CN108779499A - 用于检测念珠菌属物种的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了利用念珠菌属物种靶核酸的特异性扩增来检测样本中念珠菌属物种的存在或不存在的方法。还公开了相应的寡聚体，包括扩增寡聚体，捕获探针和检测探针及其组合，以及相应的反应混合物和试剂盒。

Description

用于检测念珠菌属物种的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C§119(e)要求于2016年1月4日提交的临时申请号62/274,610的优先权，所述临时申请的内容特此通过引用整体并入本文。
序列表的引用
本申请包含已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且其特此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝创建于2017年1月4日，命名为“DIA.0003.02(PCT)Seq Listing2_ST25”并且大小为26KB。
背景技术
生殖器/外阴阴道念珠菌病(VVC)有时也被称为“酵母菌感染”。当被称为念珠菌的酵母存在过度生长时发生常见感染。念珠菌总是以少量存在于身体内和身体上。然而，当不平衡出现时，例如当阴道的正常酸度改变时或者当荷尔蒙平衡改变时，念珠菌会繁殖。当发生这种情况时，可能会出现念珠菌病的症状。
患有VVC的女性通常经历生殖器瘙痒，灼痛，以及有时“干酪样”阴道分泌物。具有生殖器念珠菌病的男性可能会在阴茎上出现发痒的皮疹。VVC的症状与许多其它生殖器感染的症状相似，因此重要的是要接受适当的诊断以确保适当的治疗。
目前没有单一的VVC诊断标准。诊断必须基于多种适应症的临床评估，包括实验室检查结果和患者的状况。仅通过体格检查来诊断酵母菌感染可能是困难的。通常通过取样阴道分泌物并在显微镜下观察样本以查看是否存在异常数目的念珠菌属生物体来进行诊断。真菌培养可能并不总是有用的，因为念珠菌属物种是身体的正常居住者。
由于所使用的抗真菌药物具有宿主毒性，因此通常延迟念珠菌感染治疗直至鉴定出致病生物体，但是如果及时进行抗真菌治疗则预后存在很大改善。因此，任何治疗方案的焦点都是感染诊断的特异性和快速性。因此需要一种快速的敏感性和特异性测试来帮助诊断由病原性酵母菌引起的感染如念珠菌血症。
因此，本发明的目的是提供用于特异性、敏感性和快速检测样本中的念珠菌属物种的组合物、反应混合物、方法和试剂盒。
发明内容
在一个方面，本发明提供了用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的方法。所述方法通常包括以下步骤：
(1)使疑似含有念珠菌属物种的样本与第一扩增寡聚体组合和第二扩增寡聚体组合中的至少一种接触，其中
(a)所述第一扩增寡聚体组合包含用于扩增第一念珠菌属物种靶核酸区域或第二念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第一靶区域对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO:129的区域，并且所述第二区域对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO:130的区域，并且其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二念珠菌特异性靶杂交序列；和 (b)所述第二扩增寡聚体组合包含用于扩增第三念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二光滑念珠菌(C.glabrata)特异性扩增寡聚体，其中所述第三靶区域对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO:131的区域，并且其中所述第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列；
(2)进行体外核酸扩增反应，其中可能存在于所述样本中的任何念珠菌属物种靶核酸被用作模板以产生对应于所述第一、第二和第三靶区域中的至少一个的一种或多种扩增产物；和
(3)检测所述一种或多种扩增产物的存在或不存在，从而确定所述样本中念珠菌属物种的存在或不存在。
在如上所述用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的方法的一些实施方案中，所述方法包括使所述样本与所述第一和第二扩增寡聚体组合接触。例如，在某些变型中，所述方法是一种多重方法，其包括使所述样本与同一反应混合物内的第一和第二扩增寡聚体组合接触。
在如上所述的方法的一些实施方案中，第一念珠菌特异性靶杂交序列基本上对应于SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列，和/或第二念珠菌特异性靶杂交序列是(i)包含在SEQ ID NO:132的序列中并且至少包括 SEQ ID NO:133的序列的15至24个连续核苷酸的序列，(ii)包含在SEQ ID NO:152的序列中并且至少包括SEQ ID NO:151的序列的20至23个连续核苷酸的序列，或(iii)基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的序列。
在如上所述的方法的一些实施方案中，第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，和/或第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:136的序列中并且至少包括SEQ ID NO:137的序列的16至21个连续核苷酸的序列。
在如上所述的方法的一些实施方案中，所述方法还包括使样本与第三念珠菌特异性扩增寡聚体接触，其中第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且其中第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增第二念珠菌属物种靶区域，并且第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的第三念珠菌特异性靶杂交序列。在一些这样的实施方案中，第三念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列或由SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成。
在如上所述的方法的一些实施方案中，第一念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ IDNO:9的残基28-46的核苷酸序列；第二念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:74的残基3-22或SEQ ID NO:34的核苷酸序列；第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:14的残基 28-49的核苷酸序列；和/或第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在更特定的变型中，第一念珠菌特异性靶杂交序列由 SEQ IDNO:9的残基28-46的核苷酸序列组成；第二念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:26、SEQID NO:74或SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成；第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ IDNO:14的残基28-49的核苷酸序列组成；和/或第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ IDNO:12的核苷酸序列组成。
在如上所述的用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的方法的一些实施方案中，第一念珠菌特异性扩增寡聚体和第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体中的至少一种是进一步包含位于相应靶杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。特别合适的启动子序列是T7启动子序列，例如具有SEQ ID NO:9的残基1-27所示序列的T7启动子序列。在一些这样的实施方案中，第一念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:9 的核苷酸序列和/或第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:14 的核苷酸序列。
通常，用于确定念珠菌属物种的存在或不存在的方法还包括在步骤(2)之前从样本中的其它组分纯化可能存在的任何念珠菌属物种靶核酸。在某些实施方案中，纯化步骤包括使样本与至少一种捕获探针寡聚体接触，所述寡聚体包含与结合于固定化探针的序列或部分共价连接的靶杂交序列。在一些这样的变型中，使样本与第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体和第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触，其中所述第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，其中所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与第三念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一光滑念珠菌捕获探针靶杂交序列，并且其中所述第一念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列中的每一个与结合于固定化探针的序列或部分共价连接。用于第一念珠菌特异性捕获探针的特别合适的靶杂交序列包括以下序列：(i)其是包含在SEQ ID NO:138的序列中的 16至21个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:139的序列，或(ii)其是包含在SEQ ID NO:140的序列中的15至25个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:141的序列。用于第一光滑念珠菌特异性捕获探针的特别合适的靶杂交序列包括包含在SEQ ID NO:142的序列中的16至27个连续核苷酸的序列并且至少包括SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的序列。
在其中使样本与如上所述的第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触的一些实施方案中，所述方法还包括使样本与第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触。在一些这样的变型中，第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，其中所述第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:140的序列中并且至少包括SEQ ID NO:141 的序列的15至25个连续核苷酸的序列。在更特定的变型中，第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列或由 SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列组成；在一些这样的实施方案中，第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列。
在其中使样本与如上所述的第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体和第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触的一些实施方案中，第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:24的残基1-20或SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列或者由SEQ IDNO:24的残基1-20或SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列组成，和/或第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列或由SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列组成。在更特定的变型中，第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:66的核苷酸序列，和/ 或第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:48的核苷酸序列。
在某些实施方案中，检测步骤(3)包括使一种或多种扩增产物与特异性杂交于第一或第二念珠菌属物种靶区域的念珠菌特异性检测探针和特异性杂交于第三念珠菌属物种靶区域的光滑念珠菌特异性检测探针接触，以及检测任何靶杂交的念珠菌特异性和/或光滑念珠菌特异性检测探针的存在或不存在。特别合适的念珠菌特异性检测探针包括包含选自以下的念珠菌特异性检测探针靶杂交序列的探针：(A1)包含在SEQ ID NO:145的序列中并且至少包括SEQ ID NO:146的序列的18至22个连续核苷酸的序列， (B1)(A1)的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和(C1)(A1)或(B1)的完全互补序列。特别合适的光滑念珠菌特异性检测探针包括包含选自以下的光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列的探针：(A2)包含在SEQ ID NO:147的序列中并且至少包括SEQ ID NO:148的序列的17至23个连续核苷酸的序列，(B2) 基本上对应于SEQ ID NO:18的残基1-17序列的序列，(C2)基本上对应于SEQ IDNO:21的残基1-20序列的序列，(D2)(A2)-(C2)中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和(E2)(A2)-(D2)中的任一个的完全互补序列。在一些实施方案中，念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含以下或由以下组成： SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列；和/或光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，SEQ ID NO:45 的残基1-23的序列，SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列。在更特定的变型中，念珠菌特异性检测探针具有SEQ ID NO:27的序列，其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列；和/或光滑念珠菌特异性检测探针具有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21的序列，前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列。
在利用检测探针的方法的一些实施方案中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包括至少一个标记。在特定的变型中，所述标记是化学发光标记或荧光标记。在利用经标记的检测探针的某些实施方案中，检测步骤(3)在扩增步骤(2)期间发生；在一些这样的实施方案中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包含荧光标记和猝灭剂。包含荧光标记和猝灭剂的合适的检测探针包括分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针。
在利用检测探针的方法的一些实施方案中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的至少一个还包括非靶杂交序列。例如，在一些变型中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个是分子火炬或分子信标。
在如上所述用于确定念珠菌属物种的存在或不存在的方法的某些变型中，步骤(2)的扩增反应是等温扩增反应，例如转录介导的扩增(TMA) 反应。在一些这样的实施方案中，扩增反应是实时扩增反应。
在另一方面，本发明提供了用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的寡聚体组合。所述寡聚体组合通常包括第一扩增寡聚体组合和第二扩增寡聚体组合中的至少一种，其中
(a)所述第一扩增寡聚体组合包含用于扩增第一念珠菌属物种靶核酸区域或第二念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第一靶区域对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO:129的区域并且所述第二区域对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO:130的区域，并且其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二念珠菌特异性靶杂交序列；并且(b)所述第二扩增寡聚体组合包含用于扩增第三念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第三靶区域对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO:131的区域，并且其中所述第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列。
在如上所述的用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的寡聚体组合的一些实施方案中，所述寡聚体组合包括第一和第二扩增寡聚体组合。例如，在某些变型中，所述寡聚体组合包括在同一反应混合物内的第一和第二扩增寡聚体组合。
在如上所述的寡聚体组合的一些实施方案中，第一念珠菌特异性靶杂交序列基本上对应于SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列，和/或第二念珠菌特异性靶杂交序列是(i)包含在SEQ ID NO:132的序列中并且至少包括SEQ ID NO:133的序列的15至24个连续核苷酸的序列，(ii)包含在SEQ ID NO:152的序列中并且至少包括SEQ ID NO:151的序列的20至23个连续核苷酸的序列，或(iii)基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的序列。
