,413; US 5,451,503; 및 US 5,849,481; 각각이 본원에 참고문헌으로 통합됨). 증폭된 산물과 특이적으로 결합하는 직접 또는 간접적으로 표지된 프로브는 시료에서 표적 핵산의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 제공한다. 예를들면, 표적 핵산이 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 16S rRNA인 경우, 증폭된 산물은 16S rRNA의 표적 서열 또는 이에 상보적인 표적 서열을 포함할 것이고, 프로브는 테스트된 시료에서락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 16S rRNA의 존재를 나타내도록 증폭된 산물에 포함된 서열에 직접 또는 간접적으로 결합할 것이다.
상보적인 증폭된 서열에 혼성화하는 검출 프로브는 DNA 또는 RNA 올리고머, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오티드의 조합을 포함하는 올리고머 또는 변형된 골격으로 합성된 올리고머, 예로 하나 이상의 2'-메톡시 치환된 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고머일 수 있다. 증폭된 서열의 검출에 사용되는 프로브는 표지되지 않고 간접적으로 (예로, 프로브 상의 모이어티에 대한 또 다른 결합 파트너의 결합에 의해) 검출될 수 있거나, 다양한 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 전사 매개된 증폭 (TMA)을 사용하는 특정 구현예에서와 같이 BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 검출 프로브는 예로 선형의 아크리디늄 에스테르 (AE) 표지된 프로브와 같은 선형의 화학발광성 표지된 프로브이다.
검출 단계는 또한, 예로 핵산 염기 서열의 전부 또는 일부와 같은 증폭된 서열에 대한 추가적인 정보를 제공할 수 있다. 검출은 증폭 반응이 완료된 이후에 수행될 수 있거나, 표적 영역을 증폭하면서 동시에, 예로 실시간으로 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 검출 단계는 균질한 검출, 예로 혼합물로부터 혼성화되지 않은 프로브를 제거하지 않고 혼성화된 프로브의 검출을 허용한다 (예로, 각각이 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 5,639,604 및 US 5,283,174 참조).
증폭 단계 근처 또는 종결 시 증폭된 산물을 검출하는 구현예에서, 선형의 검출 프로브가 증폭된 산물에 대한 프로브의 혼성화를 나타내는 신호를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 검출의 하나의 예는 표적 핵산에 혼성화하는 발광성 표지된 프로브를 사용한다. 다음으로 발광성 표지는 혼성화되지 않은 프로브에서 가수분해된다. 검출은 발광 측정기를 사용하여 화학발광에 의해 수행된다. (예로, 국제특허출원 WO 89/002476 참조, 본원에 참조문헌으로 통합됨). 실시간 검출을 사용하는 다른 구현예에서, 검출 프로브는 예를 들면 분자 비콘, 분자 토치와 같은 헤어핀 프로브, 또는 프로브가 증폭된 산물에 결합할 때 검출되는 리포터 모이어티로 표지된 혼성화 스위치 프로브일 수 있다. 이러한 프로브는 표적-혼성화 서열 및 비-표적-혼성화 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프로브의 다양한 형태가 이전에 설명되었다 (예로, 미국 특허 US 5,118,801; US 5,312,728; US 5,925,517; US 6,150,097; US 6,849,412; US 6,835,542; US 6,534,274; 및 US 6,361,945; 및 미국 특허출원 US 20060068417A1 및 US 20060194240A1 참조; 각각이 본원에 참고문헌으로 통합됨).
락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 16S rRNA 또는 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 16S rRNA를 인코딩하는 유전자를 표적하는 증폭 기반의 검출 검정법을 포함하는 특정 구현예에서, 방법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 16S rRNA 증폭 산물에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 검출 프로브를 사용한다. 구체적인 변형에서, (A) 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 (1) 약 뉴클레오티드 위치 40번 내지 약 뉴클레오티드 위치 265번의 서열번호 1의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역; (2) 약 뉴클레오티드 위치 43번 내지 약 뉴클레오티드 위치 247번의 서열번호 2의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역; 및/또는 (3) 약 뉴클레오티드 위치 93번 내지 약 뉴클레오티드 위치 298번의 서열번호 3의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고/거나; (B) A. 버지내 특이적 검출 프로브는 약 뉴클레오티드 위치 540번 내지 약 뉴클레오티드 위치 625번의 서열번호 4의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역에 특이적으로 혼성화고/거나; (B) G. 버지날리스 특이적 검출 프로브는 약 뉴클레오티드 위치 172번 내지 약 뉴클레오티드 위치 227번의 서열번호 5의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역에 특이적으로 혼성화한다. 예를 들면, 일부 변형에서, 락토바실러스 종 증폭 산물의 검출을 위한 제 1 프로브는 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 락토바실러스 종 증폭 산물의 검출을 위한 제 2 프로브는 L. 가세리 표적 핵산의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 프로브 및/또는 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 프로브). 일부 변형에서, A. 버지내 증폭 산물의 검출을 위한 프로브는 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 프로브). 일부 변형에서, G. 버지날리스 증폭 산물의 검출을 위한 프로브는 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 프로브). 특정 구현예에서, 락토바실러스 종 증폭 산물의 검출을 위한 제 1 프로브는 서열번호 11의 서열을 포함하거나, 이로 구성되고/거나; 락토바실러스 종 증폭 산물의 검출을 위한 제 2 프로브는 서열번호 12의 서열을 포함하거나, 이로 구성되고/거나; A. 버지내 증폭 산물의 검출을 위한 프로브는 서열번호 19의 서열을 포함하거나, 이로 구성되고/거나; G. 버지날리스 증폭 산물의 검출을 위한 프로브는 서열번호 16의 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.
핵산-기반의 검출 검정법의 사용을 포함하는 방법의 일부 구현예에서, 비-증폭 기반의 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스를 검출하는데 사용된다. 이러한 일부 구현예에서, 비-증폭 기반의 검정법은 표적 핵산에 대한 특이적 검출 프로브의 혼성화를 포함하는 혼성화 검정법이다. 폴리뉴클레오티드 혼성화 검정법을 시행하는 방법은 당 업계에서 잘 개발되었다. 혼성화 검정법 절차 및 조건은 응용 분야에 따라 달라질 것이며, 예로 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제 3판. Cold Spring Harbor, N.Y., 2002), 및 Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987)에 언급된 것을 포함하여 공지된 일반적인 결합 방법에 따라 선택된다. 일반적으로, 프로브와 시료는 특이적 핵산 혼성화를 허용하는 조건 하에서 혼합되고, 다음으로 각 표적에 대한 프로브의 특이적 혼성화가 검출된다. 핵산 혼성화는 다양한 검정법 형식에 적응가능하다. 하나의 적합한 형식은 비-변성화 조건 하에서 혼성화에 구체적으로 적응할 수 있는 샌드위치 검정법 형식이다. 샌드위치 유형의 검정법의 주요 구성성분은 DNA 서열의 일부에 상보적이며 표지되지 않은 고정화된 핵산 프로브를 흡착하거나 이를 공유 결합시킨 고체 지지체이다. 표적 핵산은 고정화된 프로브에 혼성화되고, 고정화된 표지되지 않은 핵산 프로브가 혼성화되는 동일한 DNA 가닥의 상이한 제 2 영역에 상보적인 제 2 표지된 검출 프로브가 [표적 핵산] : [고정화된 프로브] 이중체에 혼성화되어 표적 핵산을 검출한다. 또 다른 예시적인 형식은 신호 전달기로서 적합한 전극 표면에 고정화된 표지되지 않은 검출 프로브에 혼성화된 표적 핵산의 전기화학적 검출을 이용한다. 예로, Drummond et al., Nat. Biotechnol. 21: 1192, 2003; Gooding, Electroanalysis 14: 1149, 2002; Wang, Anal. Chim. Acta 469: 63, 2002; Cagnin et al., Sensors 9: 3122, 2009; Katz and Willner, Electroanalysis 15: 913, 2003; Daniels and Pourmand, Electroanalysis 19: 1239, 2007 참조.
