JP7201735B2 - Candida種を検出するための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、35 U.S.C§119(e)のもと、2016年1月4日に出願された仮出願第62/274,610号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2017年1月4日に作成された該ASCIIコピーは、「DIA.0003.02(PCT)Seq Listing2_ST25」と名付けられ、大きさは26KBである。
(1)Candida種を含有することが疑われる試料を、第1の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第2の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも1つと接触させるステップであって、
(a)第1の増幅オリゴマーの組み合わせが、第1のCandida種標的核酸領域または第2のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーを含み、第1の標的領域が、配列番号129のヌクレオチド約133位もしくは161位~ヌクレオチド約259位の領域に対応し、第2の領域が、配列番号130のヌクレオチド約202位~ヌクレオチド約308位の領域に対応し、第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
(b)第2の増幅オリゴマーの組み合わせが、第3のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーを含み、第3の標的領域が、配列番号131のヌクレオチド約355位~ヌクレオチド約554位の領域に対応し、第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、接触させるステップと、
(2)インビトロ核酸増幅反応を実施するステップであって、試料中に存在する場合、任意のCandida種標的核酸が、第1、第2、及び第3の標的領域のうちの少なくとも1つに対応する1つ以上の増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施するステップと、
(3)1つ以上の増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、試料中のCandida種の存在または不在を判定するステップとを含む。
(a)第1の増幅オリゴマーの組み合わせが、第1のCandida種標的核酸領域または第2のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーを含み、第1の標的領域が、配列番号129のヌクレオチド約133位もしくは161位~ヌクレオチド約259位の領域に対応し、第2の領域が、配列番号130のヌクレオチド約202位~ヌクレオチド約308位の領域に対応し、第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
(b)第2の増幅オリゴマーの組み合わせが、第3のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーを含み、第3の標的領域が、配列番号131のヌクレオチド約355位~ヌクレオチド約554位の領域に対応し、第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列を含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
試料中のCandida種の存在または不在を判定するための方法であって、
(1)Candida種を含有することが疑われる試料を、第1の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第2の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも1つと接触させることであって、
(a)前記第1の増幅オリゴマーの組み合わせが、第1のCandida種標的核酸領域または第2のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーを含み、前記第1の標的領域が、配列番号129のヌクレオチド約133位もしくは161位~ヌクレオチド約259位の領域に対応し、前記第2の領域が、配列番号130のヌクレオチド約202位~ヌクレオチド約308位の領域に対応し、前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
(b)前記第2の増幅オリゴマーの組み合わせが、第3のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーを含み、前記第3の標的領域が、配列番号131のヌクレオチド約355位~ヌクレオチド約554位の領域に対応し、前記第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、接触させることと、
(2)インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前記試料中に存在する場合、任意のCandida種標的核酸が、前記第1、第2、及び第3の標的領域のうちの少なくとも1つに対応する1つ以上の増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、実施することと、
(3)前記1つ以上の増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、前記試料中のCandida種の存在または不在を判定することと、を含む、方法。
(項目2)
前記方法が、前記試料を前記第1及び第2の両方の増幅オリゴマーの組み合わせと接触させることを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記方法が、前記試料を同じ反応混合物内で前記第1及び第2の両方の増幅オリゴマーの組み合わせと接触させることを含む多重方法である、項目2に記載の方法。
(項目4)
第1のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号9の残基28~46のヌクレオチド配列に実質的に対応し、かつ/または
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、(i)配列番号132の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号133の配列を含む配列、(ii)配列番号152の配列に含有される20~23個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号151の配列を含む配列、もしくは(iii)配列番号34のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である、項目1~3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、かつ/または
前記第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号136の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号137の配列を含む配列である、項目1~4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記試料を第3のCandida特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第1のCandida種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、
前記第1及び第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第2のCandida種標的領域を増幅するためのものであり、前記第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号34のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、項目4または5に記載の方法。
(項目7)
前記第1のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号9の残基28~46のヌクレオチド配列を含み、