在如上所述的寡聚体组合的一些实施方案中，第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，和/或第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:136的序列中并且至少包括SEQ ID NO:137的序列的16至21个连续核苷酸的序列。
在如上所述的寡聚体组合的一些实施方案中，寡聚体组合还包括第三念珠菌特异性扩增寡聚体，其中第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且其中第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增第二念珠菌属物种靶区域，并且第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的第三念珠菌特异性靶杂交序列。在一些这样的实施方案中，第三念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列或由SEQID NO:34的核苷酸序列组成。
在如上所述的寡聚体组合的一些实施方案中，第一念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列；第二念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:74的残基3-22或SEQ ID NO:34的核苷酸序列；第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列；和/或第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在更特定的变型中，第一念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列组成；第二念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成；第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:14的残基28-49 的核苷酸序列组成；和/或第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。
在如上所述用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的寡聚体组合的一些实施方案中，第一念珠菌特异性扩增寡聚体和第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体中的至少一种是进一步包含位于相应靶杂交序列的 5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。特别合适的启动子序列是 T7启动子序列，例如具有SEQ ID NO:9的残基1-27所示序列的T7启动子序列。在一些这样的实施方案中，第一念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ IDNO:9的核苷酸序列，和/或第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
在某些实施方案中，如上所述的寡聚体组合还包括至少一种捕获探针寡聚体，所述寡聚体包含与结合于固定化探针的序列或部分共价连接的靶杂交序列。在一些这样的变型中，寡聚体组合包括第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体和第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体，其中所述第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，其中所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与第三念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一光滑念珠菌捕获探针靶杂交序列，并且其中第一念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列中的每一个与结合于固定化探针的序列或部分共价连接。用于第一念珠菌特异性捕获探针的特别合适的靶杂交序列包括以下序列：(i)其是包含在SEQ ID NO:138的序列中的16至21个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:139的序列，或(ii)其是包含在SEQ ID NO:140的序列中的15至25个连续核苷酸并且至少包括 SEQ ID NO:141的序列。用于第一光滑念珠菌特异性捕获探针的特别合适的靶杂交序列包括包含在SEQ ID NO:142的序列中的16至27个连续核苷酸的序列并且至少包括SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的序列。
在其中如上所述寡聚体组合包括第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体的一些实施方案中，所述寡聚体组合还包括第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体。在一些这样的变型中，第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的 16至21个连续核苷酸的序列，并且第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，其中第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:140的序列中并且至少包括SEQ ID NO:141的序列的15 至25个连续核苷酸的序列。在更特定的变型中，第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列或由SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列组成；在一些这样的实施方案中，第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列。
在其中如上所述寡聚体组合包括第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体和第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体的一些实施方案中，第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:24的残基1-20或SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列或者由SEQ IDNO:24的残基1-20或SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列组成，和/或第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列或由SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列组成。在更特定的变型中，第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:66的核苷酸序列，和/ 或第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:48的核苷酸序列。
在某些实施方案中，如上所述的寡聚体组合还包括与第一或第二念珠菌属物种靶区域特异性杂交的念珠菌特异性检测探针和与第三念珠菌属物种靶区域特异性杂交的光滑念珠菌特异性检测探针。特别合适的念珠菌特异性检测探针包括包含选自以下的念珠菌特异性检测探针靶杂交序列的探针：(A1)包含在SEQ ID NO:145的序列中并且至少包括SEQID NO:146的序列的18至22个连续核苷酸的序列，(B1)(A1)的DNA等效物或 RNA/DNA嵌合体，和(C1)(A1)或(B1)的完全互补序列。特别合适的光滑念珠菌特异性检测探针包括包含选自以下的光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列的探针：(A2)包含在SEQ ID NO:147的序列中并且至少包括SEQ ID NO:148的序列的17至23个连续核苷酸的序列，(B2)基本上对应于SEQ ID NO:18的残基1-17序列的序列，(C2)基本上对应于SEQ ID NO:21的残基1-20序列的序列，(D2)(A2)-(C2)中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和(E2)(A2)-(D2)中的任一个的完全互补序列。在一些实施方案中，念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的残基 1-22的序列，其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列；和/或光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，SEQ ID NO:45的残基1-23的序列， SEQID NO:18的残基1-17的序列，SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列。在更特定的变型中，念珠菌特异性检测探针具有SEQ ID NO:27的序列，其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列；和/或光滑念珠菌特异性检测探针具有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21的序列，前述中的任一个的DNA等效物或 RNA/DNA嵌合体，或前述中的任一个的完全互补序列。
在进一步包含检测探针的寡聚体组合的一些实施方案中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包括一个至少标记。在特定的变型中，所述标记是化学发光标记或荧光标记。在一些实施方案中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包含荧光标记和猝灭剂。合适的包含荧光标记和猝灭剂的检测探针包括分子火炬、分子信标和TaqMan检测探针。
在进一步包含检测探针的寡聚体组合的一些实施方案中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的至少一个还包括非靶杂交序列。例如，在一些变型中，念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个是分子火炬或分子信标。
在另一方面，本发明提供了用于检测念珠菌属物种靶核酸的检测探针，其中所述检测探针是如上所述的念珠菌特异性检测探针或光滑念珠菌特异性检测探针。
参考本发明的以下详细描述，本发明的这些和其它方面将变得显而易见。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与所述方法和组合物有关的本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语和短语具有归属于它们的含义。
除非上下文另有明确指示，否则术语“一”和“所述”包括复数个指示物。
如本文所用的“念珠菌属物种”是指白色念珠菌(C.albicans)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)、热带念珠菌 (C.tropicalis)和光滑念珠菌中的至少一种或多种。如本文关于寡聚体所用的“念珠菌特异性”是指对白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌靶核酸中的至少一种或多种的特异性。如本文关于寡聚体所用的“光滑念珠菌特异性”是指对至少光滑念珠菌靶核酸的特异性。
“样本”包括任何可能含有念珠菌属物种或其组分的标本，如核酸或核酸片段。样本包括“生物样本”，其包括源自活人或死人的任何组织或材料，其可能含有念珠菌属物种或其组分(例如，由其衍生的靶核酸)，包括例如阴道拭子样本，宫颈刷样本，呼吸组织或分泌物如支气管镜检查、支气管肺泡灌洗(BAL)或肺活检，痰液，唾液，外周血，血浆，血清，淋巴结，胃肠组织，粪便，尿液，精液或其它体液或材料。可以对生物样本进行处理以物理地或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内组分释放到可进一步含有酶、缓冲剂、盐、去污剂等的溶液中，所述溶液使用标准方法用于制备生物样本进行分析。此外，样本可包括经过处理的样本，例如使样本经过或通过过滤装置，或在离心后，或通过粘附于培养基、基质或支持物获得的样本。
“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷或核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其它键连接在一起形成多核苷酸。核酸包括RNA，DNA，或嵌合 DNA-RNA聚合物或寡核苷酸，及其类似物。核酸“骨架”可以由各种键构成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(在“肽核酸”或PNA中，参见PCT No. WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键中的一种或多种，或其组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代例如2'甲氧基取代和 2'卤化物取代(例如2'-F)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、 C、T、U)，其类似物(例如肌苷、5-甲基异胞嘧啶、异鸟嘌呤；《核酸生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)》,5-36,Adams等编,第11 版,1992；Abraham等,2007,《生物技术(BioTechniques)》,43:617-24)，其包括嘌呤或嘧啶碱基的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷，脱氮或氮杂嘌呤，脱氮或氮杂嘧啶，在5或6位具有取代基的嘧啶碱基，在2、6和/或8位具有改变或置换取代基的嘌呤碱基，如2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶，以及吡唑并化合物，例如未取代的或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶；美国专利No. 5,378,825、6,949,367和PCT No.WO 93/13121)。核酸可包括“无碱基”残基，其中骨架不包括一个或多个残基的含氮碱基(美国专利No.5,585,481)。核酸可以仅包含在RNA和DNA中发现的常规糖、碱基和键，或者可以包括常规组分和取代(例如，通过2'甲氧基骨架连接的常规碱基，或包含常规碱基和一种或多种碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可包括“锁核酸”(LNA)，其中一个或多个核苷酸单体具有锁定在RNA模拟糖构象中的双环呋喃糖单元，其增强了对单链RNA(ssRNA)、单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA) 中的互补序列的杂交亲和力(Vester等,《生物化学(Biochemistry)》, 43:13233-41,2004)。核酸可包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如添加3'端双脱氧核苷酸以阻止额外的核苷酸被添加到核酸中。用于在体外制备核酸的合成方法在本领域中是众所周知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”表示核酸链。在整个本申请中，核酸被指定为5'端至3'端。标准核酸，例如DNA和RNA，通常以“5'至3'”，即通过将核苷酸添加到生长核酸的3'端进行合成。
如本文所用，“核苷酸”是由磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基组成的核酸的亚基。RNA中存在的5-碳糖是核糖。在DNA中，5-碳糖是2'-脱氧核糖。该术语还包括这些亚基的类似物，例如核糖的2'位上的甲氧基 (2'-O-Me)。
如本文所用，“靶核酸”是包含待检测的靶序列的核酸。靶核酸可以是如本文所述的DNA或RNA，并且可以是单链或双链的。靶核酸可包括除靶序列以外的其它序列。
“分离的”是指含有靶核酸的样本取自其天然环境，但该术语并不意味着任何程度的纯化。
如本文所用，术语“靶序列”是指待检测的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在检测过程(例如基于扩增的检测测定，例如TMA 或PCR)期间与寡核苷酸(例如，探针寡核苷酸、引发寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸)复合的复合序列。在靶核酸最初是单链的情况下，术语“靶序列”也将指靶核酸中存在的与“靶序列”互补的序列。在靶核酸最初是双链的情况下，术语“靶序列”是指有义(+)和反义(-)链。在选择靶序列时，本领域技术人员将理解，应该选择“独特”序列以区分不相关或紧密相关的靶核酸。
“靶杂交序列”在本文中用于指被配置为与靶核酸序列杂交的寡聚体的部分。优选地，靶杂交序列被配置为与靶核酸序列特异性杂交。靶杂交序列可以与它们被配置以杂交的靶序列的部分100％互补，但不一定。靶杂交序列也可以包括相对于靶序列插入、缺失和/或取代的核苷酸残基。例如，当靶核酸是一个物种内的多个菌株时，例如对于被配置以与乳酸杆菌属(Lactobacillus)的各种菌株杂交的寡聚体的情况，靶杂交序列与靶序列的互补性可能小于100％。应理解，配置靶杂交序列与靶核酸具有小于 100％的互补性存在其它原因。
如本文关于念珠菌属物种核酸区域所用的术语“靶向序列”是指寡核苷酸以允许如本文所述进行检测的方式与靶序列杂交的过程。在一个实施方案中，寡核苷酸与靶向的念珠菌属物种核酸序列互补并且不含错配。在另一个实施方案中，寡核苷酸与靶向的念珠菌属物种核酸序列互补，但含有1、2、3、4或5个错配。优选地，与靶核酸序列杂交的寡核苷酸包括至少10个至多达50个与靶序列互补的核苷酸。应理解，至少10个并且多达 50个是包涵性范围，因此包括10、50和它们之间的每个整数。优选地，寡聚体与靶序列特异性杂交。