혼성화 검정법을 포함하는 특정 구현예에서, 검출 프로브는 락토바실러스 종, A. 버지내 또는 G. 버지날리스 16S rRNA 또는 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출에 이용된다. 이러한 일부 구현예에서, (A) 락토바실러스 종 16S rRNA 또는 락토바실러스 종 16S rRNA를 인코딩하는 유전자를 검출하는 프로브는 (1) 약 뉴클레오티드 위치 40번 내지 약 뉴클레오티드 위치 265번의 서열번호 1의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역; (2) 약 뉴클레오티드 위치 43번 내지 약 뉴클레오티드 위치 247번의 서열번호 2의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역; 및/또는 (3) 약 뉴클레오티드 위치 93번 내지 약 뉴클레오티드 위치 298번의 서열번호 3의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역에 특이적으로 혼성화하고/거나; (B) A. 버지내 16S rRNA 또는 A. 버지내 16S rRNA를 인코딩하는 유전자를 검출하는 프로브는 약 뉴클레오티드 위치 540번 내지 약 뉴클레오티드 위치 625번의 서열번호 4의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역에 특이적으로 혼성화고/거나; (C) G. 버지날리스 16S rRNA 또는 G. 버지날리스 16S rRNA를 인코딩하는 유전자를 검출하는 프로브는 약 뉴클레오티드 위치 172번 내지 약 뉴클레오티드 위치 227번의 서열번호 5의 영역에 상응하는 핵산 표적 영역에 특이적으로 혼성화한다. 예를 들면, 일부 변형에서, 락토바실러스 종 16S rRNA 또는 락토바실러스 종 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 제 1 프로브는 L. 크리스파투스 및 L. 젠세니 표적 핵산 각각의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고, 락토바실러스 종 16S rRNA 또는 락토바실러스 종 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 제 2 프로브는 L. 가세리 표적 핵산의 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하고; 일부 이러한 구현예에서, 제 1 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 실질적으로 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나, 제 2 락토바실러스 특이적 검출 프로브는 실질적으로 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 11의 잔기 1번 내지 17번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 프로브 및/또는 서열번호 12의 잔기 7번 내지 23번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 프로브). 일부 변형에서, A. 버지내 16S rRNA 또는 A. 버지내 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 브로브는 실질적으로 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 19의 잔기 6번 내지 21번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 프로브). 일부 변형에서, G. 버지날리스 16S rRNA 또는 G. 버지날리스 16S rRNA를 인코딩하는 유전자 검출을 위한 프로브는 실질적으로 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 16의 잔기 1번 내지 18번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 프로브). 특정 구현예에서, 락토바실러스 종 16S rRNA 또는 락토바실러스 종 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 제 1 프로브는 서열번호 11의 서열을 포함하거나, 이로 구성되고/거나; 락토바실러스 종 16S rRNA 또는 락토바실러스 종 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 제 2 프로브는 서열번호 12의 서열을 포함하거나, 이로 구성되고/거나; A. 버지내 16S rRNA 또는 A. 버지내 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 프로브는 서열번호 19의 서열을 포함하거나, 이로 구성되고/거나; G. 버지날리스 16S rRNA 또는 G. 버지날리스 16S rRNA를 인코딩하는 유전자의 검출을 위한 프로브는 서열번호 16의 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 검출을 위한 비-증폭 기반의 검정법은 비-표적-혼성화 플랩 영역을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드가 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 중첩 의존적 방식으로 절단되어, 다음에 검출되는 절단 산물을 방출한다. 예시적인 절단 기반의 검정 시약은 예로 Lyamichev et al., Nat. Biotechnol. 17: 292-296, 1999), Ryan et al., Mol. Diagn. 4: 135-144, 1999 및 Allawi et al., J. Clin. Microbiol. 44: 3443-3447, 2006에 기술되어 있다. 플랩 엔도뉴클레아제 반응에 대한 적절한 조건은 공지되어 있거나 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다 (예로, Kaiser et al., J. Biol. Chem. 274: 2138-721394, 1999 참조). 방법에 사용될 수 있는 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 hermus aquaticus DNA 중합효소 I, Thermus thermophilus DNA 중합효소 I, 포유동물 FEN-1, Archaeoglobus fulgidus FEN-1, Methanococcus jannaschii FEN-1, Pyrococcus furiosus FEN-1, Methanobacterium thermoautotrophicum FEN-1, Thermus thermophilus FEN-1, 클레아바제® (Hologic, Inc., Madison, WI), S. cerevisiae RTH1, S. cerevisiae RAD27, Schizosaccharomyces pombe rad2, 박테리오파지 T5 5'-3' 엑소뉴클레아제, Pyrococcus horikoshii FEN-1, 인간 엔도뉴클레아제 1, 송아지 흉선 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하며, 진세균, 진핵생물 및 고생물에서 이들의 상동체, 예컨대 구조 특이적 효소의 클래스 Ⅱ 패밀리의 구성원, 뿐만 아니라 이들의 돌연변이체 또는 변이체도 포함한다. 플랩 엔도뉴클레아제에 대한 설명은 예를 들면 Lyamichev et al., Science 260: 778-783, 1993; Eis et al., Nat. Biotechnol. 19: 673-676, 2001; Shen et al., Trends in Bio. Sci. 23: 171-173, 1998; Kaiser et al., J. Biol. Chem. 274: 21387-21394, 1999; Ma et al., J. Biol. Chem. 275: 24693-24700, 2000; Allawi et al., J. Mol. Biol. 328: 537-554, 2003; Sharma et al., J. Biol. Chem. 278: 23487-23496, 2003; 및 Feng et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 450-456, 2004에서 찾을 수 있다.
특정 변형에서, 절단 기반의 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 RNA 표적 핵산을 검출하고 절단 기반의 검정법은 RNA : DNA 선형의 이중체 구조를 절단할 수 있는 플랩 엔도뉴클레아제를 사용한다. 일부 대안의 구현예에서, 절단 기반의 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 DNA 표적 핵산을 검출하고 절단 기반의 검정법은 DNA : DNA 선형의 이중체 구조를 절단할 수 있는 플랩 엔도뉴클레아제를 사용한다. RNA : DNA 이중체를 절단할 수 있는 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 Thermus 속의 중합효소 결핍 5' 뉴클레아제, 뿐만 아니라 예를 들면 클레아바제® BN (Taq 중합효소의 BstX-NotI 결실, 미국 특허 US 5,614,402 참조), 클레아바제® II (전장의 Taq 중합효소의 “”돌연변이체, 미국 특허 US 5,614, 402 참조), 클레아바제® VII (전장의 Thermus thermophilus 중합효소, 클레아바제® IX (Tth DNA 중합효소의 중합효소 결핍 돌연변이체) 및 클레아바제® ⅩⅡ (Taq DNA 중합효소 및 Tth DNA 중합효소의 단편으로부터 제작된 중합효소 결핍 키메라 중합효소)와 같은 특정 클레아바제® 효소 (Hologic, Inc.)를 포함한다. DNA : DNA 이중체를 절단할 수 있는 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 상기에 표시된 플랩 엔도뉴클레아제, 뿐만 아니라 클레아바제® 2.0 (Archaeoglobus fulgidus FEN-1), 클레아바제® 2.1 (C-말단에 6개의 히스티딘을 갖는 Archaeoglobus fulgidus FEN-1), 클레아바제® 3.0 (Archaeoglobus veneficus FEN-1) 및 클레아바제® 3.1 (C-말단에 6개의 히스티딘을 갖는 Archaeoglobus veneficus FEN-1)을 포함한다.
일부 구현예에서, 절단 기반의 검정법은 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 RNA 표적 핵산을 검출하고, 검정법은 RNA 표적 영역의 DNA 상보체를 합성하는 단계를 포함하며, 이는 다음으로 cDNA 가닥을 중첩하는 제 1 및 제 2 프로브 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 플랩 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위한 선형의 이중체 절단 구조를 형성한다. RNA 의존성 DNA 중합효소 (역전사효소)를 사용하여 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하기 위한 반응 조건은 당 업계에 잘 알려져 있다.
핵산 기반의 검출 검정법을 이용하는 특정 구현예에서, 방법은 시료의 다른 성분으로부터 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스 표적 핵산을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 정제는 시료에 포함 된 유기체를 다른 시료 구성성분으로부터 분리하고/거나 농축하는 방법을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 표적 핵산을 정제하는 단계는 표적 핵산을 다른 시료 구성성분으로부터 특이적으로 또는 비-특이적으로 분리하도록 표적 핵산을 포획하는 것을 포함한다. 비-특이적 표적 포획 방법은 실질적으로 수용성 혼합물로부터 핵산의 선택적 침전, 다른 시료 구성성분을 세척하여 제거하는 지지체에 핵산의 부착, 또는 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스 핵산 및 다른 시료 구성성분을 포함하는 혼합물에서 핵산을 물리적으로 분리하는 기타 수단을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 표적 핵산 (예로, 16S rRNA 표적 핵산 또는 16S rRNA를 인코딩하는 유전자)는 포획 프로브 올리고머에 표적 핵산을 혼성화함으로써 다른 시료 구성성분으로부터 분리된다. 포획 프로브 올리고머는 표적 핵산에 특이적으로 또는 비-특이적으로 혼성화하도록 구성된 표적-혼성화 서열을 포함하여 다른 시료 구성성분으로부터 분리되는 [표적 핵산] : [포획 프로브] 복합체를 형성한다. 표적 핵산의 비-특이적인 포획에 적합한 표적-혼성화 서열을 포함하는 포획 프로브는, 예로 본원에 참고문헌으로 통합되는 PCT 국제특허출원 WO 2008/016988에 기술되어 있다. 일부 변형에서, 표적 핵산을 다른 시료 구성성분으로부터 분리하는 단계는 시료를 (i) 락토바실러스 종 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 포획 프로브 올리고머 (예로, L. 크리스파투스, L. 젠세니 및 L. 가세리 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열), 및 (ii) A 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 포획 프로브 올리고머와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 (i) 및 (ii)의 제 1 및 제 2 포획 프로브 올리고머를 포함하는 일부 상세한 변형에서, 제 1 포획 프로브 올리고머는 실질적으로 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함하고/거나 (예로, 서열번호 6의 잔기 1번 내지 19번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 포획 프로브), 제 2 포획 프로브 올리고머는 실질적으로 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적-혼성화 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 13의 잔기 1번 내지 20번의 표적-혼성화 서열을 포함하는 포획 프로브). 바람직한 변형에서, 포획 프로브는 [표적 핵산] : [포획 프로브] 복합체를 고정화된 프로브에 결합하여, 시료로부터 분리되고 선택적으로 세척되어 비-표적 시료 구성성분을 제거하는 [표적 핵산] : [포획 프로브] : [고정화 프로브] 복합체를 형성한다 (예로, 미국 특허 US 6,110,678; US6,280,952; 및 US 6,534,273 참조; 각각이 본원에 참고문헌으로 통합됨). 이러한 변형에서, 포획 프로브 올리고머는 결합된 표적 서열과 함께 포획 프로브를 고체 지지체에 부착된 고정화된 프로브에 부착하는 서열 또는 모이어티를 추가로 포함하고, 이로써 혼성화된 표적 핵산을 다른 시료 구성성분으로부터 분리시킨다.