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26、配列番号74の残基3~22、または配列番号34のヌクレオチド配列を含み、
前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号14の残基28~49のヌクレオチド配列を含み、かつ/または
前記第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号12のヌクレオチド配列を含む、項目4または5に記載の方法。
(項目8)
前記試料を第3のCandida特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第1のCandida種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、
前記第1及び第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第2のCandida種標的領域を増幅するためのものであり、前記第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号34のヌクレオチド配列を含む第3のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、項目4、5、及び7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記第1のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号9の残基28~46のヌクレオチド配列からなり、
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26、配列番号74、または配列番号34のヌクレオチド配列からなり、
前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号14の残基28~49のヌクレオチド配列からなり、かつ/または
前記第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号12のヌクレオチド配列からなる、項目4、5、及び7のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記試料を第3のCandida特異的増幅オリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第1のCandida種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、
前記第1及び第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第2のCandida種標的領域を増幅するためのものであり、前記第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号34のヌクレオチド配列からなる第3のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、項目4、5、7、及び9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26のヌクレオチド配列を含む、項目6または8に記載の方法。
(項目12)
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26のヌクレオチド配列からなる、項目6、8、及び10のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記第1のCandida特異的増幅オリゴマー及び前記第1のC.glabrata特異的増幅オリゴマーのうちの少なくとも1つが、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の5’側に位置するプロモーター配列を更に含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、項目1~12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記プロモーター配列が、配列番号9の残基1~27のヌクレオチド配列を有する、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記第1のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、配列番号14のヌクレオチド配列を有する、項目13に記載の方法。
(項目17)
存在する場合、任意のCandida種標的核酸を、ステップ(2)の前に試料中の他の構成成分から精製することを更に含む、項目1~16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記精製ステップが、前記試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記試料が、第1のCandida特異的捕捉プローブオリゴマー及び第1のC.glabrata特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させられ、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第1または第2のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第3のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第1のC.glabrata捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第1のCandida特異的及びC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の各々が、前記固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、(i)配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列、もしくは(ii)配列番号140の配列に含有される15~25個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号141の配列を含む配列であり、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号142の配列に含有される16~27個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号143もしくは配列番号144の配列を含む配列である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記試料を第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列であり、
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第1または第2のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号140の配列に含有される15~25個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号141の配列を含む配列である、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20、もしくは配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列を含み、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号48の残基1~26のヌクレオチド配列を含む、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記試料を第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列であり、
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列を含む前記第1または第2のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする、第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、項目20または22に記載の方法。
