JP2019501652A - Ｃａｎｄｉｄａ種を検出するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を検出するためのＣａｎｄｉｄａ種標的核酸の特異的増幅を利用する方法を開示する。また、増幅オリゴマー、捕捉プローブ、及び検出プローブ、ならびにそれらの組み合わせを含む対応するオリゴマー、ならびに対応する反応混合物及びキットも開示される。試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法のいくつかの実施形態では、本方法は、試料を第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせに接触させることを含む。【選択図】図１
Description
関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）のもと、２０１６年１月４日に出願された仮出願第６２／２７４，６１０号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）のもと、２０１６年１月４日に出願された仮出願第６２／２７４，６１０号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年１月４日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＩＡ．０００３．０２（ＰＣＴ）Ｓｅｑ Ｌｉｓｔｉｎｇ２＿ＳＴ２５」と名付けられ、大きさは２６ＫＢである。
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年１月４日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＩＡ．０００３．０２（ＰＣＴ）Ｓｅｑ Ｌｉｓｔｉｎｇ２＿ＳＴ２５」と名付けられ、大きさは２６ＫＢである。
陰部／外陰膣Ｃａｎｄｉｄａ症（ＶＶＣ）は、「酵母感染症」と呼ばれる場合もある。それは、Ｃａｎｄｉｄａと呼ばれる酵母の過剰増殖が存在するときに生じる一般的な感染である。Ｃａｎｄｉｄａは少量で体内及び体表に常に存在する。しかしながら、不均衡が生じる場合、例えば、膣の正常な酸性度が変化するとき、またはホルモンバランスが変化するときに、Ｃａｎｄｉｄａが増殖し得る。それらが起こるとき、Ｃａｎｄｉｄａ症の症状が現れる場合がある。
ＶＶＣを有する女性は、通常、陰部掻痒、灼熱感、及び時として「カッテージチーズ様」膣分泌物を経験する。陰部Ｃａｎｄｉｄａ症を有する男性は、陰茎に掻痒を伴う発疹を経験し得る。ＶＶＣの症状は、多くの他の陰部感染症の症状と類似し、そのため、適切な治療を保証するために適切な診断を受けることが重要である。
ＶＶＣを診断するための単一基準は今のところない。診断は、検査所見及び患者の状態の両方からのいくつかの徴候の臨床評価に基づく必要がある。身体検査のみによる酵母感染症の診断は困難であり得る。通常、診断は、膣分泌物の試料を採取し、顕微鏡下で試料を調べ、異常な数のＣａｎｄｉｄａ生物が存在するかどうかを確認することによって行われる。Ｃａｎｄｉｄａ種は身体の常在菌であるため、真菌培養は常に有用ではない場合がある。
Ｃａｎｄｉｄａ感染症の治療は、使用される抗真菌薬が宿主毒性を有するため、起因生物が特定されるまで延期されることが多いが、抗真菌療法が迅速である場合、予後が非常に改善される。したがって、任意の治療レジメンは、感染症の診断の特異性及び迅速性に焦点を当てる。したがって、病原性酵母によって引き起こされるＣａｎｄｉｄａ血症などの感染症の診断に役立つ、迅速で感度が高くかつ特異的な試験の必要性が存在する。
したがって、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の特異的で感度が高くかつ迅速な検出のための組成物、反応混合物、方法、及びキットを提供することが本発明の目的である。
一態様では、本発明は、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法を提供する。本方法は、一般に、
（１）Ｃａｎｄｉｄａ種を含有することが疑われる試料を、第１の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第２の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも１つと接触させるステップであって、
（ａ）第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、第１の標的領域が、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、第２の領域が、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
（ｂ）第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含み、第３の標的領域が、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応し、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、接触させるステップと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施するステップであって、試料中に存在する場合、任意のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸が、第１、第２、及び第３の標的領域のうちの少なくとも１つに対応する１つ以上の増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施するステップと、
（３）１つ以上の増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するステップとを含む。
（１）Ｃａｎｄｉｄａ種を含有することが疑われる試料を、第１の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第２の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも１つと接触させるステップであって、
（ａ）第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、第１の標的領域が、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、第２の領域が、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
（ｂ）第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含み、第３の標的領域が、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応し、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、接触させるステップと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施するステップであって、試料中に存在する場合、任意のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸が、第１、第２、及び第３の標的領域のうちの少なくとも１つに対応する１つ以上の増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施するステップと、
（３）１つ以上の増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するステップとを含む。
上記の試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法のいくつかの実施形態では、本方法は、試料を第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせに接触させることを含む。例えば、ある特定の変形例では、本方法は、試料を同じ反応混合物内で第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせと接触させることを含む多重方法である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応し、かつ／または第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１３２の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３３の配列を含む配列、（ｉｉ）配列番号１５２の配列に含有される２０〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１５１の配列を含む配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、かつ／または第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３６の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３７の配列を含む配列である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、本方法は、試料を第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列を含み、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２６、配列番号７４の残基３〜２２、もしくは配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列を含み、かつ／または第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。より具体的な変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列からなり、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２６、配列番号７４、もしくは配列番号３４のヌクレオチド配列からなり、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列からなり、かつ／または第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる。
上記の試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法のいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーのうちの少なくとも１つは、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するプロモーター配列を更に含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に好適なプロモーター配列は、例えば、配列番号９の残基１〜２７に示される配列を有するＴ７プロモーター配列などのＴ７プロモーター配列である。いくつかのかかる実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号９のヌクレオチド配列を有し、かつ／または第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。
典型的には、Ｃａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法は、存在する場合、任意のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸を、ステップ（２）の前に試料中の他の構成成分から精製することを更に含む。ある特定の実施形態では、精製ステップは、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含む。いくつかのかかる変形例では、試料は、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させられ、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の各々は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される。第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブに特に好適な標的ハイブリダイズ配列には、（ｉ）配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列、または（ｉｉ）配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列が含まれる。第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブに特に好適な標的ハイブリダイズ配列には、配列番号 １４２の配列に含有される１６〜２７個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１４３または配列番号１４４の配列を含む配列が含まれる。
上記のように、試料が第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させられるいくつかの実施形態では、本方法は、試料を第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含む。いくつかのかかる変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列である。より具体的な変形例では、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、いくつかのかかる実施形態では、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する。
上記のように、試料が第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させられるいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２４の残基１〜２０もしくは配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、かつ／あるいは第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。より具体的な変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号２４もしくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有し、かつ／または第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号４８のヌクレオチド配列を有する。
ある特定の実施形態では、検出ステップ（３）は、１つ以上の増幅産物を、第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ及び第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブと接触させることと、任意の標的ハイブリダイズＣａｎｄｉｄａ特異的及び／もしくはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの存在または不在を検出することとを含む。特に好適なＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブには、（Ａ１）配列番号１４５の配列に含有される１８〜２２個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４６の配列を含む配列、（Ｂ１）（Ａ１）のＤＮＡ等価物またはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに（Ｃ１）（Ａ１）または（Ｂ１）の完全な補体から選択されるＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含むプローブが含まれる。特に好適なＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブには、（Ａ２）配列番号１４７の配列に含有される１７〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列、（Ｂ２）配列番号１８の残基１〜１７の配列に実質的に対応する配列、（Ｃ２）配列番号２１の残基１〜２０の配列に実質的に対応する配列、（Ｄ２）（Ａ２）〜（Ｃ２）のいずれか１つのＤＮＡ等価物またはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに（Ｅ２）（Ａ２）〜（Ｄ２）のいずれか１つの完全な補体から選択されるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含むプローブが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２７の残基１〜２２の配列、そのＤＮＡ等価もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を含むか、またはそれからなり、かつ／あるいはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６０の残基１〜１７の配列、配列番号４５の残基１〜２３の配列、配列番号１８の残基１〜１７の配列、配列番号２１の残基１〜２０の配列、前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を含むか、またはそれからなる。より具体的な変形例では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブは、配列番号２７の配列、そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を有し、かつ／あるいはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブは、配列番号６０、配列番号４５、配列番号１８、配列番号２１の配列、前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を有する。
検出プローブを利用する方法のいくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々は、少なくとも１つの標識を含む。特定の変形例では、標識は、化学発光標識または蛍光標識である。標識された検出プローブを利用するある特定の実施形態では、検出ステップ（３）は、増幅ステップ（２）中に起こり、いくつかのそのような実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々は、蛍光標識及び消光剤を含む。蛍光標識及び消光剤を含む好適な検出プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、及びＴａｑＭａｎ検出プローブを含む。
検出プローブを利用する方法のいくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの少なくとも１つは、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む。例えば、いくつかの変形例では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々は、分子トーチまたは分子ビーコンである。
上記のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法のある特定の変形例では、ステップ（２）の増幅反応は、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応などの等温増幅反応である。いくつかのかかる実施形態では、増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。
別の態様では、本発明は、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するためのオリゴマーの組み合わせを提供する。オリゴマーの組み合わせは、一般に、第１の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第２の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも１つを含み、
（ａ）第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、第１の標的領域が、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、第２の領域が、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
（ｂ）第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含み、第３の標的領域が、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応し、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。
（ａ）第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、第１の標的領域が、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、第２の領域が、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
（ｂ）第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含み、第３の標的領域が、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応し、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。
上記の試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するためのオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせを含む。例えば、ある特定の変形例では、オリゴマーの組み合わせは、同じ反応混合物内に第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせを含む。
上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応し、かつ／または第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号１３２の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３３の配列を含む配列、（ｉｉ）配列番号１５２の配列に含有される２０〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１５１の配列を含む配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である。
上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、かつ／または第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３６の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３７の配列を含む配列である。
上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを更に含み、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
上記のオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列を含み、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２６、配列番号７４の残基３〜２２、もしくは配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列を含み、かつ／または第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。より具体的な変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列からなり、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２６、配列番号７４、もしくは配列番号３４のヌクレオチド配列からなり、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列からなり、かつ／または第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる。
上記の試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するためのオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーのうちの少なくとも１つは、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するプロモーター配列を更に含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。特に好適なプロモーター配列は、例えば、配列番号９の残基１〜２７に示される配列を有するＴ７プロモーター配列などのＴ７プロモーター配列である。いくつかのかかる実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号９のヌクレオチド配列を有し、かつ／または第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。