보다 구체적인 구현예에서, 포획 프로브 올리고머는 표적 핵산에 상보적이지는 않지만 고정화된 프로브 상의 서열에 특이적으로 혼성화하고, 이로써 표적 핵산을 다른 시료 구성성분으로부터 분리시키는 모이어티로서 작용하는 미단 부분 (예로, 3' 미단)을 포함하고, 예로 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 6,110,678에 이전에 기술된 바와 같다. 임의의 서열이 미단 영역에 사용될 수 있고, 이는 일반적으로 고체 지지체 예로 매트릭스 또는 입자에 부착된 상보적인 고정화된 서열 (예로, 폴리-T)에 결합하는, 약 5개 내지 50개 nt 길이이고, 바람직한 구현예는 약 10개 내지 40개 nt (예로, A10 내지 A40), 더욱 바람직하게 14개 내지 33개 nt (예로, A14 내지 A30 또는 T3A14 내지 T3A30)의 실질적인 동종중합체 미단을 포함한다. (i) L. 크리스파투스, L. 젠세니 및 L. 가세리 16S rRNA 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 1 포획 프로브 올리고머 및 (ii) A 버지내 및 G. 버지날리스 16S rRNA 표적 핵산 각각 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 표적-혼성화 서열을 포함하는 제 2 포획 프로브 올리고머를 포함하는 일부 이러한 구현예에서, 제 1 포획 프로브 올리고머는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되고/거나, 제 2 포획 프로브 올리고머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
표적 포획은 전형적으로 혼성화 조건 하에서 보통 [미단 서열] : [고정화된 프로브 서열] 이중체의 Tm보다 높은 온도에서 표적 핵산에 혼성화하는 하나 이상의 포획 프로브 올리고머를 포함하는 용액상 혼합물에서 발생한다. 포획 프로브 미단을 포함하는 구현예의 경우, [표적 핵산] : [포획 프로브] 복합체는 포획 프로브 미단이 고정화된 프로브에 혼성화되도록 혼성화 조건을 조정함으로써 포획된 다음, 고체 지지체 상의 전체 복합체가 다른 시료 구성성분으로부터 분리된다. 부착된 [고정화된 프로브] : [포획 프로브] : [표적 핵산]을 갖는 지지체는 1회 이상 세척되어 다른 시료 구성성분을 추가로 제거한다. 바람직한 구현예는 상자성 비드와 같은 미립자 고체 지지체를 사용하여, 부착된 [표적 핵산] : [포획 프로브] : [고정화된 프로브] 복합체를 갖는 입자가 세척 용액에 현탁되고, 바람직하게 자성 인력을 사용함으로써 세척 용액으로부터 복구된다. 증폭 기반의 검출 검정법의 사용을 포함하는 방법의 구현예에서, 취급 단계의 수를 제한하기 위해, 표적 핵산은 단순히 지지체 상의 복합체의 표적 핵산을 증폭 올리고머와 혼합하고, 증폭 단계로 진행함으로써 증폭될 수 있다.
BV를 진단하는 방법의 일부 구현예에서, 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 검출이 대상체에서 BV를 나타내는 곳에서, 방법은 대상체에서 BV를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. BV에 대한 치료 섭생은 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 메트로니다졸 (예로, 플라길, 메트로겔-버지날), 클린다마이신 (예로, 클레오신, 클린데세) 및 티니다졸 (예로, 틴다맥스)와 같은 항생제의 투여를 포함한다. 특정 변형에서, 대상체는 이전에 BV로 진단되지 않았다. 다른 구현예에서, 대상체는 이전에 BV로 진단되었고, 본 발명의 진단 방법이 수행될 때 BV의 치료를 받고 있다. 이러한 변형은 구체적으로 대상체에서 BV의 치료를 모니터링하는데 유용하다. 예를 들면, 방법이 BV가 대상체에게 여전히 존재하는 것을 나타내는 경우, 대상체는 치료를 계속할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 치료 섭생 (즉, 본 발명의 진단 방법이 수행될 때 대상체가 받고 있는 동일한 치료)이 대상체에게 재투여된다. 대안적으로, 치료를 받고 있는 대상체에서 BV의 지속적인 존재는 진행 중인 치료의 변화가 필요한 것을 나타낼 수 있으며, 상이한 치료 섭생 (예로, 상이한 투약, 또는 약물의 증가된 용량 및/또는 빈도)이 대상체에게 투여된다.
본 발명에 따르면, 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 각 표적에 대해 별도로 수행되거나 (예로, 별도의 반응 용기에서, 순차적으로 또는 동시에), 다중복합 반응 시스템으로서 다함께 수행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 (예로, BV를 진단하는 방법)은 다중복합 반응을 사용하며, 여기서 반응 믹스는 다수의 (예로, 적어도 2개, 3개 또는 4개 이상) 상이한 표적을 동시에 검정하기 위한 시약을 포함한다. 이러한 경우, 반응 믹스는 검출 검정법을 수행하기 위한 다수의 상이한 표적 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 증폭 기반의 검출 검정법을 사용하는 방법에서, 다중복합 반응은 증폭 올리고머의 다수의 세트 (예로, 다수의 쌍)을 포함할 수 있다 (예를 들면, 다수의 PCR 프라이머 쌍 또는 다수의 TMA 증폭 올리고머 쌍 (예로, TMA를 위한 다수의 프로모터 프라이머 및 비-프로모터 프라이머 쌍 또는 다수의 프로모터 제공자 및 비-프로모터 프라이머 쌍)). 절단 기반의 검출 검정법을 사용하는 다른 구현예에서, 다중복합 반응은 일단 절단되면 상이한 플랩을 갖는 다수의 프로브 올리고뉴클레오티드, 다수의 상이한 중첩 프로브 올리고뉴클레오티드 및 상이한 플랩을 검출하는 다수의 상이한 FRET 카세트를 포함할 수 있다.
추가적인 미생물 검출 검정법은 BV에 관여된 복수의 미생물의 존재 및/또는 상대량을 결정하기 위해 유사하게 수행될 수 있다. 단지 예로서, 이러한 복수의 미생물은 혐기성 그램 양성 구균; Eggerthella 종; Clostridiales 강으로부터의 세균; Clostridium-유사 종; Enterobacteria; Peptostreptococcus micros; Aerococcus christensenii; Leptotrichia amnionii; Peptoniphilus 종; Dialister 종; Mycoplasma hominis; Sneathia sanguinegens; Anaerococcus tetradius; Mobiluncus 종; Mobiluncus hominis; Eggerthella hongkongensis; Prevotella 종; 메가스파에라 종; Leptotrichia sanguinegens 및 Finegoldia magna 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 검정법은 별도로 수행되거나, 다중복합화될 수 있다. 따라서, BV의 진단은 시료에서 복수의 미생물을 확인하고, 선택적으로 이들의 상대 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, BV를 진단하는 방법은 BV와 관련된 10개 이하의 세균 속의 검출을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 BV와 관련된 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하 또는 4개 이하의 박테리아 속의 검출을 포함한다. 일부 변형에서, 방법은 락토바실러스, 아토포비움, 가르드네렐라 이외의 BV와 관련된 세균 속의 검출을 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에서는 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 중 임의의 하나 이상의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 올리고머 또는 이의 조합이 제공된다. 다양한 구현예에서, 올리고머 또는 이의 조합은 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 위한 본원에 제시된 바와 같은 올리고머를 포함한다. 일부 변형에서, 올리고머 조합은 적어도 하나의 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드 (예로, 각각 상이한 표적 서열에 결합하는 적어도 2개 또는 3개의 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드); 적어도 하나의 A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드 (예로, 각각 상이한 표적 서열에 결합하는 적어도 2개 또는 3개의 A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드); 및/또는 적어도 하나의 G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드 (예로, 각각 상이한 표적 서열에 결합하는 적어도 2개 또는 3개의 G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 변형에서, 올리고머 조합은 적어도 2개의 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드 (예로, 각각 상이한 표적 서열에 결합하는 적어도 3개의 락토바실러스 특이적 올리고뉴클레오티드); 적어도 2개의 A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드 (예로, 각각 상이한 표적 서열에 결합하는 적어도 3개의 A. 버지내 특이적 올리고뉴클레오티드); 및/또는 적어도 2개의 G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드 (예로, 각각 상이한 표적 서열에 결합하는 적어도 3개의 G. 버지날리스 특이적 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 조합은 락토바실러스 종 핵산 표적 영역을 증폭하기 위한 적어도 2개의 락토바실러스 특이적 증폭 올리고뉴클레오티드; A. 버지내 핵산 표적 영역을 증폭하기 위한 적어도 2개의 A. 버지내 특이적 증폭 올리고뉴클레오티드; 및/또는 G. 버지날리스 핵산 표적 영역을 증폭하기 위한 적어도 2개의 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 락토바실러스 종 표적 핵산, A. 버지내 표적 핵산 및/또는 G. 버지날리스 표적 핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브 올리고머를 포함한다. 올리고머 또는 이의 조합은 반응 혼합물 또는 올리고머(들)를 포함하는 키트의 형태일 수 있다. 반응 혼합물 또는 키트는 예를 들면 포획 프로브 핵산 또는 포획 프로브 핵산 어레이와 같은 많은 선택적 구성성분을 추가로 포함할 수있다. 증폭 반응 혼합물의 경우, 반응 혼합물은 전형적으로 예로 완충액, 염 용액, 적절한 뉴클레오티드 트리포스페이트 (예로, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP, CTP, GTP 및 UTP) 및/또는 효소 (예로, 역전사효소 및/또는 RNA 중합효소)와 같은, 시험관내 증폭을 수행하는데 적합한 기타 시약을 포함할 것이고, 전형적으로 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스 표적 핵산이 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 테스트 시료 구성성분을 포함할 것이다. 또한, 락토바실러스 종, A. 버지내 및/또는 G. 버지날리스 중 하나 이상의 표적 핵산의 증폭을 위한 올리고머 조합은 예로 완충액, 염 용액, 적절한 뉴클레오티드 트리포스페이트 (예로, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP, CTP, GTP 및 UTP) 및/또는 효소 (예로, 역전사효소 및/또는 RNA 중합효소)와 같은, 시험관내 증폭을 수행하는데 적합한 기타 시약을 포함할 수 있다. 공통 표적 핵산을 표적하는 증폭 올리고머 조합과 함께 검출 프로브를 포함하는 올리고머 조합 (예로, 반응 혼합물 또는 키트)의 경우, 증폭 올리고머 및 검출 프로브 올리고머의 선택은 공통 표적 영역에 의해 연결된다 (즉, 조합이 증폭 올리고머 조합에 의해 증폭가능한 서열에 결합하는 프로브를 포함할 것임).
