JP2010075203A - Candidaspp.の検出のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の配列により規定されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された2本鎖核酸。さらに他のいくつかの配列により定義されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された2本鎖核酸。「ALL−CAN−TET」およびその相補体として言及される配列から本質的になる単離された2本鎖核酸。
【選択図】なし
Description
本発明は、Candida属およびCandidaの異なる種ならびに他の微生物の検出および区別のための診断アッセイ、ならびにアッセイを行うための組成物およびキットに関する。
Candida albicansは、胃腸管の共生生物である。C.albicansおよびより少ない程度でいくつかの他の関連種は、免疫が傷つけられた宿主における日和見病原体としてますます重要である。未知の性周期を有する2型性2倍体酵母である、C.albicansは、免疫系がインタクトであるヒトの皮膚および粘膜組織から単離され得る内因性生物である。しかし、免疫系または内分泌系の混乱は、Candida種が共生状態から局所的または全身的のいずれかで組織を侵すことに変わる機会を生じ得る。この日和見の例は、HIV感染に関連して遭遇する口−食道または膣のカンジダ症である。
本発明は、高度に保存された機能的ドメインにより隣接されるITS2の非保存領域の使用による種同定に対する迅速なアプローチを提供する。属および他の関連生物の同定はまた、5.8S rRNA遺伝子の「属」特異的領域の検出により増強される。本発明者らが本明細書に記載の生物を選択的に回収することを可能にする、この遺伝子の領域を見出すことは驚くべきことであった。
他に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるような同じ意味を有する。Singletonら(1994)Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,John Wiley and Sons(New York);Walker(編)(1988)The Cambridge Dictionary of Science and Technology,The press syndicate of the University of Cambridge(New York);ならびにHaleおよびMarham(1991)The Harper Collins Dictionary of Biology Harper Perennial(New York)は全て、当業者に本発明において使用される用語のうちの多くの一般的な辞書を提供する。本明細書中に記載される方法および材料に類似したまたは等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、特定の好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
・項目1.以下の配列およびその相補体に対応するヌクレオチド配列から本質的になる、単離された二本鎖核酸:
・項目3.表1に提供された核酸配列のうちの一つに特異的にハイブリダイズする、単離された核酸。
・項目4.サンプル中のAspergillus sp.およびCandida sp.を検出するための方法であって、核酸ハイブリダイゼーションの条件下で当該サンプルを項目2に記載の単離された核酸に曝す工程、および次いでサンプルの核酸と項目2に記載の核酸との間のハイブリダイゼーション複合体について検出する工程を包含する、方法。
・項目5.Candida sp.の検出のためのキットであって、項目2に記載の核酸プローブ、および上記検出方法についての説明書を含む、キット。
・項目6.Aspergillus sp.がさらに検出される、項目5に記載のキット。
・項目7.上記キットが、配列番号5〜9からなる配列の群に規定されるヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも1つのプローブをさらに含む、項目5に記載のキット。
本発明は、配列番号5により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された2本鎖核酸を提供する。これは、C.albicans ITS2配列を含む。「単離された」は、天然に生じる生物において見出される他の核酸から分離されたことを意味する。核酸は、C.albicansに特異的なヌクレオチド配列を含む。「特異的な」は、C.albicansに由来する核酸との適切なポジティブハイブリダイゼーションの決定を妨げる他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。2本鎖核酸と「特異的にハイブリダイズする」プローブは、1本鎖形態の場合、2本の鎖のうちの1本にハイブリダイズする。