术语“配置为”表示参考的寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际排列。例如，配置为与靶序列特异性杂交的寡核苷酸具有在严格杂交条件下与参考序列特异性杂交的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“配置为特异性杂交”是指寡核苷酸的靶杂交区域被设计成具有可靶向参考念珠菌属物种靶区域的序列的多核苷酸序列。这样的寡核苷酸不限于仅靶向该序列，而是可用作组合物，用于试剂盒中或用于靶向念珠菌属物种靶核酸的方法中。寡核苷酸被设计为充当用于从样本检测念珠菌属物种的测定组分，因此被设计为在测试样本中常见的其它核酸的存在下靶向念珠菌属物种。如本领域所理解的，“特异性杂交”并不意味着完全杂交，因为可能发生一些小水平的与非靶核酸的杂交。相反，“特异性杂交”是指寡核苷酸被配置为在测定中主要用于与靶杂交，从而可以确定样本中靶核酸的准确检测。术语“配置为”表示寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际排列。
如本文中关于念珠菌属物种靶向核酸所用的术语“片段”是指一段连续核酸。在某些实施方案中，片段包括来自念珠菌属物种的RNA酶P 的RNA组分的非编码RNA核酶的连续核苷酸，或编码RNA酶P的RNA核酶组分的念珠菌属基因RPR1的连续核苷酸，其中片段中的连续核苷酸数目少于由RPR1基因编码的整个RNA核酶的连续核苷酸数目。
如本文所用，术语“区域”是指核酸的一部分，其中该部分小于整个核酸。例如，当参考核酸是寡核苷酸启动子引物时，术语“区域”可以用于指整个寡核苷酸的较小的启动子部分。类似地，也仅作为示例，当核酸是由RPR1基因编码的RNA核酶时，术语“区域”可以用于指核酸的较小区域，其中所述较小区域由一个或多个本发明的寡核苷酸靶向。作为另一个非限制性实例，当参考核酸是扩增子时，术语区域可以用于指由探针的靶杂交序列杂交鉴定的较小的核苷酸序列。
可互换的术语“寡聚体”、“寡聚物”和“寡核苷酸”是指具有通常小于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸，包括在下限为约5nt残基和上限为约500至900nt残基范围内的聚合物。在一些实施方案中，寡核苷酸在下限为约12至15nt和上限为约50至600nt的大小范围内，并且其它实施方案在下限为约15至20nt和上限为约22至100nt的范围内。寡核苷酸可以从天然存在的来源中纯化，或者可以使用各种众所周知的酶或化学方法中的任何一种来合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；相反，它通常用于涵盖本文描述的所有这些试剂。寡核苷酸可以发挥各种不同的功能。例如，如果它对于互补链具特异性并且能够与互补链杂交并且可以在核酸聚合酶存在下进一步延伸，则其可以用作引物；如果它含有被RNA聚合酶识别的序列并允许转录(例如T7引物)，则它可以充当引物并提供启动子；并且如果它能够与靶核酸或其扩增子杂交，并且还提供可检测部分(例如吖啶酯化合物)，则其可用于检测靶核酸。
如本文所用，寡核苷酸“基本上对应于”指定参考核酸序列是指寡核苷酸与参考核酸序列足够相似，使得寡核苷酸具有与参考核酸序列类似的杂交性质，这在于它可以在严格杂交条件下与相同的靶核酸序列杂交。本领域技术人员将理解，“基本上相应的寡核苷酸”可以不同于参考序列并且仍然与相同的靶核酸序列杂交。还应理解的是，对应于第二核酸的第一核酸包括其RNA和DNA，并且包括其互补物，除非上下文另有明确说明。核酸的这种变化可以用序列内相同碱基的百分比或探针或引物与其靶序列之间完全互补碱基的百分比来表示。因此，在某些实施方案中，如果这些碱基同一性或互补性的百分比为100％至约80％，则寡核苷酸“基本上对应于”参考核酸序列。在优选的实施方案中，百分比为100％至约85％。在更优选的实施方案中，该百分比是100％至约90％；在其它优选的实施方案中，该百分比是100％至约95％。类似地，核酸或扩增核酸的区域在本文中可被称为对应于参考核酸序列。本领域技术人员将理解，在各种互补百分比下可能需要对杂交条件进行各种修改，以允许与特异性靶序列杂交而不引起不可接受水平的非特异性杂交。
“扩增寡聚体”是这样的寡聚体，其至少3'末端与靶核酸互补，并且其与靶核酸或其互补序列杂交，并参与核酸扩增反应。扩增寡聚体的一个实例是与靶核酸杂交并含有在扩增过程中通过聚合酶延伸的3'OH末端的“引物”。扩增寡聚体的另一个实例是不能通过聚合酶延伸(例如，因为它具有3'封端)但参与或促进扩增的寡聚体。例如，扩增寡核苷酸的5'区域可以包括与靶核酸不互补的启动子序列(其可以被称为“启动子引物”或“启动子提供者”)。本领域技术人员将会理解，用作引物的扩增寡聚体可以被修饰以包括5'启动子序列，并因此用作启动子引物。结合有3'封端进一步修饰启动子引物，其现在能够与靶核酸杂交并提供用于启动转录的上游启动子序列，但不提供用于寡聚体延伸的引物。这种修饰的寡聚体在本文中被称为“启动子提供者”寡聚体。扩增寡核苷酸的大小范围包括长度为约10至约70nt(不包括任何启动子序列或多聚A尾)并且含有与靶核酸序列(或其互补链)的区域互补的至少约10个连续碱基或甚至至少12个连续碱基的那些范围。连续碱基与扩增寡聚体结合的靶序列至少80％，或至少90％或完全互补。扩增寡聚体可以任选地包括修饰的核苷酸或类似物，或参与扩增反应但不与靶核酸或模板序列互补或不包含在靶核酸或模板序列中的另外的核苷酸。应理解的是，当涉及寡核苷酸、扩增子或其它核酸的长度范围时，该范围包括所有整数(例如，19-25个连续核苷酸的长度包括19、20、21、22、23、24和25)。
如本文所用，“启动子”是被DNA依赖性RNA聚合酶(“转录酶”)识别为结合核酸并在特定位点开始RNA转录的信号的特异性核酸序列。
如本文所用，“启动子提供者”或“提供者”是指包含第一和第二区域并且被修饰以防止从其3'端开始DNA合成的寡核苷酸。启动子提供者寡核苷酸的“第一区域”包含与DNA模板杂交的碱基序列，其中杂交序列位于启动子区域的3'端但不一定与其相邻。启动子寡核苷酸的杂交部分的长度通常为至少10个核苷酸，并且长度可以延伸至50个或更多个核苷酸。“第二区域”包含用于RNA聚合酶的启动子序列。启动子寡核苷酸被工程化以使其不能被RNA或DNA依赖性DNA聚合酶例如逆转录酶延伸，优选如上所述在其3'端包含阻断部分。如本文所提及，“T7提供者”是阻断的启动子提供者寡核苷酸，其提供被T7RNA聚合酶识别的寡核苷酸序列。
“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补序列或其片段的多个拷贝的任何已知程序。多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物。已知的扩增方法包括热循环和等温扩增方法。在一些实施方案中，等温扩增方法是优选的。复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和转录介导或转录相关的扩增是核酸扩增方法的非限制性实例。复制酶介导的扩增使用自复制RNA分子和复制酶如QB复制酶(例如美国专利No.4,786,600)。PCR扩增使用DNA聚合酶、引物对和热循环来合成dsDNA的两条互补链或来自cDNA的多个拷贝(例如美国专利No. 4,683,195、4,683,202和4,800,159)。LCR扩增使用四种或更多种不同的寡核苷酸以通过使用多轮杂交、连接和变性来扩增靶标及其互补链(例如美国专利No.5,427,930和美国专利No.5,516,663)。SDA使用含有限制性内切酶识别位点的引物和切割包含靶序列的半修饰的DNA双链体的一条链的内切核酸酶，由此扩增发生在一系列引物延伸和链置换步骤中(例如，美国专利No.5,422,252；美国专利No.5,547,861；和美国专利No.5,648,211)。优选的实施方案使用适合扩增RNA靶核酸的扩增方法，例如转录介导的扩增(TMA)或NASBA，但是对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，本文公开的寡聚体可以很容易在其它扩增方法中用作引物。
“转录相关扩增”，在本文中也称为“转录介导的扩增”(TMA)，是指使用RNA聚合酶从核酸模板产生多个RNA转录物的核酸扩增。这些方法通常使用RNA聚合酶、DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、三磷酸核糖核苷和包含启动子序列的模板互补寡核苷酸，并且任选地可以包括一种或多种其它寡核苷酸。如本文所述，TMA方法是用于扩增和检测HSV靶序列的扩增方法的实施方案。如先前所详细公开(例如，美国专利No.4,868,105； 5,124,246；5,130,238；5,399,491；5,437,990；5,554,516；和7,374,885；以及PCT公开No.WO 88/01302、WO 88/10315和WO 95/03430)，转录相关扩增的变化是本领域中众所周知的。本领域普通技术人员将理解，所公开的组合物可用于基于聚合酶延伸寡聚体序列的扩增方法。
如本文所用，术语“实时TMA”是指通过实时检测手段监测的靶核酸的单引物转录介导的扩增(“TMA”)。
与“扩增产物”互换使用的术语“扩增子”是指在扩增过程期间产生的与靶序列内包含的序列互补或同源的核酸分子。这些术语可以用来指单链扩增产物、双链扩增产物或双链扩增产物的一条链。
“探针”、“检测探针”、“检测寡核苷酸”和“检测探针寡聚体”在本文中可互换使用，是指在促进杂交以允许检测靶序列或扩增核酸的条件下与核酸中或扩增核酸中的靶序列特异性杂交的核酸寡聚体。检测可以是直接的(例如直接与其靶序列杂交的探针)或间接的(例如经由中间分子结构与其靶标连接的探针)。探针可以是DNA、RNA、其类似物或其组合，并且它们可以被标记或未标记。探针的“靶序列”通常是指较大核酸序列内的较小核酸序列，其通过标准碱基配对与探针寡聚体的至少一部分特异性杂交。探针可以包含靶特异性序列和其它有助于探针的三维构象的序列(例如美国专利No.5,118,801；5,312,728；6,849,412；6,835,542； 6,534,274；和6,361,945；以及美国公开No.20060068417)。在一个优选的实施方案中，检测探针包含2'甲氧基骨架，其可以导致获得更高的信号。
术语“探针”是指检测寡核苷酸，其通常在5'碱基上含有荧光染料，并且典型地在3'碱基上含有非荧光淬灭染料(猝灭剂)。当受到照射时，激发的荧光染料将能量转移到附近的淬灭染料分子而不是发荧光，从而产生非荧光底物。在扩增期间，聚合酶的核酸外切酶活性切割 TaqMan探针以将荧光团与猝灭剂分开，从而允许从荧光团发出未猝灭的信号作为扩增指示物。
如本文所用，“标记”是指直接或间接地与探针接合的部分或化合物，其可以被检测到或导致可检测信号。直接标记可以通过将标记与探针连接的键或相互作用发生，包括共价键或非共价相互作用，例如氢键、疏水性和离子性相互作用，或形成螯合物或配位络合物。间接标记可以通过使用桥接部分或“接头”来实现，例如结合对成员、抗体或另外的寡聚体，其可以直接或间接标记，并且可以放大可检测信号。标记包括任何可检测的部分，例如放射性核素，配体(例如生物素、抗生物素蛋白)，酶或酶底物，反应性基团，或发色团(例如赋予可检测颜色的染料、颗粒或珠粒)，发光化合物(例如，生物发光、磷光或化学发光标记)，或荧光团。标记可以在均相测定中检测到，其中混合物中结合的标记探针显示与未结合的标记探针不同的可检测变化，例如不稳定性或差异降解性质。在没有从未结合形式的标记或标记探针以物理方式去除结合形式的标记或标记探针的情况下，可以检测到“均相可检测标记”(例如美国专利No. 5,283,174、5,656,207和5,658,737)。标记包括化学发光化合物，例如包括标准AE和衍生物的吖啶酯(“AE”)化合物(例如美国专利No.5,656,207、5,658,737和5,639,604)。将标记连接到核酸并检测标记的合成和方法是众所周知的(例如，Sambrook等,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)》,第2版.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989),第10章；美国专利No.5,658,737、5,656,207、 5,547,842、5,283,174和4,581,333)。多于一种的标记和多于一种类型的标记可以存在于特定的探针上，或者检测可以使用探针的混合物，其中每个探针用产生可检测信号的化合物标记(例如，美国专利No.6,180,340和 6,350,579)。
如本文所用，被称为“分子火炬”的结构被设计为包括通过接合区域(“靶结合结构域”)连接并且在预定的杂交测定条件下相互杂交的具自互补性的不同区域(“闭合结构域”)。包含靶闭合结构域的全部或部分核苷酸序列也可以用作靶结合结构域。因此，靶闭合序列可以包括靶结合序列、非靶结合序列及其组合。
“捕获探针”、“捕获寡核苷酸”、“靶捕获寡核苷酸”和“捕获探针寡聚体”在本文中可互换使用，是指通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列特异性杂交并且接合到固定化探针上的结合搭配物以将靶核酸捕获到支持物的核酸寡聚体。捕获寡聚体的一个实例包括寡核苷酸，其包含两个结合区域：靶杂交序列和固定化探针结合区域。这个实例的一个变型是两个区域可以存在于由一个或多个接头接合在一起的两个不同的寡聚体上。捕获寡聚体的另一个实施方案，靶杂交序列是包括随机或非随机多聚 GU、多聚GT或多聚U序列与靶核酸非特异性结合并将其连接至支持物上的固定化探针的序列(参见例如PCT公开No.WO 2008/016988)。固定化探针结合区域可以是被称为尾的核酸序列。尾包括约10至40个核苷酸(例如 A10至A40)或约14至33nt(例如T3A14至T3A30)的基本上均聚的尾，其结合于与支持颗粒或支持基质连接的互补固定化序列。因此，在一些实施方案中，优选的核酸尾的非限制性实例可以包括T0-4A10-40序列。捕获寡聚体的另一个实例包含两个区域，靶杂交序列和并非核酸序列的结合对成员。
如本文所用，“固定化寡核苷酸”、“固定化探针”或“固定化核酸”是指将捕获寡聚体直接或间接接合到支持物的核酸结合搭配物。接合到支持物的固定化探针有助于在样本中将捕获探针结合靶标与未结合材料分离。固定化探针的一个实施方案是接合到支持物的寡聚体，所述支持物有助于样本中结合靶序列与未结合材料的分离。支持物可包括已知材料，例如可由硝基纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯、金属或其它组合物制成的在溶液中游离的基质和颗粒，其中一个实施方案是磁性可吸引的颗粒。支持物可以是单分散的磁性球(例如均匀大小±5％)，固定化探针直接(通过共价键、螯合或离子相互作用)或间接(通过一个或多个接头)接合到所述磁性球，其中探针与支持物之间的键或相互作用在杂交条件下是稳定的。
附图说明
图1示出了念珠菌属物种RPR1基因(白色念珠菌菌株ATCC 90028核糖核酸酶P RNA(RPR1)基因，部分序列，以登录号DQ660433, GI:110084517,10-MAR-2007在GenBank可见)的参考序列(SEQ ID NO:129)。
图2示出了念珠菌属物种RPR1基因(光滑念珠菌菌株ATCC 2238 核糖核酸酶P RNA(RPR1)基因，部分序列，以登录号DQ660434, GI:133874753,21-MAR-2007在GenBank可见)的参考序列(SEQ ID NO:131)。
图3示出了念珠菌属物种RPR1基因(近平滑念珠菌菌株ATCC 22019核糖核酸酶PRNA(RPR1)基因，部分序列，以登录号DQ660436, GI:110084520,10MAR-2007在GenBank可见)的参考序列(SEQ ID NO:130)。
具体实施方式
本发明提供了用于确定样本中念珠菌属物种核酸的存在或不存在的组合物、试剂盒和方法。优选地，所述样本是生物样本。所述组合物、试剂盒和方法提供了识别RPR1基因的靶序列或由RPR1基因编码的非编码 RNA的寡核苷酸序列，包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌和/或光滑念珠菌的RPR1靶序列，或其互补序列。这种寡核苷酸可以用作扩增寡核苷酸，其可以包括引物、启动子引物和启动子提供者寡核苷酸，其功能已经在前面描述(参见例如美国专利No.4,683,195； 4,683,202；4,800,159；5,399,491；5,554,516；5,824,518；和7,374,885；各自通过引用并入本文)。其它寡核苷酸可用作探针以检测念珠菌属物种的扩增序列，或用于念珠菌属物种靶核酸的捕获。在某些方面，本发明的组合物是识别念珠菌属物种RPR1靶序列(例如两种或更多种扩增寡聚体)的两种或更多种寡聚体的组合。
所述方法提供了对念珠菌属物种核酸的敏感性和特异性检测。在某些实施方案中，所述方法包括进行念珠菌属物种靶区域的核酸扩增，并通过例如将扩增产物与核酸检测探针特异性杂交来检测扩增产物，所述核酸检测探针提供信号以指示样本中念珠菌属物种的存在。扩增步骤包括如果样本中存在念珠菌属物种核酸，则将样本与对念珠菌属物种靶核酸中的靶序列具特异性的一种或多种扩增寡聚体接触以产生扩增产物。扩增通过使用至少一种核酸聚合酶和扩增寡聚体从模板链产生拷贝(例如，通过使用模板链从引物延伸序列)而合成靶序列或其互补序列的其它拷贝。用于检测扩增产物的一个实施方案使用杂交步骤，该步骤包括使扩增产物与至少一个针对由所选扩增寡聚体扩增的序列(例如包含在侧接一对选定的扩增寡聚体的靶序列中的序列)具特异性的探针接触。
检测步骤可以使用多种已知技术中的任一种来进行，以检测与扩增的靶序列特异性相关的信号，例如通过将扩增产物与标记的检测探针杂交并检测由标记探针产生的信号。检测步骤还可以提供关于扩增序列例如其核酸碱基序列的全部或一部分的其它信息。可以在扩增反应完成之后进行检测，或者可以与例如实时扩增靶区域同时进行检测。在一个实施方案中，检测步骤允许均相检测，例如检测杂交探针而不从混合物中除去未杂交的探针(参见例如美国专利No.5,639,604和5,283,174，各自通过引用并入本文)。
在扩增步骤接近结束或结束时检测扩增产物的实施方案中，可使用线性检测探针来提供信号以指示探针与扩增产物的杂交。这种检测的一个实例使用与靶核酸杂交的发光标记的探针。然后从非杂交探针水解发光标记。通过使用发光计的化学发光进行检测。(参见例如国际专利申请公开No.WO 89/002476，通过引用并入本文)。在使用实时检测的其它实施方案中，检测探针可以是发夹探针，例如分子信标、分子火炬或杂交开关探针，其用当探针结合于扩增产物时检测到的报告基因部分进行标记。这种探针可以包含靶杂交序列和非靶杂交序列。先前已经描述了各种形式的这种探针(参见例如美国专利No.5,118,801；5,312,728；5,925,517； 6,150,097；6,849,412；6,835,542；6,534,274；和6,361,945；以及美国专利申请公开No.20060068417A1和20060194240A1；各自通过引入并入本文)。