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1: BV 다변량 알고리즘
1. 결과 해석 요약
BV 양성 또는 BV 음성 상태를 결정하기 위하여, 락토바실러스 종 ("L.spp", BV와 음성 상관됨) 및 가르드넬라 버지날리스 및 아토포비움 버지내 (각각 "Gvag" 및 "Avag", BV와 양성 상관됨)는 다변량 선형 예측인자 알고리즘을 사용하여 단일 수치 BV 점수로 조합된다. 이 점수는 단일 컷오프 값과 비교되며, 음수는 컷오프 미만을 표시하고, 양수는 컷오프 이상을 표시한다.
이 알고리즘의 단순화된 버전에서 L.spp 정량화된 값 (로그사본 단위)은 Gvag 또는 Avag 값 (둘 중 최대 값)으로부터 차감된다.
단순화된 점수 = 최대 (Gvag, Avag) - L.spp
APTIMA B 결과 해석에 실제로 적용된 바와 같이, 공식은 추가로 복잡해진다. 음성 상수가 추가되고 (임상 결정 지점의 점수가 0이 됨), 추가적인 인자 (IC 항)가 추가되고 (관찰 된 억제를 보상함), 최소값이 L.spp에 대해 부여되고 (재현가능성을 개선함), 3가지 분석물의 농도가 표준화되고 (알고리즘에서 Gvag 및 Avag의 참여를 균형 맞춤), 각 항에 가중치가 부여된다.
적용되는 공식:
점수 = C0 + WL*최대값(L-ML, FL-ML) + WAG*최대값(G-MG, A-MA, FGA-MG) + WIC*로그2(IC/calIC)
2. 결과 해석 세부사항
표본 해석은 타당성 판정기준을 평가하고, BV 점수를 계산하고, 점수를 해석하는 것으로 구성된다. 본 실시예의 설명은 내부 대조군 (IC) 신호의 T기간 값과 평가할 각 표본에 대한 L.spp, Gvag 및 Avag (L, G, A)에 대한 로그사본/mL 정량화된 값에서 시작한다.
2.1 BV 점수의 계산
타당성 판정기준 (본원에 설명되지 않음)을 충족하는 표본의 경우 BV 점수가 계산된다. BV 점수의 계산은 3가지 단계: 1) 분석물 표준화, 2) IC 비율의 계산, 및 3) 범용 공식의 적용으로 구성된다.
2.1.1 분석물 표준화
임상 표본의 모집단에서, 관찰된 Gvag 농도는 Avag 농도보다 높은 경향이 있다. 선형 예측인자 공식은 최대 값 (Gvag 로그C 또는 Avag 로그C)만을 사용하기 때문에, 알고리즘에 참여하는 각 분석물의 가능성의 균형을 맞추도록 조건이 평준화된다. 강력한 평준화 방법은 모집단 통계 (중앙값)에 의해 항을 조정하는 것이다. 농도가 사본 단위이었던 경우, 중앙값 및 표준화된 값으로서 제공된 상대 농도로 나누어졌을 것이다. 본원에 사용된 정량적 데이터가 로그사본 단위이기 때문에, 동등한 조작은 중앙값 로그C 값을 차감하는 것이다.
표준화는 두 가지 주요 기능을 제공한다:
1) 농도 수치를 평준화하고 (상기에 설명된 바와 같음),
2) 훈련된 상수의 신뢰 구간을 개선한다.
이러한 표준화의 형태는 로그사본 단위로 존재하는 모든 항에 적용된다. 이것은 3가지 표본 분석물 값 (L, G, A) 및 기본 값 FL 및 FGA를 포함한다. 이들 각각은 선형 예측인자 공식의 사용 이전에 중앙 모집단 값 (ML, MG, MA)을 차감함으로써 표준화된다. 표준화된 값은 범용 공식에서 "S"의 아래 첨자로 표시된다.
Figure pct00002
2.1.2 IC 비율의 계산
IC 비율은 위음성 표시의 확률을 줄이기 위해 표본 억제를 보상하는 항의 일부로서 범용 공식에서 사용된다. IC 비율은 내부 제어 (IC) T시간에 대해 관찰된 값을 IC T시간에 대한 예상된 값으로 나눈 것이다. 반응이 억제되는 경우 (예상보다 느린 반응), IC 비율은 1보다 크다. 예상된 IC T시간은 유효한 키트 교정인자 반복의 평균 관찰된 IC Ｔ시간으로서 계산된다.
IC Ｔ시간을 생성하지 않는 표본의 경우, IC 비율은 상수 ICd로서 정의된다. 디폴트 IC Ｔ시간은 유효한 키트 교정인자 반복의 평균 관찰 IC Ｔ시간에 ICd를 곱한 값으로서 계산될 수 있다. 디폴트 IC Ｔ시간보다 작지 않은 모든 IC Ｔ시간은 ICd를 IC 비율로서 사용한다.
Figure pct00003
2.1.3 범용 공식
APTIMA® BV 결과 해석을 위해 PANTHER® 소프트웨어로 코딩된 공식은 범용 공식으로서 지칭된다. 이 공식에서, 아래 첨자 "S"는 관련 분석물질에 대한 모집단 중앙값의 차감에 의해 표준화된 값을 말한다.
BV 점수 = C0 + WL최대값(LS, FLS) + WA최대값(AS, FAS) + WG최대값(GS, FGS) + WGA최대값(AS, GS, FGAS) + WIC로그2(IC비율)
이 범용 공식은 알고리즘을 완성하기 이전에 구현되었다. 후속적으로, WA 및 WG는 둘 다 0으로 설정되었다. 따라서, 공식 (적용된 바와 같음)을 다음과 같이 단순화할 수 있다.
BV 점수 = C0 + WL최대값(LS, FLS) + WGA최대값(AS, GS, FGAS) + WIC로그2(IC비율)
이 공식에서, 4개의 항을 다함께 더하여 점수를 만든다.
Figure pct00004
2.2 BV 점수의 해석
BV 양성 또는 BV 음성 상태 (보고된 표시)를 결정하기 위해 수치 BV 점수를 단일 컷오프 값 (현재 0으로 설정됨)과 비교한다. 표본의 BV 점수가 컷오프 값 미만인 경우, 표본은 BV 음성으로서 보고된다. 점수가 컷오프 값 이상인 경우, 표본은 BV 양성으로서 보고된다.
3. 임상 표본 결과 해석에 다변량 알고리즘의 적용
BV 임상 결과의 해석을 위해, 표 4에 나타낸 바와 같이 암셀 판정기준으로 결정된 중간값을 갖는 뉴전트 점수로 "진정한 결과"를 결정하였다.
Figure pct00005
알고리즘에 사용된 상수는 표 5에 설명되어 있으며, 이 분석에 사용된 수치 값으로 나타낸다.
Figure pct00006
개발 중인 APTIMA 제품에 대한 BV RT-TMA PANTHER 테스트 결과로부터 두 세트의 데이터를 수집하였다. 훈련 세트는 대상체 당 하나의 테스트에서 1204개의 테스트 결과로 구성된다. 이러한 데이터 세트는 표 5에 나타낸 상수 값을 유도하는데 사용되었다. 검증 세트는 대상체 당 하나의 테스트에서 1076개의 테스트 결과로 구성된다. 대상체의 모집단은 동일하였지만, 훈련과 검증 세트 사이에 공통되는 테스트 결과는 없었다. (본원에서 "훈련 세트"및 "검증 세트"는 임상 표시 (양성 또는 음성)를 만들기 위한 알고리즘을 최적화하도록 동일한 검정법 설계로 테스트된 임상 표본 세트를 말한다. 훈련 세트는 임시 알고리즘을 설계하는데 사용되는 표본 그룹이며, 검증 세트는 알고리즘 성능의 정확성을 테스트하는 별도의 표본 세트이다.)