C.albicans: CAAACまたはTTCAAまたはCTTCA
C.parapsilosis:AAATTまたはCAAATまたはCAAAA
C.tropicalis: ATAACまたはTTCATまたはTCATA
C.glabrata: TAACTまたはTTAAGまたはAAGTT
C.krusei: ATTACまたはTCATAまたはCATAA。
本明細書に記載される生物のアッセイおよび検出のためのキットがさらに意図される。上記で述べられるこの方法に有用な試薬の組み合わせ、特に、任意のプローブまたはプライマーは、記載されたアッセイにおいてそれらを使用するための説明書を用いて、単一または共にのいずれかでパッケージされ得る。好ましいキットは、単一の試験アリコートを用いてアッセイを行うための、表1で述べられるプローブおよび説明書を含む。
Candida albicansおよび関連種のITS2領域のヌクレオチド配列分析
酵母株および維持
全てのCandida単離物は、以前に、同化(API)プロフィールおよび形態学により特徴付けられた(Van der WaltおよびYarrow,1984)。さらに、全てのC.albicansおよびC.parapsilosis単離物は、以前に、電気泳動的に核型分類され、そして別々の関連しない株を示すことが知られている(Laskerら、1989)。全ての単離物を増殖させ、そして酵母−ペプトン−デキストロース(YPD)培地(GuthrieおよびFink、1991)上で維持した。DNA抽出のために、37℃でYPD上で増殖された10mlの一晩培養物を1×TE緩衝液で2回洗浄し、そしてDNAを標準的な手順(Sambrookら、1989)により抽出した。PCR増幅の前に、DNAをEcoRI制限エンドヌクレアーゼ(New England Biolabs)で消化し、1.0%アガロースゲル上で電気泳動し、そして臭化エチジウム(EtBr)で染色して、濃度および純度を確認した。
Taqポリメラーゼ、緩衝液およびPCRのための条件は、1反応あたり100ngゲノムDNAを使用する、売り主(Perkin−Elmer/Cetus)により供給されたものであった。最初の適用のために、95℃、55℃、および72℃(1分間隔)の35サイクルに続いて、72℃での5分間の最終伸長を行った。以下の「ユニバーサル」ITSプライマーを使用し、この計算されたTmは以前に報告されている(Whiteら、1990):
ITS1 5’ TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’(配列番号1)
ITS3 5’ CCA TCG ATG AAG AAC GCA GC 3’(配列番号2)
ITS4 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’(配列番号3)
プライマーITS1は、18S核サブユニットにおける保存3’ドメインに対するものである。プライマーITS3は5.8Sサブユニットの末端から約25bpであり、そしてITS4は、核大rDNAの保存領域に対する逆プライマーである。さらに、21M13正プライマー配列(Messingら、1981)を、正方向および逆方向、それぞれにおける配列決定のためにプライマーITS1およびITS4に対して5’末端に付加し、そして以下の配列からなった:
5’ GTA AAA CGA CGG CCA G 3’(配列番号10)
ここでITS1およびITS4の末端5’Tは、18bpのアニーリング配列のうち17bpを作った。予備実験から、この配列の付加が得られるPCR産物の性質を変えなかったことが決定された。最初のPCR反応の水相をエタノール沈殿させ、乾燥し、そして8μlのTE緩衝液に再懸濁した。全量を、1.5%アガロース、1.0% NuSieveアガロースゲル(Lehmannら、1992)の単一ウェルにロードし、110Vで電気泳動し、そしてEtBrで染色した。適切なサイズの単一の非常に濃く染色したバンドを切除し、そしてDNAを、40℃、13000×gで30分間、Spin−X酢酸セルロースカラム(Coster, Inc.)において抽出した。次いで、DNAをエタノール沈殿させ、70%EtOHで2回洗浄し、手短に乾燥し、そして配列決定のためにH2Oに再懸濁した。自動化DNA配列決定(Smithら、1986)を、売り手(Applied Biosystems)により供給される条件を用いて、「Prism」ダイ−プライマージデオキシ配列決定反応(Sangerら、1977)と共に、Applied Biosystems Catalyst 800ワークステーションを用いて行った。沈殿させたDNAを乾燥し、そして6μlのホルムアミド/50mM EDTA(5:1)に再懸濁し、90℃で2分間変性し、そしてApplied Biosystems モデル373A DNA配列決定機にロードした。全てのDNAを正方向および逆方向の両方で配列決定し、そして複数の作業を、全ての種および所定の種内の大部分の株について行った。