(項目24)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20、もしくは配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列からなり、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号48の残基1~26のヌクレオチド配列からなる、項目20または22に記載の方法。
(項目25)
前記試料を第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーと接触させることを更に含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列であり、
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列からなる第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、項目20、22、及び24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20のヌクレオチド配列を含む、項目21または23に記載の方法。
(項目27)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20のヌクレオチド配列からなる、項目21、23、及び25のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号24もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を有し、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号48のヌクレオチド配列を有する、項目20、22、及び24のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号66のヌクレオチド配列を有する、項目21、23、及び25のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記検出ステップ(3)が、
1つ以上の増幅産物を、前記第1または第2のCandida種標的領域と特異的にハイブリダイズするCandida特異的検出プローブ及び前記第3のCandida種標的領域と特異的にハイブリダイズするC.glabrata特異的検出プローブと接触させることと、
任意の標的ハイブリダイズされたCandida特異的及び/もしくはC.glabrata特異的検出プローブの存在または不在を検出することと、を含む、項目1~29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記Candida特異的検出プローブが、
(A1)配列番号145の配列に含有される18~22個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号146の配列を含む配列、
(B1)(A1)のDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、ならびに
(C1)(A1)もしくは(B1)の完全な補体からなる群から選択されるCandida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ/または
前記C.glabrata特異的検出プローブが、
(A2)配列番号147の配列に含有される17~23個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号148の配列を含む配列、
(B2)配列番号18の残基1~17の配列に実質的に対応する配列、
(C2)配列番号21の残基1~20の配列に実質的に対応する配列、
(D2)(A2)~(C2)のうちのいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、ならびに
(E2)(A2)~(D2)のうちのいずれか1つの完全な補体からなる群から選択されるC.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、
そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含み、かつ/または
C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号60の残基1~17の配列、
配列番号45の残基1~23の配列、
配列番号18の残基1~17の配列、
配列番号21の残基1~20の配列、
前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、
そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなり、かつ/または
前記C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号60の残基1~17の配列、
配列番号45の残基1~23の配列、
配列番号18の残基1~17の配列、
配列番号21の残基1~20の配列、
前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなる、項目31または32に記載の方法。
(項目34)
前記Candida特異的検出プローブが、配列番号27の配列、そのDNAもしくはRNA/DNAキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有し、かつ/または
前記C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号60、配列番号45、配列番号18、配列番号21、前述のいずれかのDNAもしくはRNA/DNAキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有する、項目31~33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、標識を含む、項目30~33のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記検出ステップ(3)が、前記増幅ステップ(2)中に起こる、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、蛍光標識及び消光剤を含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブのうちの少なくとも1つが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目30~33のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、分子トーチまたは分子ビーコンである、項目40に記載の方法。
(項目42)
ステップ(2)における前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目1~41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記増幅反応が、転写媒介増幅(TMA)反応である、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目42または43に記載の方法。
(項目45)
試料中のCandida種の存在または不在を判定するためのオリゴマーの組み合わせであって、前記オリゴマーの組み合わせが、
第1の増幅オリゴマーの組み合わせ及び第2の増幅オリゴマーの組み合わせのうちの少なくとも1つを含み、
(a)前記第1の増幅オリゴマーの組み合わせが、第1のCandida種標的核酸領域または第2のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーを含み、前記第1の標的領域が、配列番号129のヌクレオチド約133位もしくは161位~ヌクレオチド約259位の領域に対応し、前記第2の領域が、配列番号130のヌクレオチド約202位~ヌクレオチド約308位の領域に対応し、前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ
(b)前記第2の増幅オリゴマーの組み合わせが、第3のCandida種標的核酸領域を増幅するための第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーを含み、前記第3の標的領域が、配列番号131のヌクレオチド約355位~ヌクレオチド約554位の領域に対応し、前記第1及び第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、それぞれ、第1及び第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴマーの組み合わせ。
(項目46)
前記オリゴマーの組み合わせが、前記第1及び第2の両方の増幅オリゴマーの組み合わせを含む、項目45に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目47)
前記オリゴマーの組み合わせが、同じ反応混合物内に前記第1及び第2の両方の増幅オリゴマーの組み合わせを含む、項目46に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目48)
第1のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号9の残基28~46のヌクレオチド配列に実質的に対応し、かつ/または
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、(i)配列番号132の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号133の配列を含む配列、(ii)配列番号152の配列に含有される20~23個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号151の配列を含む配列、もしくは(iii)配列番号34のヌクレオチド配列に実質的に対応する配列である、項目45~47のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目49)
前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、かつ/または
前記第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号136の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号137の配列を含む配列である、項目47~48のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目50)
第3のCandida特異的増幅オリゴマーを更に含み、
前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第1のCandida種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、
前記第1及び第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第2のCandida種標的領域を増幅するためのものであり、前記第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号34のヌクレオチド配列に実質的に対応する第3のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、項目48または49に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目51)
前記第1のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号9の残基28~46のヌクレオチド配列を含み、
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26、配列番号74の残基3~22、または配列番号34のヌクレオチド配列を含み、
前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号14の残基28~49のヌクレオチド配列を含み、かつ/または
前記第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号12のヌクレオチド配列を含む、項目48または49に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目52)
第3のCandida特異的増幅オリゴマーを更に含み、
前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第1のCandida種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、
前記第1及び第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第2のCandida種標的領域を増幅するためのものであり、前記第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号34のヌクレオチド配列を含む第3のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、項目48、49、及び51のいずれか1項のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目53)
前記第1のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号9の残基28~46のヌクレオチド配列からなり、
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26、配列番号74、または配列番号34のヌクレオチド配列からなり、
前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号14の残基28~49のヌクレオチド配列からなり、かつ/または
前記第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号12のヌクレオチド配列からなる、項目48、49、及び51のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目54)
第3のCandida特異的増幅オリゴマーを更に含み、
前記第1及び第2のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第1のCandida種標的核酸領域を増幅するためのものであり、前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号135の配列を含む配列であり、
前記第1及び第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、前記第2のCandida種標的領域を増幅するためのものであり、前記第3のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号34のヌクレオチド配列からなる第3のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列を含む、項目48、49、51、及び53のいずれかに記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目55)
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26のヌクレオチド配列を含む、項目50または52に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目56)
前記第2のCandida特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号26のヌクレオチド配列からなる、項目50、52、及び54のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目57)
前記第1のCandida特異的増幅オリゴマー及び前記第1のC.glabrata特異的増幅オリゴマーのうちの少なくとも1つが、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の5’側に位置するプロモーター配列を更に含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、項目45~56のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目58)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目57に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目59)