범용 공식에서 표 5로부터의 상수를 사용하는 것은 표 6에 나타낸 훈련 세트 및 검증 세트에 대한 임상 성능 (민감도/특이도) 추정값을 제공한다.
Figure pct00007
BV는 상이한 인종 및 민족 그룹에서 다르게 나타날 수 있다. 따라서, 훈련 세트 및 검증 세트는 다음의 카테고리를 사용하여 인종/민족별로 구분하여 나타내고 있다: 민족에 상관없이 흑인 또는 아프리카계 미국인 (흑인), 비-히스파니아계 백인 (백인-NH), 히스파니아계 백인 (백인-Hisp), 민족과 상관없이 아시아인 (아시아인) 및 기타. 기타 카테고리는 아일랜드인, 인도인, 중동인, 아메리카 원주민 및 기타 알려지지 않거나 혼혈 인종의 사람들로 구성된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 2: 증폭 간섭
바람직하게, 증폭 올리고는 바람직한 표본 유형에서 높은 역가로 존재할 수 있는 다른 유기체로부터의 최소의 간섭으로 표적화된 종의 16S rRNA를 특이적으로 검출한다. 다른 질 유기체와 G. 버지날리스의 16S rRNA 서열 정렬이 G. 버지날리스와 비피도박테리아 사이의 유사성을 보여주었고, 비피도박테리아 또는 다른 관련 유기체에 의한 간섭이 일부 표본에서 G. 버지날리스의 검출에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 추가적인 G. 버지날리스 증폭 올리고는 가능한 간섭을 줄이도록 설계되었다.
초기 설계는 약 964번 내지 1033번 (영역 1)의 서열번호 5의 증폭을 표적화하였다. 잠재적으로 더 큰 특이성을 갖는 부위를 표적으로 하는 추가적인 올리고를 스크리닝하였다 (서열번호 5, 대략 염기 160번 내지 277번 (영역 2)).
간섭을 테스트하기 위해, 프라이머 세트는 시료에 존재하는 더 높은 농도의 Bifidobacterium breve가 있거나 없는 1E4 CFU/mL G. 버지날리스를 포함하는 시료에서 수동 RT-TMA 형식으로 테스트되었다. 각 세트는 B. breve 부재 시 1E4 CFU/mL Gvag 조건과 비교한 각 조건에 대해 나타낸 5회 반복 및 평균 값 (RFU 범위, 비정규화 Ｔ시간 및 비정규화 T경사)에서 테스트되었다.
Figure pct00010
G. 버지날리스 증폭 간섭에 대한 테스트 결과. 영역 2의 세트 둘 다는 높은 역가의 B. breve 존재 시 비교적 안정한 G. 버지날리스 검출을 제공하였다. 대조적으로, 세트 1 (영역 1의)은 증가하는 B. breve 농도의 존재 하에 감소된 RFU 범위, 감소된 Ｔ경사 및 증가된 Ｔ시간을 제공하여 G.vag 증폭 간섭을 입증하였다.
락토바실러스 종 (L. 가세리, L. 젠세니 및 L. 크리스파투스) 검출을 위한 초기 올리고 조합은 고농도의 여러 다른 유기체 존재 하에서 저농도 L. 가세리의 검출 감소를 보여주었다. 간섭을 줄이고 특이도를 개선하기 위해 3가지 표적화된 락토바실러스 종 각각에 대해 별도의 정방향 프라이머를 설계하였다. 고유의 올리고 세트와 개질된 올리고 세트는 각각 단독으로 또는 N. gonorrhoeae 1E6 CFU/mL, C. difficilet 1E6 CFU/mL, A. lwoffii 1E6 CFU/mL, M. hominis 5E9 사본/mL 또는 L. iners 1E6 CFU/mL의 존재 시, L. 가세리 1E4 CFU/mL 의 검출을 위한 수동 RT-TMA 형식으로 사용되었다. 두 조건은 동일한 프로모터 프라이머와 토치 조합 (서열번호 10, 서열번호 259 및 서열번호 11)을 사용하였다. 각 조건에 사용되는 정방향 프라이머는 하기 표에 나타낸다. 간섭을 평가하기 위해 각 시료의 평균 Ｔ시간을 L. 가세리 1E4 CFU/mL에 대한 평균 Ｔ시간으로 나누었다. 100％를 초과하는 Ｔ시간 비율은 Ｔ시간 지연 (증폭 간섭)을 나타낸다.
Figure pct00011
락토바실러스 종 증폭 간섭에 대한 테스트 결과. 초기 조건 (L. 가세리, L. 젠세니 및 L. 크리스파투스에 대한 단일한 정방향 프라이머 사용)은 C. difficile, A. lwoffi 및 M. hominis에 의한 증폭 간섭을 보인 반면, 개질된 조건 (각 표적화된 종에 대해 별도의 정방향 프라이머 사용) 은 그렇지 않았다.
실시예 3: 락토바실러스 표적 포획 올리고 스크리닝
락토바실러스 종 표적 포획 올리고에 대한 초기 설계 (서열번호 257)를 개선하기 위해, L. 크리스파투스, L. 가세리 또는 L. 젠세니 1E4 CFU/mL을 포함하는 시료에서 기존 설계와 동시에 추가적인 설계를 만들고 스크리닝하였다. 증폭 및 검출 올리고 (모든 조건에 공통적임)는 서열번호 258, 서열번호 10, 서열번호 259 및 서열번호 11이었다. 스크리닝이 수동 RT-TMA 형식으로 조건 당 3회 반복으로, 평균 정규화된 T시간 값을 표시하여 수행하였다.
Figure pct00012
조건이 표적 포획 올리고에 의해서만 달라지기 때문에, 더 느린 증폭 (더 높은 Ｔ시간)은 표적 포획 효율 감소에 기인할 수 있다. 조건 1에서는 표적 포획 올리고가 사용되지 않았고, Ｔ시간이 지연되거나 부재하였다. 표적 포획 올리고의 사용은 포획 효율성을 증가시킴으로써 이를 개선할 것으로 기대된다. 서로 다른 조건에서는 3가지 락토바실러스 종을 포획하기 위해 단일한 TCO를 사용하였다. 조건 4 내지 8에서 TCO는 락토바실러스 16S rRNA를 특이적으로 포획하도록 설계되어, 다른 속으로부터의 서열보다 이러한 서열을 선호하였다. 조건 2 및 3에서 TCO는 락토바실러스 뿐만 아니라 다른 세균으로부터의 rRNA를 포획하도록 설계되었다.
결과. 조건 5, 6 및 7은 초기의 락토바실러스 TCO 설계 (조건 4) 및 덜 특이적인 TCO 둘 다 (조건 2 및 3)보다 3가지 표적화된 락토바실러스 종 모두에 대해 Ｔ시간이 더 신속하다 (더 효율적인 포획). 3가지 바람직한 락토바실러스 TCO 설계 중 조건 7 (TCO 서열번호 6)은 이 실험에서 가장 높은 효율 (가장 낮은 T시간)을 나타냈다.
실시예 4: 초기 다중복합화의 교차-반응성
G.vag, A.vag 및 락토바실러스 종의 검출을 위한 RT-TMA 시약의 다중복합 입체구조는 표 12의 올리고를 사용하여 조립되었다.
Figure pct00013
시약은 높은 역가 (대부분의 경우 1E6 CFU/mL)에서 개 내지 5개의 표적화되지 않은 유기체를 포함하는 풀에 대해 표본 당 5회 반복으로 PANTHER 기기에서 테스트되었다. FAM 채널에서 예상치 못한 신호가 풀 #7에서 관찰되었으며, 이는 다음의 4가지 유기체: Mobiluncus curtisii (5E9 사본 rRNA/mL), Mycoplasma genitalium (1E6 CFU/mL), Mycoplasma hominis (5E9 rRNA 사본/mL) 및 Neisseria gonorrhoeae (1E6 CFU/mL)로 구성되었다. 풀 #7로부터의 개별 유기체를 포함하는 시료에 대해 추적 테스트를 시행하였다. 시약은 대조군 조건 당 2회 반복 및 테스트 조건 당 4회 반복으로 PANTHER 기기에서 테스트되었다. 평균 정규화된 Ｔ시간은 하기 표 13에 나타낸다.
Figure pct00014
예상치 못한 FAM 신호가 M. genitalium에서만 관찰되었다. 올리고머가 예상치 못한 신호 생성에 책임이 있는지 결정하기 위해, 각 조건에 대한 다중복합 혼합물으로부터 개별 올리고머를 생략하는 실험을 시행하였다. 다중복합체는 표 12의 올리고머를 이용하였으며, 서열번호 23은 생략하였다. 8개의 시약 세트 (모든 올리고머를 포함하는 대조군 조건 및 단일한 올리고머가 생략된 7개의 조건) 각각을 조건 당 3번 반복하여 특이도 풀 #7에 대해 수동 RT-TMA 형식으로 테스트하였다. 정규화된 FAM Ｔ시간은 하기 표 14에 나타낸다.