5.8S配列アラインメントを、手動でおよびWisconsin大学Genetics Computer Group(GCG)パッケージ(Devereuxら、1984)からの「山積み(pileup)」プログラムを用いての両方で行った。ITSアラインメントを、GCG(NeedlemanおよびWunsch 1970)により実行されたように、NeedlemanおよびWunschアルゴリズムを用いて全ての可能な対様組み合せで行った。DNA節減(parsimony)およびブートストラップ分析を、マイクロ−ヴァックス(Digital Equip.Corp.)クラスター上で実行される、Felsenstein(Felsenstein 1982)の「Phylip」プログラムを用いて行った。系統樹を、包括的な選択(global option)を用いて、および他者集団として種々の異なる種を用いて構築した(Felsenstein 1985)。他の5.8S配列は以下の通りである:Neurospora crassa、Shizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiae、Pneumocystis carinii、Fusarium sambucium、Epichloe typhina、Cephalosporium acremonium、Lentinula edodes。
C.albicans、C.parapsilosis、C.tropicalis、C.glabrataおよびC.kruseiのITS2領域の配列は、配列番号5〜9として配列表に示される。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用による血液中のCandida albicans細胞からのDNAの検出
C.albicansの増殖
C.albicans 36B株を、25℃で48時間、Sabouraudのデキストロース寒天Emmons傾斜(slant)において増殖させた。細胞を、各傾斜を5mlの0.85%NaClで洗浄することにより採集し、1500×gで10分間遠心分離し、そして新鮮に収集されたウサギ血液または0.85%生理食塩水中に適切な濃度に再懸濁した。
成体雌ウサギ(ニュージーランドホワイト、Myrtle’s Rabbit Farm)からの血液を、中心耳動脈から、1単位の精製サポニン水溶液、8ml/Lポリプロピレングリコール、9.6g/L ポリアンエタノールスルホン酸ナトリウムおよび16g/L (Na)2EDTAを含むISOLATOR 10(登録商標)細菌チューブ(Wampole Laboratories,Cranbury,NJ);EDTAコートチューブ(Becton Dickinson,Rutherford,NJ);またはヘパリン化されたチューブ(Becton Dickinson)に収集した。次いで、C.albicans 36B株(Quebec Gynecological Institute,Montreal,Quebec)細胞を導入し、そしてサンプルを、3000×gで30分間遠心分離した。上清を除去し、そして等容量の脱イオン化水を添加して、残存血液細胞を溶解した。残存C.albicans細胞を0.85% NaClで洗浄し、そして1500×gで10分間の遠心分離によりペレット化した。ISOLATOR 10(登録商標)チューブは、血液からの生存能力のあるC.albicans細胞の回収のための他の血液収集系よりも優れていることがわかった(Jones,1990)。血液収集のためのISOLATOR 10(登録商標)チューブの使用は、カンジタDNAのPCR増幅をもたらしたが、EDTAコートまたはヘパリンコートされたチューブの使用はもたらさなかった。