ある特定の実施形態では、上記のオリゴマーの組み合わせは、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーを更に含む。いくつかのかかる変形例では、オリゴマーの組み合わせは、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーを含み、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の各々は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される。第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブに特に好適な標的ハイブリダイズ配列には、（ｉ）配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列、または（ｉｉ）配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列が含まれる。第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブに特に好適な標的ハイブリダイズ配列には、配列番号１４２の配列に含有される１６〜２７個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１４３または配列番号１４４の配列を含む配列が含まれる。
上記のように、オリゴマーの組み合わせが第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーを含むいくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含む。いくつかのかかる変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列である。より具体的な変形例では、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、いくつかのかかる実施形態では、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する。
上記のように、オリゴマーの組み合わせが第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーを含むいくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２４の残基１〜２０もしくは配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、かつ／あるいは第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。より具体的な変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号２４もしくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有し、かつ／または第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号４８のヌクレオチド配列を有する。
ある特定の実施形態では、上記のオリゴマーの組み合わせは、第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ、及び第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブを更に含む 特に好適なＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブには、（Ａ１）配列番号１４５の配列に含有される１８〜２２個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４６の配列を含む配列、（Ｂ１）（Ａ１）のＤＮＡ等価物またはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに（Ｃ１）（Ａ１）または（Ｂ１）の完全な補体から選択されるＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含むプローブが含まれる。特に好適なＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブには、（Ａ２）配列番号１４７の配列に含有される１７〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列、（Ｂ２）配列番号１８の残基１〜１７の配列に実質的に対応する配列、（Ｃ２）配列番号２１の残基１〜２０の配列に実質的に対応する配列、（Ｄ２）（Ａ２）〜（Ｃ２）のいずれか１つのＤＮＡ等価物またはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに（Ｅ２）（Ａ２）〜（Ｄ２）のいずれか１つの完全な補体から選択されるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含むプローブが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２７の残基１〜２２の配列、そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を含むか、またはそれからなり、かつ／あるいはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６０の残基１〜１７の配列、配列番号４５の残基１〜２３の配列、配列番号１８の残基１〜１７の配列、配列番号２１の残基１〜２０の配列、前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を含むか、またはそれからなる。より具体的な変形例では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブは、配列番号２７の配列、そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を有し、かつ／あるいはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブは、配列番号６０、配列番号４５、配列番号１８、配列番号２１の配列、前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、または前述のいずれかの完全な補体を有する。
検出プローブを更に含むオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々は、少なくとも１つの標識を含む。具体的な変形例では、標識は、化学発光標識または蛍光標識である。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々は、蛍光標識及び消光剤を含む。蛍光標識及び消光剤を含む好適な検出プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、及びＴａｑＭａｎ検出プローブを含む。
検出プローブを更に含むオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブうちの少なくとも１つは、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む。例えば、いくつかの変形例では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々は、分子トーチまたは分子ビーコンである。
別の態様では、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸を検出するための検出プローブを提供し、検出プローブは、上述のＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブまたはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブである。
本発明のこれら及び他の態様は、本発明の以下の詳細な説明を参照することにより明らかとなる。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、記載される方法及び組成物に関する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語及び語句は、別途特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、記載される方法及び組成物に関する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語及び語句は、別途特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｎｄｉｄａ種」は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａのうちの少なくとも１つ以上を意味する。オリゴマーに関して本明細書で使用される場合、「Ｃａｎｄｉｄａ特異的」は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ標的核酸のうちの少なくとも１つ以上に対する特異性を意味する。オリゴマーに関して本明細書で使用される場合、「Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的」は、少なくともＣ．ｇｌａｂｒａｔａ標的核酸に対する特異性を意味する。
「試料」は、Ｃａｎｄｉｄａ種、またはその構成要素（核酸もしくは核酸の断片など）を含有し得る任意の検体を含む。試料は、Ｃａｎｄｉｄａ種またはその構成要素（例えば、それに由来する標的核酸）を含有し得る生きているもしくは死んでいるヒト由来の任意の組織または材料を含む「生物学的試料」を含み、例えば、膣スワブ試料、頸部ブラシ試料、呼吸組織もしくは滲出物（気管支鏡、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、もしくは肺生検、痰、唾液、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、精液、または他の体液もしくは材料など）を含む。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊するように処理されてもよく、したがって、細胞内構成成分を、酵素、緩衝剤、塩、洗剤等を更に含有し得る溶液中に放出し、これらを、標準的な方法を使用して分析のための生物学的試料を調製するために使用する。また、試料は、処理された試料、例えば、試料を濾過装置上に通すかまたは濾過装置に通して、または遠心分離後に、または媒体、マトリックス、もしくは支持体に付着させることによって得られたものなどを含み得る。
「核酸」は、ヌクレオシドがホスホジエステル結合または他の連結によって一緒に連結されてポリヌクレオチドを形成する、２つ以上の共有結合されたヌクレオシド、または窒素含有複素環塩基を有するヌクレオシド類似体、または塩基類似体を含む多量体化合物を指す。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、またはオリゴヌクレオチド、及びそれらの類似体が含まれる。核酸「骨格」は、糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡにおいて、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボースのいずれか、または既知の置換、例えば、２’メトキシ置換及び２’ハロゲン化置換（例えば、２’−Ｆ）を有する類似する化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、イノシン、５−メチルイソシトシン、イソグアニン、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３：６１７−２４）であってよく、これには、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−もしくはアザ−プリン、デアザ−もしくはアザ−ピリミジン、５もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６、及び／もしくは８位に変更もしくは交換置換基を有するプリン塩基、例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、及びＯ４−アルキル−ピリミジン、及びピラゾロ−化合物、例えば、非置換もしくは３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）が含まれる。核酸は、骨格が１つ以上の残基に対して窒素含有塩基を含まない「非塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡに見られる従来の糖、塩基、及び連結のみを含み得るか、または従来の構成成分及び置換（例えば、２’メトキシ骨格によって連結された従来の塩基、または従来の塩基と１つ以上の塩基類似体との混合物を含む核酸）を含み得る。核酸は、１つ以上のヌクレオチド単量体が単鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の相補的配列に対してハイブリダイゼーション親和性を増強するＲＮＡ模倣糖立体構造内にロックされた二環式フラノース単位を有する、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含み得る（Ｖｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１３２３３−４１，２００４）。核酸は、核酸の機能または挙動を変更するための修飾塩基、例えば、更なるヌクレオチドが核酸に付加されるのを遮断するための３’末端ジデオキシヌクレオチドの付加を含み得る。インビトロで核酸を作製するための合成方法は当該技術分野において周知であるが、核酸は慣用的な技法を使用して天然源から精製することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸鎖を表す。本出願を通して、核酸は、５’末端から３’末端で指定される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡは、典型的には、「５’から３’」、すなわち、成長核酸の３’末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５−炭素糖、及び窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５−炭素糖はリボースである。ＤＮＡにおいて、５−炭素糖は、２’−デオキシリボースである。本用語は、リボースの２’位のメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）など、かかるサブユニットの類似体も含む。
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、検出される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡであり得、単鎖または二本鎖のいずれかであり得る。標的核酸は、標的配列以外の他の配列を含み得る。
「単離された」とは、標的核酸を含有する試料がその天然環境から採取されることを意味するが、本用語は、精製のいずれの程度も含蓄しない。
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、検出されるべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、オリゴヌクレオチド（例えば、プローブオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、及び／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が検出プロセス中（例えば、ＴＭＡまたはＰＣＲなどの増幅系検出アッセイ）に複合体化する複合体化配列を含む。標的核酸が元々単一鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸に存在する「標的配列」に相補的な配列も指す。標的核酸が元々二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）及びアンチセンス（−）鎖の両方を指す。標的配列の選択において、当業者は、関連しないまたは密接に関連する標的核酸を区別するように「独特」な配列が選択されるべきであることを理解する。
「標的ハイブリダイズ配列」は、本明細書において、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されるオリゴマーの一部を指すように使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成される。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成される標的配列の一部に１００％相補的であり得るが、必ずしもそうではない。標的ハイブリダイズ配列は、標的配列に対して挿入、欠失、及び／または置換されたヌクレオチド残基も含み得る。例えば、様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合にそうであるなど、標的核酸が種内の複数の株である場合、標的配列に対して標的ハイブリダイズ配列が１００％未満の相補性が生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有する標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することを理解する。
Ｃａｎｄｉｄａ種核酸の領域に関して本明細書で使用される場合、「配列を標的とする」という用語は、オリゴヌクレオチドが本明細書に記載される検出を可能にする様式で標的配列とハイブリダイズするプロセスを指す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的となるＣａｎｄｉｄａ種核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含有しない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的となるＣａｎｄｉｄａ種核酸配列と相補的であるが、１、２、３、４、または５個のミスマッチを含有する。好ましくは、標的核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的な少なくとも１０〜５０個ほどのヌクレオチドを含む。少なくとも１０〜５０個ほどは、１０、５０、及びその間の各整数が含まれるような包括的な範囲である。好ましくは、オリゴマーは、標的配列と特異的にハイブリダイズする。
「〜するように構成された」という用語は、参照するオリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を表す。例えば、標的配列と特異的にハイブリダイズするように構成されるオリゴヌクレオチドは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、参照する配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。
本明細書で使用される場合、「〜と特異的にハイブリダイズするように構成された」という用語は、オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域が参照するＣａｎｄｉｄａ種標的領域の配列を標的とし得るポリヌクレオチド配列を有するように設計されることを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドは、その配列のみを標的とすることに限定されず、むしろＣａｎｄｉｄａ種標的核酸を標的とするためのキットまたは方法において、組成物として有用である。オリゴヌクレオチドは、試料からのＣａｎｄｉｄａ種の検出のためのアッセイの構成成分として機能するように設計され、したがって、試験試料中に一般的に見られる他の核酸の存在下で、Ｃａｎｄｉｄａ種を標的とするように設計される。「〜と特異的にハイブリダイズする」は、当該技術分野において理解されるように、ある程度の小レベルの非標的核酸とのハイブリダイゼーションが生じ得るため、排他的にハイブリダイズすることを意味しない。むしろ、「〜と特異的にハイブリダイズする」は、試料中の標的核酸の正確な検出が判定され得るように、オリゴヌクレオチドが、主に標的をハイブリダイズするアッセイにおいて機能するように構成されることを意味する。「〜するように構成された」という用語は、オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を表す。
Ｃａｎｄｉｄａ種を標的とする核酸に関して本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、連続核酸の一片を指す。ある特定の実施形態では、断片は、Ｃａｎｄｉｄａ種のＲＮＡｓｅ ＰのＲＮＡ構成成分である非コードＲＮＡリボザイムからの連続ヌクレオチド、またはＲＮＡｓｅ ＰのＲＮＡリボザイム構成成分をコードするＣａｎｄｉｄａ遺伝子ＲＰＲ１の連続ヌクレオチドを含み、断片における連続ヌクレオチドの数は、ＲＰＲ１遺伝子によってコードされるＲＮＡリボザイム全体のものよりも少ない。
本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、一部が核酸全体よりも小さい核酸の一部分を指す。例えば、参照の核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーである場合、「領域」という用語は、オリゴヌクレオチド全体のより小さなプロモーター部分を指すために使用され得る。同様に、また単に例として、核酸がＲＰＲ１遺伝子によってコードされるＲＮＡリボザイムである場合、「領域」という用語は、核酸のより小さな区域を指すために使用され得、より小さな区域は、本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドの標的となる。別の非限定的な例として、参照の核酸がアンプリコンである場合、領域という用語は、プローブの標的ハイブリダイズ配列によるハイブリダイゼーションのために特定されたより小さなヌクレオチド配列を指すために使用され得る。
交換可能な「オリゴマー」、「オリゴ」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に１，０００未満のヌクレオチド（ｎｔ）残基を有する核酸を指し、約５ｎｔ残基の下限及び約５００〜９００ｎｔ残基の上限を有する範囲のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２〜１５ｎｔの下限及び約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲であり、他の実施形態は、約１５〜２０ｎｔの下限及び約２２〜１００ｎｔの上限を有する範囲である。オリゴヌクレオチドは、自然発生源から精製され得るか、または様々な周知の酵素または化学方法のいずれかを使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する任意の特定の機能を表さず、むしろ本明細書に記載される全てのかかる試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、それが相補鎖とのハイブリダイズに特異的であり、それを可能にする場合、プライマーとして機能してもよく、核酸ポリメラーゼの存在下で更に伸長され得る、それがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする（例えば、Ｔ７プライマー）場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得る、そしてそれが標的核酸、またはそのアンプリコンとハイブリダイズすることができる場合、標的核酸を検出するように機能し得、検出可能な部分（例えば、アクリジニウム−エステル化合物）を更に提供する。
本明細書で使用される場合、特定の参照核酸配列に「実質的に対応する」オリゴヌクレオチドは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするであろうという点において、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列に類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に類似することを意味する。当業者であれば、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が参照配列とは異なるが、依然として同じ標的核酸配列とハイブリダイズし得ることを理解するだろう。 文脈が別途明確に指示しない限り、第２の核酸に対応する第１の核酸がそのＲＮＡ及びＤＮＡを含み、その補体を含むことも理解される。核酸のこの変動は、配列内の同一塩基の割合、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合に関して述べられてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、塩基同一性または相補性のこれらの割合が１００％〜約８０％である場合、オリゴヌクレオチドは、参照核酸配列に「実質的に対応する」。好ましい実施形態では、割合は１００％〜約８５％である。より好ましい実施形態では、この割合は１００％〜約９０％である。他の好ましい実施形態では、この割合は１００％〜約９５％である。同様に、核酸また増幅した核酸の領域は、本明細書において、参照核酸配列に対応すると称される場合がある。当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく特定の標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にするために、様々な割合の相補性に必要とされ得るハイブリダイゼーション条件に対する様々な修正を理解するだろう。