本发明的优选组合物被配置成与白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌和/或光滑念珠菌中的至少一种的核酸特异性杂交，其中与样本中疑似存在的其它非念珠菌属核酸(例如，与阴道感染相关的其它病原体)的交叉反应性最小。在某些变型中，本发明的组合物(例如寡聚体组合)允许检测广谱念珠菌属物种(例如白色念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌中的任一种；白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌中的任一种；或白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌中的任一种)。在一些方面，本发明的组合物被配置成与白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌中的一种或多种的核酸特异性杂交，其中与以下中的一种或多种的交叉反应性最小：阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、沙眼衣原体 (Chlamydiatrachomatis)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter iwoffii)、衣氏放线菌 (Actinomycesisraelii)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragilis)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、生殖器棒状杆菌 (Corynebacterium genitalium)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、屎肠球菌 (Enterococcus feacalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescentis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、阴道毛滴虫、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、克柔念珠菌(Candida krusei)、葡萄牙念珠菌(Candidalusitaniae)、二路普雷沃尔菌(Prevotella bivia)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、柯氏动弯杆菌(Mobiluncus curtisii)、沙眼衣原体、新型隐球菌 (Cryptococcus neoformans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、口腔纤毛菌(Leptotrichiabucalis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、埃氏巨型球菌(Megaspahaera elsdenii)、阴道阿托波菌(Atopobium vaginae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、胃乳杆菌(Lactobacillus gastricus)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)。在一些实施方案中，本发明的组合物是包括多组寡聚体的多重系统的一部分，其以组合形式允许检测白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌中的任一种，例如在如本文所述的多重检测方法中。
在本发明的某些方面，提供了用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的至少两种寡聚体的组合。通常，寡聚体组合包括：(a)用于扩增对应于SEQ ID NO:129的区域的第一念珠菌属物种靶区域或对应于 SEQ ID NO:130的区域的第二念珠菌属物种靶区域的第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体，和/或(b)用于扩增对应于SEQ ID NO:131的区域的第三念珠菌属物种靶区域的第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体。在这些实施方案中，来自上述寡聚体组(a)和寡聚体组(b)中的每一个的至少一种扩增寡聚体包含有义方向的靶杂交序列(“有义THS”)并且至少一种扩增寡聚体包含反义方向的靶杂交序列(“反义THS”)，其中组(a)的扩增寡聚体的有义THS和反义THS各自被配置为与对应于SEQ ID NO:129或130内包含序列的念珠菌属物种靶序列特异性杂交，其中组(b)的扩增寡聚体的有义THS和反义THS各自被配置为与对应于SEQ ID NO:131内包含序列的念珠菌属物种靶序列特异性杂交，并且其中所述靶杂交序列经过选择以使得被反义THS靶向的念珠菌属序列位于被有义THS靶向的念珠菌属序列下游 (即，至少两种扩增寡聚体定位成使得它们侧接有待扩增的靶区域)。在一些实施方案中，第一念珠菌属物种靶区域对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO:129的区域，第二念珠菌属物种靶区域对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO:130的区域，和 /或第三念珠菌属物种靶区域对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO:131的区域。在一些变型中，寡聚体组合包括(a)第一念珠菌特异性扩增寡聚体，其包含基本上对应于SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列的第一念珠菌特异性靶杂交序列。在一些变型中，寡聚体组合包括(a)第二念珠菌特异性扩增寡聚体，其包含第二念珠菌特异性靶杂交序列，所述序列是(i)包含在SEQ ID NO:132的序列中并且至少包括SEQ ID NO:133的序列的15至24个连续核苷酸的序列，(ii)包含在SEQ ID NO:152的序列中并且至少包括SEQ ID NO:151的序列的20至23个连续核苷酸的序列，或(iii)基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的序列。在一些变型中，寡聚体组合包括(b)第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体，其包含第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列，所述序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列。在一些变型中，寡聚体组合包括(b)第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体，其包含第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列，所述序列是包含在SEQ IDNO:136的序列中并且至少包括SEQ ID NO:137的序列的16至21个连续核苷酸的序列。
在本发明的更特定实施方案中，用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的如上所述的寡聚体组合包括以下中的至少一种：(A)包含 SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列或由SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列组成的扩增寡聚体，(B)包含SEQ IDNO:26的核苷酸序列或由SEQ ID NO:26的核苷酸序列组成的扩增寡聚体，(C)包含SEQ IDNO:74的残基 3-22的核苷酸序列或由SEQ ID NO:74的残基3-22的核苷酸序列组成的扩增寡聚体，(D)包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列或由SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成的扩增寡聚体，(E)包含SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列或由SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列组成的扩增寡聚体，和(F)包含 SEQ ID NO:12的核苷酸序列或由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成的扩增寡聚体。
在某些实施方案中，如本文所述的扩增寡聚体是进一步包含位于靶杂交序列的5'的启动子序列并且与念珠菌属物种靶核酸不互补的启动子引物或启动子提供者。例如，在用于扩增念珠菌属物种靶区域的如本文所述的寡聚体组合的一些实施方案中，如上所述的第一念珠菌特异性扩增寡聚体(例如，包含基本上对应于SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列的第一念珠菌特异性靶杂交序列的第一念珠菌特异性扩增寡聚体)和/或如上所述的第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体(例如，包含第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列的第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体，所述序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24 个连续核苷酸的序列)是进一步包含5'启动子序列的启动子引物。在特定实施方案中，启动子序列是T7RNA聚合酶启动子序列，例如，具有SEQ IDNO:9的残基1-27所示序列的T7启动子序列。在特定变型中，第一念珠菌特异性扩增寡聚体是具有SEQ ID NO:9所示序列的启动子引物和/或第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体是具有SEQ ID NO:14所示序列的启动子引物。
在一些实施方案中，如本文所述的寡聚体组合还包括末端寡核苷酸(在本文中也称为“封端”寡核苷酸)，其包含与靶区域的5'末端附近的靶核酸内包含的序列基本上互补(例如完全互补)的碱基序列。末端寡聚体通常与例如启动子提供者扩增寡聚体组合使用，例如，在本文关于转录介导的扩增(TMA)所述的某些实施方案中。
在一些实施方案中，如本文所述的寡聚体组合还包含至少一种念珠菌特异性捕获探针寡聚体和/或至少一种光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体。在某些实施方案中，念珠菌特异性捕获探针寡聚体包括基本上对应于SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:30的互补序列中所含序列的靶杂交序列。在某些实施方案中，光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体包括基本上对应于SEQ ID NO:131的互补序列中所含序列的靶杂交序列。在一些实施方案中，捕获探针寡聚体靶杂交序列与结合于固定化探针的序列或部分共价连接。在一些实施方案中，念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有靶杂交序列，所述序列是(i)包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸，或(ii)包含在SEQ ID NO:140的序列中并且至少包括SEQ ID NO:141的序列的15至25个连续核苷酸。在一些实施方案中，光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有包含在SEQ ID NO:142的序列中并且至少包括SEQID NO:143或SEQ ID NO:144的序列的16至27个连续核苷酸的靶杂交序列。在特定实施方案中，念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含选自以下的核苷酸序列或由选自以下的核苷酸序列组成： (i)SEQ ID NO:24的残基1-20的核苷酸序列和(ii)SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列；和/或光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列或由SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列组成。在更特定的变型中，念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有选自SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:66的核苷酸序列；和/或光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:48的核苷酸序列。寡聚体组合可包括至少两种(例如三种)如上所述的捕获探针寡聚体。在一些实施方案中，寡聚体组合包括如上所述的念珠菌特异性捕获探针寡聚体和光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体；在一些这样的实施方案中，寡聚体组合还包括第一和第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体，其中第一和第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体中的每一个是如上所述的念珠菌特异性捕获探针寡聚体。在某些实施方案中，捕获探针寡聚体提供于靶捕获反应混合物内。
在某些变型中，如本文所述的寡聚体组合还包含至少一种检测探针寡聚体，其被配置成与念珠菌属物种靶序列特异性杂交，所述念珠菌属物种靶序列可使用靶向念珠菌属物种靶区域(例如，侧接如本文所述的第一和第二念珠菌特异性或光滑念珠菌特异性扩增寡聚体的靶杂交序列的念珠菌属物种靶区域)的第一和第二扩增寡聚体扩增。在一些实施方案中，寡聚体组合包括念珠菌特异性检测探针，其与以下特异性杂交：(a-i)对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO:129的区域的第一念珠菌属物种靶区域，(a-ii)对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO:130的区域的第二念珠菌属物种靶区域，或(a-iii)(a-i)或 (a-ii)的完全互补序列。在一些实施方案中，寡聚体组合包括光滑念珠菌特异性检测探针，其与以下特异性杂交：(b-i)对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO:131的区域的第三念珠菌属物种靶区域，或(b-ii)(b-i)的完全互补序列。在一些实施方案中，念珠菌特异性检测探针包括包含在SEQID NO:145的序列中并且至少包括SEQ ID NO:146的序列的 18至22个连续核苷酸的念珠菌特异性检测探针靶杂交序列，或作为前述的完全互补序列的靶杂交序列。在一些实施方案中，光滑念珠菌特异性检测探针包括选自以下的光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列：(A)包含在 SEQ ID NO:147的序列中并且至少包括SEQ ID NO:148的序列的17至23个连续核苷酸的序列，(B)基本上对应于SEQ ID NO:18的残基1-17序列的序列，(C)基本上对应于SEQ ID NO:21的残基1-20序列的序列，和(D)(A)-(C) 中的任一个的完全互补序列。在更特定实施方案中，念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的残基1-22的序列或其完全互补序列；和/或光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，SEQ ID NO:45的残基1-23 的序列，SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，或前述中的任一个的完全互补序列。在念珠菌特异性检测探针的特定变型中，探针具有SEQ ID NO:27的序列或其完全互补序列。在光滑念珠菌特异性检测探针的特定变型中，探针具有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:45、 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21的序列，或前述中的任一个的完全互补序列。合适的检测探针还包括前述中的任一个的DNA等效物和DNA/RNA嵌合体。检测探针寡聚体可在核酸骨架的一个或多个键处含有2'-甲氧基骨架。在一些变型中，寡聚体组合包括至少两种检测探针寡聚体(例如，如本文所述的念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针)。在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体提供于扩增子检测反应混合物中。
通常，根据本发明的检测探针寡聚体还包括标记。特别合适的标记包括发出可检测的光信号的化合物，例如可以在均相混合物中检测到的荧光团或发光(例如化学发光)化合物。多于一种标记和多于一种类型的标记可以存在于特定探针上，或者检测可以依赖于使用探针混合物，其中每个探针用产生可检测信号的化合物标记(参见例如美国专利No.6,180,340和6,350,579，各自通过引用并入本文)。标记可以通过各种方式连接到探针上，包括共价键、螯合和离子相互作用，但优选标记是共价连接的。例如，在一些实施方案中，检测探针具有连接的化学发光标记，例如吖啶酯(AE)化合物(参见例如美国专利No.5,185,439；5,639,604； 5,585,481；和5,656,744；各自通过引用并入本文)，其在典型的变型中通过非核苷酸接头连接到探针上(参见例如美国专利No.5,585,481； 5,656,744；和5,639,604，特别是在第10栏第6行至第11栏第3行，和实施例8；各自通过引用并入本文)。在其它实施方案中，检测探针包含荧光标记和猝灭剂，这是特别可用于荧光共振能量转移(FRET)测定中的组合。这些检测探针的具体变型包括例如TaqMan检测探针(Roche MolecularDiagnostics) 和“分子信标”(参见例如Tyagi等,《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》,16:49-53,1998；美国专利No.5,118,801和5,312,728；各自通过引用并入本文)。
根据本发明的检测探针寡聚体还可包括非靶杂交序列。这些检测探针的具体实施方案包括例如形成通过分子内杂交保持的构象，例如通常称为发夹的构象的探针。特别合适的发夹探针包括“分子火炬”(参见例如美国专利No.6,849,412；6,835,542；6,534,274；和6,361,945，各自通过引用并入本文)和“分子信标”(参见例如Tyagi等，同上；US 5,118,801 和US 5,312,728，同上)。使用这种发夹探针的方法在本领域中是众所周知的。
在其它实施方案中，检测探针是基本上不会形成由分子内键保持的构象的线性寡聚体。在特定变型中，线性检测探针寡聚体包括作为标记的化学发光化合物，优选吖啶酯(AE)化合物。
本发明还提供如本文所述的检测探针寡聚体和捕获探针寡聚体。