ユニバーサル真菌プライマー対、ITS1および2またはITS3および4を、CDCcore facility.により合成し、そして天然のTaq DNAポリメラーゼ(250U、Perkin Elmer Cetus,Alameda,CA)を使用するGeneAmpR DNA増幅試薬キットを、ゲノムDNAのPCR増幅のために使用した(Saikiら、1988)。これらのプライマーは、全ての真菌およびいくつかの寄生体からDNAを増幅する。ITS1、ITS2、ITS3およびITS4プライマーの例を、それぞれ、配列番号1、4、2および3として配列表に示す。反応は以下からなる:53.5μlの2重に蒸留した滅菌水、10μlの10×反応緩衝液、16μlの等モル(1.25mM)量のdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの混合物、5μlの20μM ITS1または3、5μlの20μM ITS2または4、10μlの標的DNA、0.5μlのTaqポリメラーゼ、ならびに6μlの25mM MgCl2。サンプルを、DNA増幅の間の蒸発を最小にするために、サーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus)に置く前に鉱物油で重層した。サンプルを、95℃で5分間、サーマルサイクラーで最初に変性させた。これに続いて、以下の30サイクルを行った:95℃1分間の変性、50℃で2分間のアニーリング、および72℃で1.5分の伸長。最終伸長は、72℃にて5分間で生じた。
C.albicans 3307株のDNAを、ドットブロットのためのプローブとして使用した。プローブを作製するために、20ngのC.albicans 3307のゲノムDNAを、プライマー対としてITS1およびITS2またはITS3およびITS4を用いてPCR増幅した。次いで、PCR産物をアガロースゲルにおいて電気泳動し、そして得られたDNAバンドをゲルから切り出した。産物を、Thuringら(Thuringら、1975)の凍結−圧搾法によりゲルから抽出した。DNAプローブを、製造者の説明書に従って、非放射性DNA標識および検出キット(「Genius」キット、Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)からのジゴキシゲニン−dUTPと一晩インキュベートすることにより標識した。配列番号5〜9の核酸に由来する他の属または種特異的プローブもまた、この方法において使用され得る。
「ブースター」PCR増幅を、Ruanoら(Ruanoら、1989)の方法により行った。簡単には、上記で概説されたのと同じプロトコルを使用したが、PCR増幅の15サイクル後に、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、そして新鮮なプライマーを40μMの最終濃度まで添加した。次いで、サンプルを、さらなる15サイクルおよび最終伸長のためにサーマルサイクラーに戻した。血液に導入された細胞に由来するPCR産物の検出の感度レベルは、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルにより検出した場合、1mlあたり105個細胞から1mlあたり103個細胞に改善された。しかし、この系の特異性は、ネガティブコントロールがポジティブになったので不十分であった。
ISOQUICK(登録商標)キット単独を用いて生理食塩水から単離および精製されたC.albicans DNAと、ザイモリアーゼ+キットの使用により得られたものとの比較を行った。C.albicans細胞(107/ml食塩水)を、37℃または25℃のいずれかで溶解した。ザイモリアーゼとISOQUICK(登録商標)キットとの組み合わせ使用(25℃または37℃いずれかでの)は、キット単独と比較して精製DNAの増強した回収をもたらした。
ザイモリアーゼ+ISOQUICK(登録商標)キット法を使用して、血液中のC.albicansを検出し得るかどうかを決定するために、1mlあたり107個のC.albicans細胞を、上記のように、新鮮に収集されたウサギ血液に導入した。血液を以下のうちの1つに収集した:ISOLATOR 10(登録商標)細菌チューブ;EDTAコートチューブ、またはヘパリン化されたチューブ。増幅DNAを、ISOLATOR 10(登録商標)チューブのみに吸い出された血液に導入された細胞から調製されたサンプルにおいて検出した。血液がEDTAコートのみされたチューブまたはヘパリンコートのみされたチューブのいずれかに吸い出されたサンプルでは、DNAは検出されなかった。
C.albicans DNAの検出感度を改善する努力において、PCR産物の検出について、臭化エチジウム染色アガロースゲル法とドットブロットハイブリダイゼーション法との比較を行った。ドットブロット法は、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により検出された1mlあたり103個の細胞に対し、生理食塩水中1mlあたり101個の細胞の検出を可能にした。血液中に導入されたC.albicans細胞のPCR産物の検出感度は、ドットブロット法による1mlあたり101個の細胞対臭化エチジウム染色アガロースゲル検出の1mlあたり105個の細胞であった。上記のドットブロットに使用されたプローブは、C.albicans特異的であった。C.tropicalis DNAおよびヒト胎盤DNAは、ドットブロットにおいて反応せず、これはプローブの特異性を支持する。従って、本明細書中に教示される方法は、臨床サンプル(例えば、血液)においてCandida DNAを検出し得る。