「増幅オリゴマー」は、オリゴマーであり、その少なくとも３’末端は、標的核酸に相補的であり、標的核酸またはその補体とハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与する。増幅オリゴマーの例は、標的核酸とハイブリダイズし、増幅プロセスにおけるポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ末端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、それが３’遮断末端を有するため）が、増幅に関与するか、または増幅を容易にするオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの５’領域は、標的核酸に非相補的であるプロモーター配列（「プロモータープライマー」または「プロモータープロバイダー」と称され得る）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’プロモーター配列を含むように修飾され、したがってプロモータープライマーとして機能し得ることが理解されるだろう。３’遮断末端の組み込みにより、プロモータープライマーが更に修飾され、標的核酸とのハイブリダイズが可能となり、転写を開始するように機能する上流プロモーター配列が提供されるが、オリゴ伸長のためのプライマーは提供されない。かかる修飾オリゴは、本明細書において、「プロモータープロバイダー」オリゴマーと称される。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲は、約１０〜約７０ｎｔの長さ（任意のプロモーター配列またはポリ−Ａ尾部を含まず）を含み、少なくとも約１０個の連続塩基、または更には標的核酸配列の領域に相補的な少なくとも１２個の連続塩基（またはその相補鎖）を含む。連続塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは、任意選択で、修飾ヌクレオチドもしくは類似体、または増幅反応に関与するが、標的核酸またはテンプレート配列には相補的でないか、またはそれに含有されない追加のヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さに対する範囲を参照する場合、その範囲は、全ての整数を含む（例えば、長さが１９〜２５個の連続ヌクレオチドは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５を含む）。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、特定の部位で核酸に結合し、ＲＮＡの転写を開始するシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特定の核酸配列である。
本明細書で使用される場合、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」は、第１及び第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を阻止するように修飾される、オリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡテンプレートとハイブリダイズする塩基配列を含み、ハイブリダイズ配列は、３’に位置するが、必ずしもプロモーター領域に隣接していない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分は、典型的には、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、長さが最大５０ヌクレオチド以上まで伸長し得る。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、好ましくは上述のその３’末端に遮断部分を含む逆転写酵素によって伸長することができないように操作される。本明細書で言及されるように、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する遮断プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである。
「増幅」は、標的核酸配列もしくはその補体、またはそれらの断片の複数のコピーを得るための任意の既知の手順を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称され得る。既知の増幅方法には、熱サイクル及び等温増幅方法の両方が含まれる。いくつかの実施形態では、等温増幅方法が好ましい。レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び転写媒介または転写関連増幅は、核酸増幅方法の非限定的な例である。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、及びＱＢ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）。ＰＣＲ増幅は、ｄｓＤＮＡのまたはｃＤＮＡからの２つの相補鎖の複数のコピーを合成するために、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、及び熱サイクルを使用する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、及び変性の複数のサイクルを使用することにより標的及びその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号及び米国特許第５，５１６，６６３号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼ、及び標的配列を含むヘミ修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖に切れ目を入れるエンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用し、それにより、一連のプライマー伸長及び鎖置換ステップで増幅が起こる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、米国特許第５，５４７，８６１号、及び米国特許第５，６４８，２１１号）。好ましい実施形態は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）またはＮＡＳＢＡなどのＲＮＡ標的核酸の増幅に好適な増幅方法を使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅方法においてプライマーとして容易に使用され得ることは、当業者には明らかであろう。
本明細書において「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）とも称される「転写関連増幅」は、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生するためにＲＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅を指す。これらの方法は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、及びプロモーター配列を含むテンプレート相補的オリゴヌクレオチドを用い、任意選択で、１ つ以上の他のオリゴヌクレオチドを含み得る。ＴＭＡ方法は、本明細書に記載されるＨＳＶ標的配列を増幅及び検出するために使用される増幅方法の実施形態である。転写関連増幅の変形例は、以前に詳細に開示されるように、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，３９９，４９１号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号、及び同第７，３７４，８８５号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１３０２号、同第ＷＯ８８／１０３１５号、及び同第ＷＯ９５／０３４３０号）。当業者であれば、開示された組成物がポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅方法で使用され得ることを理解するだろう。
本明細書で使用される場合、「リアルタイムＴＭＡ」という用語は、リアルタイム検出手段によって監視される標的核酸の単一プライマー転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）を指す。
「アンプリコン」という用語は、「増幅産物」と交換可能に使用され、標的配列内に含有される配列に対して相補的または相同である増幅手順中に生成された核酸分子を指す。これらの用語は、単鎖増幅産物、二本鎖増幅産物、または二本鎖増幅産物の鎖のうちの一方を指すように使用されてもよい。
「プローブ」、「検出プローブ」、「検出オリゴヌクレオチド」、及び「検出プローブオリゴマー」は、本明細書において、標的配列または増幅した核酸の検出を可能にするハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸または増幅した核酸における標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指すように交換可能に使用される。検出は、直接的（例えば、その標的配列と直接ハイブリダイズするプローブ）、または間接的（例えば、中間分子構造を介してその標的に連結されるプローブ）のいずれかであり得る。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせであってよく、それらは、標識されるか、または標識されなくてもよい。プローブの「標的配列」は、一般的に、標準的な塩基対合によりプローブオリゴマーの少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするより大きな核酸配列内のより小さな核酸配列を指す。プローブは、標的特異的配列、及びプローブの三次元立体構造に寄与する他の配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、及び同第６，３６１，９４５号、ならびに米国公開第２００６／００６８４１７号）。好ましい実施形態では、検出プローブは、より高いシグナルが得られ得る２’メトキシ骨格を含む。
「ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ」という用語は、典型的には５’塩基上に蛍光色素、及び典型的には３’塩基上に非蛍光消光色素（消光剤）を含有する検出オリゴヌクレオチドを指す。照射されると、励起蛍光色素は、蛍光を発するのではなく、近隣の消光色素分子にエネルギーを転移し、非蛍光基材をもたらす。増幅中、ポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎプローブを切断して、フルオロフォアを消光剤から分離し、それにより、消光されないシグナルを増幅の指標としてフルオロフォアから放射することを可能にする。
本明細書で使用される場合、「標識」は、検出される、または検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的または間接的に接合された部分または化合物を指す。直接標識は、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通して生じ得、共有結合または非共有結合相互作用、例えば、水素結合、疎水性及びイオン相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む。間接的な標識は、直接的または間接的のいずれかで標識され、検出可能なシグナルを増幅し得る、結合対部材、抗体、または追加のオリゴマーなどの架橋部分または「リンカー」の使用を通して生じ得る。標識には、放射性核種、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応性基、または発色団（例えば、検出可能な色を付与する色素、粒子、またはビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光標識）、またはフルオロフォアなどの任意の検出可能な部分を含む。標識は、混合物中の結合した標識されたプローブが未結合の標識されたプローブとは異なる検出可能な変化、例えば、不安定性または差次的分解特性を呈する均一アッセイにおいて検出可能であり得る。「均一の検出可能な標識」は、標識の未結合形態から結合形態を、または未標識のプローブを物理的に除去することなく検出することができる（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、及び同第５，６５８，７３７号）。標識には、化学発光化合物、例えば、標準的なＡＥ及び誘導体を含むアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物を含む（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、及び同第５，６３９，６０４号）。合成、及び標識を核酸に結合し、標識を検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １０、米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、及び同第４，５８１，３３３号）。２つ以上の標識及び２種類以上の標識が特定のプローブ上に存在し得るか、または検出は、各プローブが検出可能なシグナルを産生する化合物で標識されるプローブの混合物を使用することができる（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号及び同第６，３５０，５７９号）。
本明細書で使用される場合、「分子トーチ」と称される構造は、接合領域（「標的結合ドメイン」）によって接続され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする自己相補性（「閉鎖ドメイン」）の明確な領域を含むように設計される。標的閉鎖ドメインを含むヌクレオチド配列の全てまたは一部は、標的結合ドメインとしても機能し得る。したがって、標的閉鎖配列は、標的結合配列、非標的結合配列、及びそれらの組み合わせを含み得る。
「捕捉プローブ」、「捕捉オリゴヌクレオチド」、「標的捕捉オリゴヌクレオチド」、及び「捕捉プローブオリゴマー」は、本明細書において、標準的な塩基対合によって標的核酸の標的配列と特異的にハイブリダイズし、標的核酸を支持体に捕捉するために固定化プローブ上の結合パートナーに接合する核酸オリゴマーを指すように交換可能に使用される。捕捉オリゴマーの一例は、２つの結合領域：標的ハイブリダイズ配列及び固定化プローブ結合領域を含むオリゴヌクレオチドを含む。この例の変形例では、２つの領域は、１つ以上のリンカーによって一緒に接合された２つの異なるオリゴマー上に存在し得る。捕捉オリゴマーの別の実施形態では、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸に非特異的に結合し、それを支持体上の固定化プローブに連結するランダムまたは非ランダムポリ−ＧＵ、ポリ−ＧＴ、またはポリＵ配列を含む配列である（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０１６９８８号を参照されたい）。固定化プローブ結合領域は、尾部と称される核酸配列であり得る。尾部は、支持粒子または支持マトリックスに結合した相補的な固定化配列に結合する、約１０〜４０ヌクレオチド（例えば、Ａ１０〜Ａ４０）、または約１４〜３３ｎｔ（例えば、Ｔ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーの尾部を含む。したがって、好ましい核酸尾部の非限定的な例としては、いくつかの実施形態では、Ｔ０〜４Ａ１０〜４０配列を挙げることができる。捕捉オリゴマーの別の例は、核酸配列ではない２つの領域：標的ハイブリダイズ配列及び結合対部材を含む。
本明細書で使用される場合、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」、または「固定化核酸」は、直接的または間接的に捕捉オリゴマーを支持体に接合する核酸結合パートナーを指す。支持体に接合された固定化プローブは、試料中の未結合材料からの捕捉プローブ結合標的の分離を容易にする。固定化プローブの一実施形態は、試料中の未結合材料からの結合標的配列の分離を容易にする支持体に接合されたオリゴマーである。支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、または他の組成物から構成され得る、溶液中に遊離しているマトリックス及び粒子などの既知の材料を含み得、その一実施形態は、磁気的に吸引可能な粒子である。支持体は、固定化プローブが直接（共有結合、キレート化、またはイオン相互作用を介して）、または間接的に（１つ以上のリンカーを介して）に接合される、単分散磁性球体（例えば、均一なサイズ±５％）であってよく、プローブと支持体との間の連結または相互作用はハイブリダイゼーション状態中安定している。
本発明は、試料中のＣａｎｄｉｄａ種核酸の存在または不在を判定するための組成物、キット、及び方法を提供する。好ましくは、試料は生物学的試料である。組成物、キット、及び方法は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及び／もしくはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ、またはそれらの相補配列のＲＰＲ１標的配列を含む、ＲＰＲ１遺伝子、またはＲＰＲ１遺伝子によりコードされる非コードＲＮＡの標的配列を認識するオリゴヌクレオチド配列を提供する。かかるオリゴヌクレオチドは、プライマー、プロモータープライマー、及びプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを含み得る増幅オリゴヌクレオチドとして使用され得、その機能は以前に説明されている（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，８２４，５１８号、及び同第７，３７４，８８５号を参照されたい、各々が参照により本明細書に組み込まれる）。他のオリゴヌクレオチドがＣａｎｄｉｄａ種の増幅された配列を検出するため、またはＣａｎｄｉｄａ種標的核酸の捕捉のためのプローブとして使用され得る。ある特定の態様では、本発明の組成物は、Ｃａｎｄｉｄａ種ＲＰＲ１標的配列（例えば、２つ以上の増幅オリゴマー）を認識する２つ以上のオリゴマーの組み合わせである。
本方法は、Ｃａｎｄｉｄａ種核酸の高感度特異的検出を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、Ｃａｎｄｉｄａ種標的領域の核酸増幅を実施することと、例えば、増幅された産物を、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在を示すシグナルを提供する核酸検出プローブと特異的にハイブリダイズすることにより、増幅された産物を検出することとを含む。増幅ステップは、Ｃａｎｄｉｄａ種核酸が試料中に存在する場合、増幅された産物を産生するために、試料をＣａｎｄｉｄａ種標的核酸の標的配列に特異的な１つ以上の増幅オリゴマーと接触させることを含む。増幅は、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ及び増幅オリゴマーを使用してテンプレート鎖からコピーを産生することにより（例えば、テンプレート鎖を使用してプライマーから配列を伸長することにより）、標的配列またはその補体の更なるコピーを合成する。増幅された産物を検出するための一実施形態は、増幅された産物を、選択された増幅オリゴマーによって増幅された配列、例えば、一対の選択された増幅オリゴマーに隣接している標的配列に含有される配列に特異的な少なくとも１つのプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズステップを使用する。
検出ステップは、例えば、増幅産物を標識した検出プローブとハイブリダイズし、標識したプローブから得られるシグナルを検出することなどにより、増幅された標的配列と特異的に関連するシグナルを検出するために、様々な既知の技法のうちのいずれかを使用して実施することができる。検出ステップは、例えば、その核酸塩基配列の全てまたは一部など、増幅された配列の追加情報も提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施され得るか、または例えば、リアルタイムで、標的領域の増幅と同時に実施され得る。一実施形態では、検出ステップは、均一検出、例えば、混合物からハイブリダイズされていないプローブを除去することなくハイブリダイズされたプローブの検出を可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号及び同第５，２８３，１７４号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
増幅ステップの終了近くまたはその終了時に増幅された産物を検出する実施形態では、プローブの増幅された産物とのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供するために、線形検出プローブが使用されてもよい。かかる検出の一例は、標的核酸とハイブリダイズする発光標識されたプローブを使用する。次いで、発光標識がハイブリダイズされていないプローブから加水分解される。発光測定器を使用して、化学発光によって検出が実施される。（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ８９／００２４７６号を参照されたい、参照により本明細書に組み込まれる）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、例えば、プローブが増幅された産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識される分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのヘアピンプローブであり得る。かかるプローブは、標的ハイブリダイズ配列及び非標的ハイブリダイズ配列を含み得る。かかるプローブの様々な形態が以前に説明されている（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、及び同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７Ａ１号及び同第２００６／０１９４２４０Ａ１号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の好ましい組成物は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及び／またはＣ．ｇｌａｂｒａｔａのうちの少なくとも１つの核酸と特異的にハイブリダイズするように構成され、試料中に存在することが疑われる（例えば、膣感染症と関連する他の病原体）他の非Ｃａｎｄｉｄａ核酸に最小限の交差反応性を有する。ある特定の変形例では、本発明の組成物（例えば、オリゴマーの組み合わせ）は、広範囲のＣａｎｄｉｄａ種（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのいずれか、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのいずれか、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａのいずれか）の検出を可能にする。いくつかの態様では、本発明の組成物は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａのうちの１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするように構成され、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｗｏｆｆｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｅｇａｓｐａｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、及びＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓのうちの１つ以上に対して最小限の交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される多重検出方法など、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａのいずれかの検出を可能にする、組み合わせで複数のセットのオリゴマーを含む多重システムの一部である。