前記プロモーター配列が、配列番号9の残基1~27のヌクレオチド配列を有する、項目58に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目60)
前記第1のCandida特異的増幅オリゴマーが、配列番号9のヌクレオチド配列を有し、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、配列番号14のヌクレオチド配列を有する、項目59に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目61)
固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合された標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つの捕捉プローブオリゴマーを更に含む、項目45~60のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目62)
前記オリゴマーの組み合わせが、第1のCandida特異的捕捉プローブオリゴマー及び第1のC.glabrata特異的捕捉プローブオリゴマーを含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第1または第2のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第3のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第1のC.glabrata捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第1のCandida特異的及びC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の各々が、前記固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合される、項目61に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目63)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、(i)配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列、もしくは(ii)配列番号140の配列に含有される15~25個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号141の配列を含む配列であり、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号142の配列に含有される16~27個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号143もしくは配列番号144の配列を含む配列である、項目62に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目64)
第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列であり、
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、前記第1または第2のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、前記第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号140の配列に含有される15~25個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号141の配列を含む配列である、項目63に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目65)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20、もしくは配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列を含み、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号48の残基1~26のヌクレオチド配列を含む、項目63に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目66)
第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列であり、
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列を含む前記第1または第2のCandida種標的核酸内の標的配列と特異的にハイブリダイズする、第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、項目63または65に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目67)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20、もしくは配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列からなり、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号48の残基1~26のヌクレオチド配列からなる、項目63または65に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目68)
第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーを更に含み、
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号138の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号139の配列を含む配列であり、
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号66の残基1~17のヌクレオチド配列からなる第2のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、項目63、65、及び67のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目69)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20のヌクレオチド配列を含む、項目64または66に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目70)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号24の残基1~20のヌクレオチド配列からなる、項目64、66、及び68のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目71)
前記第1のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号24もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を有し、かつ/または
前記第1のC.glabrata特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号48のヌクレオチド配列を有する、項目63、65、及び67のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目72)
前記第2のCandida特異的捕捉プローブオリゴマーが、配列番号66のヌクレオチド配列を有する、項目64、66、及び68のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目73)
