CN104232745B - 用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及内标基因人核糖核酸酶P（RNaseP）的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的引物和探针包括用于检测RNaseP基因的特异性上游引物、下游引物和Taqman探针。

Description

用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种内标基因RNaseP的快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
核糖核酸酶P(Ribonuclease P，简写为RNase P)是一种核糖核酸酶，是具有酶活性的核糖核蛋白复合体，在各种生物体内普遍存在。RNaseP的主要功能是切除转移核糖核酸(tRNA)前体的5’端序列、产生成熟tRNA 5’端的核糖核酸内切酶。
西德尼·奥尔特曼在1970年代在研究前体tRNA中发现它可以剪切RNA的5’'端，也因此获得了1989年度的诺贝尔化学奖。近期的研究发现核糖核酸酶P也具有一些新的功能，例如人类细胞核中的核糖核酸酶P对于正常并有效地转录多种非编码RNA(包括tRNA、5S rRNA、SRP RNA和U6snRNA)的基因是必要的，这些基因是由RNA聚合酶III(人类细胞中三类主要的RNA聚合酶之一)来进行转录。
所有生物体的核糖核酸酶P都由RNA和蛋白质构成，人类核糖核酸酶P由一个具有催化活性的RNA亚单位以及至少10个蛋白质辅助因子组成。H1RNA是人类核糖核酸酶P的RNA亚单位，由340个核苷酸组成。常见的蛋白亚单位包括：Rpp14、Rpp20、Rpp21、Rpp25、Rpp29、Rpp30、Rpp38、Rpp40、hPop1和hPop5。人类核糖核酸酶P的RNA亚单位具有催化功能，而蛋白亚单位则是RNA亚单位的辅助因子。Rpp21、Rpp29、Rpp30和Rpp38能直接与H1RNA相互作用，其中Rpp30和Rpp38具有H1RNA结合域，为高度保守的左手螺旋的RNA模体，由保守的赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸序列组成，而Rpp14、Rpp21和Rpp29则具有RNA底物结合域，由芳香族氨基酸残基紧密相连的α螺旋和β折叠构成。
由于人类核糖核酸酶P在人体各器官组织细胞中普遍存在，因而本发明针对核糖核酸酶P的蛋白亚单位Rpp30保守序列设计引物探针，提供一种RNaseP基因的实时荧光定量PCR检测方法，低成本快速检测RNaseP基因，能够对人来源样本的RNA核酸片段进行检测，可以作为人标本中RNA提取是否有效的验证，也可以作为内标与其他目的基因的RNA检测试剂盒结合使用。
发明内容
本发明提供一种用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒。
为了完成本发明的目的，采用以下技术方案：
提供一种用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括RT-PCR buffer、混合酶液、RNaseP引物探针混合液、阳性质控品；其中RT-PCR buffer包括：PCR缓冲液、dNTPs，
MgCl2；混合酶液包括HotStart Taq酶和逆转录酶；
反应体系为25μL，其中：RT-PCR buffer 20.85μL、混合酶液0.4μL、RNaseP引物探针1.75μL，RNA模板/无RNase水/阳性质控品2μL；
所述针对RNaseP基因的上游引物序列SEQ ID NO.1；下游引物序列SEQ ID NO.2；所述RNaseP特异性TaqMan探针的序列SEQ ID NO.3；
所述引物探针与RNaseP蛋白亚基RPP30的mRNA(GeneBank登录号NM_080010.4和NM_001272879.1)特异性保守区域序列模板完全匹配；
所述阳性对照样品是对应前述RNaseP基因序列的cDNA质粒。
各引物序列列举如下：
SEQ ID NO.1：5’-CTGACCTGAAGGCTCTGC-3'
SEQ ID NO.2：5’-GGCAAAGTTGTGAAGAGTTC-3'
SEQ ID NO.3：5’-FAM-CCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTG-BHQl-3’
进一步地，本发明还提供了基于前述试剂盒的RNaseP基因实时荧光定量PCR检测方法，该方法具体包括以下步骤：
(1)将样品RNA模板(从人的各类标本，包括组织、血液等中提取)、无RNase水、阳性质控品各2μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20.85μL、混合酶液0.4μL和RNaseP引物探针混合液1.75μL，配成25μL体系，盖好管盖，进行荧光PCR检测；
(2)PCR扩增反应的条件为：45℃逆转录15～30min；92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火40s；40～45个循环；
(3)有效性判定：
无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；
(4)结果判读：
样本检测孔Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；
样本检测孔Ct值≤38，该样本结果判断为阳性，样本RNA提取成功；
样本检测孔Ct值为38～40，需要复检一次，如果Ct值仍为38～40，则判断为阴性。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测人来源的各种组织中RNaseP基因RNA，尤其可采用非细胞体系如血液或脑脊液RNA片段。
本发明将逆转录酶与HotStart Taq酶混合在一个PCR反应管中使用，先进行逆转录过程合成出cDNA，再进行PCR扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。
本发明所检测的RNaseP基因在人体内各组织中普遍存在，且表达量稳定，既可以单独检测RNaseP基因来验证RNA提取过程的有效与否，也可以作为内标基因与其他目的基因的核酸检测试剂盒结合使用。
本发明所使用的探针为5’端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时HotStart Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板RNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
综合一步法检测的优势，以及实时荧光定量PCR技术的特点，与直接测序等检测技术比较，本发明用于检测RNaseP基因具有以下优势：
1.特异性强：本发明的引物探针针对RNaseP基因蛋白亚单位RPP30的mRNA特异性保守区域序列设计，仅能对RNaseP的mRNA及cDNA进行检测，避免了RNaseP基因的DNA干扰，特异性强；
2.敏感性高：本发明能检测到100copies/μL浓度的RNaseP基因mRNA片段；
3.检测过程为闭管反应，并将逆转录过程和PCR扩增过程结合，减少实验步骤，并大大降低了污染及结果偏差的可能性；
4.操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成；
5.结果判读明确、客观，若需要亦可对结果进行定量分析；
6.可作为内标基因结合其他目的基因试剂盒使用，适用性较广；
6.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。
附图说明
图1为用本发明所述实时荧光定量PCR检测试剂盒检测正常人外周血提取RNA样本的RNaseP的扩增曲线图；
图2为用本发明所述实时荧光定量PCR检测试剂盒与另一目的基因试剂盒结合使用，以RNaseP为内标并检测目的基因的扩增曲线图；
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施案例。
收集20例正常人的外周血新鲜样本，从血液样本中提取总RNA供以下的实验应用。用实时荧光定量PCR检测RNaseP基因蛋白亚单位RPP30的mRNA。
设计并筛选能特异性检测：
RNaseP基因检测上游引物序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-CTGACCTGAAGGCTCTGC-3'
RNaseP基因检测下游引物序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-GGCAAAGTTGTGAAGAGTTC-3'
RNaseP基因检测Taqman探针序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-FAM-CCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTG-BHQl-3’
(1)引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1uM
至1.6uM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是0.3uM。
(2)探针浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从，确0.05uM至0.5uM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.1uM。
(3)退火温度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(54℃～62℃退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是58℃。
(4)酶的优化在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，确定最佳酶是HotStart Taq酶。
经优化反应体系为25μL，RT-PCR buffer 20.85μL、混合酶液0.4μL、RNaseP引物探针1.75μL，RNA模板/无RNase水/阳性质控品2μL；
所述RT-PCR buffer组分及其终浓度为：
PCR缓冲液终浓度为1×；
dNTPs终浓度为0.2mM；
MgCl2终浓度为4mM；
结果为：在20例正常人的外周血样本提取RNA全部检测出阳性。
上述结果表明本发明的实时荧光定量PCR法检测RNaseP基因灵敏度高，可检测样本中RNA的提取效果，结果可靠。所述方法快速，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，适合于在实验室或临床中大规模使用。此外用作内标也可以正确的检测出目的基因和RNaseP基因，适合多种实验需要。