本発明のある特定の態様では、少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせが試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するために提供される。典型的には、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）配列番号１２９の領域に対応する第１のＣａｎｄｉｄａ種標的領域、もしくは配列番号１３０の領域に対応する第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー、及び／または（ｂ）配列番号１３１の領域に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含む。かかる実施形態では、上記のオリゴマーセット（ａ）及びオリゴマーセット（ｂ）の各々からの少なくとも１つの増幅オリゴマーは、センス配向の標的ハイブリダイズ配列（「センスＴＨＳ」）を含み、少なくとも１つの増幅オリゴマーは、アンチセンス配向の標的ハイブリダイズ配列（「アンチセンスＴＨＳ」）を含み、セット（ａ）の増幅オリゴマーのセンスＴＨＳ及びアンチセンスＴＨＳは各々、配列番号１２９または１３０内に含有される配列に対応するＣａｎｄｉｄａ種標的配列と特異的にハイブリダイズするように構成され、セット（ｂ）の増幅オリゴマーのセンスＴＨＳ及びアンチセンスＴＨＳは各々、配列番号１３１内に含有される配列に対応するＣａｎｄｉｄａ種標的配列と特異的にハイブリダイズするように構成され、標的ハイブリダイズ配列は、アンチセンスＴＨＳが標的とするＣａｎｄｉｄａ配列が、センスＴＨＳが標的とするＣａｎｄｉｄａ配列の下流に位置するように選択される（すなわち、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、それらが増幅される標的領域に隣接するように位置する）。いくつかの実施形態では、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的領域は、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３または１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域は、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、かつ／または第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域は、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応する。いくつかの変形例では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応する第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含む。いくつかの変形例では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ）（ｉ）配列番号１３２の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３３の配列を含む配列であるか、（ｉｉ）配列番号１５２の配列に含有される２０〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１５１の配列を含む配列であるか、または（ｉｉｉ）配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含む。いくつかの変形例では、オリゴマーの組み合わせは、（ｂ）配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列である第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含む。いくつかの変形例では、オリゴマーの組み合わせは、（ｂ）配列番号１３６の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３７の配列を含む配列である第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含む。
本発明のより具体的な実施形態では、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための上記のオリゴマーの組み合わせは、（Ａ）配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる増幅オリゴマー、（Ｂ）配列番号２６のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる増幅オリゴマー、（Ｃ）配列番号７４の残基３〜２２のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる増幅オリゴマー、（Ｄ）配列番号３４のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる増幅オリゴマー、（Ｅ）配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる増幅オリゴマー、及び（Ｆ）配列番号１２のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる増幅オリゴマーのうちの少なくとも１つを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される増幅オリゴマーは、標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置し、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸に非相補的であるプロモーター配列を更に含む、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ種標的領域の増幅のための本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせのいくつかの実施形態では、上述の第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー（例えば、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応する第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー）、及び／または上述の第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマー（例えば、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列である第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマー）は、５’プロモーター配列を更に含むプロモータープライマーである。具体的な実施形態では、プロモーター配列は、例えば、配列番号９の残基１〜２７に示される配列を有するＴ７プロモーター配列などのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である。具体的な変形例では、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号９に示される配列を有するプロモータープライマーであり、かつ／または第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーは、配列番号１４に示される配列を有するプロモータープライマーである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせは、標的領域の５’末端付近の標的核酸内に含有される配列に実質的に相補的である（例えば、完全に相補的）塩基配列を含む終止オリゴヌクレオチド（本明細書において、「ブロッカー」オリゴヌクレオチドとも称される）を更に含む。終止オリゴマーは、典型的には、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）に関して本明細書に記載されるある特定の実施形態などでは、例えば、プロモータープロバイダー増幅オリゴマーと組み合わせて使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせは、少なくとも１つのＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー、及び／または少なくとも１つのＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１２９または配列番号３０の補体に含有される配列に実質的に対応する標的ハイブリダイズ配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１３１の補体に含有される配列に実質的に対応する標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列は、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、（ｉ）配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１３９の配列を含む標的ハイブリダイズ配列、または（ｉｉ）配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１４１の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号１４２の配列に含有される１６〜２７個の連続ヌクレオチドであり、少なくとも配列番号１４３または配列番号１４４の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、（ｉ）配列番号２４の残基１〜２０のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなり、かつ／またはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなる。より具体的な変形例では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号２４及び配列番号６６から選択されるヌクレオチド配列を有し、かつ／またはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーは、配列番号４８のヌクレオチド配列を有する。オリゴマーの組み合わせは、上記の少なくとも２つ（例えば、３つ）の捕捉プローブオリゴマーを含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、上記のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーの両方を含み、いくつかのかかる実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーの各々は、上記のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーである。ある特定の実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、標的捕捉反応混合物内に提供される。
ある特定の変形例では、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせは、Ｃａｎｄｉｄａ種標的領域（例えば、本明細書に記載される第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的またはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列に隣接しているＣａｎｄｉｄａ種標的領域）を標的とする第１及び第２の増幅オリゴマーを使用して増幅可能なＣａｎｄｉｄａ種標的配列と特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを更に含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ａ−ｉ）配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応する第１のＣａｎｄｉｄａ種標的領域、（ａ−ｉｉ）配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応する第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域、または（ａ−ｉｉｉ）（ａ−ｉ）もしくは（ａ−ｉｉ）の完全な補体と特異的にハイブリダイズするＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、（ｂ−ｉ）配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域、または（ｂ−ｉｉ）（ｂ−ｉ）の完全な補体と特異的にハイブリダイズするＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブは、配列番号１４５の配列に含有される１８〜２２個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４６の配列を含むＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列、または前述の完全な補体である標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブには、（Ａ）配列番号１４７の配列に含有される１７〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列、（Ｂ）配列番号１８の残基１〜１７の配列に実質的に対応する配列、（Ｃ）配列番号２１の残基１〜２０の配列に実質的に対応する配列、及び（Ｄ）（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの完全な補体から選択されるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が含まれる。より具体的な実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２７の残基１〜２２の配列、または前述の完全な補体を含むか、またはそれからなり、かつ／あるいはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６０の残基１〜１７の配列、配列番号４５の残基１〜２３の配列、配列番号１８の残基１〜１７の配列、配列番号２１の残基１〜２０の配列、または前述のいずれかの完全な補体を含むか、またはそれからなる。Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブの具体的な変形例では、プローブは、配列番号２７の配列またはその完全な補体を有する。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの具体的な変形例では、プローブは、配列番号６０、配列番号４５、配列番号１８、配列番号２１の配列、または前述のいずれかの完全な補体を有する。好適な検出プローブは、上記のいずれかのＤＮＡ等価物及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラを更に含む。検出プローブオリゴマーは、核酸骨格の１つ以上の連結に２’−メトキシ骨格を含有し得る。いくつかの変形例では、オリゴマーの組み合わせは、少なくとも２つの検出プローブオリゴマー（例えば、本明細書に記載されるＣａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的の両方の検出プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーは、アンプリコン検出反応混合物において提供される。
典型的には、本発明による検出プローブオリゴマーは、標識を更に含む。特に好適な標識には、検出可能な光シグナルを放出する化合物、例えば、均一な混合物中で検出され得るフルオロフォアまたは発光（例えば、化学発光）化合物を含む。２つ以上の標識及び２種類以上の標識が特定のプローブ上に存在し得るか、または検出は、各プローブが検出可能なシグナルをもたらす化合物で標識されるプローブの混合物の使用に依存し得る（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号及び同第６，３５０，５７９号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。標識は、共有結合、キレート化、及びイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合され得るが、好ましくは、標識は共有結合される。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物などの結合された化学発光標識を有し（例えば、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、及び同第５，６５６，７４４号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）、典型的な変形例では、これは、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合される（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、及び同第５，６３９，６０４号を参照されたい、特に列１０の６行目〜列１１の３行目、及び実施例８、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。他の実施形態では、検出プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイにおいて特に有用である組み合わせである、蛍光標識及び消光剤の両方を含む。かかる検出プローブの具体的な変形例には、例えば、ＴａｑＭａｎ検出プローブ（Ｒｏｃｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び「分子ビーコン」（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３，１９９８、米国特許第５，１１８，８０１号及び同第５，３１２，７２８号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。
本発明による検出プローブオリゴマーは、非標的ハイブリダイズ配列を更に含み得る。かかる検出プローブの具体的な実施形態には、例えば、一般的にヘアピンと称される立体構造などの分子内ハイブリダイゼーションによって保持された立体構造を形成するプローブが含まれる。特に好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ」（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、及び同第６，３６１，９４５号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）、及び「分子ビーコン」（例えば、上記のＴｙａｇｉら、上記のＵＳ５，１１８，８０１及びＵＳ５，３１２，７２８を参照されたい）が含まれる。かかるヘアピンプローブを使用するための方法は、当該技術分野において周知である。
また他の実施形態では、検出プローブは、分子内結合によって保持された立体構造を実質的に形成しない直鎖状オリゴマーである。具体的な変形例では、直鎖状検出プローブオリゴマーは、標識として化学発光化合物、好ましくは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物を含む。
また、本発明により、本明細書に記載される検出プローブオリゴマー及び捕捉プローブオリゴマーが提供される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせを使用して、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法を提供する。かかる方法は、一般的に、（１）試料を第１の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第２のオリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも１つと接触させることであって、（ａ）第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、配列番号１２９の領域に対応する第１のＣａｎｄｉｄａ種標的領域、または配列番号１３０の領域に対応する第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、（ｂ）第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、配列番号１３１の領域に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含む、接触させることと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、試料中に存在する場合、任意のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸が、第１、第２、及び第３の標的領域のうちの少なくとも１つに対応する１つ以上の増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、（３）１つ以上の増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定することとを含む。本発明による検出方法は、典型的には、少なくとも２つのオリゴマーと接触させられる試料を得るステップを更に含む。ある特定の実施形態では、ステップ（１）〜（３）に使用される試料を「得る」ことは、例えば、試験施設もしくは方法の１つ以上のステップが実施される他の場所で試料を受け取り、かつ／または方法の１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、貯蔵所または他の保管所から）試料を取り出すことを含む。
ある特定の実施形態では、本方法は、接触ステップの前に、試料中の他の構成成分からＣａｎｄｉｄａ種標的核酸を精製することを更に含む。かかる精製は、試料中に含有される生物を他の試料構成成分から分離及び／または濃縮する方法を含み得る。特定の実施形態では、標的核酸の精製は、標的核酸を他の試料構成成分から特異的または非特異的に分離するために、標的核酸を捕捉することを含む。非特異的標的捕捉方法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的な沈殿、他の試料構成成分を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、またはＣａｎｄｉｄａ種核酸及び他の試料構成成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴ってもよい。
いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核は、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸を捕捉プローブオリゴマーと特異的にハイブリダイズすることによって、他の試料構成成分から選択的に分離される。捕捉プローブオリゴマーは、試料構成成分から分離される標的配列：捕捉プローブ複合体を形成するように、Ｃａｎｄｉｄａ種標的配列と特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む。好適な捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列は、Ｃａｎｄｉｄａ種を検出するためのオリゴマーの組み合わせのある特定の実施形態で使用され得るＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ及び／またはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブに関して、上述の配列を含む。好ましい変形例では、特定の標的捕捉は、Ｃａｎｄｉｄａ種標的：捕捉プローブ複合体を固定化プローブに結合して、試料から分離される標的：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を形成し、任意選択で、非標的試料構成成分を除去するために洗浄される（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号、同第６，２８０，９５２号、及び同第６，５３４，２７３号を参照されたい、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。かかる変形例では、捕捉プローブオリゴマーは、捕捉プローブを、その結合された標的配列と共に、固体支持体に結合された固定化プローブに結合（ｂｉｎｄｓ）し結合（ａｔｔａｃｈｅｓ）し、それにより、ハイブリダイズされた標的核酸が他の試料構成成分から分離されることを可能にする配列または部分を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ種を含有することが疑われる試料は、Ｃａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ捕捉プローブオリゴマーの両方と接触させられ、いくつかのかかる実施形態では、試料は、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーと更に接触させられる。
より具体的な実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、米国特許第６，１１０，６７８号（参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載されるなどの、Ｃａｎｄｉｄａ種標的配列に相補的ではないが、固定化プローブ上の配列と特異的にハイブリダイズし、それにより、標的核酸が他の試料構成成分から分離されることを可能にする部分として機能する尾部分（例えば、３’尾部）を含む。任意の配列は、一般的に、長さが約５〜５０ｎｔである尾領域において使用され得、好ましい実施形態は、固体支持体、例えば、マトリックスまたは粒子に結合された相補的固定化配列（例えば、ポリ−Ｔ）に結合する、約１０〜４０ｎｔ（例えば、Ａ１０〜Ａ４０）、より好ましくは約１４〜３３ｎｔ（例えば、Ａ１４〜Ａ３０またはＴ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーの尾部を含む。例えば、３’尾部を含む捕捉プローブの具体的な実施形態では、捕捉プローブは、配列番号２４、配列番号６６、及び配列番号４８から選択される配列を有する。