前記第1または第2のCandida種標的領域と特異的にハイブリダイズするCandida特異的検出プローブ及び前記第3のCandida種標的領域と特異的にハイブリダイズするC.glabrata特異的検出プローブを更に含む、項目45~72のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目74)
前記Candida特異的検出プローブが、
(A1)配列番号145の配列に含有される18~22個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号146の配列を含む配列、
(B1)(A1)のDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、ならびに
(C1)(A1)もしくは(B1)の完全な補体からなる群から選択されるCandida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ/または
前記C.glabrata特異的検出プローブが、
(A2)配列番号147の配列に含有される17~23個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号148の配列を含む配列、
(B2)配列番号18の残基1~17の配列に実質的に対応する配列、
(C2)配列番号21の残基1~20の配列に実質的に対応する配列、
(D2)(A2)~(C2)のうちのいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び(E2)(A2)~(D2)のうちのいずれか1つの完全な補体からなる群から選択されるC.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、項目73に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目75)
前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、
そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含み、かつ/または
C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号60の残基1~17の配列、
配列番号45の残基1~23の配列、
配列番号18の残基1~17の配列、
配列番号21の残基1~20の配列、
前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含む、項目74に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目76)
前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、
そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなり、かつ/または
前記C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号60の残基1~17の配列、
配列番号45の残基1~23の配列、
配列番号18の残基1~17の配列、
配列番号21の残基1~20の配列、
前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなる、項目74または75に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目77)
前記Candida特異的検出プローブが、配列番号27の配列、そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有し、かつ/または
前記C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号60、配列番号45、配列番号18、配列番号21、前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有する、項目74~76のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目78)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、標識を含む、項目73~76のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目79)
前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、項目78に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目80)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、蛍光標識及び消光剤を含む、項目78に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目81)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、項目80に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目82)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブのうちの少なくとも1つが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目73~76のいずれか1項に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目83)
前記Candida特異的及びC.glabrata特異的検出プローブの各々が、分子トーチまたは分子ビーコンである、項目82に記載のオリゴマーの組み合わせ。
(項目84)
Candida種標的核酸を検出するための検出プローブであって、前記検出プローブが、
Candida特異的検出プローブであって、
(A1)配列番号145の配列に含有される18~22個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号146の配列を含む配列、
(B1)(A1)のDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、ならびに
(C1)(A1)もしくは(B1)の完全な補体からなる群から選択されるCandida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、Candida特異的検出プローブ、または
C.glabrata特異的検出プローブであって、
(A2)配列番号147の配列に含有される17~23個の連続ヌクレオチド、及び少なくとも配列番号148の配列を含む配列、
(B2)配列番号18の残基1~17の配列に実質的に対応する配列、
(C2)配列番号21の残基1~20の配列に実質的に対応する配列、
(D2)(A2)~(C2)のうちのいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、ならびに
(E2)(A2)~(D2)のうちのいずれか1つの完全な補体からなる群から選択されるC.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、C.glabrata特異的検出プローブである、検出プローブ。
(項目85)
前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、
そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含むか、または
C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号60の残基1~17の配列、
配列番号45の残基1~23の配列、
配列番号18の残基1~17の配列、
配列番号21の残基1~20の配列、
前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を含む、項目84に記載の検出プローブ。
(項目86)
前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、
そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなるか、または
前記C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号60の残基1~17の配列、
配列番号45の残基1~23の配列、