Figure pct00015
이 실험은 예상치 못한 FAM 신호 생성을 위해 서열번호 259, 서열번호 10, 및 서열번호 45가 필요함을 나타냈다. FAM에서 M. genitalium 검출용 이러한 올리고의 충분한 정도를 테스트하기 위해 RT-TMA 시약이 구축되었으며, 이 3가지 올리고머 (서열번호 259, 서열번호 10 및 서열번호 45)가 유일한 토치, 프로모터 프라이머 및 프라이머이었다. M. genitalium은 테스트된 4개 반복 모두에서 FAM 상에서 검출된 반면, A. vag, G. vag, L. gas 및 음성 대조군은 이 올리고머 조합으로 검출되지 않았다 (표 15 참조). 따라서 이 올리고머 세트로 충분하다.
Figure pct00016
표 12에 설명된 다중복합체에 대한 M. genitalium 교차-반응성 위험은 초기 생물정보학 평가에서 표시되지 않았다. 서열번호 10 및 서열번호 259는 M. genitalium에 대한 예측된 혼성화에 대한 초기 판정기준을 충족하지 못하였다. 따라서 관찰된 교차-반응성은 예상치 못한 것이었다.
실시예 5
A.vag 민감도를 증가시키기 위하여, 다중복합 테스트가 2가지 A.vag 시스템과 함께 동시에 시행되었다: (1) 긴 앰플리콘 ("LAG-5")와 함께 이중상 A. vag 시스템을 사용하는 Lacto-A.vag-G.vag 다중복합체 및 (2) 짧은 앰플리콘 ("LAG-6")와 함께 비-이중상 A. vag 시스템을 사용하는 Lacto-A.vag-G.vag 다중복합체. 이러한 A.vag 시스템은 표 16에 나타낸 올리고로 시작되었다.
Figure pct00017
A.vag 이중상 시스템은 IVT 등가의 임상 관련 고농도 A.vag (≥1E11 cp/mL)로부터 Ｔ시간을 제공하기에는 너무 신속하였다. 이전에 설계된 A.vag T7 올리고가 재스크리닝되었다. 예측된 2차 구조를 가진 하나의 T7은 Ｔ시간을 더 느리게 하였다.
A.vag 비-이중상 시스템의 개선은 A.vag 곡선 경사를 개선하는데 중점을 두었다. 다수의 A.vag 토치 반복이 동일한 영역 내에서 설계되고, 단일복합체로 스크리닝되었다. 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 A.vag 토치는 다중복합체 맥락에서 민감도의 개선으로 인해 선택되었다.
분석적 특이도 결과는 2가지 A.vag 시스템 (LAG5 및 LAG6) 간에 유사하였다.
개선된 A.vag 올리고 세트는 하기 표 17에 나타낸다.
Figure pct00018
LAG5 및 LAG6 다중복합체 올리고 조합 (상기 표 17에 나타낸 바와 같이 A.vag 설계 올리고에서 다름)의 임상 성능을 2가지 작은 질 임상 면봉 시료 세트에서 비교하였다. 데이터는 2가지 유형의 알고리즘, 즉 실시예 6에 기술된 바와 같이 L. crisp, G. vag 및 A. vag 표준 곡선의 정량화를 기초로 하는 결정 트리 알고리즘 및 교정되지 않은 Ｔ시간 비율 알고리즘으로 해석되었다. 교정되지 않은 Ｔ시간 비 알고리즘에서 표본이 2가지 판정기준 둘 다를 충족하는 경우 양성으로서 표시되었다 (다른 경우 이들은 음성이었음): 1) G. VAG Ｔ시간 또는 A. VAG Ｔ시간 대비 내부 대조군 T 시간의 비율이 컷오프 값을 초과하고, 2) G. vag Ｔ시간 또는 A. vag Ｔ시간 대비 L. spp Ｔ시간의 비율이 다른 컷오프 값을 초과하였음. 부재 시간은 고정된 값으로 할당되었다. LAG5와 LAG6 둘 다 유사한 임상 성능을 보였지만, LAG6가 미리 확립된 로그c/mL 컷오프 값 (Lacto 8.3, G.vag 10.5 및 A.vag 7.4)에서 약간 더 나은 성능을 보였다. 이 프로젝트는 LAG6 다중복합체 설계를 사용하여 진행되었으며, 모든 시스템은 비-이중상이고, A.vag 앰플리콘은 짧았다.
실시예 6
표 18에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고머를 L. 크리스파투스, L. 젠세니, L. 가세리, G. 버지날리스, 및 A. 버지내 그리고 일반 내부 대조군 (GIC)의 증폭 및 검출을 위한 다중복합 APTIMA® 세균성 질증 (ABV) 검정법에서 평가하였다.
Figure pct00019
세균성 질증 검정법을 위해 설계되고 스크리닝된 올리고머는 표 34에 나타낸다. 이러한 스크리닝을 기초로 하여, 표 16에 나타낸 올리고머는 선형성, 교차-반응성, 임상 성능 및 긴장 포용도를 위한 PANTHER® 시스템 상에서 추가 평가를 위해 선택되었다.
다음의 대용량 액체 시약이 구축되었다:
1) TCR: HEPES 유리산 디하드레이트 (250 mM), 수산화리튬 모노하이드레이트 (310 mM), 염화리튬 (1.883 M), EDTA 유리산 (100 mM), 폴리 dT14 매그 입자 (0.03％ w/v), 수산화리튬 및 염산으로 pH, 물로 부피;
2) 효소: HEPES 유리산 (57.46 mM), EDTA 유리산 (0.98 mM), 트리톤 X-100 (0.10 v/v), 염화칼륨 (49.61 mM), 무수 글리세롤 (0.2 v/v), EDTA 이소듐 탈수화물 (0.39 mM), N-아세틸-L-시스테인 (49.58 mM), D(+) 트레할로스 탈수화물 (0.03 w/v), 클론된 MMLV 효소 (224 MR/L), T7 RNA 중합효소 (140 MU/L), 물로 부피;
3) 증폭 및 프로모터 시약: 염화칼륨 (23.3 mM), 글리세롤 무수물 (3.33％), 아연 아세테이트 탈수화물 (0.05 mM), 프로클린 300 보존제 (0.02％), 트윈-20 (1％), 트리즈마 염기 (11.61 mM), 트리즈마 염산화염 (14.94 mM), 염화마그네슘 (31 mM), dATP (0.83 mM), dCTP (0.83 mM), dGTP (0.83 mM), dTTP (0.83 mM), ATP (7 mM), CTP (7 mM), GTP (7 mM), UTP (8 mM), 물 (부피).
표 19의 Amp 및 Pro 시약은 증폭 및 프로모터 대용량 시약의 분취량에 올리고뉴클레오티드를 스파이킹하여 제조하였다. 표 19의 TCR 시약은 올리고뉴클레오티드 및 내부 대조군 시험관내 전사체를 TCR 대용량 시약으로 스파이킹하여 제조하였다. 효소 시약에 올리고를 첨가하지 않았다.
응집을 감소시켜 토치 안정성을 향상시키기 위해 계면활성제 트윈-20을 amp/프로모터 완충액에 최종 농도 1％로 첨가하였다.
테스트는 PANTHER 시스템에서 시행되었으며, 결과는 실시간 곡선 성질 해석을 위해 사내 개발 소프트웨어로 분석되었다.
Figure pct00020
선형성/동적 범위 테스트/분석 민감도
5개의 검정 표적 (A.vag, G.vag, L.crisp, L.gas 및 L.jen) 각각에 대해 선형성 테스트를 시행하였다. 각 분석물에 대해 두 세트의 패널이 준비되었다. 하나의 패널은 배양 용해물을 표본 운반 배지, STM (소듐 포스페이트 일염기성 모노하이드레이트 (2.07 g/L), 리튬 라우릴 설페이트 (30 g/L), EDTA 이소듐 탈수화물 (0.372 g/L)), EGTA 유리산 (0.38 g/L), 이염기성 소듐 포스페이트 (2.13 g/L)) 내에 스파이킹하여 준비하였다. 두 번째 패널은 시험관내 전사체 (IVT)를 STM 내에 스파이킹하여 준비하였다. 각 패널은 PANTHER 시스템에서 5회 반복으로 테스트되었다. 패널 농도는 표 20에 열거되어 있다.
Figure pct00021
표 21은 5가지 분석물 모두에 대한 양성률 요약을 보여준다. A.vag 및 3가지 Lacto 종 모두 1E + 07 c/mL까지의 100％ IVT 양성도를 갖는다. G.vag는 1E + 08 c/mL에서 100％ IVT 양성도를 갖는다. 모든 용해물은 1E + 03 CFU/mL에서 100％ 양성도를 갖는다.
모든 분석물에 대한 자세한 선형성 결과는 표 22 내지 26에 나타낸다. 표시된 결과는 양성도, 평균 RFU 범위, 평균 Ｔ시간, 평균 Ｔ경사 및 표준 편차를 포함한다. 모든 반응은 일반 내부 대조군에 의해 표시된 바와 같이 타당하였다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
미생물에 대한 교차-반응성 - 정돈된 (분석적 특이도) 및 스파이크 (억제) 테스트
비뇨 생식기의 정상 세균총 또는 APTIMA BV 표적과 밀접하게 관련된 유기체를 예시하는 세균 또는 효모 물질로 구성된 17개의 풀이 교차-반응성 테스트를 지원하도록 구축되었다 (표 27 참조). 각 유기체의 농도는 1.00E + 06 CFU/mL 또는 세포 등가물/mL를 표적으로 하였으며, 이는 예상된 농도의 최고값 이상이다.