在另一方面，本发明提供了使用如本文所述的寡聚体组合确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的方法。这种方法通常包括(1)使样本与第一扩增寡聚体组合和第二寡聚体组合中的至少一种接触，其中(a)所述第一扩增寡聚体组合包括用于扩增对应于SEQID NO:129的区域的第一念珠菌属物种靶区域或对应于SEQ ID NO:130的区域的第二念珠菌属物种靶区域的第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体，和(b)所述第二扩增寡聚体组合包括用于扩增对应于SEQ ID NO:131的区域的第三念珠菌属物种靶区域的第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体；(2)进行体外核酸扩增反应，其中可能存在于样本中的任何念珠菌属物种靶核酸被用作模板以产生对应于第一、第二和第三靶区域中的至少一个的一种或多种扩增产物；和(3)检测所述一种或多种扩增产物的存在或不存在，从而确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在。根据本发明的检测方法通常还包括获得样本以与至少两种寡聚体接触的步骤。在某些实施方案中，“获得”有待在步骤(1)-(3) 中使用的样本包括例如在其中进行所述方法的一个或多个步骤的测试设施或其它位置接收样本，和/或从其中进行所述方法的一个或多个步骤的设施内的位置(例如，从存储或其它贮藏所)回收样本。
在某些实施方案中，所述方法还包括在接触步骤之前从样本中的其它组分纯化念珠菌属物种靶核酸。这种纯化可以包括从其它样本组分分离和/或浓缩样本中包含的生物体的方法。在特定实施方案中，纯化靶核酸包括捕获靶核酸以特异性或非特异性地将靶核酸与其它样本组分分离。非特异性靶捕获方法可能涉及从基本上水性混合物中选择性沉淀核酸，将核酸附着到经过洗涤以去除其它样本组分的支持物上，或者从含有念珠菌属物种核酸和其它样本组分的混合物中物理分离核酸的其它手段。
在一些实施方案中，通过将念珠菌属物种靶核酸与捕获探针寡聚体特异性杂交而将念珠菌属物种靶核酸与其它样本组分选择性分离。捕获探针寡聚体包含靶杂交序列，其被配置为与念珠菌属物种靶序列特异性杂交以形成与样本组分分离的靶序列:捕获探针复合物。合适的捕获探针靶杂交序列包括如上文关于在寡聚体组合的某些实施方案中可用于检测念珠菌属物种的念珠菌特异性捕获探针和/或光滑念珠菌特异性捕获探针所述的序列。在一个优选的变型中，特异性靶捕获将念珠菌属物种靶:捕获探针复合物与固定化探针结合以形成靶:捕获探针:固定化探针复合物，其与样本分离并且任选地洗涤以除去非靶样本组分(参见例如美国专利No. 6,110,678；6,280,952；和6,534,273；各自通过引用并入本文)。在这样的变型中，捕获探针寡聚体还包含将捕获探针与其结合的靶序列连接到与固体支持物连接的固定化探针的序列或部分，由此允许杂交靶核酸与其它样本组分分离。在一些实施方案中，使疑似含有念珠菌属物种的样本与念珠菌特异性捕获探针寡聚体和光滑念珠菌捕获探针寡聚体接触；在一些这样的实施方案中，使样本进一步与第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触。
在更特定的实施方案中，捕获探针寡聚体包括与念珠菌属物种靶序列不互补但与固定化探针上的序列特异性杂交的尾部(例如3'尾)，从而用作允许靶核酸与其它样本组分分离的部分，例如先前在例如美国专利 No.6,110,678中所述，所述专利通过引用并入本文。任何序列都可用于通常约5至50nt长的尾区域，并且优选的实施方案包括约10至40nt(例如A10至A40)、更优选约14至33nt(例如A14至A30或T3A14至T3A30)的基本上均聚尾，其结合于与固体支持物(例如基质或颗粒)连接的互补固定化序列 (例如多聚T)。例如，在包含3'尾的捕获探针的特定实施方案中，捕获探针具有选自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:66和SEQ IDNO:48的序列。
靶捕获通常发生在含有一种或多种捕获探针寡聚体的溶液相混合物中，所述捕获探针寡聚体在杂交条件下，通常在高于尾序列:固定化探针序列双链体的Tm的温度下与念珠菌属物种靶序列特异性杂交。对于包含捕获探针尾的实施方案，通过调整杂交条件以使得捕获探针尾与固定化探针杂交来捕获念珠菌属物种靶:捕获探针复合物，然后使固体支持物上的整个复合物与其它样本组分分离。连接有固定化探针:捕获探针:念珠菌属物种靶序列的支持物可以洗涤一次或多次以进一步去除其它样本组分。优选的实施方案使用颗粒状固体支持物，例如顺磁珠粒，使得连接有念珠菌属物种靶:捕获探针:固定化探针复合物的颗粒可以悬浮在洗涤溶液中并从洗涤溶液中回收，优选通过使用磁吸引力。为了限制处理步骤的数量，可以通过将支持物上的复合物中的念珠菌属物种靶序列与扩增寡聚体简单混合并进行扩增步骤来扩增念珠菌属物种靶核酸。
念珠菌属物种靶序列的扩增利用使用侧接待扩增靶区域的至少两种扩增寡聚体的体外扩增反应。在一些实施方案中，待扩增靶区域对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO:129的区域。在一些实施方案中，待扩增靶区域对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO:130的区域。在一些实施方案中，待扩增靶区域对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO:131的区域。本文描述了用于扩增这些靶区域的特别合适的扩增寡聚体组合。合适的扩增方法包括例如复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和转录介导或转录相关的扩增(TMA)。这样的扩增方法在本领域中是众所周知的，并且容易根据本发明的方法使用。
例如，使用TMA扩增的一些扩增方法包括以下步骤。简言之，含有待扩增序列的靶核酸作为单链核酸(例如，ssRNA或ssDNA)提供。本领域技术人员将会理解，双链核酸(例如dsDNA)的常规熔融可用于提供单链靶核酸。启动子引物在其靶序列处与靶核酸特异性结合，并且逆转录酶(RT)使用靶链作为模板延伸启动子引物的3'末端，以产生靶序列链的cDNA拷贝，从而产生RNA:DNA双链体。RNA酶消化RNA:DNA双链体的 RNA链，并且第二引物特异性结合其位于启动子引物末端下游的cDNA链上的靶序列。RT通过使用第一cDNA模板延伸第二引物的3'末端以产生包含功能性启动子序列的dsDNA来合成新的DNA链。对启动子序列具特异性的 RNA聚合酶然后启动转录以产生RNA转录物，所述RNA转录物为反应中初始靶链的约100至1000个扩增拷贝(“扩增子”)。当第二引物与每个扩增子中的靶序列特异性结合时扩增继续，并且RT从扩增子RNA模板产生DNA 拷贝以产生RNA:DNA双链体。反应混合物中的RNA酶从RNA:DNA双链体中消化扩增子RNA，并且启动子引物特异性结合新合成DNA中的其互补序列。RT延伸启动子引物的3'末端以产生dsDNA，其含有与RNA聚合酶结合的功能启动子以转录与靶链互补的额外扩增子。在反应过程中重复产生更多扩增子拷贝的自动催化循环导致样本中存在的靶核酸扩增约10亿倍。扩增产物可以在扩增期间实时检测，或在扩增反应结束时通过使用特异性结合扩增产物中包含的靶序列的探针来检测。检测到结合探针所产生的信号表明样本中存在靶核酸。
在一些实施方案中，所述方法利用“反向”TMA反应。在这样的变型中，初始或“前向”扩增寡聚体是与靶区域3'末端附近的靶核酸杂交的引发寡核苷酸。逆转录酶(RT)通过使用靶核酸作为模板延伸引物的3'末端来合成cDNA链。第二或“反向”扩增寡聚体是具有被配置为与包含在合成 cDNA链内的靶序列杂交的靶杂交序列的启动子引物或启动子提供者。其中第二扩增寡聚体是启动子引物，RT利用cDNA链作为模板来延伸启动子引物的3'末端以产生靶序列链的第二cDNA拷贝，由此产生含有功能性启动子序列的dsDNA。然后基本上如上文段落[105]中所述利用RNA聚合酶从启动子序列开始转录以继续扩增。可选地，在第二扩增寡聚体是启动子提供者的情况下，与靶区域的5'末端附近的靶序列杂交的末端寡核苷酸通常用于终止引发寡聚体在末端寡核苷酸3'末端的延伸，从而为从引发寡聚体延伸合成的初始cDNA链提供限定的3'末端。启动子提供者的靶杂交序列然后与初始 cDNA链的限定的3'末端杂交，并且cDNA链的3'末端延伸以添加与启动子提供者的启动子序列互补的序列，从而形成双链启动子序列。使用识别双链启动子并启动从其转录的RNA聚合酶，初始cDNA链然后使用模板来转录与不包括启动子部分的初始cDNA链互补的多个RNA转录物。然后这些RNA 转录物中的每一个可用于充当从第一引发扩增寡聚体进一步扩增的模板。
扩增产物的检测可以通过多种方法来完成。核酸可与产生物理变化(例如可检测到的电变化)的表面相缔合。扩增的核酸可以通过将它们集中在基质中或基质上并且检测与它们相缔合的核酸或染料(例如插入剂如溴化乙锭或cyber green)或检测溶液相中与核酸相缔合的染料的增加来检测。其它检测方法可以使用核酸检测探针，所述核酸检测探针被配置为与扩增产物中的序列特异性杂交并检测探针:产物复合物的存在，或者通过使用可以放大与扩增产物相关的可检测信号的探针复合物(例如，美国专利No.5,424,413；5,451,503；和5,849,481；各自通过引用并入本文)。与扩增产物特异性结合的直接或间接标记的探针提供可检测的信号，所述信号表明样本中存在靶核酸。特别地，扩增产物将含有念珠菌属物种RPR1基因中的靶序列或与念珠菌属物种RPR1基因中的序列互补的靶序列或由RPR1基因编码的RNA，并且探针将直接或间接地结合到扩增产物中包含的序列以表明测试样本中存在念珠菌属物种核酸。
与互补扩增序列杂交的检测探针的优选实施方案可以是DNA或 RNA寡聚体，或含有DNA和RNA核苷酸的组合的寡聚体(在本文中也称为“RNA/DNA嵌合体”)，或用修饰骨架合成的寡聚体，例如包含一个或多个2'-甲氧基取代的核糖核苷酸的寡聚体。用于检测扩增的念珠菌属物种序列的探针可以是未标记的并间接检测(例如通过将另一种结合搭配物与探针上的部分结合)或可以用各种可检测标记进行标记。本文进一步描述了适合根据本发明的方法使用的检测探针的特定实施方案。在用于检测念珠菌属物种序列的方法的一些实施方案中，例如在某些使用转录介导扩增 (TMA)的实施方案中，检测探针是线性化学发光标记探针，更优选线性吖啶酯(AE)标记的探针。在其它实施方案中，检测探针包含荧光标记和猝灭剂(例如分子火炬或分子信标)。
不希望通过核酸聚合酶延伸的寡聚体优选包括替代3'OH以阻止寡聚体在扩增反应中的酶介导延伸的阻断基团。例如，扩增期间存在的阻断的扩增寡聚体和/或检测探针优选不具有功能性3'OH，而是包含位于3' 末端处或附近的一个或多个阻断基团。3'末端附近的阻断基团优选在3'末端的五个残基内并且足够大以限制聚合酶与寡聚体的结合，并且其它优选的实施方案含有共价连接至3'端的阻断基团。可以使用许多不同的化学基团来阻断3'末端，例如烷基、非核苷酸接头、链烷二醇双脱氧核苷酸残基和虫草素。
典型地在3'末端被阻断并且特别适用于使用转录介导扩增的某些实施方案中的寡聚体的实例是启动子提供者。如前所述，启动子提供者包含第一靶杂交区域，和位于第一区域5'处的包含用于RNA聚合酶的启动子序列的第二区域。启动子提供者寡核苷酸被修饰以阻止从其3'端起始 DNA合成，例如通过包含如上文所讨论的阻断基团。
典型地3'阻断寡聚体的另一个实例是先前如上所述的封端(“阻断”)寡核苷酸。封端寡聚体通常与例如启动子提供者扩增寡聚体组合使用，例如，在本文关于转录介导扩增(TMA)所述的某些实施方案中。封端寡聚体与靶区域5'末端附近的靶核酸内包含的序列杂交，以“终止”包括引发寡核苷酸的新生核酸的引物延伸，从而为新生核酸链提供限定的3'末端。
其它使用转录介导扩增的实施方案利用启动子引物，所述启动子引物包含第一靶杂交区域，和位于第一区域5'处的第二区域，所述第二区域包含用于RNA聚合酶的启动子序列，但其未被修饰以阻止从其3'末端起始DNA合成。在一些实施方案中，根据检测方法使用的启动子引物包含(i) 基本上对应于SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列的念珠菌特异性靶杂交序列，或(ii)包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135 的序列的15至24个连续核苷酸的光滑念珠菌特异性靶杂交序列。在一些这样的实施方案中，启动子引物包含(i)包含SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列或由SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列组成的念珠菌特异性靶杂交序列，或(ii)包含SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列或由SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列组成的光滑念珠菌特异性靶杂交序列。在更特定的变型中，根据检测方法使用的启动子引物具有SEQ ID NO:9或 SEQID NO:14所示的序列。
用于检测念珠菌属物种核酸的测定可以任选地包括非念珠菌属物种内部对照(IC)核酸，其通过使用对IC序列具特异性的扩增和检测寡聚体在相同测定反应混合物中扩增和检测。IC核酸序列可以是RNA模板序列 (例如和体外转录物)，掺入样本中的合成核酸序列，或者IC核酸序列可以是细胞组分。作为细胞组分的IC核酸序列可以来自相对于标本的外源细胞来源或内源细胞来源。在这些情况下，内部对照核酸与扩增反应混合物中的念珠菌属物种核酸共同扩增。内部对照扩增产物和念珠菌属物种靶序列扩增产物可以独立检测。
本发明还提供了用于确定样本中念珠菌属物种靶核酸的存在或不存在的反应混合物。根据本发明的反应混合物至少包含以下中的一种或多种：如本文所述的用于扩增念珠菌属物种靶核酸的寡聚体组合；如本文所述的用于纯化念珠菌属物种靶核酸的捕获探针寡聚体；以及如本文所述的用于确定念珠菌属物种扩增产物的存在或不存在的检测探针寡聚体。反应混合物可以进一步包括许多任选组分，例如捕获探针核酸阵列。对于扩增反应混合物，反应混合物通常将包括适合于进行体外扩增的其它试剂，例如缓冲剂，盐溶液，适当的三磷酸核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP、 dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP)和/或酶(例如逆转录酶和/或RNA聚合酶)，并且通常将包括其中可能存在或可能不存在念珠菌属物种靶核酸的测试样本组分。此外，对于包括检测探针和扩增寡聚体组合的反应混合物，选择用于反应混合物的扩增寡聚体和检测探针寡聚体通过共同的靶区域连接 (即，反应混合物将包括与反应混合物的扩增寡聚体组合可扩增的序列结合的探针)。
本发明还提供了用于实施如本文所述方法的试剂盒。根据本发明的试剂盒至少包含以下中的一种或多种：如本文所述的用于扩增念珠菌属物种靶核酸的扩增寡聚体组合；如本文所述的用于纯化念珠菌属物种靶核酸的捕获探针寡聚体；以及如本文所述的用于确定念珠菌属物种扩增产物的存在或不存在的检测探针寡聚体。所述试剂盒还可包括许多任选组分，例如捕获探针核酸阵列。可存在于试剂盒中的其它试剂包括适合于进行体外扩增的试剂，例如缓冲剂，盐溶液，适当的三磷酸核苷酸(例如dATP、 dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP)，和/或酶(例如逆转录酶和/或RNA聚合酶)。在各种不同的实施方案中如本文所述的寡聚体可以被包装，并且本领域技术人员将会理解，本发明包括许多不同的试剂盒配置。例如，试剂盒可包括用于念珠菌属物种基因组的仅一个靶区域的扩增寡聚体，或者其可能包括用于多个念珠菌属物种靶区域的扩增寡聚体。另外，对于包括检测探针与扩增寡聚体组合的试剂盒，选择用于试剂盒的扩增寡聚体和检测探针寡聚体通过共同的靶区域连接(即，所述试剂盒将包括与试剂盒的扩增寡聚体组合可扩增的序列结合的探针)。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于实施根据本发明的方法的一套说明书，其中所述说明书可以与包装插页和/或试剂盒包装或其组件相关联。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例1：用于进行念珠菌扩增和检测测定的示例性方案
用于进行念珠菌扩增和检测反应的一个示例性方案如下：(a) 制备试剂。每个组分的总体积是根据预期进行的测试次数确定的。此外计算添加到每种试剂混合物中以产生期望的最终寡核苷酸浓度的每种寡核苷酸储备材料的所需体积。(1)然后制备总共4种单独的试剂：TCR(靶捕获试剂：多聚T磁珠(与adT.sub.14寡核苷酸接合的磁珠)，靶捕获寡核苷酸和 (任选地)于水性HEPES缓冲液中的T7引物)，AMP(扩增试剂：于含有盐和核苷酸的TRIS缓冲溶液中的NT7引物)，PRO(启动子试剂：于含有盐和核苷酸的TRIS缓冲溶液中的T7和火炬寡核苷酸)和ENZ(酶溶液： MMLV逆转录酶和T7RNA聚合酶于含甘油的含水缓冲液中的混合物)。对于本实施例，除非另有说明，否则使用以下浓度的寡核苷酸：在TCR中每个T7寡核苷酸每个反应5pmol，在TCR中每个靶捕获寡核苷酸(TCO)每个反应15pmol，在AMP中每个非T7寡核苷酸每个反应15pmol，在PRO中每个 T7寡核苷酸每个反应15pmol，和在PRO中每个火炬寡核苷酸每个反应15 pmol。在制备每种试剂时，基于添加到试剂中的寡核苷酸的体积确定较少寡聚体形式试剂的体积。然后，将较少寡聚体试剂等分，并且使用计算的寡聚体体积使各等分试样达到全部体积。
反应在自动化系统(例如，Panther系统(Hologic,Inc., Marlborough,MA))上以纯系统或以半手动方法进行。对于在诸如Panther 系统的自动化系统上运行的反应，将所制备的试剂(TCR、AMP、PRO、 ENZ)加载到自动化装置中，随后加入样本。自动化系统然后执行靶捕获，扩增，和数据收集。对于在“纯系统”中运行的反应，没有靶捕获步骤。相反，将靶核酸(例如体外转录物)直接加入到微量滴定板中的AMP混合物中，然后进行扩增反应。对于半手动反应，靶捕获和洗涤步骤如下进行：
如果使用半手动方法运行，则如下进行靶捕获和洗涤步骤：(1) 将AMP混合物以50μL/孔等分至96孔PCR板。将Aptima洗涤缓冲液(例如洗涤溶液(Hologic,Inc.,Marlborough,MA，目录号302179))以500μL/孔等分至圆底Kingfisher深孔板，并且以200μL/孔等分至浅Kingfisher 96孔板。然后将这3块板搁置一旁。(2)将TCR以100μL/孔等分至深孔板中，接着400 μL样本/孔。然后将含有该样本的平板盖住，置于Torrey Pines加热块(Torrey Pines Scientific,CA，目录号IC25)上，并在62摄氏度下温育30分钟。使加热的平板缓慢冷却至室温(20分钟)。(3)然后如Aptima HCV RNA定性测定(Hologic,Inc.，目录号302179)的包装插页中一般描述的那样，将室温平板移至Kingfisher仪器用于珠粒洗涤。在平板上放置套头(磁盖)，将平板置于Kingfisher仪器上，并执行洗涤程序以收集珠粒，将收集的珠粒转移至深孔洗涤板，混合平板，再次捕获珠粒并将它们转移到浅孔洗涤板上。 (4)在洗涤程序之后，将含有珠粒的平板转移到具有较小套头(磁盖)的 Kingfisher仪器，然后收集经过洗涤的珠粒，并转移/释放到含有AMP试剂的平板中。
通常如下进行扩增和检测反应：将包含AMP试剂和样本的平板盖住并使用(摇动器/加热块)(Eppendorf,Hamburg DE， Eppendorf型号5355)在44摄氏度下温育约5分钟。温育5分钟后，将25μL 酶混合物加入到每个孔中，并再次盖上平板。将盖住的平板以1400rpm混合1分钟，然后在44摄氏度下温育5分钟。在此温育之后，将25μL启动子混合物(PRO)加入到每个孔中，并且将平板在1400rpm下混合1分钟。然后用光学板密封物盖住平板，然后立即将密封平板置于Stratagene实时循环仪 (型号Mx3005p，AgilentTechnologies,CA)上并在43摄氏度下温育。从 FAM、HEX和ROX通道中的每一个采集数据，进行150次循环，每次循环 30秒。导出数据并分析。