配列番号18の残基1~17の配列、
配列番号21の残基1~20の配列、
前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び
前述のうちのいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列からなる、項目84または85に記載の検出プローブ。
(項目87)
前記Candida特異的検出プローブが、配列番号27の配列、そのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有するか、または
前記C.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号60、配列番号45、配列番号18、配列番号21、前述のいずれかのDNA等価物もしくはRNA/DNAキメラ、及び前述のいずれかの完全な補体からなる群から選択される配列を有する、項目84~86のいずれか1項に記載の検出プローブ。
(項目88)
前記検出プローブが標識を含む、項目84~86のいずれか1項に記載の検出プローブ。
(項目89)
前記標識が、化学発光標識または蛍光標識である、項目88に記載の検出プローブ。
(項目90)
前記検出プローブが、蛍光標識及び消光剤を含む、項目88に記載の検出プローブ。
(項目91)
前記検出プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、またはTaqMan検出プローブである、項目90に記載の検出プローブ。
(項目92)
前記検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目84~86のいずれか1項に記載の検出プローブ。
(項目93)
前記検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、項目92に記載の検出プローブ。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、記載される方法及び組成物に関する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語及び語句は、別途特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
magnus、Propionibacterium acnes、Neisseria gonorrhoeae、Trichomonas vaginalis、Ureaplasma urealyticum、Ureaplasma parvum、Candida krusei、Candida lusitaniae、Prevotella bivia、Eggerthella lenta、Pseudomonas aeruginosa、Mobiluncus curtisii、Chlamydia trachomatis、Cryptococcus neoformans、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes、Leptotrichia bucalis、Proteus
vulgaris、Megaspahaera elsdenii、Atopobium vaginae、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus iners、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus gasseri、及びGardnerella vaginalisのうちの1つ以上に対して最小限の交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される多重検出方法など、C.albicans、C.parapsilosis、C.dubliniensis、C.tropicalis、及びC.glabrataのいずれかの検出を可能にする、組み合わせで複数のセットのオリゴマーを含む多重システムの一部である。
Candida増幅及び検出反応を実施するための1つの例示的なプロトコルは以下の通りである。(a)試薬の調製各構成成分の総体積は、実施される試験の予想数に基づいて決定された。また、各オリゴストック材料に必要な体積を計算して、各試薬ミックスに加えて所望の最終オリゴヌクレオチド濃度を得た。(1)次いで、合計4つの別個の試薬を調製した:TCR(標的捕捉試薬:ポリ-T磁気ビーズ(adT.sub.14オリゴヌクレオチドに接合された磁気ビーズ)、標的捕捉オリゴ、及び(任意選択で)水性HEPES緩衝液中のT7プライマー)、AMP(増幅試薬:塩及びヌクレオチドを含有するTRIS緩衝溶液中のNT7プライマー)、PRO(プロモーター試薬:塩及びヌクレオチドを含有するTRIS緩衝溶液中のT7及びトーチオリゴ)、ならびにENZ(酵素溶液:グリセロールを含む水性緩衝液中のMMLV逆転写酵素及びT7 RNAポリメラーゼの混合物)。現行例に関して、別途記載のない限り、以下の濃度のオリゴヌクレオチドが使用された:TCR中5pmol/反応の各T7オリゴ、TCR中15pmol/反応の各標的捕捉オリゴ(TCO)、AMP中15pmol/反応の各非T7オリゴ、PRO中15pmol/反応の各T7オリゴ、及びPRO中15pmol/反応の各トーチオリゴ。各試薬の調製において、試薬のオリゴマーなし形態の体積は、試薬に添加されるオリゴヌクレオチドの体積に基づいて決定された。次いで、オリゴマーなしの試薬を分注し、計算したオリゴマー体積を使用して、各アリコートを最大体積にした。
ROXチャネルの各々からデータを収集した。データをエクスポートし、分析した。
この実施例は、Candida種albicans、parapsilosis、tropicalis、及びdubliniensisの増幅及び検出、ならびにCandida glabrataの別個の増幅及び検出のためのアッセイを例示する。
オリゴの選択は主に以下の基準に基づく:
1.蛍光トーチのシグナル対ノイズ比
2.増幅曲線(ある場合)の外観。シグモイド型曲線は、通常、効率的な増幅を示す
3.T時間
4.検出の限度
配列番号9及び配列番号10のT7は各々、非T7オリゴ、トーチの様々な組み合わせと共に試験された。標的核酸としてC.albicansインビトロ転写物のみを使用して(系列希釈された)、初期試験を行った。表3は、スクリーニングされたオリゴの組み合わせ及び感度結果を示す。試験されたインビトロ転写物(IVT)の最低濃度は1E4であった。
5つのCandida種の各々からの溶解物を使用して、分析感度を評価した。培養において生物を成長させ、平板計数によって定量化し、試料輸送用媒体(STM)(例えば、Cary-Blair輸送用媒体(Becton-Dickenson&Co..,NJ、カタログ番号211102)、及び例えば、Aptima Vaginal Swab検体収集キット(Hologic,Inc.,Marlborough,MA、カタログ番号301162))に、1ミリリットル当たりのコロニー形成単位(CFU/mL)の正規化濃度に希釈することにより、各溶解物を生成した。STM中の溶解物を、STMに、100、300、1000、3000、10000、及び30000CFU/mLの最終濃度に系列希釈した。
実施例3からの試薬製剤の特異性を試験するために、非標的生物のパネルをSTMにおいて構築した。各パネルメンバーは、STMに、100万個のCFU/mLの最終濃度に希釈された1~5つの非標的生物からの細胞溶解物材料からなった。この濃度が実行可能ではない生物(Trichomonas vaginalis、Chlamydia trachomatis)を、より低い濃度(それぞれ、1mL当たり43000及び38500生物)で試験した。各試料パネルの生物は以下の通りである。パネル1:Acinetobacter iwoffii、Actinomyces israeliii、Alcaligenes faecalis、Bacteroides fragilis。パネル2:Clostridium difficile、Corynebacterium genitalium、Enterobacter cloacae、Enterococcus feacalis、Escherichia coli。パネル3:Bifidobacterium adolescentis、Campylobacter jejuni、Fusobacterium nucleatum、Haemophilus ducreyi、Klebsiella pneumoniae。パネル4:Listeria monocytogenes、Mycoplasma hominis、Peptostreptococcus magnus、Propionibacterium acnes。