ポリメラーゼ連鎖反応の使用による血液中のCandida spp.からのDNAの検出
Candida spp.の検出および同定は、特に、新たに出現する非albicans Candida感染の増加のために重要になってきている。本発明者らは、1つの反応チューブ中で3つまでのCandida spp.を検出するための真菌特異的PCRプライマーおよび種特異的DNAプローブを使用した(TaqManTM PCR,Perkin−Elmer Corp.,Foster City,CA)。rDNAの内部転写スペーサー領域に対するプローブを、3つの蛍光レポーター色素のうちの1つで標識した:FAM(6−カルボキシ−フルオレセイン)、TET(テトラクロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン)、またはHEX(ヘキサ−クロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン)。各色素は、特異的な標的DNAのPCR増幅の際に特徴的な波長を放射し、その結果3つまでのプローブがPCR反応中に同時に使用され得る。次いで、各プローブの異なるシグナルを、蛍光マイクロタイタープレートリーダーを使用することによりサーマルサイクリング直後に検出する。6つのプローブをこの研究において使用し:CA−FAM、CT−TETおよびCP−HEXを、それぞれ、C.albicans、C.tropicalis、およびC.parapsilosisの同時検出および同定のために1つのチューブに添加した。TG−FAMおよびCK−TETを、C.glabrataおよびC.krusei(蛍光耐性種)検出のために第2のチューブに添加した。Candida属プローブであるAllCAN−TETを第3のチューブに添加した。61のポジティブな血液培養ボトル(23のC.albicans、18のC.glabrata、6つのC.tropicalis、6つのC.krusei、5つのC.parapsilosis、および3つの混合真菌血症)から回収されたDNAを使用した。コントロールサンプルは、細菌(n=10)または他の真菌血症(n=3)の培養物、または増殖なしのボトル(n=10)を含んだ。TaqManTM PCRは、61の標本のうち57(93.4%)を検出し、そして正確に同定し、そして偽陽性結果を与えなかった。この方法は迅速であり、PCR後ハイブリダイゼーションおよびインキュベーション工程を排除する。これは、血液培養ボトルからのCandida種を検出および同定するのに感度が良くおよび特異的であり、より迅速な診断および薬物治療の適切な標的化を可能にする。
培養したBacT/Alert瓶(Organon Teknika Corporation, Durham, N.C.)からの81サンプルすべてを試験した。細菌血症または真菌血症に罹患していると疑われる患者由来の10ミリリットルの血液をベッドサイドで収集し、そして各5mlを直ちに好気性および嫌気性Bac/Alert瓶に接種した。接種した瓶をBacT/Alert装置中(Organon Teknika Corporation, Durham, N.C.)で1分あたり68サイクルの速度で連続的に振盪し、そして35℃で5日間、すなわち瓶がCO2の比色検出により陽性となるまで、インキュベートした。陽性の瓶からのアリコートをグラム染色し、そして継代培養した。グラム染色によりCandida spp.を含むことが証明された瓶を選択し、2mlのアリコートを取り出し、そして−30℃で保存した。研究の期間の間に、Candida spp.が24患者からの61培養瓶から単離された。
機械的破壊法を、使用した。200マイクロリットルのサンプルを、滅菌1.5ml遠沈管中の800μlのTXTE緩衝液(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0, 1% Triton X−100)に添加し、そして室温で10分間インキュベートした。溶解後、細胞残渣およびCandida出芽型分生子を、エッペンドルフ遠心分離器(Eppendorf model 5403, Germany)において14,000rpmで5分間遠心分離することによりペレット化した。1mlのTXTE緩衝液での遠心分離による3回の洗浄後、ペレットを300μlのTXTE緩衝液中に再懸濁し、そして200μlの0.5mmジルコニウムビーズ(Biospec Products, Bartlesville, OK)を含む2mlのスクリューキャップコニカル底チューブへ移した。15分間煮沸した後、混合物を機械的細胞破壊器(Mini−beadbeater, Biospec Products)中で20分間振盪させた。20秒間の遠心分離後、上清を、PCR増幅に使用するまで−20℃で保存した。