標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイズ条件下、通常、尾部配列：固定化プローブ配列二本鎖のＴｍ よりも高い温度でＣａｎｄｉｄａ種標的配列と特異的にハイブリダイズする１つ以上の捕捉プローブオリゴマーを含有する溶液相混合物において起こる。捕捉プローブ尾部を含む実施形態に関して、Ｃａｎｄｉｄａ種標的：捕捉プローブ複合体は、捕捉プローブ尾部が固定化プローブとハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調節することによって捕捉され、その後、固体支持体上の複合体全体が他の試料構成要素から分離される。結合された固定化プローブ：捕捉プローブ：Ｃａｎｄｉｄａ種標的配列を有する支持体は、他の試料構成要素を更に除去するために１回以上洗浄され得る。好ましい実施形態は、結合したＣａｎｄｉｄａ種標的：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を有する粒子が洗浄溶液に懸濁され、好ましくは磁気吸引を使用して洗浄溶液から回収され得るように、常磁性ビーズなどの微粒子固体支持体を使用する。取扱いステップの数を制限するために、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸は、支持体上の複合体のＣａｎｄｉｄａ種標的配列を増幅オリゴマーと単純に混合し、増幅ステップに進むことにより増幅され得る。
Ｃａｎｄｉｄａ種標的配列の増幅は、増幅される標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用する、インビトロ増幅反応を利用する。いくつかの実施形態では、増幅される標的領域は、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位または１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応する。いくつかの実施形態では、増幅される標的領域は、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応する。いくつかの実施形態では、増幅される標的領域は、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応する。これらの標的領域の増幅に特に好適な増幅オリゴマーの組み合わせは、本明細書に記載される。好適な増幅方法には、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び転写媒介または転写関連増幅（ＴＭＡ）が含まれる。かかる増幅方法は当該技術分野において周知であり、本発明の方法に従い容易に使用される。
例えば、ＴＭＡ増幅を使用するいくつかの増幅方法には、以下のステップが含まれる。簡潔に述べると、増幅される配列を含有する標的核酸が一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。当業者であれば、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の従来の溶融が一本鎖標的核酸を提供するために使用され得ることを理解するだろう。プロモータープライマーは、その標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的配列鎖のｃＤＮＡのコピーを創出するためにテンプレートとして標的鎖を使用して、プロモータープライマーの３ ’末端を伸長し、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をもたらす。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を消化し、第２のプライマーは、プロモータープライマー末端から下流のｃＤＮＡ鎖上に位置するその標的配列に特異的に結合する。ＲＴは、機能プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを創出するために第１のｃＤＮＡテンプレートを使用して、第２のプライマーの３’末端を伸長することにより新たなＤＮＡ鎖を合成する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは、反応における初期標的鎖の約１００〜１０００の増幅されたコピー（「アンプリコン」）であるＲＮＡ転写物を産生するために転写を開始する。第２のプライマーがアンプリコンの各々においてその標的配列に特異的に結合し、ＲＴがアンプリコンＲＮＡテンプレートからＤＮＡのコピーを創出して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を産生するときに増幅が続く。反応混合物中のＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からのアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーは、新たに合成されたＤＮＡのその相補配列に特異的に結合する。ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが標的鎖に相補的である追加のアンプリコンを転写するように結合する機能プロモーターを含有するｄｓＤＮＡを創出する。より多くのアンプリコンのコピーを作製する自己触媒サイクルが反応の過程中に繰り返され、試料中に存在する標的核酸の約１０億倍の増幅をもたらす。増幅された産物は、増幅中にリアルタイムで、または増幅された産物に含有される標的配列に特異的に結合するプローブを使用することにより、増幅反応の終了時に検出され得る。結合されたプローブから得られたシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
いくつかの実施形態では、本方法は、「逆」ＴＭＡ反応を利用する。かかる変形例では、初期または「順方向」増幅オリゴマーは、標的領域の３’末端付近で標的核酸とハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。逆転写酵素（ＲＴ）は、テンプレートとして標的核酸を使用してプライマーの３’末端を伸長することによってｃＤＮＡ鎖を合成する。第２または「逆方向」増幅オリゴマーは、合成されたｃＤＮＡ鎖内に含有される標的配列とハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を有するプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第２の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、ＲＴは、標的配列鎖の第２のｃＤＮＡのコピーを創出するために、テンプレートとしてｃＤＮＡ鎖を使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長し、それにより、機能プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを創出する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼを利用するプロモーター配列からの転写開始に関して、基本的に段落［１０５］に上述されるように増幅が続く。あるいは、第２の増幅オリゴマーがプロモータープロバイダーである場合、終止オリゴヌクレオチドの３’末端でプライミングオリゴマーの伸長を終了させるために、標的領域の５’末端付近の標的配列とハイブリダイズする終止オリゴヌクレオチドが典型的に利用され、それにより、プライミングオリゴマーからの伸長により合成された初期ｃＤＮＡ鎖に対して定義された３’末端を提供する。次いで、プロモータープロバイダーの標的ハイブリダイズ配列は、初期ｃＤＮＡ鎖の定義された３’末端とハイブリダイズし、ｃＤＮＡ鎖の３’末端は、プロモータープロバイダーのプロモーター配列に相補的な配列を付加するために伸長され、二本鎖プロモーター配列の形成をもたらす。次いで、初期ｃＤＮＡ鎖は、プロモーター部分を含まず、二本鎖プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用する、初期ｃＤＮＡ鎖に相補的な複数のＲＮＡ転写物を転写するためのテンプレートとして使用される。次いで、これらのＲＮＡ転写物の各々は、第１のプライミング増幅オリゴマーからの更なる増幅のためのテンプレートとしての役割を果たすために利用可能である。
増幅された産物の検出は、様々な方法によって達成され得る。核酸は、検出可能な電気変化などの物理的変化をもたらす表面と関連付けられてもよい。増幅された核酸は、それらをマトリックス中またはマトリックス上に濃縮し、それらと関連する核酸または色素（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出する、または溶液相における核酸と関連する色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出方法は、増幅された産物の配列と特異的にハイブリダイズし、プローブ：産物複合体の存在を検出するように構成される核酸検出プローブを使用し得るか、または増幅された産物と関連する検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによる（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、及び同第５，８４９，４８１号、各々が参照により本明細書に組み込まれる）。増幅された産物と特異的に関連する直接または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。具体的には、増幅された産物は、Ｃａｎｄｉｄａ種ＲＰＲ１遺伝子、またはＲＰＲ１遺伝子によってコードされたＲＮＡの配列の、またはその配列に相補的な標的配列を含有し、プローブは、試験試料中のＣａｎｄｉｄａ種核酸の存在を示すために、増幅された産物に含有される配列に直接または間接的に結合する。
相補的な増幅された配列とハイブリダイズする検出プローブの好ましい実施形態は、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴマー、またはＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチド（本明細書において、「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ」とも称される）の組み合わせを含有するオリゴマー、または修飾した骨格と合成されたオリゴマー、例えば、１つ以上の２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであり得る。増幅されたＣａｎｄｉｄａ種配列の検出に使用されるプローブは、標識されず、間接的に検出され得る（例えば、プローブ上の部分への別の結合パートナーの結合によって）か、または様々な検出可能な標識で標識され得る。本発明の方法により使用するのに好適な検出プローブの特定の実施形態が本明細書に更に記載される。Ｃａｎｄｉｄａ種配列を検出するための方法のいくつかの実施形態では、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）を使用するある特定の実施形態では、検出プローブは、直鎖状の化学発光により標識されたプローブ、より好ましくは直鎖状のアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブである。他の実施形態では、検出プローブは、蛍光標識及び消光剤（例えば、分子トーチまたは分子ビーコン）の両方を含む。
核酸ポリメラーゼによって伸長されることが意図されないオリゴマーは、好ましくは、増幅反応においてオリゴマーの酵素媒介伸長を阻止するために、３’ＯＨを置き換えるブロッカー基を含む。例えば、増幅中に存在する遮断された増幅オリゴマー及び／または検出プローブは、好ましくは、機能的な３’ＯＨ を有しないが、代わりに３’末端にまたはその近くに位置する１つ以上の遮断基を含む。３’末端近くの遮断基は、好ましくは、３’末端の５残基以内であり、ポリメラーゼのオリゴマーへの結合を制限するように十分に大きく、他の好ましい実施形態は、３’末端に共有結合される遮断基を含有する。多くの異なる化学基、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、及びコルジセピンが、３’末端を遮断するために使用され得る。
３’末端で典型的に遮断され、転写媒介増幅を使用するある特定の実施形態において特に適しているオリゴマーの例は、プロモータープロバイダーである。前述のように、プロモータープロバイダーは、第１の標的ハイブリダイズ領域、及び第１の領域の５’側に位置する、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む第２の領域を含む。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、上述のブロッカー基を含むことなどにより、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を阻止するように修飾される。
典型的に３’遮断されたオリゴマーの別の例は、前に上述したように、終止（「ブロッカー」）オリゴヌクレオチドである。終止オリゴマーは、典型的には、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）に関して本明細書に記載されるある特定の実施形態などでは、例えば、プロモータープロバイダー増幅オリゴマーと組み合わせて使用される。終止オリゴマーは、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終止する」ように、標的領域の５’末端付近の標的核酸内に含有される配列とハイブリダイズし、それにより、新生核酸鎖の定義された３’末端を提供する。
転写媒介増幅を使用する他の実施形態は、第１の標的ハイブリダイズ領域、及び第１の領域の５’側に位置する、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む第２の領域を含むが、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を阻止するように修飾されない、プロモータープライマーを利用する。いくつかの実施形態では、検出方法により使用するためのプロモータープライマーは、（ｉ）配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応するＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列、または（ｉｉ）配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含むＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモータープライマーは、（ｉ）配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなるＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列、または（ｉｉ）配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。より具体的な変形例では、検出方法により使用するためのプロモータープライマーは、配列番号９または配列番号１４に示される配列を有する。
Ｃａｎｄｉｄａ種核酸の検出のためのアッセイは、任意選択で、内部対照（ＩＣ）配列に特異的な増幅及び検出オリゴマーを使用することにより、同じアッセイ反応混合物中で増幅及び検出される非Ｃａｎｄｉｄａ種ＩＣ核酸を含み得る。ＩＣ核酸配列は、ＲＮＡテンプレート配列（例えば、インビトロ転写物）であってよく、試料またはＩＣ核酸配列に添加される合成核酸配列は、細胞構成成分であってよい。細胞構成成分であるＩＣ核酸配列は、検体に対して外因性細胞源または内在性細胞源からであり得る。これらの場合では、内部対照核酸は、増幅反応混合物中でＣａｎｄｉｄａ種核酸と共増幅される。内部対照増幅産物及びＣａｎｄｉｄａ種標的配列増幅産物は、独立して検出され得る。
試料中のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸の存在または不在を判定するための反応混合物も、本発明によって提供される。本発明による反応混合物は少なくとも、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸の増幅のための本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせ、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸を精製するための本明細書に記載される捕捉プローブオリゴマー、及びＣａｎｄｉｄａ種増幅産物の存在または不在を判定するための本明細書に記載される検出プローブオリゴマーのうちの１つ以上を含む。反応混合物は、例えば、捕捉プローブ核酸のアレイなどのいくつかの任意選択の構成成分を更に含み得る。増幅反応混合物の場合、反応混合物は、典型的には、例えば、緩衝剤、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、及び／または酵素（例えば、逆転写酵素及び／またはＲＮＡポリメラーゼ），などのインビトロ増幅を実施するのに好適な他の試薬を含み、典型的には、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸が存在してもよい、または存在しなくてもよい試験試料構成成分を含む。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含む反応混合物に関して、反応混合物の増幅オリゴマー及び検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結される（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含む）。
本明細書に記載される方法を実践するためのキットも本発明により提供される。本発明によるキットは少なくとも、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸の増幅のための本明細書に記載される増幅オリゴマーの組み合わせ、Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸を精製するための本明細書に記載される捕捉プローブオリゴマー、及びＣａｎｄｉｄａ種増幅産物の存在または不在を判定するための本明細書に記載される検出プローブオリゴマーのうちの１つ以上を含む。キットは、例えば、捕捉プローブ核酸のアレイなどのいくつかの任意選択の構成成分を更に含み得る。キットに存在し得る他の試薬には、例えば、緩衝剤、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、及び／または酵素（例えば、逆転写酵素及び／またはＲＮＡポリメラーゼ），などのインビトロ増幅を実施するのに好適な試薬を含む。本明細書に記載されるオリゴマーは、様々な異なる実施形態においてパッケージされ得、当業者は、本発明が多くの異なるキット構成を包含することを理解するだろう。例えば、キットは、Ｃａｎｄｉｄａ種ゲノムの１つの標的領域のみに対する増幅オリゴマーを含み得るか、またはそれは、複数のＣａｎｄｉｄａ種標的領域に対する増幅オリゴマーを含み得る。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含むキットに関して、キットの増幅オリゴマー及び検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結される（すなわち、キットは、キットの増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含む）。ある特定の実施形態では、キットは、本発明による方法を実践するための指示書一式を更に含み、指示書は、添付文書及び／またはキットのパッケージングもしくはその構成成分と関連し得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に図示される。
実施例１：Ｃａｎｄｉｄａ増幅及び検出アッセイを実施するための例示的なプロトコル
Ｃａｎｄｉｄａ増幅及び検出反応を実施するための１つの例示的なプロトコルは以下の通りである。（ａ）試薬の調製各構成成分の総体積は、実施される試験の予想数に基づいて決定された。また、各オリゴストック材料に必要な体積を計算して、各試薬ミックスに加えて所望の最終オリゴヌクレオチド濃度を得た。（１）次いで、合計４つの別個の試薬を調製した：ＴＣＲ（標的捕捉試薬：ポリ−Ｔ磁気ビーズ（ａｄＴ．ｓｕｂ．１４オリゴヌクレオチドに接合された磁気ビーズ）、標的捕捉オリゴ、及び（任意選択で）水性ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＴ７プライマー）、ＡＭＰ（増幅試薬：塩及びヌクレオチドを含有するＴＲＩＳ緩衝溶液中のＮＴ７プライマー）、ＰＲＯ（プロモーター試薬：塩及びヌクレオチドを含有するＴＲＩＳ緩衝溶液中のＴ７及びトーチオリゴ）、ならびにＥＮＺ（酵素溶液：グリセロールを含む水性緩衝液中のＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの混合物）。現行例に関して、別途記載のない限り、以下の濃度のオリゴヌクレオチドが使用された：ＴＣＲ中５ｐｍｏｌ／反応の各Ｔ７オリゴ、ＴＣＲ中１５ｐｍｏｌ／反応の各標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）、ＡＭＰ中１５ｐｍｏｌ／反応の各非Ｔ７オリゴ、ＰＲＯ中１５ｐｍｏｌ／反応の各Ｔ７オリゴ、及びＰＲＯ中１５ｐｍｏｌ／反応の各トーチオリゴ。各試薬の調製において、試薬のオリゴマーなし形態の体積は、試薬に添加されるオリゴヌクレオチドの体積に基づいて決定された。次いで、オリゴマーなしの試薬を分注し、計算したオリゴマー体積を使用して、各アリコートを最大体積にした。
Ｃａｎｄｉｄａ増幅及び検出反応を実施するための１つの例示的なプロトコルは以下の通りである。（ａ）試薬の調製各構成成分の総体積は、実施される試験の予想数に基づいて決定された。また、各オリゴストック材料に必要な体積を計算して、各試薬ミックスに加えて所望の最終オリゴヌクレオチド濃度を得た。（１）次いで、合計４つの別個の試薬を調製した：ＴＣＲ（標的捕捉試薬：ポリ−Ｔ磁気ビーズ（ａｄＴ．ｓｕｂ．１４オリゴヌクレオチドに接合された磁気ビーズ）、標的捕捉オリゴ、及び（任意選択で）水性ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＴ７プライマー）、ＡＭＰ（増幅試薬：塩及びヌクレオチドを含有するＴＲＩＳ緩衝溶液中のＮＴ７プライマー）、ＰＲＯ（プロモーター試薬：塩及びヌクレオチドを含有するＴＲＩＳ緩衝溶液中のＴ７及びトーチオリゴ）、ならびにＥＮＺ（酵素溶液：グリセロールを含む水性緩衝液中のＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの混合物）。現行例に関して、別途記載のない限り、以下の濃度のオリゴヌクレオチドが使用された：ＴＣＲ中５ｐｍｏｌ／反応の各Ｔ７オリゴ、ＴＣＲ中１５ｐｍｏｌ／反応の各標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）、ＡＭＰ中１５ｐｍｏｌ／反応の各非Ｔ７オリゴ、ＰＲＯ中１５ｐｍｏｌ／反応の各Ｔ７オリゴ、及びＰＲＯ中１５ｐｍｏｌ／反応の各トーチオリゴ。各試薬の調製において、試薬のオリゴマーなし形態の体積は、試薬に添加されるオリゴヌクレオチドの体積に基づいて決定された。次いで、オリゴマーなしの試薬を分注し、計算したオリゴマー体積を使用して、各アリコートを最大体積にした。
純粋な系または半手動方法の自動化システム（例えば、Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ））で反応を実施した。Ｐａｎｔｈｅｒシステムなどの自動化システムでの反応実行に関して、調製された試薬（ＴＣＲ、ＡＭＰ、ＰＲＯ、ＥＮＺ）、続いて試料を自動化デバイスに装填した。次いで、自動化システムは、目標捕捉、増幅、及びデータ収集を実施した。「純粋な系」での反応実行に関して、標的捕捉ステップはなかった。むしろ、標的核酸（例えば、インビトロ転写物）を、マイクロタイタープレート中のＡＭＰミックスに直接添加し、次いで増幅反応に進んだ。半手動反応に関して、標的捕捉及び洗浄ステップを次のように実施した。