분석적 특이도를 검증하기 위해 풀을 정돈하여 테스트하였다 (검정 표적으로부는 스파이크되지 않음). 풀은 또한 각각의 검정 표적 (A.vag, G.vag 및 3가지 Lacto 용해물)을 예시하는 용해물로 스파이 킹되게 테스트되어, 다른 미생물에 의한 검정 억제에 대해 테스트되었다. 각 조건은 5회 반복으로 테스트되었다.
Figure pct00028
Figure pct00029
정돈된 교차-반응성 결과
FAM 채널 (Lacto 종)은 풀 #16 (Lacto acidophilus)에 대해 양성 신호를 제공하였다. 이러한 양성 결과는 L.crisp에 대한 테스트 유기체의 실질적인 서열 동일성으로 인해 예상되었다. L. acidophilus는 상부 위창자관에서 발견되고, 질내 세균총에는 존재할 가능성이 없기 때문에 이러한 교차-반응성이 허용가능하다.
HEX 채널 (G.vag)은 17개 패널 모두에 대해 음성 결과를 제공하였다.
ROX 채널 (A.vag)은 풀 #13 (아토포비움 종)에 대해 양성 신호를 제공하였다. 풀 #13을 구성하는 3가지 아토포비움 종 (A.rimae, A.minimum, A.parvulum)을 분리하고 다시 테스트하였다. 구성성분 테스트는 3가지 아토포비움 종 모두 ROX 채널에서 양성 신호를 제공하였다.
Cy5.5 채널 (GIC)은 17개 풀 모두에 대해 양성 결과를 제공하였다.
스파이크된 교차-반응성 결과
표적 검정 분석물 (L.crisp, L.jen, L.gas, A.vag 또는 G.vag)을 표 27의 17개 풀 각각 내에 스파이크하였다. 양성 분석물을 대략 3xLOD 농도로 스파이크하고, 풀 당 패널 당 5회 반복 테스트하였다. 분석물 스파이크 농도는 표 28에 나타낸다. 스파이크된 STM (풀 0)은 비교를 위한 대조군으로서 테스트되었다.
Figure pct00030
스파이크된 교차-반응성 테스트를 위해 한 세트의 대용량 시약이 구축되었다. 대용량 시약은 테스트를 위해 3개의 100회-테스트 시약 키트로 분취되었다. 효소의 개별 병은 3개의 키트 각각에 대해 별도로 재구성되었다. Ｔ시간 결과를 좌표화하였을 때, 시약 키트 #2는 4개 채널 모두에 대한 Ｔ시간이 시약 키트 #1 및 #3과 비교할 때 더 느린 것으로 관찰되었다. 이것은 효소의 인식 변동성으로 인해 발생하였을 것 같고, 따라서 키트 간 변동성으로 인해 발생할 수 있는 분산을 나타낸다. 분석물 Ｔ시간을 GIC Ｔ시간으로 나누면 데이터를 정규화하여 키트 간 변동성을 설명한다. Ｔ시간 결과는 표 29에 열거되어 있다.
FAM 채널 (Lacto 종)은 대조군 (풀 #0)과 비교할 때, 풀 #16 (L. acidophilus)의 존재 시 L.crisp, L.jen 및 L.gas로부터의 더 신속한 Ｔ시간 결과 그리고 풀 #06 (L.bucalis, M.curtisii, M.genitalium, M.hominis)에 대해 약간 지연된 T시간을 보여주었다. 풀 #16은 정돈된 테스트 동안도 교차-반응성을 보였으며, 테스트 유기체의 16S 설계 영역에서 L.crisp과 밀접하게 관련된 특성으로 인해 예상되었다. 풀 #06은 하위 구성성분으로 나뉘어져서, 다시 테스트되었다. 재검사는 M.hominis 존재 시 L.gas Ｔ시간에서 1.6분 지연을 보여주었다.
HEX 채널 (G.vag)은 풀 #12 (Candida tropicalis, krusei 및 lusitaniae)의 존재 시 테스트할 때 5회 반복 중 4회에서 민감도 손실을 나타내었다. 풀 #12를 구성하는 3가지 칸디다 종을 분리하고 다시 테스트하였다. 구성성분 테스트에서 C. krusei 가 민감도 손실을 일으킨 것으로 나타났다. 이러한 잠재적인 간섭은 C. krusei 가 질내 세균총에서 발견되지만 흔하지 않기 때문에 주의해야 한다. (BD MaxTM 질 패널에 대한 미국 임상 연구에서 C. krusei 비율은 4/1647 또는 0.2％이었음, BD PI 참조번호 443710).
ROX 채널 (A.vag)은 대조군 (풀 0)과 비교할 때 풀 #13 (아토포비움 종)에 대해 약간 더 신속한 Ｔ시간을 나타내었다. 이것은 정돈된 테스트에서 교차-반응성을 일으킨 동일한 풀이며, 테스트 유기체의 APTIMA BV 표적 A.vag와 밀접하게 관련된 특성으로 인해 예상되었다.
Cy5.5 채널 (GIC)은 풀 #6 (L.bucalis, M.curtisii, M.genitalium, M.hominis)에 대해 약간 지연된 Ｔ시간을 보여주었다. 이들 4가지 유기체의 구성성분 테스트는 M.hominis가 GIC T 시간을 단지 1분 동안 지연시키고, GIC 출현 곡선 모양을 약간 변화시키는 것을 보여준다. Mycoplasma hominis는 BV 대상체에서 공통적으로 발견된다. 실시예 1에 설명된 BV 다변량 알고리즘을 사용하여, GIC의 Ｔ시간 지연은 IC 비율 항을 통해 BV 점수를 상승시키고, 따라서 BV 양성 표시의 확률을 증가시킨다. 이것은 M. hominis를 포함한 BV와 관련된 유기체의 존재로 인한 반응 억제 효과를 경감할 수 있다.
Figure pct00031
임상 시료의 평가
임상 표본 테스트는 STM에서 수집한 100개의 임상 질 면봉 표본 세트로 시행되었다. 10개 임상 부위로부터 증상이 있는 여성의 시료를 PANTHER 기기에서 APTIMA BV 검정법으로 테스트하였다. 시료 당 하나의 반복분이 테스트되었다.
임상 시료는 20개의 교정인자 (L.crisp, A.vag 및 G.vag에 대한 5개의 단일 분석물 교정인자 수준 및 3개의 분석물 모두를 포함하는 5개의 혼합된 분석물 교정인자 수준)와 함께 전개되었다. 각 단일 분석물 교정인자는 4회 반복으로 테스트되었고, 각 혼합된 분석물 교정인자는 5회 반복 테스트되었다.
테스트된 100개의 임상 표본 반복분 중 93개의 반복분이 유효하였다. 시료 부피가 충분하지 않아 나머지 7개의 반복분은 유효하지 않았다.
임상 시료 정량화는 L.crisp, G.vag 및 A.vag 표준 곡선을 기초로 하여 계산되었다.
BV 상태의 진단은 정량화 및 결정 트리 알고리즘을 기초로 하였다. 결정 트리 알고리즘은 다음과 같이 요약할 수 있다 (여기서 L, A 및 G는 각각 L.crisp, A.vag 및 G.vag에 대해 측정된 로그사본 값이고 X, Y 및 Z는 각각 L.crisp, A.vag 및 G.vag에 대한 컷오프 값임): L > X인 경우 BV 음성이고; 아니면 A> Y 또는 G> Z인 경우 BV 양성이고, 그렇지 않으면 BV 음성이다. 이러한 검정법에서 L.crisp, G.vag 및 A.vag에 대해 각각 다음의 컷오프 값: 8.3, 10.4 및 7.4 로그 c/mL이 사용되었다.
본 실시예에서 사용된 임상 기준 표준은 4개의 암셀 판정기준 중 3개에 의해 결정된 중간값을 갖는 뉴전트 점수이다.
단일 분석물 및 혼합된 분석물 교정인자는 동일한 민감도 결과 (90.2％)와 유사한 특이도 결과 (각각 88.5％ 및 86.5％)를 제공했으며, 정량화 차이로 인해 하나의 시료가 변경되었다 (표 30 참조).
Figure pct00032
포용성 테스트
포용성 테스트는 5개의 검정 표적 각각에 대해 하나의 대조군 균주와 모든 입수가능한 다형성 IVT 균주로 시행되었다. 테스트는 각 균주의 낮은 농도와 중간 농도로 시행되었다. 분석물 민감도에 미치는 다형성의 영향을 결정하는데 낮은 패널 결과를 사용하고, 분석물 T시간에 미치는 다형성의 효과를 결정하도록 중간 패널 결과를 분석하였다.
표 31은 테스트된 균주의 수, 뿐만 아니라 각 분석물을 표적으로 하는 저농도 및 고농도를 자세히 설명한다. 결과를 표 32에 나타낸다.
A.vag는 테스트된 4개 다형성 균주 중 3개에 대해 낮은 사본 수준에서 민감도 손실을 나타내었다. 중간 사본 수준은 4개 균주 중 2개에 대해 2 내지 3.5분 Ｔ시간 지연을 나타냈다. Ｔ시간 지연을 보인 2개의 균주는 A.vag T7 올리고와 2개의 미스매칭을 갖는다. Ｔ시간 지연을 보인 2개의 균주는 유병률 21.95％ 및 <4.87％를 갖는다.