Claims (6)

1.基于人核糖核酸酶P（RNaseP）基因检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括RT-PCR buffer、混合酶液、RNaseP引物探针混合液、阳性质控品；其中RT-PCR buffer包括：PCR缓冲液、dNTPs和MgCl2；混合酶液包括HotStart Taq酶和逆转录酶；
针对RNaseP基因的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；RNaseP特异性TaqMan探针序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，RT-PCR buffer中含有：10×Buffer液2.5μL，每种脱氧核苷酸浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL，25mM的MgCl2溶液3μL，用水补足到20.85μL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，混合酶液中含有：HotStart Taq酶0.3μL和逆转录酶0.1μL。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，RNaseP引物探针混合液中含有：10μmol/L的上、下游引物各0.75μL，10μmol/L的探针0.25μL。
5.根据权利要求1所述试剂盒的RNaseP基因荧光PCR检测方法，其特征在于：将样品RNA模板、无RNase水、阳性质控品各2µL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20.85μL、混合酶液0.4μL和RNaseP引物探针混合液1.75μL，配成25μL体系，盖好管盖，进行荧光PCR检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测方法中进行PCR扩增反应的条件为：45℃逆转录15~30min；92～97℃预变性 1~10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火40s；所述变性和退火过程为40～45个循环。
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