半手動方法で実行する場合、標的捕捉及び洗浄ステップを次のように実施した。（１）ＡＭＰミックスを５０ｕＬ／ウェルで９６ウェルＰＣＲプレートに分注した。Ａｐｔｉｍａ洗浄緩衝液（例えば、洗浄溶液（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ、カタログ番号３０２１７９））を５００ｕＬ／ウェルで丸底Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒディープウェルプレートに、及び２００ｕＬ／ウェルで浅いＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６ウェルプレートに分注した。次いで、これらの３つのプレートを取っておいた。（２）ＴＣＲを１００ｕＬ／ウェルで、その後、４００ｕＬの試料／ウェルでディープウェルプレートに分注した。その後、この試料含有プレートを覆い、Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓヒートブロック（Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，カタログ番号ＩＣ２５）上に設置し、６２℃で３０分間インキュベートした。加熱したプレートをゆっくり室温に冷却した（２０分）。（３）次いで、Ａｐｔｉｍａ ＨＣＶ ＲＮＡ定性的アッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、カタログ番号３０２１７９）の添付文書に一般的に記載されるビーズ洗浄のために室温のプレートをＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器に移した。チップコーム（磁石カバー）をプレート上に設置し、プレートをＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器に設置し、洗浄プログラムを実行してビーズを収集し、収集したビーズをディープウェル洗浄プレートに移し、プレートを混合し、ビーズを再捕捉し、それらを浅いウェル洗浄プレートに移した。（４）洗浄プログラム後、ビーズ含有プレートを、より小さいコーム（磁石カバー）を有するＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器に移し、その後、洗浄したビーズを収集し、ＡＭＰ試薬を含有するプレートに移した／放出した。
増幅及び検出反応は、一般的に以下のように実施された。ＡＭＰ試薬及び試料を含有するプレートを覆い、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）（シェーカー／ヒートブロック）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ ＤＥ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５３５５）を使用して、摂氏４４度で約５分間インキュベートした。５分のインキュベーション後、２５ｕＬの酵素ミックスを各ウェルに添加し、プレートを再び覆った。覆ったプレートを１４００ｒｐｍで１分間混合し、次いで、摂氏４４度で５分間インキュベートした。このインキュベーション後、２５ｕＬのプロモーターミックス（ＰＲＯ）を各ウェルに添加し、プレートを１４００ｒｐｍで１分間混合した。次いで、プレートを光学プレートシールで覆った後、密封したプレートをＳｔｒａｔａｇｅｎｅリアルタイムサイクラー（モデルＭｘ３００５ｐ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）に直ちに設置し、摂氏４３度でインキュベートした。各々３０秒の１５０サイクルのＦＡＭ、ＨＥＸ、及び ＲＯＸチャネルの各々からデータを収集した。データをエクスポートし、分析した。
実施例２：Ｃａｎｄｉｄａ ＲＴ−ＴＭＡオリゴスクリーニング
この実施例は、Ｃａｎｄｉｄａ種ａｌｂｉｃａｎｓ、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの増幅及び検出、ならびにＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの別個の増幅及び検出のためのアッセイを例示する。
この実施例は、Ｃａｎｄｉｄａ種ａｌｂｉｃａｎｓ、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの増幅及び検出、ならびにＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの別個の増幅及び検出のためのアッセイを例示する。
アッセイは、２セットの増幅及び検出系からなる。第１の系は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの増幅及び検出のための単一の広範囲Ｔ７オリゴ、１対の非Ｔ７オリゴ、及び標識したトーチオリゴからなる。第２の系は、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの増幅及び検出に特異的なＴ７、非Ｔ７、及び標識したトーチオリゴからなる。アッセイは、３つの標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）を含み、１つのＴＣＯは、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａに特異的であるが、他の２つのＴＣＯは、広範囲増幅系によって検出された種を捕捉する。広範囲オリゴの組み合わせの全てのオリゴ及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的オリゴの組み合わせを表１に列記する。この研究で評価されたオリゴマー配列を表２に示す。全増幅系は、別個のプロモーター及び増幅試薬を使用して、二相リアルタイムＴＭＡアッセイ形式で実行することができる。全増幅二相系は４つの主なステップを伴う：（ｉ）試料中の標的核酸の標的捕捉：標的捕捉反応は、標的核酸を標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）、ポリ−Ｔ磁気ビーズ、及びＴ７プロモータープライマー（Ｔ７）と混合する一般的なステップを含んだ。ＴＣＯ及びＴ７を標的核酸とハイブリダイズし、またＴＣＯの３’末端をポリＴ磁気ビーズの固定化プローブとハイブリダイズした。次いで、得られたハイブリダイゼーション複合体を試料の他の構成要素から分離し、（ｉｉ）分離したハイブリダイゼーション複合体を洗浄して試料に残留する任意の干渉物質、未結合標的、及びＴ７を除去し、実質的に精製されたハイブリダイゼーション複合体を得た。（ｉｉｉ）次いで、初期の線形増幅を実施した。実質的に精製されたハイブリダイゼーション複合体を、非Ｔ７プライマー（ＮＴ７）及び増幅に必要な試薬（すなわち、ＲＮａｓｅ活性を有する逆転写酵素、ｄＮＴＰ及び塩）を含有する線形増幅試薬中に再懸濁した。任意の追加のＴ７増幅オリゴマーは、線形増幅試薬に含まれなかった。結果として、線形増幅反応は、アンプリコンとしてＲＮＡ転写物の初期量をもたらした。（ｉｖ）次いで、線形増幅産物の指数関数的増幅を実施した。簡潔に述べると、線形増幅反応の持続期間後、指数関数的増幅試薬が反応に添加された。指数関数的増幅試薬は、Ｔ７増幅オリゴマー及びトーチ検出プローブオリゴマーを含有した。したがって、指数関数的増幅試薬は、ＲＮＡ転写物アンプリコンから二本鎖ＤＮＡ産物（二本鎖プロモーター配列を伴う）の産生に必要な反応構成成分を提供し、したがって、ＲＮＡ転写物アンプリコンを産生する二本鎖ＤＮＡ分子の数を指数関数的に増大させる。ＲＮＡ転写物アンプリコンが生成されると、トーチがアンプリコンを結合して検出シグナルを生成する。
オリゴ選択の要約
オリゴの選択は主に以下の基準に基づく：
１．蛍光トーチのシグナル対ノイズ比
２．増幅曲線（ある場合）の外観。シグモイド型曲線は、通常、効率的な増幅を示す
３．Ｔ時間
４．検出の限度
オリゴの選択は主に以下の基準に基づく：
１．蛍光トーチのシグナル対ノイズ比
２．増幅曲線（ある場合）の外観。シグモイド型曲線は、通常、効率的な増幅を示す
３．Ｔ時間
４．検出の限度
簡略化のために、検出（感度）結果の限度みがこの実施例に示される。反応当たりのインビトロ転写物のコピーにおける試験した最低濃度のみが各表に示される。
増幅及び検出は、純粋な増幅系において実施された。純粋な増幅系は、標的捕捉、洗浄、または二相増幅を伴わない。代わりに、全ての増幅オリゴ及びインビトロ転写物標的核酸が１つの共通の増幅試薬に添加され、インキュベーション期間後、酵素がリアルタイム検出のためにトーチと共に添加される。オリゴスクリーニングは、簡略化の目的のため、純粋な系において実施された。本実施例において別途指定されない限り、スクリーニングプロセスのほとんどは、純粋な増幅系を使用して実施された。
広範囲系
配列番号９及び配列番号１０のＴ７は各々、非Ｔ７オリゴ、トーチの様々な組み合わせと共に試験された。標的核酸としてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓインビトロ転写物のみを使用して（系列希釈された）、初期試験を行った。表３は、スクリーニングされたオリゴの組み合わせ及び感度結果を示す。試験されたインビトロ転写物（ＩＶＴ）の最低濃度は１Ｅ４であった。
配列番号９及び配列番号１０のＴ７は各々、非Ｔ７オリゴ、トーチの様々な組み合わせと共に試験された。標的核酸としてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓインビトロ転写物のみを使用して（系列希釈された）、初期試験を行った。表３は、スクリーニングされたオリゴの組み合わせ及び感度結果を示す。試験されたインビトロ転写物（ＩＶＴ）の最低濃度は１Ｅ４であった。
全てのオリゴの組み合わせは、同じ検出限度（１Ｅ６）を示したが、配列番号９（Ｔ７）と配列番号１２（非Ｔ７）との組み合わせは、この実験において、わずかに速いＴ時間を示した。オリゴ濃度の変化は、これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせの感度を有意には変化させなかった。以降の全ての試験は、配列番号９に示される配列を有するＴ７オリゴマーを使用して実施された。
次いで、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの低ＲＦＵシグナルに対処し、本系が標的とする全てのＣａｎｄｉｄａ種の感度の改善を図るために、オリゴの新しい組み合わせを試験した。表４は、このスクリーニングにおいて試験されたオリゴを示す。元のスクリーニングにおいて、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ以外の他のＣａｎｄｉｄａ株は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと同様の増幅を示した。したがって、これらのオリゴの組み合わせを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓを用いて試験した。
配列番号９、配列番号２６、及び配列番号２７のオリゴの組み合わせは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの感度を有意に改善したが、試験された濃度でのＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに関して増幅は得られなかった。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの弱い増幅が反応当たり１Ｅ８ ＩＶＴのコピーで観察された。配列番号９、配列番号２６、及び配列番号２７のオリゴの組み合わせを用いて、他のＣａｎｄｉｄａ株を試験した。結果を表５に示す。
上述のように、配列番号９、配列番号１２、及び配列番号４を使用して、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓならびに他のＣａｎｄｉｄａ種の増幅が見られた。更なるアッセイにおいて、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの増幅及び検出の感度を判定するために、配列番号９及び配列番号４または配列番号２７がいくつかの非Ｔ７オリゴと組み合わせて試験された。表 ６は、使用された全オリゴ一式を示す。ＩＶＴのコピー／反応の最低試験濃度は、１Ｅ４／ｕＬであった。
Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの増幅及び検出感度は、配列番号９及び配列番号１２と共に配列番号２７を使用したときに１Ｅ８ ＩＶＴのコピー／反応であった。配列番号２７のトーチを配列番号４のトーチと置き換えることにより、１Ｅ６ ＩＶＴのコピー／ｒｘｎの感度が示された。配列番号１２の非Ｔ７プライマーが配列番号３４の非Ｔ７プライマーで置換されたときに、配列番号４及び２７のトーチの両方に関して、有意に改善された感度が見られた。
配列番号９、配列番号３４、ならびに別個に配列番号４及び２７の各々を使用して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを試験した。これらのアッセイにおいて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増幅及び検出は不在であった。しかしながら、配列番号２６の非Ｔ７プライマーをこれらの反応に添加することによって、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓを含む全てのＣａｎｄｉｄａ種の増幅及び検出が観察された。しかしながら、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増幅効率は、低いＩＶＴのコピーレベルでのＴ時間遅延に悪影響を及ぼし、検出限度において１対数減少した（１Ｅ４から１Ｅ５）。
次いで、配列番号９、配列番号２６、及び配列番号３４、ならびに配列番号２７のオリゴの組み合わせが、二相増幅アプローチを用いて、自動化増幅及び検出システム（Ｐａｎｔｈｅｒシステム，Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ）で試験された。純粋な系及び二相系の結果を比較したとき、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｓｉｓを除くＣａｎｄｉｄａ種のいずれに関しても、感度の有意な減少は観察されなかった。
二相系を使用する１ つの単一反応における両非Ｔ７オリゴの組み合わせは、個々の反応において同じ２つの非Ｔ７オリゴ（配列番号２６及び配列番号３４）を使用した二相反応と比較したとき、標的のいずれの増幅にも影響を及ぼさなかった（個々の反応におけるオリゴを用いた結果に関しては、表４、５、及び６を参照されたい）。純粋な系対二相系の結果を下の表７に示す。感度の濃度は、ＩＶＴのコピー／ｒｘｎである。
実施例３：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの増幅及び検出のための実現可能性ＲＴ−ＴＭＡ試薬製剤の感度試験
５つのＣａｎｄｉｄａ種の各々からの溶解物を使用して、分析感度を評価した。培養において生物を成長させ、平板計数によって定量化し、試料輸送用媒体（ＳＴＭ）（例えば、Ｃａｒｙ−Ｂｌａｉｒ輸送用媒体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ＆Ｃｏ．．，ＮＪ、カタログ番号２１１１０２）、及び例えば、Ａｐｔｉｍａ Ｖａｇｉｎａｌ Ｓｗａｂ検体収集キット（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ、カタログ番号３０１１６２））に、１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の正規化濃度に希釈することにより、各溶解物を生成した。ＳＴＭ中の溶解物を、ＳＴＭに、１００、３００、１０００、３０００、１００００、及び３００００ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度に系列希釈した。
５つのＣａｎｄｉｄａ種の各々からの溶解物を使用して、分析感度を評価した。培養において生物を成長させ、平板計数によって定量化し、試料輸送用媒体（ＳＴＭ）（例えば、Ｃａｒｙ−Ｂｌａｉｒ輸送用媒体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ＆Ｃｏ．．，ＮＪ、カタログ番号２１１１０２）、及び例えば、Ａｐｔｉｍａ Ｖａｇｉｎａｌ Ｓｗａｂ検体収集キット（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ、カタログ番号３０１１６２））に、１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の正規化濃度に希釈することにより、各溶解物を生成した。ＳＴＭ中の溶解物を、ＳＴＭに、１００、３００、１０００、３０００、１００００、及び３００００ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度に系列希釈した。
各濃度の１５の複製物を、自動化増幅及び検出システム（Ｐａｎｔｈｅｒ システム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ））でのリアルタイム転写媒介増幅及び検出反応（ＲＴ−ＴＭＡ）において試料として使用した。製剤は、核酸内部対照、ならびにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｍｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ （集合的に、「広範囲」と称される）、ならびにＣ．ｇｌａｂｒａｔａのＣａｎｄｉｄａ種の各々からのＲＮＡｓｅ Ｐ ＲＮＡを増幅及び検出するように構成された。広範囲標的は、単一のＴ７及び２つの非Ｔ７プライマーで増幅され、その後、トーチとして構成された単一のプローブで検出された。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａは、単一のＴ７、単一の非Ｔ７、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａを広範囲から区別するために広範囲トーチオリゴと異なって標識された単一トーチオリゴで増幅された。増幅及び検出オリゴ（図示せず）と共に内部対照標的が含まれ、検出オリゴは、標的と区別可能であるように異なって標識された。三重反応で使用されたＣａｎｄｉｄａオリゴのヌクレオチド配列を下の表８に示す。
結果：陽性は、様々なカットオフ時間（分）で閾値を上回るＲＦＵとして推定された。下の表９は、広範囲Ｃａｎｄｉｄａ種に関して３０００のＲＦＵ閾値及び２０分のＴ時間カットオフ、ならびにＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａに関して１６００のＲＦＵ閾値及び２５分のＴ時間カットオフを使用する、１５のうちのいくつかの陽性複製物を示す。
プロビット分析を実施して、各分析物の９５％及び５０％の検出レベルを推定した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに関して、Ｃ５０（５０％の陽性確率を有する推定レベル）は５８３ＣＦＵ／ｍＬであり、９５％の信頼限界は３８３〜７４７であり、Ｃ９５（９５％の陽性確率を有する推定レベル）は１０３５ＣＦＵ／ｍＬであり、９５％の信頼限界は８０９〜１５６３であった。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに関して、Ｃ５０は、２００（１２４〜２４４）であり、Ｃ９５は、３０９（２５３〜４３７）であった。Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓに関して、Ｃ５０は、３１４２（３０００〜３２９２）であり、Ｃ９５は、３３３７（３１９５〜３４９５）であった。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに関して、Ｃ５０は、２９２（２８５〜３００）であり、Ｃ９５は、３１０（３０２〜３１９）であった。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａに関して、Ｃ５０は、２８４１（２７６３〜２９２２）であり、Ｃ９５は、３０１２（２９２９〜３０９７）ＣＦＵ／ｍＬであった。
実施例４：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの増幅及び検出に関するオリゴヌクレオチドの特異性及び干渉試験
実施例３からの試薬製剤の特異性を試験するために、非標的生物のパネルをＳＴＭにおいて構築した。各パネルメンバーは、ＳＴＭに、１００万個のＣＦＵ／ｍＬの最終濃度に希釈された１〜５つの非標的生物からの細胞溶解物材料からなった。この濃度が実行可能ではない生物（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を、より低い濃度（それぞれ、１ｍＬ当たり４３０００及び３８５００生物）で試験した。各試料パネルの生物は以下の通りである。パネル１：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｗｏｆｆｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ。パネル２：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。パネル３：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。パネル４：Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ。パネル５：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ Ｐａｒｖｕｍ。パネル６：Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ。パネル１０：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。パネル１１：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ。パネル１２：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｅｇａｓｐａｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ。パネル１３：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ。パネル１４：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ。パネル１５：Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ。各パネルの１０個の複製物の反応を、表１に示される広範囲及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステムで実行した。
実施例３からの試薬製剤の特異性を試験するために、非標的生物のパネルをＳＴＭにおいて構築した。各パネルメンバーは、ＳＴＭに、１００万個のＣＦＵ／ｍＬの最終濃度に希釈された１〜５つの非標的生物からの細胞溶解物材料からなった。この濃度が実行可能ではない生物（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を、より低い濃度（それぞれ、１ｍＬ当たり４３０００及び３８５００生物）で試験した。各試料パネルの生物は以下の通りである。パネル１：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｗｏｆｆｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ。パネル２：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅａｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。パネル３：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。パネル４：Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ。パネル５：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ Ｐａｒｖｕｍ。パネル６：Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ。パネル１０：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。パネル１１：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ。パネル１２：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｅｇａｓｐａｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ。パネル１３：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ。パネル１４：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ。パネル１５：Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ。各パネルの１０個の複製物の反応を、表１に示される広範囲及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステムで実行した。
特異性結果：反応は、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ検出に使用された蛍光チャネルにおいて１６００の閾値、または広範囲オリゴの組み合わせの検出に使用された蛍光チャネルに関して３０００の閾値を超えるＲＦＵ範囲によって判定されるとき、陽性を示さなかった。内部対照の全ての複製物は陽性であり、ＲＦＵ範囲は１６００の閾値を超えた。
Ｃａｎｄｉｄａ生物の検出が試料中の非標的生物の存在によって損なわれるかどうかを判定するために、上述の特異性パネルは各々、自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステムで実行される前に、表１に示される広範囲及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて標的生物が添加された。パネルは、３０００ＣＦＵ／ｍＬのＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓまたは３０００ＣＦＵ／ｍＬのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのいずれか、及び３０００ＣＦＵ／ｍＬのＣ．ｇｌａｂｒａｔａに添加された。結果：反応の全て（条件当たり１０個の複製物）は、ＲＦＵ範囲によって判定されたとき、陽性であった。有意な阻害は観察されなかった。