精製Candida DNA(C.albicans,C.tropicalis,C.parapsilosis,C.glabrata、およびC.krusei DNAを含む)(Fujitaら)を、各TaqMan(登録商標)PCRのためのテンプレート標準として用いた。これらのDNAならびに他のCandida種、Saccharomyces cervisiae, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, A.flavus, Penicillium marneffei, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa、およびヒト胎盤細胞株から精製されたDNAを以前に記載される従来の手段(Fujitaら)により得た。使用したすべての微生物株は、C.lusitaniae株およびC.pseudotropicalis株、WO696以外は、以前に記載されている。これらの株は、CDC菌類学委託研究室から得た。
プローブは、3つの利用可能な蛍光レポーター色素(FAM(6−カルボキシフルオレセイン)、TET(テトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン)、またはHEX(ヘキサクロロ−6−カルボキシフルオレセイン)の1つを用いて5’末端で標識されるオリゴヌクレオチドからなった。プローブはまた、3’末端および3’−ブロッキングホスフェート付近のリンカーアーム改変ヌクレオチドに結合した消光色素であるTAMRA(6−カルボキシテトラメチルローダミン)を含む。この研究で用いた6つのプローブを表1に列挙する:すべてのCandida spp.を検出するためのAll−CAN−TET、およびそれぞれC.albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis, C.glabrataおよびC.kruseiのDNAを検出するためのCA−FAM、CT−TET,CP−HEX,CG−FAMおよびCK−TET。
プライマーITS3およびITS4(Fujitaら)ならびに以前に公表されたPCRプロトコル(Fujitaら)の改変を、TaqMan(登録商標)蛍光標識プローブを用いてPCRを実施した。G+C成分に基づくと、CA、CG、CP、CK、およびCTプローブ(Fujitaら)の予測される融解温度(Tm)は、70℃、70℃、70℃、76℃、および72℃であった。さらに、すべてのCandida種を検出するためのプローブを、rDNAの5.8s領域から設計した(All−CANプローブ、Tm=80℃)。他方、ITS3およびITS4プライマーのTmは、62℃および58℃であった。ITSプライマーを用いるPCR増幅が蛍光標識Candidaプローブの存在下で実施されるので、プローブを、Tmがプライマー伸長を最適化し、そして1反応チューブ中で混合される場合に複数のプローブが同様の頻度で結合することを可能にするように再設計した。
PCRの後ただちに、または24時間以内(サンプルは暗冷蔵庫に保存した)のいずれかで、40μlの各PCR産物を、蛍光の検出のために設計された清潔な白色の96ウェルマイクロタイトレーションプレート(Perkin−Elmer)に移した。40μlのTE緩衝液(10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)を緩衝液ブランクとして使用した。プレートを、マイクロタイトレーションプレート読み取り付属品を用いてPerkin−Elmer LS 50B Luminescence Spectrometer上で読んだ。使用した励起波長は488nmであった。各レポーター色素についての発光波長は、以下の通りであった:FAM,518nm;TET,538nm;HEX,556nm。消光色素(TAMRA)についての発光波長は582nmであった。励起スリット幅は488nmであり、そして発光スリット幅は10nmであった。EXCEL互換マクロを用いる蛍光データ管理システムを、データ分析に使用した。
すべてのCandida spp.の検出のためのAll−CAN−TETプローブを用いるPCR