实施例2：念珠菌属RT-TMA寡核苷酸筛选
本实施例说明了用于扩增和检测念珠菌属物种白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌以及用于另外扩增和检测光滑念珠菌的测定。
所述测定由两套扩增和检测系统组成。第一系统由以下组成：单一广谱T7寡核苷酸，一对非T7寡核苷酸，和用于扩增和检测白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌的经标记的火炬寡核苷酸。第二系统由以下组成：T7、非T7和对光滑念珠菌的扩增和检测具特异性的经标记的火炬寡核苷酸。所述测定包括三种靶捕获寡核苷酸(TCO)，其中一种 TCO对光滑念珠菌具特异性，而另外两种TCO捕获通过广谱扩增系统检测到的物种。表1列出了广谱寡核苷酸组合和光滑念珠菌特异性寡核苷酸组合的所有寡核苷酸。表2示出本研究中评估的寡聚体序列。完全扩增系统可以使用单独启动子和扩增试剂以双相实时TMA测定形式运行。完全扩增双相系统包括4个主要步骤：(i)在样本中进行靶核酸的靶捕获：靶捕获反应包括将靶核酸与靶捕获寡聚体(TCO)、多聚T磁珠和T7启动子引物(T7)混合的一般步骤。TCO和T7与靶核酸杂交，并且还将TCO的3'末端与多聚T磁珠的固定化探针杂交。然后将所得的杂交复合物与样本的其它组分分离。(ii)洗涤分离的杂交复合物以除去任何干扰物质、未结合的靶标和留在样本中的T7，从而产生基本上纯化的杂交复合物。(iii)然后进行初始线性扩增。将基本上纯化的杂交复合物重悬于含有非T7引物(NT7)的线性扩增试剂和扩增必需试剂(即具有RNA酶活性的逆转录酶，dNTP和盐)中。线性扩增试剂不存在任何额外的T7扩增寡聚体。结果，线性扩增反应产生作为扩增子的初始量的RNA转录物。(iv)然后进行线性扩增产物的指数扩增：简言之，在线性扩增反应持续一段时间后，将指数扩增试剂加入到反应中。指数扩增试剂含有T7扩增寡聚体和火炬检测探针寡聚体。因此，指数扩增试剂提供了从 RNA转录物扩增子产生双链DNA产物(具有双链启动子序列)所必需的反应组分，因此产生RNA转录扩增子的双链DNA分子的数目成指数地增加。当产生RNA转录物扩增子时，火炬结合扩增子以产生检测信号。
表1：用于念珠菌属RNA实时TMA测定系统的寡核苷酸
1本实施例中的靶核酸是体外转录物。
表2：寡聚体序列
寡核苷酸选择概述
寡核苷酸的选择主要基于以下标准：
1.荧光火炬的信噪比
2.扩增曲线(如果有的话)的外观；S形曲线通常表示有效的扩增
3.T时间
4.检测限
为了简单起见，本实施例中仅显示检测限(敏感性)结果。每个表中仅示出每个反应的体外转录物拷贝中测试的最低浓度。
扩增和检测在纯扩增系统中进行。纯扩增系统不涉及靶捕获、洗涤或双相扩增。相反，将所有扩增寡核苷酸和体外转录物靶核酸加入到一种常见的扩增试剂中，并且在温育期后，将酶与火炬一起添加用于实时检测。为了简化目的，在纯系统中进行寡核苷酸筛选。除非在本实施例中另有说明，否则大多数筛选过程都是使用纯扩增系统进行的。
广谱系统
T7SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10各自与非T7寡核苷酸、火炬的组合一起测试。初始测试仅使用白色念珠菌体外转录物作为靶核酸(连续稀释)进行。表3示出筛选的寡核苷酸组合和敏感性结果。所测试的体外转录物(IVT)的最低浓度是1E4。
表3：广谱系统的T7寡核苷酸筛选
所有寡核苷酸组合都显示出相同的检测限(1E6)，但在该实验中SEQ ID NO:9(T7)与SEQ ID NO:12(非T7)的组合显示稍快的T时间。寡核苷酸浓度的变化不会显著改变这些寡核苷酸组合的敏感性。所有未来的测试都使用具有SEQ ID NO:9所示序列的T7寡聚体进行。
然后测试新的寡核苷酸组合以处理近平滑念珠菌中的低RFU 信号，并尝试提高该系统中靶向的所有念珠菌属物种的敏感性。表4示出在该筛选中测试的寡核苷酸。在最初的筛选中，除近平滑念珠菌以外的其它念珠菌菌株显示出与白色念珠菌相似的扩增。因此，这些寡核苷酸组合用白色念珠菌和近平滑念珠菌进行测试。
表4：非T7和火炬筛选
在所测试的浓度下，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的寡核苷酸组合显著提高了白色念珠菌的敏感性，但近平滑念珠菌没有获得扩增。在每个反应1E8IVT拷贝下观测到近平滑念珠菌的弱扩增。用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的寡核苷酸组合测试其它念珠菌属菌株。结果示于表5中。
表5：利用新的广谱寡核苷酸组的白色念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌的敏感性
如上所述，使用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:4 可见近平滑念珠菌以及其它念珠菌属物种的扩增。在另一测定中，用多种非T7寡核苷酸组合测试SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:27以确定近平滑念珠菌的扩增和检测的敏感性。表6示出所用寡核苷酸的完全集合。IVT拷贝/反应的最低测试浓度是1E4/μL。
表6：利用SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:6的近平滑念珠菌敏感性
当使用SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12时，近平滑念珠菌扩增和检测敏感性为1E8IVT拷贝/反应。用火炬SEQ ID NO:27 代替火炬SEQ ID NO:4显示1E6IVT拷贝/rxn的敏感性。当用非T7引物SEQ ID NO:12代替非T7引物SEQ ID NO:34时，对于两个火炬SEQ ID No:4和27 观察到显著提高的敏感性。
使用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:34以及分别地SEQ ID No:4和 27中的每一个测试白色念珠菌。在这些测定中，不存在白色念珠菌的扩增和检测。然而，通过在这些反应中加入非T7引物SEQ ID NO:26，观测到包括近平滑念珠菌在内的所有念珠菌属物种的扩增和检测。然而，白色念珠菌扩增效率受到低IVT拷贝水平下的T时间延迟和检测限下降1log(从1E4 到1E5)的负面影响。
然后在自动化扩增和检测系统(Panther system,Hologic,Inc.) 上用双相扩增方法测试寡核苷酸组合SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34以及SEQ ID NO:27。当比较纯系统和双相系统结果时，除了都柏林念珠菌以外，没有观察到任何念珠菌属物种的敏感性显著降低。
与使用相同的两个非T7寡核苷酸(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34)的双相反应相比，使用双相系统在单一反应中组合两个非T7寡核苷酸不会影响任何靶标在个别反应中的扩增(关于寡核苷酸在个别反应中的结果，参见表4、5和6)。下表7示出纯系统相对于双相系统的结果。敏感性浓度以IVT拷贝/rxn计。
表7：念珠菌系统在双相测定中相比于纯系统中的敏感性
2纯系统中近平滑念珠菌的最低测试浓度。
实施例3：用于扩增和检测白色念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和光 滑念珠菌的可行性RT-TMA试剂制剂的敏感性测试
使用来自五个念珠菌属物种中的每一个的裂解物评估分析敏感性。通过使生物体在培养物中生长，通过平板计数进行定量并在样本传输介质(STM)(例如Cary-Blair传输介质(Becton-Dickenson&Co.,NJ，目录号211102)；和例如Aptima阴道拭子标本收集试剂盒(Hologic,Inc., Marlborough,MA，目录号301162))中稀释至以菌落形成单位/毫升 (CFU/mL)计的归一化浓度来产生每种裂解物。STM中的裂解物在STM中连续稀释至最终浓度为100、300、1000、3000、10000和30000CFU/mL。
在自动化扩增和检测系统(Panther系统(Hologic,Inc.))上，在实时转录介导的扩增和检测反应(RT-TMA)中使用各浓度的15个重复物作为样本。该制剂被配置为扩增并检测核酸内部对照以及来自下列念珠菌属物种中的每一个的RNA酶P RNA：白色念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌(统称为“广谱”)和光滑念珠菌。广谱靶标用单个 T7和两个非T7引物扩增，然后用配置为火炬的单个探针检测。光滑念珠菌用单个T7、单个非T7和单个火炬寡核苷酸扩增，所述单个火炬寡核苷酸与广谱火炬寡核苷酸被不同标记，以区分广谱与光滑念珠菌。包括内部对照靶标以及扩增和检测寡核苷酸(未显示)，并且检测寡核苷酸被不同地标记以便与靶标区分。用于三重反应的念珠菌寡核苷酸的核苷酸序列示于下表8中。
表8
结果：阳性估计为RFU在不同截止时间(分钟)下高于阈值。下表9示出对于广谱念珠菌属物种使用RFU阈值3000和20分钟的T时间截止值以及对于光滑念珠菌使用RFU阈值1600和25分钟的T时间截止值，在15 个中的阳性重复物数目。
表9
进行Probit分析以估计每种被分析物的95％和50％检测水平。对于白色念珠菌，C50(阳性概率为50％的估计水平)为583CFU/mL，95％置信限度为383-747，并且C95(阳性概率为95％的估计水平)为1035 CFU/mL，95％置信限度为809-1563。对于热带念珠菌，C50为200(124-244) 并且C95为309(253-437)。对于都柏林念珠菌，C50为3142(3000-3292)并且C95为3337(3195-3495)。对于近平滑念珠菌，C50为292(285-300)并且C95 为310(302-319)。对于光滑念珠菌，C50为2841(2763-2922)并且C95为3012 (2929-3097)CFU/mL。
实施例4：用于扩增和检测白色念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和光 滑念珠菌的寡核苷酸的特异性和干扰测试
为了测试来自实施例3的试剂制剂的特异性，在STM中构建一组非靶向生物体。每个小组成员由来自1至5个非靶向生物体的细胞裂解物材料组成，所述细胞裂解物材料在STM中稀释至最终浓度为100万CFU/mL。这种浓度不可行的生物体(阴道毛滴虫、沙眼衣原体)在较低浓度下测试 (分别为每毫升43000和38500个生物体)。每个样本小组中的生物体如下。小组1：鲁氏不动杆菌、衣氏放线菌、粪产碱菌、脆弱拟杆菌。小组2：艰难梭菌、生殖器棒状杆菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌。小组3：青春双歧杆菌、空肠弯曲菌、具核梭杆菌、杜克雷氏嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌。小组4：单核细胞增生李斯特菌、人型支原体、大消化链球菌、痤疮丙酸杆菌。小组5：淋病奈瑟氏菌、阴道毛滴虫、解脲支原体、微小脲原体。小组6：克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、二路普雷沃尔菌、迟缓埃格特菌。小组10：铜绿假单胞菌、柯氏动弯杆菌、沙眼衣原体、新型隐球菌。小组11：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌。小组12：口腔纤毛菌、普通变形杆菌、埃氏巨型球菌、阴道阿托波菌。小组13：嗜酸乳杆菌、粘膜乳杆菌、胃乳杆菌、惰性乳杆菌。小组14：卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、格氏乳杆菌。小组15：阴道加德纳菌。如表1所示，在具有广谱和光滑念珠菌寡核苷酸组合的自动化Panther系统上进行每个小组的10个重复反应。
特异性结果：无反应显示阳性，如通过在用于光滑念珠菌检测的荧光通道中超过阈值1600或者对于用于检测广谱寡核苷酸组合的荧光通道超过阈值3000的RFU范围所确定。内部对照的所有重复物都是阳性的，其中RFU范围超过阈值1600。
为了确定在样本中是否由于非靶向生物体的存在而损害了念珠菌属生物体的检测，将上述特异性小组各自掺入靶标生物体，然后在具有如表1所示的广谱和光滑念珠菌寡核苷酸组合的自动化Panther系统上运行。将小组掺入3000CFU/mL的近平滑念珠菌或3000CFU/mL的白色念珠菌和3000CFU/mL光滑念珠菌。结果：如通过RFU范围所确定，所有反应(每个条件10次重复)均为阳性。没有观察到显著的抑制。
实施例5：用于检测光滑念珠菌的替代火炬设计的评估
直接比较六种替代的火炬探针设计，以双相扩增和检测形式检测光滑念珠菌。每个火炬用FAM荧光团和Dabcyl猝灭剂标记。每个反应为10000CFU/反应的在STM中稀释的光滑念珠菌裂解物。阴性对照是不含裂解物的STM。各种寡聚体条件都含有SEQ ID NO:12、14和48，并且还含有SEQ ID NO:60、18、45、46、21、3之一。在本实施例中使用的念珠菌属寡核苷酸的核苷酸序列示于下表10中。
表10
通过在每个条件下对每个靶标的8个重复物进行RT-TMA扩增和检测反应来评估火炬性能，除了火炬探针的身份外，所有试剂都是恒定的。使用Torrey Pines加热块(TorreyPines Scientific,CA，目录号IC25)、提取系统(ThermoScientific,MA，目录号5400500)、(摇动器/加热块)(Eppendorf,Hamburg DE，Eppendorf型号5355)和实时循环仪(型号Mx3005p，Agilent Technologies,Santa Clara,CA)或Panther系统(Hologic,Inc.,Marlborough,MA)，通常如上所述半手动地进行反应。
结果示于下表11中。六个火炬探针中的两个(PR4和PR6)在无靶标对照和光滑念珠菌裂解物靶标样本之间差异很小，因此不适合用于测定。在剩余的四个候选火炬探针中，由于较低的平均T时间和较高的平均 T斜率，PR2和PR1与PR3和PR5相比具有优选的性能。
表11
实施例6：用于检测念珠菌属物种的替代非T7引物设计
使用RT-TMA测试五种单独的非T7引物以检测广谱念珠菌属物种。在扩增混合物中每个反应使用15pmol的每个非T7引物。将普通试剂用于TCR和启动子溶液。TCR含有各自15pmol/rxn的靶捕获寡核苷酸SEQ ID No:24和66以及5pmol/rxn的T7引物寡核苷酸SEQ IDNO:9。启动子溶液含有15pmol/rxn的T7引物SEQ ID NO:9和15pmol/rxn的火炬寡核苷酸SEQID NO:27。所比较的非T7引物如下表12所示。
表12：非T7引物
SEQ ID NO: 序列
26 CGTTACAAGAAATATACACGG
34 GGTAGTTTGGCTTTTCTTTGG
73 CTTCCTTAGCGTGAAAACGCA
74 AGGCTGTAAAAGGTCTGCTTCGT
75 AGAAATCTTCAGAGCCCGA
扩增靶标是含有来自以下物种中的每一个的部分RNA酶PR1 基因序列的体外转录物：白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌。
使用Torrey Pines加热块、提取系统、 (摇动器/加热块)和实时循环仪半手动地进行反应，并如上文实施例5中通常所述进行分析。
结果：非T7引物SEQ ID NO:73未能可检测地扩增靶标。非T7 引物SEQ ID NO:74与非T7引物SEQ ID NO:26相比以较快的T时间扩增靶标，而非T7引物SEQ ID NO:75与非T7引物SEQ ID NO:34相比以较慢的T时间扩增近平滑念珠菌。
实施例7：念珠菌属物种火炬与替代干配置的比较
两种替代火炬设计在功能上进行比较，以评估设计差异对临床准确性和分析性能的潜在影响。火炬被设计成含有相同的被分析物特异性区域(用于检测广谱靶核酸(白色念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌或热带念珠菌))和相同的接头，但是最3'处的两个碱基不同。两个寡核苷酸都由甲氧基-RNA组成，其中两个最3'处的碱基是CC或GG。
进行了两个实验。在第一个实验中，构建了多重念珠菌制剂 (广谱寡核苷酸、光滑念珠菌寡核苷酸和内部对照寡核苷酸)，但省略了广谱火炬寡核苷酸。然后将试剂分成两部分，并且以每个反应15皮摩尔加入SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:155以完成每个制剂。每个完成的制剂在 Panther系统上相对于分析(对照)样本和汇集阴性样本(来自推测阴性样本的残留阴道拭子材料汇集在一起，然后分成两个制剂进行相同测试)操作。数据代表每池每个制剂10次重复的两个汇集阴性样本，和每个制剂5 次重复的1E4菌落形成单位/毫升的阳性对照白色念珠菌裂解物。如下表13 所示，火炬SEQ ID NO:155给出了比火炬SEQ ID NO:27更高的阳性对照背景扣除的RFU范围，不同重复物之间的可变性(％CV)类似。这些反应的平均背景信号对于火炬SEQ ID NO:27是3337RFU和对于火炬SEQ ID NO:155 是1182。在汇集的阴性样本上，火炬SEQ ID NO:155相比于火炬SEQ ID NO:27给出较低的RFU范围和较低的不同重复物之间的可变性(％CV)。基于这些数据，火炬SEQ ID NO:155提供了阳性与阴性样本之间的更好区分。
表13
在第二个实验中，使用两种念珠菌试剂制剂(广谱报告为FAM，光滑念珠菌报告为HEX)，在自动化Panther系统(Hologic,Inc., Marlborough,MA)上运行50个临床样本。制剂1使用每个反应32皮摩尔的 SEQ ID NO:27(FAM火炬)，并且制剂2使用每个反应10皮摩尔的SEQ ID NO:155(FAM火炬)。所述制剂在其它方面是相同的。在两种制剂中，光滑念珠菌(HEX)火炬(SEQ ID NO:60)以每个反应26皮摩尔存在。每个临床样本以每种制剂1次重复操作。然而，两种制剂的背景信号在HEX通道上相似，制剂1具有比制剂2基本上更高的背景。平均背景信号是5645(FAM-制剂1)、 638(FAM-制剂2)、1457(HEX-制剂1)、1347(HEX-制剂2)。在下表 14中示出从48个有效结果中扣除背景的RFU范围的分布(N＝每个条件下48 个中的阳性数目)。对于HEX结果，没有样本给出的RFU范围在1250与5000 RFU之间，留出空间来设置RFU范围阈值以区分阳性与阴性样本。在FAM 上，制剂2在样本之间也具有强烈差别，给出高或低的RFU范围，而制剂1 没有。在该实验中不存在中间RFU范围样本结果表明，火炬SEQID NO:155 对于广谱寡核苷酸组合来说是比SEQ ID NO:27性能更好的火炬。
表14
序列
表15：示例性寡聚体序列、参考序列和区域
从以上所述，应该理解，虽然本文为了说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，但是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下做出各种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文。
序列表
<110> GEN-PROBE INCORPORATED
JIANG, Alice
GETMAN, Damon K.