実施例５：Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの検出のための代替のトーチ設計の評価
二相増幅及び検出形式におけるＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの検出に関して、６つの代替のトーチプローブ設計が直接比較された。各トーチは、ＦＡＭフルオロフォア及びＤａｂｃｙｌ消光剤で標識された。各反応は、ＳＴＭに希釈された、１００００ＣＦＵ／反応のＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ溶解物であった。陰極対照は、溶解物を含まないＳＴＭであった。様々なオリゴマー条件は全て、配列番号１２、１４、及び４８を含有し、配列番号６０、１８、４５、４６、２１、３のうちの１つも含有した。この実施例で使用されるＣａｎｄｉｄａオリゴのヌクレオチド配列を下の表１０に示す。
二相増幅及び検出形式におけるＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａの検出に関して、６つの代替のトーチプローブ設計が直接比較された。各トーチは、ＦＡＭフルオロフォア及びＤａｂｃｙｌ消光剤で標識された。各反応は、ＳＴＭに希釈された、１００００ＣＦＵ／反応のＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ溶解物であった。陰極対照は、溶解物を含まないＳＴＭであった。様々なオリゴマー条件は全て、配列番号１２、１４、及び４８を含有し、配列番号６０、１８、４５、４６、２１、３のうちの１つも含有した。この実施例で使用されるＣａｎｄｉｄａオリゴのヌクレオチド配列を下の表１０に示す。
トーチの性能は、条件当たりの標的の各々の８つの複製物に対してＲＴ−ＴＭＡ増幅及び検出反応を実行することにより評価され、全ての試薬は、トーチプローブの同一性を除いて一定であった。Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓヒートブロック（Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ、カタログ番号ＩＣ２５）、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（登録商標）抽出システム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ、カタログ番号５４００５００）、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）（シェーカー／ヒートブロック）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ ＤＥ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５３５５）、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）リアルタイムサイクラー（モデルＭｘ３００５ｐ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、またはＰａｎｔｈｅｒシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して、反応は、基本的に上述のように半手動で行われた。
結果を下の表１１に示す。６個のトーチプローブのうちの２つ（ＰＲ４及びＰＲ６）は、非標的対照とＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ溶解物標的試料との区別が不十分であり、したがって、アッセイにおける使用には不適切であった。残りの４つの候補トーチプローブのうち、ＰＲ２及びＰＲ１は、より低い平均Ｔ時間及びより高い平均Ｔ傾斜のため、ＰＲ３及びＰＲ５と比較して好ましい性能を有した。
実施例６：Ｃａｎｄｉｄａ種検出のための代替の非Ｔ７プライマー設計
広範囲Ｃａｎｄｉｄａ種の検出のためにＲＴ−ＴＭＡを使用して、５つの個々の非Ｔ７プライマーを試験した。増幅ミックス中反応当たり１５ｐｍｏｌで各非Ｔ７プライマーを使用した。ＴＣＲ及びプロモーター溶液に一般的な試薬を使用した。ＴＣＲは、各々１５ｐｍｏｌ／の配列番号２４及び６６の標的捕捉オリゴ、及び５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの配列番号９のＴ７プライマーオリゴを含有した。プロモーター溶液は、１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの配列番号９のＴ７プライマー、及び１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの配列番号２７のトーチオリゴを含有した。比較された非Ｔ７プライマーを下の表１２に示す。
広範囲Ｃａｎｄｉｄａ種の検出のためにＲＴ−ＴＭＡを使用して、５つの個々の非Ｔ７プライマーを試験した。増幅ミックス中反応当たり１５ｐｍｏｌで各非Ｔ７プライマーを使用した。ＴＣＲ及びプロモーター溶液に一般的な試薬を使用した。ＴＣＲは、各々１５ｐｍｏｌ／の配列番号２４及び６６の標的捕捉オリゴ、及び５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの配列番号９のＴ７プライマーオリゴを含有した。プロモーター溶液は、１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの配列番号９のＴ７プライマー、及び１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの配列番号２７のトーチオリゴを含有した。比較された非Ｔ７プライマーを下の表１２に示す。
増幅の標的は、以下の種の各々からの部分ＲＮａｓｅ ＰＲ１遺伝子配列を含有するインビトロ転写物であった：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ。
基本的に上記の実施例５に記載されるように、Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓヒートブロック、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（登録商標）抽出システム、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）（シェーカー／ヒートブロック）、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）リアルタイムサイクラーを使用して、反応を半手動で行い、分析した。
結果：配列番号７３の非Ｔ７プライマーは標的を検出可能に増幅しなかった。配列番号７４の非Ｔ７プライマーは、配列番号２６の非Ｔ７プライマーよりも速いＴ時間を有する標的を増幅したが、配列番号７５の非Ｔ７プライマーは、配列番号３４の非Ｔ７プライマーよりも遅いＴ時間でＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓを増幅した。
実施例７：代替の幹構成を有するＣａｎｄｉｄａ種トーチの比較
２つの代替トーチ設計を機能的に比較して、臨床精度及び分析性能に対する設計差の潜在的な影響を評価した。トーチは、同じ分析物特異的領域（広範囲標的核酸（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の検出のための）及び同じリンカーを含有するように設計されたが、最も３’の２塩基において変化した。両方のオリゴヌクレオチドは、ＣＣまたはＧＧのいずれかの２つの最も３’塩基を有するメトキシ−ＲＮＡから構成された。
２つの代替トーチ設計を機能的に比較して、臨床精度及び分析性能に対する設計差の潜在的な影響を評価した。トーチは、同じ分析物特異的領域（広範囲標的核酸（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の検出のための）及び同じリンカーを含有するように設計されたが、最も３’の２塩基において変化した。両方のオリゴヌクレオチドは、ＣＣまたはＧＧのいずれかの２つの最も３’塩基を有するメトキシ−ＲＮＡから構成された。
２つの実験を実施した。第１の実験において、多重Ｃａｎｄｉｄａ製剤を構築した（広範囲オリゴ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａオリゴ、及び内部対照オリゴ）が、広範囲トーチオリゴオリゴは省いた。次いで、試薬を２分し、配列番号２７または配列番号１５５のいずれかを、反応当たり１５ピコモルで添加して、各製剤を完成させた。各完成した製剤を、分析（対照）試料に対してＰａｎｔｈｅｒシステムで実行し、陰性試料をプールした（推定陰性試料からの残りの膣スワブ材料、一緒にプールし、その後、２つの製剤での等しい試験のために分割した）。データは、１プール当たりの製剤当たり１０の複製物における２つのプールした陰性試料、及び製剤当たり５つの複製におけるミリリットル当たり１Ｅ４コロニー形成単位の陽性対照Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ溶解物を表す。下の表１３に示されるように、配列番号１５５のトーチは、配列番号２７のトーチよりも高い、陽性対照バックグラウンドを差し引いたＲＦＵ範囲をもたらし、複製物ごとの変動性（％ＣＶ）は類似する。これらの反応の平均バックグラウンドシグナルは、配列番号２７のトーチに関しては３３３７ＲＦＵであり、配列番号１５５のトーチに関しては１１８２であった。プールされた陰性試料で、配列番号１５５のトーチは、配列番号２７のトーチよりも低いＲＦＵ範囲、及び低い複製物ごとの変動性（％ＣＶ）をもたらす。これらのデータに基づいて、配列番号１５５のトーチは、より良い陽性と陰極試料との区別をもたらした。
第２の実験では、５０の臨床試料を、Ｃａｎｄｉｄａ試薬の２つの製剤（ＦＡＭに対して報告される広範囲及びＨＥＸに対して報告されるＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）を用いて、自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で実行した。製剤１は反応当たり３２ピコモルで配列番号２７（ＦＡＭトーチ）を使用し、製剤２は反応当たり１０ピコモルで配列番号１５５（ＦＡＭトーチ）を使用した。そうでなければ、製剤は同じであった。Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ（ＨＥＸ）トーチ（配列番号６０）は、両製剤において、反応当たり２６ピコモルで存在した。各臨床試料は、各製剤を用いて１つの複製物で実行された。バックグラウンドシグナルは、両製剤に関してＨＥＸチャネル上で類似したが、製剤１は、製剤２よりも実質的に高いバックグラウンドを有した。平均バックグラウンドシグナルは、５６４５（ＦＡＭ−製剤１）、６３８（ＦＡＭ−製剤２）、１４５７（ＨＥＸ−製剤１）、１３４７（ＨＥＸ−製剤２）であった。４８の有効な結果からのバックグラウンドを差し引いたＲＦＵ範囲の分布を下の表１４に示す（各条件に関して、Ｎ＝４８のうちの陽性の数）。ＨＥＸの結果に関して、１２５０〜５０００ＲＦＵの範囲をもたらす試料はなく、陽性と陰性試料を区別するためのＲＦＵ範囲の閾値を設定する余地がある。ＦＡＭにおいて、製剤２も高または低ＲＦＵ範囲をもたらす試料間で分離が強固であったが、製剤１では分離は強固ではなかった。この実験における中間ＲＦＵ範囲の試料の結果の不在は、配列番号１５５のトーチが広範囲オリゴの組み合わせに関して、配列番号２７よりも良好な性能トーチであることを示唆する。
配列
配列
前述から、本発明の具体的な実施形態が本明細書において図示の目的のために記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修正が行われ得ることが理解されるだろう。したがって、本発明は、添付の請求項による場合を除いて限定されない。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (93)
- 試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するための方法であって、
（１）Ｃａｎｄｉｄａ種を含有することが疑われる試料を、第１の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第２の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも１つと接触させることであって、
（ａ）前記第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、前記第１の標的領域が、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、前記第２の領域が、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
（ｂ）前記第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含み、前記第３の標的領域が、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応し、前記第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前記試料中に存在する場合、任意のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸が、前記第１、第２、及び第３の標的領域のうちの少なくとも１つに対応する１つ以上の増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、
（３）前記１つ以上の増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、前記試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定することと、を含む、方法。 - 前記方法が、前記試料を前記第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記方法が、前記試料を同じ反応混合物内で前記第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせと接触させることを含む多重方法である、請求項２に記載の方法。
- 第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応し、かつ／または
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１３２の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３３の配列を含む配列、（ｉｉ）配列番号１５２の配列に含有される２０〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１５１の配列を含む配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、かつ／または
前記第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３６の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３７の配列を含む配列である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 前記試料を第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、
前記第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、前記第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４または５に記載の方法。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列を含み、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６、配列番号７４の残基３〜２２、または配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列を含み、かつ／または
前記第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、請求項４または５に記載の方法。 - 前記試料を第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、
前記第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、前記第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号３４のヌクレオチド配列を含む第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４、５、及び７のいずれか１項に記載の方法。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列からなり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６、配列番号７４、または配列番号３４のヌクレオチド配列からなり、
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列からなり、かつ／または
前記第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる、請求項４、５、及び７のいずれかに記載の方法。 - 前記試料を第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、
前記第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、前記第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号３４のヌクレオチド配列からなる第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４、５、７、及び９のいずれかに記載の方法。 - 前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む、請求項６または８に記載の方法。
- 前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６のヌクレオチド配列からなる、請求項６、８、及び１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー及び前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーのうちの少なくとも１つが、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するプロモーター配列を更に含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項１３に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、配列番号９の残基１〜２７のヌクレオチド配列を有する、請求項１４に記載の方法。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号９のヌクレオチド配列を有し、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、請求項１３に記載の方法。 - 存在する場合、任意のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸を、ステップ（２）の前に試料中の他の構成成分から精製することを更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記精製ステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記試料が、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させられ、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の各々が、前記固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される、請求項１８に記載の方法。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列であり、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４２の配列に含有される１６〜２７個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４３もしくは配列番号１４４の配列を含む配列である、請求項１９に記載の方法。 - 前記試料を第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列である、請求項２０に記載の方法。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０、もしくは配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含み、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。 - 前記試料を第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含む前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項２０または２２に記載の方法。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０、もしくは配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列からなり、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列からなる、請求項２０または２２に記載の方法。 - 前記試料を第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列からなる第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項２０、２２、及び２４のいずれか１項に記載の方法。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０のヌクレオチド配列を含む、請求項２１または２３に記載の方法。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０のヌクレオチド配列からなる、請求項２１、２３、及び２５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号２４もしくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有し、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号４８のヌクレオチド配列を有する、請求項２０、２２、及び２４のいずれか１項に記載の方法。 - 前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、請求項２１、２３、及び２５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検出ステップ（３）が、
１つ以上の増幅産物を、前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ及び前記第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブと接触させることと、
任意の標的ハイブリダイズされたＣａｎｄｉｄａ特異的及び／もしくはＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの存在または不在を検出することと、を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブが、
（Ａ１）配列番号１４５の配列に含有される１８〜２２個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４６の配列を含む配列、
（Ｂ１）（Ａ１）のＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに
（Ｃ１）（Ａ１）もしくは（Ｂ１）の完全な補体からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ／または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブが、
（Ａ２）配列番号１４７の配列に含有される１７〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列、
（Ｂ２）配列番号１８の残基１〜１７の配列に実質的に対応する配列、
（Ｃ２）配列番号２１の残基１〜２０の配列に実質的に対応する配列、
（Ｄ２）（Ａ２）〜（Ｃ２）のうちのいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに
（Ｅ２）（Ａ２）〜（Ｄ２）のうちのいずれか１つの完全な補体からなる群から選択されるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項３０に記載の方法。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号２７の残基１〜２２の配列、
そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含み、かつ／または
Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号６０の残基１〜１７の配列、
配列番号４５の残基１〜２３の配列、
配列番号１８の残基１〜１７の配列、
配列番号２１の残基１〜２０の配列、
前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の方法。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号２７の残基１〜２２の配列、
そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなり、かつ／または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号６０の残基１〜１７の配列、
配列番号４５の残基１〜２３の配列、
配列番号１８の残基１〜１７の配列、
配列番号２１の残基１〜２０の配列、
前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなる、請求項３１または３２に記載の方法。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブが、配列番号２７の配列、そのＤＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有し、かつ／または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６０、配列番号４５、配列番号１８、配列番号２１、前述のいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、標識を含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項３５に記載の方法。
- 前記検出ステップ（３）が、前記増幅ステップ（２）中に起こる、請求項３５に記載の方法。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、蛍光標識及び消光剤を含む、請求項３７に記載の方法。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、分子トーチ、分子ビーコン、またはＴａｑＭａｎ検出プローブである、請求項３８に記載の方法。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブのうちの少なくとも１つが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項４０に記載の方法。
- ステップ（２）における前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である、請求項４２に記載の方法。
- 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項４２または４３に記載の方法。
- 試料中のＣａｎｄｉｄａ種の存在または不在を判定するためのオリゴマーの組み合わせであって、前記オリゴマーの組み合わせが、
第１の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第２の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも１つを含み、
（ａ）前記第１の増幅オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを含み、前記第１の標的領域が、配列番号１２９のヌクレオチド約１３３位もしくは１６１位〜ヌクレオチド約２５９位の領域に対応し、前記第２の領域が、配列番号１３０のヌクレオチド約２０２位〜ヌクレオチド約３０８位の領域に対応し、前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
（ｂ）前記第２の増幅オリゴマーの組み合わせが、第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するための第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーを含み、前記第３の標的領域が、配列番号１３１のヌクレオチド約３５５位〜ヌクレオチド約５５４位の領域に対応し、前記第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第１及び第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴマーの組み合わせ。 - 前記オリゴマーの組み合わせが、前記第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせを含む、請求項４５に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記オリゴマーの組み合わせが、同じ反応混合物内に前記第１及び第２の両方の増幅オリゴマーの組み合わせを含む、請求項４６に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列に実質的に対応し、かつ／または
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１３２の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３３の配列を含む配列、（ｉｉ）配列番号１５２の配列に含有される２０〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１５１の配列を含む配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である、請求項４５〜４７のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、かつ／または
前記第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３６の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３７の配列を含む配列である、請求項４７〜４８のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを更に含み、
前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、
前記第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、前記第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号３４のヌクレオチド配列に実質的に対応する第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４８または４９に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列を含み、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６、配列番号７４の残基３〜２２、または配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列を含み、かつ／または
前記第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、請求項４８または４９に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを更に含み、
前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、
前記第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、前記第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号３４のヌクレオチド配列を含む第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４８、４９、及び５１のいずれか１項のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号９の残基２８〜４６のヌクレオチド配列からなり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６、配列番号７４、または配列番号３４のヌクレオチド配列からなり、
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４の残基２８〜４９のヌクレオチド配列からなり、かつ／または
前記第２のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる、請求項４８、４９、及び５１のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーを更に含み、
前記第１及び第２のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第１のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３４の配列に含有される１５〜２４個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３５の配列を含む配列であり、
前記第１及び第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、前記第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域を増幅するためのものであり、前記第３のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号３４のヌクレオチド配列からなる第３のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４８、４９、５１、及び５３のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む、請求項５０または５２に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６のヌクレオチド配列からなる、請求項５０、５２、及び５４のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマー及び前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーのうちの少なくとも１つが、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の５’側に位置するプロモーター配列を更に含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項５７に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記プロモーター配列が、配列番号９の残基１〜２７のヌクレオチド配列を有する、請求項５８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号９のヌクレオチド配列を有し、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的増幅オリゴマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、請求項５９に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーを更に含む、請求項４５〜６０のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記オリゴマーの組み合わせが、第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマー及び第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーを含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第３のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の各々が、前記固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される、請求項６１に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列であり、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４２の配列に含有される１６〜２７個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４３もしくは配列番号１４４の配列を含む配列である、請求項６２に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４０の配列に含有される１５〜２５個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４１の配列を含む配列である、請求項６３に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０、もしくは配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含み、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列を含む前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする、第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項６３または６５に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０、もしくは配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列からなり、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４８の残基１〜２６のヌクレオチド配列からなる、請求項６３または６５に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、
前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３８の配列に含有される１６〜２１個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１３９の配列を含む配列であり、
前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号６６の残基１〜１７のヌクレオチド配列からなる第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項６３、６５、及び６７のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０のヌクレオチド配列を含む、請求項６４または６６に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４の残基１〜２０のヌクレオチド配列からなる、請求項６４、６６、及び６８のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記第１のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号２４もしくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有し、かつ／または
前記第１のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号４８のヌクレオチド配列を有する、請求項６３、６５、及び６７のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記第２のＣａｎｄｉｄａ特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、請求項６４、６６、及び６８のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記第１または第２のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ及び前記第３のＣａｎｄｉｄａ種標的領域と特異的にハイブリダイズするＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブを更に含む、請求項４５〜７２のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブが、
（Ａ１）配列番号１４５の配列に含有される１８〜２２個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４６の配列を含む配列、
（Ｂ１）（Ａ１）のＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに
（Ｃ１）（Ａ１）もしくは（Ｂ１）の完全な補体からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ／または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブが、
（Ａ２）配列番号１４７の配列に含有される１７〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列、
（Ｂ２）配列番号１８の残基１〜１７の配列に実質的に対応する配列、
（Ｃ２）配列番号２１の残基１〜２０の配列に実質的に対応する配列、
（Ｄ２）（Ａ２）〜（Ｃ２）のうちのいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び（Ｅ２）（Ａ２）〜（Ｄ２）のうちのいずれか１つの完全な補体からなる群から選択されるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項７３に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号２７の残基１〜２２の配列、
そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含み、かつ／または
Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号６０の残基１〜１７の配列、
配列番号４５の残基１〜２３の配列、
配列番号１８の残基１〜１７の配列、
配列番号２１の残基１〜２０の配列、
前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含む、請求項７４に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号２７の残基１〜２２の配列、
そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなり、かつ／または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号６０の残基１〜１７の配列、
配列番号４５の残基１〜２３の配列、
配列番号１８の残基１〜１７の配列、
配列番号２１の残基１〜２０の配列、
前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなる、請求項７４または７５に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブが、配列番号２７の配列、そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有し、かつ／または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６０、配列番号４５、配列番号１８、配列番号２１、前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有する、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、標識を含む、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項７８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、蛍光標識及び消光剤を含む、請求項７８に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、分子トーチ、分子ビーコン、またはＴａｑＭａｎ検出プローブである、請求項８０に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブのうちの少なくとも１つが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブの各々が、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項８２に記載のオリゴマーの組み合わせ。
- Ｃａｎｄｉｄａ種標的核酸を検出するための検出プローブであって、前記検出プローブが、
Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブであって、
（Ａ１）配列番号１４５の配列に含有される１８〜２２個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４６の配列を含む配列、
（Ｂ１）（Ａ１）のＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに
（Ｃ１）（Ａ１）もしくは（Ｂ１）の完全な補体からなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ、または
Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブであって、
（Ａ２）配列番号１４７の配列に含有される１７〜２３個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列、
（Ｂ２）配列番号１８の残基１〜１７の配列に実質的に対応する配列、
（Ｃ２）配列番号２１の残基１〜２０の配列に実質的に対応する配列、
（Ｄ２）（Ａ２）〜（Ｃ２）のうちのいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ならびに
（Ｅ２）（Ａ２）〜（Ｄ２）のうちのいずれか１つの完全な補体からなる群から選択されるＣ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブである、検出プローブ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号２７の残基１〜２２の配列、
そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含むか、または
Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号６０の残基１〜１７の配列、
配列番号４５の残基１〜２３の配列、
配列番号１８の残基１〜１７の配列、
配列番号２１の残基１〜２０の配列、
前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含む、請求項８４に記載の検出プローブ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号２７の残基１〜２２の配列、
そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなるか、または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号６０の残基１〜１７の配列、
配列番号４５の残基１〜２３の配列、
配列番号１８の残基１〜１７の配列、
配列番号２１の残基１〜２０の配列、
前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなる、請求項８４または８５に記載の検出プローブ。 - 前記Ｃａｎｄｉｄａ特異的検出プローブが、配列番号２７の配列、そのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有するか、または
前記Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６０、配列番号４５、配列番号１８、配列番号２１、前述のいずれかのＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有する、請求項８４〜８６のいずれか１項に記載の検出プローブ。 - 前記検出プローブが標識を含む、請求項８４〜８６のいずれか１項に記載の検出プローブ。
- 前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、請求項８８に記載の検出プローブ。
- 前記検出プローブが、蛍光標識及び消光剤を含む、請求項８８に記載の検出プローブ。
- 前記検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはＴａｑＭａｎ検出プローブである、請求項９０に記載の検出プローブ。
- 前記検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、請求項８４〜８６のいずれか１項に記載の検出プローブ。
- 前記検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項９２に記載の検出プローブ。
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