G.vag는 테스트된 다형성 균주에 대한 민감도의 손실을 나타내지 않았다. 중간 사본 수준에서, 다형성 균주는 2분보다 약 더 많은 Ｔ시간 지연을 보여주었다. 이러한 다형성은 TCO에서 하나의 미스매칭. 그리고 T7에서 하나의 미스매칭을 갖는다. 이 G.vag 균주는 유병률이 매우 낮다 (2.04％).
L.crisp은 테스트된 2가지 다형성 균주 중 하나에 대해 낮은 사본 수준에서 약간의 민감도 손실만을 보여주었다. 다형성 균주 둘 다는 Ｔ시간에서 차이를 보였다. 대조군과 비교할 때, 한 균주는 Ｔ시간이 3.5분 더 빨라진 반면, 나머지 균주는 Ｔ시간이 2분 더 느려졌다. 이들 균주는 둘 다 T7에 대해 2개의 미스매칭을 갖고, 둘 다 유병률이 2％ 미만이다.
L.gas는 테스트된 모든 균주에 대해 100％ 민감도를 가졌다. 중간 사본 수준은 대조군과 비교하여 다형성 균주에 대한 Ｔ시간의 최소 변화를 나타냈다.
L.jen은 테스트된 모든 균주에 대해 100％ 민감도를 가졌다. 중간 사본 수준은 대조군과 비교하여 다형성 균주에 대한 Ｔ시간의 최소 변화를 나타냈다.
Figure pct00033
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전술한 내용으로부터, 구체적인 구현예가 예시의 목적으로 본원에 기술되어 있지만, 다양한 변형이 명시적인 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적으로 이들의 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 참고문헌으로 통합된 모든 자료가 본 발명의 명시적 내용과 부합되지 않는 경우, 명시적 내용이 우선한다.
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다.　2019년 8월 20일자로 제작된 상기 ASCII 사본은 2019-08-20_01159-0039-60PCT_Seq List_ST25.txt로 명명되고, 크기는 66.8 킬로바이트이다.
SEQUENCE LISTING <110> GEN-PROBE INCORPORATED Getman, Damon K. Hudson, Angela S. Pham, Jimmykim Wang, Xianqun Clark, Caroline <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING BACTERIAL NUCLEIC ACID AND DIAGNOSING BACTERIAL VAGINOSIS <130> 01159-0039-00PCT <150> US 62/722,627 <151> 2018-08-24 <160> 261 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1518 <212> DNA <213> Lactobacillus crispatus <300> <308> NR_041800 <309> 2015-02-03 <313> (1)..(1518) <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gagcggaact aacagattta 60 cttcggtaat gacgttagga aagcgagcgg cggatgggtg agtaacacgt ggggaacctg 120 ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata ccggataaga aagcagatcg 180 catgatcagc ttttaaaagg cggcgtaagc tgtcgctatg ggatggcccc gcggtgcatt 240 agctagttgg taaggtaaag gcttaccaag gcgatgatgc atagccgagt tgagagactg 300 atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 360 cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga 420 tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg 480 taatcaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540 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Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(52) <223> dT3dA30 immobilized probe-binding region <400> 222 uccaucagac uugcguccat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52 <210> 223 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 223 ggtagtgaag aaagataga 19 <210> 224 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 224 tctatctggt agtgaagaaa gataga 26 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 225 agtgaagaag gttttcggat 20 <210> 226 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 226 atccgagtga agaaggtttt cggat 25 <210> 227 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 227 cctctatggt gaagaaagat agagg 25 <210> 228 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 228 cuugcgacga ggccgcaag 19 <210> 229 <211> 48 <212> DNA 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 235 gcuccugaua ccggcaggag c 21 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 236 ugccgcuccu gauaccggca 20 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 237 ugccggcucc ugauaccggc a 21 <210> 238 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 238 cgguauaucc gcuccugaua ccg 23 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 239 gguauuaucc gcuccugaua ccg 23 <210> 240 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 240 gguauuaucc gcuccugaua cc 22 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 241 cugccuccug auaccggcag 20 <210> 242 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 242 cgguacuauc cgcuccugau 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Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> promoter <222> (7)..(33) <400> 248 tctggtaatt taatacgact cactataggg agaccatctt cccctaccag a 51 <210> 249 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> promoter <222> (8)..(34) <400> 249 tctggtaaat ttaatacgac tcactatagg gagaccatct tcccctacca ga 52 <210> 250 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> promoter <222> (9)..(35) <400> 250 tctggtagaa tttaatacga ctcactatag ggagaccatc ttcccctacc aga 53 <210> 251 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> promoter <222> (10)..(36) <400> 251 tctggtagga atttaatacg actcactata gggagaccat cttcccctac caga 54 <210> 252 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> promoter <222> (1)..(27) <400> 252 aatttaatac gactcactat agggagaggt atcaggagcg gatag 45 <210> 253 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> promoter <222> (1)..(27) <400> 253 aatttaatac gactcactat agggagaggt atcaggagcg gata 44 <210> 254 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 254 gauccgcucc ugauacccgg auc 23 <210> 255 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 255 gcgguacuau ccgcuccuga uaccgc 26 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 256 cuccugauac cggcagagga g 21 <210> 257 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13)..(45) <223> dT3dA30 immobilized probe-binding region <400> 257 ucuguuaguu cctttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 45 <210> 258 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 258 cggatgggtg agtaac 16 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 259 cacucacgca ugucuagagu g 21 <210> 260 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(50) <223> dT3dA30 immobilized probe-binding region <400> 260 caugcuccgc cgcuuguttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50 <210> 261 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 261 ccugcagaga ugugguuucg cagg 24

Claims (6)

  1. 시료에서 락토바실러스 종 (Lactobacillus sp.), A. 버지내 (A. vaginae) 및 G. 버지날리스 (G. vaginalis) 각각의 존재 또는 부재를 결정하는 다중복합 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    (1) 락토바실러스 종, A. 바지내 및 G. 바지날리스 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의심되는 시료를,
    (a) 락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 상기 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 상기 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
    (b) A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 A. 버지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 버지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 버지내 특이적 증폭 올리고머; 및
    (c) G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머와 접촉시키는, 단계;
    (2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 핵산이 상기 시료에 존재하는 경우, 상기 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
    (3) 상기 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 상기 시료에서 상기 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
  2. 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 조성물 또는 키트로서, 다음을 포함하는 조성물 또는 키트:
    (a) 락토바실러스 종 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 상기 제 3 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 상기 제 4 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 락토바실러스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, 락토바실러스 특이적 증폭 올리고머;
    (b) A. 바지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 A. 바지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 A. 바지내 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 A. 바지내 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, A. 바지내 특이적 증폭 올리고머; 및
    (c) G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 G. 버지날리스 특이적 표적-혼성화 서열을 포함하는, G. 버지날리스 특이적 증폭 올리고머.
  3. 대상체에서 세균성 질증 (BV)의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    (a) BV에 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료에서 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스의 검출을 위한 검정법을 수행하는 단계;
    (c) 상기 검출 검정법을 기초로 하여 락토바실러스 종, A. 버지내 및 G. 버지날리스 각각에 대해 정량적 값을 할당하는 단계;
    (d) 상기 A. 버지내의 정량적 값 및 상기 G. 버지날리스의 정량적 값 중 더 큰 값으로부터 상기 락토바실러스 종의 정량적 값을 차감하는 단계;
    (e) 단계 (d)를 기초로 하여 단일한 BV 점수를 할당하는 단계; 및
    (f) 상기 BV 점수와 컷오프 값의 비교를 기초로 하여 대상체에서 상기 BV의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
  4. 시료에서 락토바실러스 종의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    (1) 락토바실러스 종을 포함하는 것으로 의심되는 시료를 락토바실러스 종의 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 10의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iii) 상기 제 3 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 3 표적-혼성화 서열을 포함하고; (iv) 상기 제 4 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 4 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
    (2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 락토바실러스 종 표적 핵산이 시료에 존재하는 경우, 상기 락토바실러스 종 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
    (3) 상기 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 상기 시료에서 상기 락토바실러스 종의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
  5. 시료에서 A. 버지내의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    (1) A. 버지내를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 A. 버지내 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 18의 잔기 28번 내지 45번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
    (2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 A. 버지내 표적 핵산은 상기 시료에 존재하는 경우, 상기 A. 버지내 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
    (3) 상기 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 상기 시료에서 상기 A. 버지내의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
  6. 시료에서 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    (1) G. 버지날리스를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 G. 버지날리스 표적 핵산의 표적 영역을 증폭하는 제 1 및 제 2 증폭 올리고머로서, (i) 상기 제 1 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 15의 잔기 36번 내지 52번의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 1 표적-혼성화 서열을 포함하고; (ii) 상기 제 2 증폭 올리고머는 실질적으로 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제 2 표적-혼성화 서열을 포함하는, 증폭 올리고머와 접촉시키는 단계;
    (2) 시험관내 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 임의의 G. 버지날리스 표적 핵산은 상기 시료에 존재하는 경우, 상기 G. 버지날리스 표적 영역에 상응하는 하나 이상의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로서 사용되는, 단계; 및
    (3) 상기 하나 이상의 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이로써 상기 시료에서 상기 G. 버지날리스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
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