HUDSON, Angela s.
EATON, Barbara L.
<120> 用于检测念珠菌属物种的方法和组合物
<130> DIA.0003.02
<140> TBA
<141> 2017-01-04
<150> US 62/274,610
<151> 2016-01-04
<160> 155
<170> PatentIn 3.5版
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ccaaguccuu guggcuuggc cuugg 25
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<400> 5
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<220>
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aatttaatac gactcactat agggagaacc gacatcctta cgtag 45
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<221> 启动子
<222> (1)..(27)
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aatttaatac gactcactat agggagaata ctggaccgac atccttacg 49
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ggcagagacg uaugggccug cugcc 25
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tcggtatcgg gtgcttgaat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52
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<221> misc_feature
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<400> 24
agatcggtat cgggtgcttg tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 53
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<211> 0
<212> DNA
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cgttacaaga aatatacacg g 21
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<223> 合成寡核苷酸
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ggaauggcgc cguggauggu ugcauugg 28
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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cugagaagca acuucucuau uaacgcucag 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(49)
<223> 3'尾
<400> 69
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
cttccttagc gtgaaaacgc a 21
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gatggagcgt accaccg 17
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cggtatcggg tgcttg 16
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<223> 合成寡核苷酸
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ccagaagcga aacggg 16
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tcggtatcgg gtgcttgaa 19
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<211> 25
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
gguggauuug ugcgaca 17
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
augggaaugg cgccguggau gg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
ggcagagacg uaugggccug 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
ggaauggcgc cguggauggu ug 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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cagccaacca uccacggc 18
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
caugcgcuuu ucugagaagc aac 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
cugagaagca acuucucuau uaacg 25
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<210> 124
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
ggaugugacu gucaugc 17
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<211> 0
<212> DNA
<213> 无序列存在37 CFR 1.821c
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<212> DNA
<213> 无序列存在37 CFR 1.821c
<400> 127
000
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
gaauggcgcc guggaugguu g 21
<210> 129
<211> 308
<212> DNA
<213> 白色念珠菌
<300>
<308> DQ660433.1
<309> 2007-03-10
<313> (1)..(308)
<400> 129
ccggtcaaca taaggagttt tctttagaaa ctcattcaca accaaatgcg ggtgggaaat 60
tcggtggtac gctccatcct ttacagattt gctcctgaga gcttcttcct tagcgtgaaa 120
gcgcatgggc ggcgttacaa gaaatataca cggagtttta aggctgtaga aggtctgctt 180
cgtatgggaa tggcgccgtg gatggttggc tgtgagtaat tctttactac aagctgttta 240
gtgcaatatg cgaacttgaa gtcaccttca agcacccgat accgatcacc gacttgagac 300
aggtttta 308
<210> 130
<211> 365
<212> DNA
<213> 近平滑念珠菌
<300>
<308> DQ660436.1
<309> 2007-03-10
<313> (1)..(365)
<400> 130
gagctcgact cgtctcgatt cgcattgacc cgcgaacaaa aggaactttc cgttcaaaag 60
caaaaattat gcgggtggga aattcggtgg tactctccat tcattcaaga tttgtgctcc 120
tgagagcaaa ttcctgagcg tgcaaacgca tgggcggtgt taaaagaaat cttcagagcc 180
cgaaggcgcc cgactacctt cggtagtttg gcttttcttt gggttctatg ggaatgacgc 240
cgtgaatggt tggctgttgt ttagtgtcaa agcgaacaag ggctatttag tgcaatatgc 300
gaacttgatg gttgttcata actgtcaaga acccgatacc gatcattgac gatgagttga 360
gttaa 365
<210> 131
<211> 1008
<212> DNA
<213> 光滑念珠菌
<300>
<308> DQ660434.2
<309> 2007-03-21
<313> (1)..(1008)
<400> 131
ggattacagc ttagtggagc ttggagtata ggtgctcctc tgagttcatt ttgagcctct 60
gggtactctt gagagtactg actcttacgc ggttggttac atgtggtttg aaggtctttt 120
ctgagggttt ttctgttgga ggttacggga gttgtgtgtg tcggtgtatt gtcgtggagc 180
ttcacttgga gttgtctgcg tctcagagca agtcgtgggg attatgtctt ttggctgtcc 240
gttcgttttc ctcttcacct ttctgcttgt acaataggtc ttgtagagct ccagtgctat 300
tcttagtcga ccgtgaggac ggctttcggg ggaacccggc cggtaagatt aagtgcattg 360
gagtttctgc tgaaatctgt atcgtataag gaggataagg gtggggcaga gacgtatggg 420
cctgtctagg gatgtgactg tcatgcgctt ttctgagaag caacttctct attaacggtg 480
gatttgtgcg acacttctcc attgctcact tcctctctaa tggagggccc tacgtaagga 540
tgtcggtcca gtatgtctgc gattgtttct gtggtggacc tcgcgctgtt ataagaaata 600
tacccgtttc gcttctggtt ttctgagcag gaagatatat ttccagtgaa gatgcaccag 660
gagcaacggc tgggaatggc agcggattaa gaaagccact gaaaactctc gcaggtgcat 720
tgggtagaga aagcctgcgt attttctttc cacatattcc tacatcacta tgaagggtgg 780
agctttcctc tcttcagaga tgttccgtag ttctctgggg tgcttagttt gatcatgtgg 840
tgcgtcttct tcttagtttc acggcttggc tcacacactt tgtcgcttta aacctgccat 900
ttccgctctc ttaagagagt gcattggtgt gaggcgaggt gtcaaaatcg tggtgaggct 960
ttattcagtg caattgtagg acttgtcgtc tcgttagaga tgatttga 1008
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 132
gcggcgttac aagaaatata cacgg 25
<210> 133
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 133
gttacaagaa atat 14
<210> 134
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 134
atactggacc gacatcctta cgtag 25
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
accgacatcc ttacg 15
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 136
agtgcattgg agtttctgct g 21
<210> 137
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
gcattggagt ttctgc 16
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 138
agatcggtat cgggtgcttg aa 22
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
cggtatcggg tgcttg 16
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 140
ggatggagcg taccaccgaa tttcccaccc 30
<210> 141
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 141
taccaccg 8
<210> 142
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 142
ggaaatatat cttcctgctc agaaaaccag aagcgaaacg gg 42
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 143
ccagaagcga aacggg 16
<210> 144
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 144
gctcag 6
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 145
augggaaugg cgccguggau gguuggcug 29
<210> 146
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 146
gccguggaug guug 14
<210> 147
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 147
ggaugugacu gucaugcgcu uuucugagaa gcaac 35
<210> 148
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 148
caugc 5
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 149
gccguggaug guuggcugac ggc 23
<210> 150
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 150
gccguggaug guuggcug 18
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 151
gctgtaaaag gyytrcttcg 20
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 152
aggctgtaaa aggyytrctt cgt 23
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 153
gtgaaagcgc atgggc 16
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 154
gaaatcttca gagcccgaag g 21
<210> 155
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
ggaauggcgc cguggauggu ugcauucc 28

Claims (93)

1.一种用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(1)使样本与第一扩增寡聚体组合和第二扩增寡聚体组合中的至少一种接触，所述样本疑似含有念珠菌属物种，其中
(a)所述第一扩增寡聚体组合包含用于扩增第一念珠菌属物种靶核酸区域或第二念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第一靶区域对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO：129的区域，并且所述第二区域对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO：130的区域，并且其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二念珠菌特异性靶杂交序列；并且
(b)所述第二扩增寡聚体组合包含用于扩增第三念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第三靶区域对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO：131的区域，并且其中所述第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列；
(2)进行体外核酸扩增反应，其中可能存在于所述样本中的任何念珠菌属物种靶核酸被用作模板以产生对应于所述第一、第二和第三靶区域中的至少一个的一种或多种扩增产物；以及
(3)检测所述一种或多种扩增产物的存在或不存在，从而确定所述样本中念珠菌属物种的存在或不存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使所述样本与所述第一和第二扩增寡聚体组合接触。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法是一种多重方法，其包括使所述样本与同一反应混合物内的所述第一和第二扩增寡聚体组合接触。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中
第一念珠菌特异性靶杂交序列基本上对应于SEQ ID NO：9的残基28-46的核苷酸序列；和/或
所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是(i)包含在SEQ ID NO:132的序列中并且至少包括SEQ ID NO:133的序列的15至24个连续核苷酸的序列，(ii)包含在SEQ ID NO:152的序列中并且至少包括SEQ ID NO:151的序列的20至23个连续核苷酸的序列，或(iii)基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的序列。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中
所述第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列；和/或
所述第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:136的序列中并且至少包括SEQ ID NO:137的序列的16至21个连续核苷酸的序列。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其还包括使所述样本与第三念珠菌特异性扩增寡聚体接触，
其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第二念珠菌属物种靶区域，并且所述第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的第三念珠菌特异性靶杂交序列。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列；
所述第二念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:74的残基3-22、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列；
所述第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列；和/或
所述第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
8.根据权利要求4、5和7中的任一项所述的方法，其还包括使所述样本与第三念珠菌特异性扩增寡聚体接触，
其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第二念珠菌属物种靶区域，并且所述第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含含有SEQ ID NO:34的核苷酸序列的第三念珠菌特异性靶杂交序列。
9.根据权利要求4、5和7中的任一项所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列组成；
所述第二念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成；
所述第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列组成；和/或
所述第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。
10.根据权利要求4、5、7和9中的任一项所述的方法，其还包括使所述样本与第三念珠菌特异性扩增寡聚体接触，
其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第二念珠菌属物种靶区域，并且所述第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成的第三念珠菌特异性靶杂交序列。
11.根据权利要求6或8所述的方法，其中所述第二念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQID NO:26的核苷酸序列。
12.根据权利要求6、8和10中的任一项所述的方法，其中所述第二念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:26的核苷酸序列组成。
13.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性扩增寡聚体和所述第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体中的至少一个是进一步包含位于相应靶杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述启动子序列具有SEQ ID NO:9的残基1-27的核苷酸序列。
16.根据权利要求13所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
17.根据权利要求1至16中的任一项所述的方法，其还包括在步骤(2)之前从所述样本中的其它组分纯化可能存在的任何念珠菌属物种靶核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述纯化步骤包括使所述样本与至少一种捕获探针寡聚体接触，所述捕获探针寡聚体包含与结合于固定化探针的序列或部分共价连接的靶杂交序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中使所述样本与第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体和第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，
其中所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第三念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一光滑念珠菌捕获探针靶杂交序列，并且
其中所述第一念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列中的每一个与结合于所述固定化探针的所述序列或部分共价连接。
20.根据权利要求19所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是(i)包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，或(ii)包含在SEQ IDNO:140的序列中并且至少包括SEQ ID NO:141的序列的15至25个连续核苷酸的序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:142的序列中并且至少包括SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的序列的16至27个连续核苷酸的序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其还包括使所述样本与第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，并且其中所述第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:140的序列中并且至少包括SEQ IDNO:141的序列的15至25个连续核苷酸的序列。
22.根据权利要求20所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:24的残基1-20或SEQ IDNO:66的残基1-17的核苷酸序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列。
23.根据权利要求20或22所述的方法，其还包括使所述样本与第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，其包含SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列。
24.根据权利要求20或22所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列由SEQ ID NO:24的残基1-20或SEQ IDNO:66的残基1-17的核苷酸序列组成；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列由SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列组成。