パネル5:Neisseria gonorrhoeae、Trichomonas vaginalis、Ureaplasma urealyticum、Ureaplasma Parvum。パネル6:Candida krusei、Candida lusitaniae、Prevotella bivia、Eggerthella lenta。パネル10:Pseudomonas aeruginosa、Mobiluncus curtisii、Chlamydia trachomatis、Cryptococcus neoformans。パネル11:Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes。パネル12:Leptotrichia bucalis、Proteus vulgaris、Megaspahaera elsdenii、Atopobium vaginae。パネル13:Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus iners。パネル14:Lactobacillus crispatus、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus gasseri。パネル15:Gardnerella vaginalis。各パネルの10個の複製物の反応を、表1に示される広範囲及びC.glabrataオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて自動化Pantherシステムで実行した。
二相増幅及び検出形式におけるCandida glabrataの検出に関して、6つの代替のトーチプローブ設計が直接比較された。各トーチは、FAMフルオロフォア及びDabcyl消光剤で標識された。各反応は、STMに希釈された、10000CFU/反応のCandida glabrata溶解物であった。陰極対照は、溶解物を含まないSTMであった。様々なオリゴマー条件は全て、配列番号12、14、及び48を含有し、配列番号60、18、45、46、21、3のうちの1つも含有した。この実施例で使用されるCandidaオリゴのヌクレオチド配列を下の表10に示す。
広範囲Candida種の検出のためにRT-TMAを使用して、5つの個々の非T7プライマーを試験した。増幅ミックス中反応当たり15pmolで各非T7プライマーを使用した。TCR及びプロモーター溶液に一般的な試薬を使用した。TCRは、各々15pmol/の配列番号24及び66の標的捕捉オリゴ、及び5pmol/rxnの配列番号9のT7プライマーオリゴを含有した。プロモーター溶液は、15pmol/rxnの配列番号9のT7プライマー、及び15pmol/rxnの配列番号27のトーチオリゴを含有した。比較された非T7プライマーを下の表12に示す。
2つの代替トーチ設計を機能的に比較して、臨床精度及び分析性能に対する設計差の潜在的な影響を評価した。トーチは、同じ分析物特異的領域(広範囲標的核酸(C.albicans、C.dubliniensis、C.parapsilosis、またはC.tropicalis)の検出のための)及び同じリンカーを含有するように設計されたが、最も3’の2塩基において変化した。両方のオリゴヌクレオチドは、CCまたはGGのいずれかの2つの最も3’塩基を有するメトキシ-RNAから構成された。
配列
Claims (16)
- 試料中のCandida種の存在または不在を判定するための、標的捕捉試薬および増幅試薬を含むキットであって、
(A)前記標的捕捉試薬が、
(i)配列番号9の残基28~46からなる標的ハイブリダイズ配列を含み、かつ該標的ハイブリダイズ配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含む第1のCandida特異的増幅オリゴマーであって、該標的ハイブリダイズ配列が該第1のCandida特異的増幅オリゴマーの3’末端に位置し、かつ該第1のCandida特異的増幅オリゴマーが46ヌクレオチド長である、第1のCandida特異的増幅オリゴマーと、
(ii)配列番号90からなる配列を含む標的ハイブリダイズ領域、および固定化プローブ結合領域を含む標的捕捉オリゴヌクレオチドと、
(iii)固体支持体に結合した固定化プローブと
を含み、および
(B)前記増幅試薬が、
(i)配列番号26のヌクレオチド配列からなる標的ハイブリダイズ配列からなる第2のCandida特異的増幅オリゴマーであって、該第2のCandida特異的増幅オリゴマーが21ヌクレオチド長である、第2のCandida特異的増幅オリゴマーと、
(ii)ヌクレオチドと、
(iii)塩と
を含む、キット。 - 前記プロモーター配列がT7プロモーター配列である、請求項1に記載のキット。
- 前記プロモーター配列が、配列番号9の残基1~27のヌクレオチド配列を有する、請求項2に記載のキット。
- 前記標的捕捉試薬が、さらに、配列番号134の配列に含有される15~24個の連続ヌクレオチドの、かつ少なくとも配列番号135の配列を含む配列からなる標的ハイブリダイズ配列を含む第1のC.glabrata特異的増幅オリゴマーを含み、かつ前記増幅試薬が、さらに、配列番号136の配列に含有される16~21個の連続ヌクレオチドの、かつ少なくとも配列番号137の配列を含む配列からなる標的ハイブリダイズ配列を含む第2のC.glabrata特異的増幅オリゴマーを含む、請求項1に記載のキット。
- 前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号14の残基28~49のヌクレオチド配列からなり、および/または
第2のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列が、配列番号12のヌクレオチド配列からなる、請求項4に記載のキット。 - 前記第1のC.glabrata特異的増幅オリゴマーが、前記第1のC.glabrata特異的標的ハイブリダイズ配列の5’側に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである、請求項4または5に記載のキット。
- プロモーター試薬をさらに含み、該プロモーター試薬が、(i)配列番号145の配列に含有される18~22個の連続ヌクレオチドの、かつ少なくとも配列番号146の配列を含む配列、および(ii)(i)のRNA/DNAキメラからなる群から選択されるCandida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含むCandida特異的検出プローブを含む、請求項1に記載のキット。
- 前記Candida特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、
配列番号27の残基1~22の配列、および
そのRNA/DNAキメラ
からなる群から選択される配列からなる、請求項7に記載のキット。 - 前記Candida特異的検出プローブが、配列番号27からなる配列を含む、請求項7に記載のキット。
- 前記Candida特異的検出プローブが、蛍光標識および消光剤を含む、請求項7に記載のキット。
- Candida特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項10に記載のキット。
- 前記プロモーター試薬が、C.glabrata特異的検出プローブをさらに含む、請求項7に記載のキット。
- C.glabrata特異的検出プローブが、
(A2)配列番号147の配列に含有される17~23個の連続ヌクレオチドの、かつ少なくとも配列番号148の配列を含む配列、
(B2)配列番号18の残基1~17からなる配列、
(C2)配列番号21の残基1~20からなる配列、
(D2)配列番号60の残基1~17からなる配列、
(E2)配列番号45の残基1~23からなる配列、および
(F2)(A2)~(E2)のいずれかのRNA/DNAキメラ
からなる群から選択されるC.glabrata特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項12に記載のキット。 - 前記C.glabrata特異的検出プローブが、配列番号60からなる配列を含む、請求項13に記載のキット。
- 前記C.glabrata特異的検出プローブが、蛍光標識および消光剤を含む、請求項13または14に記載のキット。
- 前記C.glabrata特異的検出プローブが、分子トーチまたは分子ビーコンである、請求項13に記載のキット。
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