25.根据权利要求20、22和24中的任一项所述的方法，其还包括使所述样本与第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体接触，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含由SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列组成的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列。
26.根据权利要求21或23所述的方法，其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:24的残基1-20的核苷酸序列。
27.根据权利要求21、23和25中的任一项所述的方法，其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列由SEQ ID NO:24的残基1-20的核苷酸序列组成。
28.根据权利要求20、22和24中的任一项所述的方法，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:66的核苷酸序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:48的核苷酸序列。
29.根据权利要求21、23和25中的任一项所述的方法，其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列。
30.根据权利要求1至29中的任一项所述的方法，其中所述检测步骤(3)包括
使一种或多种扩增产物与和所述第一或第二念珠菌属物种靶区域特异性杂交的念珠菌特异性检测探针以及和所述第三念珠菌属物种靶区域特异性杂交的光滑念珠菌特异性检测探针接触，并且
检测任何靶杂交的念珠菌特异性和/或光滑念珠菌特异性检测探针的存在或不存在。
31.根据权利要求30所述的方法，其中
所述念珠菌特异性检测探针包含选自以下的念珠菌特异性检测探针靶杂交序列：
(A1)包含在SEQ ID NO:145的序列中并且至少包括SEQ ID NO:146的序列的18至22个连续核苷酸的序列，
(B1)(A1)的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
(C1)(A1)或(B1)的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针包含选自以下的光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列：
(A2)包含在SEQ ID NO:147的序列中并且至少包括SEQ ID NO:148的序列的17至23个连续核苷酸的序列，
(B2)基本上对应于SEQ ID NO:18的残基1-17序列的序列，
(C2)基本上对应于SEQ ID NO:21的残基1-20序列的序列，
(D2)(A2)-(C2)中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
(E2)(A2)-(D2)中的任一个的完全互补序列。
32.根据权利要求31所述的方法，其中
所述念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，
其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:45的残基1-23的序列，
SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，
前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中
所述念珠菌特异性检测探针靶杂交序列由选自以下的序列组成：
SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，
其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列由选自以下的序列组成：
SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:45的残基1-23的序列，
SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，
前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列。
34.根据权利要求31至33中的任一项所述的方法，其中
所述念珠菌特异性检测探针具有选自以下的序列：SEQ ID NO:27的序列，其DNA或RNA/DNA嵌合体，以及前述中的任一个的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列具有选自以下的序列：SEQ ID NO:60、SEQID NO:45、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21，前述中的任一个的DNA或RNA/DNA嵌合体，以及前述中的任一个的完全互补序列。
35.根据权利要求30至33中的任一项所述的方法，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包含标记。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述标记是化学发光标记或荧光标记。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述检测步骤(3)发生在扩增步骤(2)期间。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包含荧光标记和猝灭剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个是分子火炬、分子信标或TaqMan检测探针。
40.根据权利要求30至33中的任一项所述的方法，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的至少一个还包含非靶杂交序列。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个是分子火炬或分子信标。
42.根据权利要求1至41中的任一项所述的方法，其中步骤(2)的所述扩增反应是等温扩增反应。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述扩增反应是转录介导的扩增(TMA)反应。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述扩增反应是实时扩增反应。
45.一种用于确定样本中念珠菌属物种的存在或不存在的寡聚体组合，所述寡聚体组合包含：
第一扩增寡聚体组合和第二扩增寡聚体组合中的至少一种，其中
(a)所述第一扩增寡聚体组合包含用于扩增第一念珠菌属物种靶核酸区域或第二念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第一靶区域对应于从约第133或161位核苷酸至约第259位核苷酸的SEQ ID NO:129的区域并且所述第二区域对应于从约第202位核苷酸至约第308位核苷酸的SEQ ID NO:130的区域，并且其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二念珠菌特异性靶杂交序列；并且
(b)所述第二扩增寡聚体组合包含用于扩增第三念珠菌属物种靶核酸区域的第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体，其中所述第三靶区域对应于从约第355位核苷酸至约第554位核苷酸的SEQ ID NO:131的区域，并且其中所述第一和第二光滑念珠菌特异性扩增寡聚体分别包含第一和第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列。
46.根据权利要求45所述的寡聚体组合，其中所述寡聚体组合包含所述第一和第二扩增寡聚体组合。
47.根据权利要求46所述的寡聚体组合，其中所述寡聚体组合包含在同一反应混合物内的所述第一和第二扩增寡聚体组合。
48.根据权利要求45至47中的任一项所述的寡聚体组合，其中
第一念珠菌特异性靶杂交序列基本上对应于SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列；和/或
所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是(i)包含在SEQ ID NO:132的序列中并且至少包括SEQ ID NO:133的序列的15至24个连续核苷酸的序列，(ii)包含在SEQ ID NO:152的序列中并且至少包括SEQ ID NO:151的序列中的20至23个连续核苷酸的序列，或(iii)基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的序列。
49.根据权利要求47至48中的任一项所述的寡聚体组合，其中
所述第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列；和/或
所述第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:136的序列中并且至少包括SEQ ID NO:137的序列的16至21个连续核苷酸的序列。
50.根据权利要求48或49所述的寡聚体组合，其还包含第三念珠菌特异性扩增寡聚体，
其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第二念珠菌属物种靶区域，并且所述第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含基本上对应于SEQ ID NO:34的核苷酸序列的第三念珠菌特异性靶杂交序列。
51.根据权利要求48或49所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列；
所述第二念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:74的残基3-22或SEQ ID NO:34的核苷酸序列；
所述第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列；和/或
所述第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
52.根据权利要求48、49和51中的任一项所述的寡聚体组合，其还包含第三念珠菌特异性扩增寡聚体，
其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第二念珠菌属物种靶区域，并且所述第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含含有SEQ ID NO:34的核苷酸序列的第三念珠菌特异性靶杂交序列。
53.根据权利要求48、49和51中的任一项所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:9的残基28-46的核苷酸序列组成；
所述第二念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成；
所述第一光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:14的残基28-49的核苷酸序列组成；和/或
所述第二光滑念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。
54.根据权利要求48、49、51和53中的任一项所述的寡聚体组合，其还包含第三念珠菌特异性扩增寡聚体，
其中所述第一和第二念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第一念珠菌属物种靶核酸区域，并且所述第二念珠菌特异性靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:134的序列中并且至少包括SEQ ID NO:135的序列的15至24个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第一和第三念珠菌特异性扩增寡聚体是用于扩增所述第二念珠菌属物种靶区域，并且所述第三念珠菌特异性扩增寡聚体包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成的第三念珠菌特异性靶杂交序列。
55.根据权利要求50或52所述的寡聚体组合，其中所述第二念珠菌特异性靶杂交序列包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
56.根据权利要求50、52和54中的任一项所述的寡聚体组合，其中所述第二念珠菌特异性靶杂交序列由SEQ ID NO:26的核苷酸序列组成。
57.根据权利要求45至56中的任一项所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性扩增寡聚体和所述第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体中的至少一个是进一步包含位于相应靶杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。
58.根据权利要求57所述的寡聚体组合，其中所述启动子序列是T7启动子序列。
59.根据权利要求58所述的寡聚体组合，其中所述启动子序列具有SEQ ID NO:9的残基1-27的核苷酸序列。
60.根据权利要求59所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性扩增寡聚体具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
61.根据权利要求45至60中的任一项所述的寡聚体组合，其还包含至少一种捕获探针寡聚体，所述捕获探针寡聚体包含与结合于固定化探针的序列或部分共价连接的靶杂交序列。
62.根据权利要求61所述的寡聚体组合，其中所述寡聚体组合包含第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体和第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，
其中所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第三念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第一光滑念珠菌捕获探针靶杂交序列，并且
其中所述第一念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列中的每一个与结合于所述固定化探针的序列或部分共价连接。
63.根据权利要求62所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是(i)包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列或(ii)包含在SEQ ID NO:140的序列中并且至少包括SEQ ID NO:141的序列的15至25个连续核苷酸的序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:142的序列中并且至少包括SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的序列的16至27个连续核苷酸的序列。
64.根据权利要求63所述的寡聚体组合，其还包含第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，并且其中所述第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:140的序列中并且至少包括SEQ IDNO:141的序列的15至25个连续核苷酸的序列。
65.根据权利要求63所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:24的残基1-20或SEQ IDNO:66的残基1-17的核苷酸序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列。
66.根据权利要求63或65所述的寡聚体组合，其还包含第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶核酸内的靶序列特异性杂交的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列，其包含SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列。
67.根据权利要求63或65所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列由SEQ ID NO:24的残基1-20或SEQ IDNO:66的残基1-17的核苷酸序列组成；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列由SEQ ID NO:48的残基1-26的核苷酸序列组成。
68.根据权利要求63、65和67中的任一项所述的寡聚体组合，其还包含第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体，
其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列是包含在SEQ ID NO:138的序列中并且至少包括SEQ ID NO:139的序列的16至21个连续核苷酸的序列，并且
其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体包含由SEQ ID NO:66的残基1-17的核苷酸序列组成的第二念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列。
69.根据权利要求64或66所述的寡聚体组合，其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列包含SEQ ID NO:24的残基1-20的核苷酸序列。
70.根据权利要求64、66和68中的任一项所述的寡聚体组合，其中所述第一念珠菌特异性捕获探针靶杂交序列由SEQ ID NO:24的残基1-20的核苷酸序列组成。
71.根据权利要求63、65和67中的任一项所述的寡聚体组合，其中
所述第一念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:66的核苷酸序列；和/或
所述第一光滑念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:48的核苷酸序列。
72.根据权利要求64、66和68中的任一项所述的寡聚体组合，其中所述第二念珠菌特异性捕获探针寡聚体具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列。
73.根据权利要求45至72中的任一项所述的寡聚体组合，其还包含与所述第一或第二念珠菌属物种靶区域特异性杂交的念珠菌特异性检测探针和与所述第三念珠菌属物种靶区域特异性杂交的光滑念珠菌特异性检测探针。
74.根据权利要求73所述的寡聚体组合，其中
所述念珠菌特异性检测探针包含选自以下的念珠菌特异性检测探针靶杂交序列：
(A1)包含在SEQ ID NO:145的序列中并且至少包括SEQ ID NO:146的序列的18至22个连续核苷酸的序列，
(B1)(A1)的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
(C1)(A1)或(B1)的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针包含选自以下的光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列：
(A2)包含在SEQ ID NO:147的序列中并且至少包括SEQ ID NO:148的序列的17至23个连续核苷酸的序列，
(B2)基本上对应于SEQ ID NO:18的残基1-17序列的序列，
(C2)基本上对应于SEQ ID NO:21的残基1-20序列的序列，
(D2)(A2)-(C2)中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
(E2)(A2)-(D2)中的任一个的完全互补序列。
75.根据权利要求74所述的寡聚体组合，其中
所述念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，
其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:45的残基1-23的序列，
SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，
前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列。
76.根据权利要求74或75所述的寡聚体组合，其中
所述念珠菌特异性检测探针靶杂交序列由选自以下的序列组成：
SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，
其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列由选自以下的序列组成：
SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:45的残基1-23的序列，
SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，
前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列。
77.根据权利要求74至76中的任一项所述的寡聚体组合，其中
所述念珠菌特异性检测探针具有选自以下的序列：SEQ ID NO:27的序列，其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和前述中的任一个的完全互补序列；和/或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列具有选自以下的序列：SEQ ID NO:60、SEQID NO:45、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21，前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和前述中的任一个的完全互补序列。
78.根据权利要求73至76中的任一项所述的寡聚体组合，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包含标记。
79.根据权利要求78所述的寡聚体组合，其中所述标记是化学发光标记或荧光标记。
80.根据权利要求78所述的寡聚体组合，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个包含荧光标记和猝灭剂。
81.根据权利要求80所述的寡聚体组合，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个是分子火炬、分子信标或TaqMan检测探针。
82.根据权利要求73至76中的任一项所述的寡聚体组合，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的至少一个还包含非靶杂交序列。
83.根据权利要求82所述的寡聚体组合，其中所述念珠菌特异性和光滑念珠菌特异性检测探针中的每一个是分子火炬或分子信标。
84.一种用于检测念珠菌属物种靶核酸的检测探针，其中所述检测探针是
包含选自以下的念珠菌特异性检测探针靶杂交序列的念珠菌特异性检测探针：
(A1)包含在SEQ ID NO:145的序列中并且至少包括SEQ ID NO:146的序列的18至22个连续核苷酸的序列，
(B1)(A1)的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
(C1)(A1)或(B1)的完全互补序列，或
包含选自以下的光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列的光滑念珠菌特异性检测探针：
(A2)包含在SEQ ID NO:147的序列中并且至少包括SEQ ID NO:148的序列的17至23个连续核苷酸的序列，
(B2)基本上对应于SEQ ID NO:18的残基1-17序列的序列，
(C2)基本上对应于SEQ ID NO:21的残基1-20序列的序列，
(D2)(A2)-(C2)中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
(E2)(A2)-(D2)中的任一个的完全互补序列。
85.根据权利要求84所述的检测探针，其中
所述念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，
其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列，或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:45的残基1-23的序列，
SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，
前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列。
86.根据权利要求84或85所述的检测探针，其中
所述念珠菌特异性检测探针靶杂交序列由选自以下的序列组成：
SEQ ID NO:27的残基1-22的序列，
其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列，或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列由选自以下的序列组成：
SEQ ID NO:60的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:45的残基1-23的序列，
SEQ ID NO:18的残基1-17的序列，
SEQ ID NO:21的残基1-20的序列，
前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和
前述中的任一个的完全互补序列。
87.根据权利要求84至86中的任一项所述的检测探针，其中
所述念珠菌特异性检测探针具有选自以下的序列：SEQ ID NO:27的序列，其DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和前述中的任一个的完全互补序列，或
所述光滑念珠菌特异性检测探针靶杂交序列具有选自以下的序列：SEQ ID NO:60、SEQID NO:45、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21，前述中的任一个的DNA等效物或RNA/DNA嵌合体，和前述中的任一个的完全互补序列。
88.根据权利要求84至86中的任一项所述的检测探针，其中所述检测探针包含标记。
89.根据权利要求88所述的检测探针，其中所述标记是化学发光标记或荧光标记。
90.根据权利要求88所述的检测探针，其中所述检测探针包含荧光标记和猝灭剂。
91.根据权利要求90所述的检测探针，其中所述检测探针是分子火炬、分子信标或TaqMan检测探针。
92.根据权利要求84至86中的任一项所述的检测探针，其中所述检测探针还包含非靶杂交序列。
93.根据权利要求92所述的检测探针，其中所述检测探针是分子火炬或分子信标。
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