TaqMan(登録商標)データワークシートおよびマクロを用いて、各サンプルについてのΔRQを自動的に計算した。ΔRQは、TaqMan(登録商標)プローブ(RQ+)上の消光色素からの放出後のレポーター色素の発光強度比からインタクトなTaqMan(登録商標)プローブ(RQ−)上の消光レポーター色素の基底発光強度を引いた増分である。閾値RQを計算して、3連の連プレートなしのコントロールサンプルから得られる標準偏差を用いて統計的に高い信頼性のレベル(99%)を確実にする。本発明者らは、ポジティブ性についてのカットオフ値を、本研究で用いたすべてのネガティブコントロール(n=20)についての平均のΔRQから3SDを超える値に設定した。
本発明者らは、TaqMan(登録商標)PCRの結果の解釈のために多成分データプログラムを使用した。多成分データプログラムは、TaqMan(登録商標)3Allele−Genotype WorksheetまたはWPR(ウェルプレートリーダーソフトウェア)についての2レポーター多成分ワークシートのいずれかを使用した場合、「DNAなし」、テンプレート1(すなわち対立遺伝子1)、テンプレート2(対立遺伝子2)、またはテンプレート3(対立遺伝子3)として結果を示した。DNAなしの閾値を、ネガティブコントロールの平均(値=1.00)を2SD超える値から自動的に計算した。本発明者らは、DNAなし値を、1から各DNAなし値を減ずることにより、「DNA値」として標準化した。本発明者らは、DNA値についてのカットオフ値を、コントロール値についての平均を1SD超えるもの、および各プローブについてのカットオフ値を、TaqMan(登録商標)PCR反応におけるコントロール値についての平均を2SD超えるものとして、設定した。
各反応を2連または3連で実施した。1ナノグラムのC.albicansおよびC.glabrataのDNAを、各サンプルの実行についてのポジティブコントロールとして使用した。持ち越しを、アエロゾル耐性ピペットチップおよびDNAサンプル調整およびPCR調製のための別の研究室区域を用いて除去した。
TaqMan(登録商標) PCRの最適化
TaqMan(登録商標) PCRアッセイのために使用したプローブを、表1に示す。本発明者らは、MgCl2濃度、伸長時間、PCRサイクルの数、およびプローブ濃度の、ΔRQ値に対する効果を評価した。最適なマグネシウムイオン濃度を、95℃で30秒および58℃で90秒からなる40サイクルを用いて、2.5nM〜5.0nMの濃度を試験することによって決定した。3.5nMのMgCl2濃度を用いた場合、ΔRQは最も高かった(4.37±0.38, n=4; 3.33〜5.16の範囲)。このMgCl2濃度の範囲は、(RQ−)値(0.71〜0.84)を変化しなかった。
カンジダ血症を有する患者由来の61の臨床的サンプルのうち、58のサンプルは、単一のCandida spp.を含むことが証明された(表2)。相同のspp.に対するAll−CAN−TETプローブを用いた平均ΔRQ値は、以下の通りであった:C.albicans, 3.42±0.67 (範囲=1.15〜4.58);C.tropicalis, 1.92±1.34 (範囲=0.45〜3.48);C.parapsilosis, 1.78±1.48 (範囲=0.80〜4.22);C.glabrata, 2.81±1.24 (範囲=0.53〜4.66);およびC.krusei, 3.38±0.92 (範囲=1.87〜4.40)(表3)。C.glabrataおよびC.albicansの両方の混合培養物として同定された3つのサンプルを用いたAll−CAN−TETについてのΔRQ値は、それぞれ4.14、3.46、および3.58であった。
カンジダ血症を有する24人の患者の61の血液培養物由来のCandida spp.のPCR−EIA同定(Fujitaら)を、以下のように同定した:C.albicans (n=23)、C.glabrata (n=18)、C.parapsilosis (n=5)、C.tropicalis (n=6)、C.krusei (n=6)、ならびにC.albicansおよびC.glabrataに起因する混合したカンジダ血症(n=3)。All−CAN−TETプローブを用いるPCR「C」アッセイは、61のすべてのサンプル中のすべてのCandida sppを検出した。PCR「A」および「B」アッセイ結果は、単一のCandida spp.を含むと報告された58個のサンプルのうちの55個(23個のC.albicans、17個のC.glabrata、4個のC.parapsilosis、5個のC.tropicalis、および6個のC.krusei)についてのPCR−EIAに関するこれらのアッセイ結果と適合した。慣習的なPCRによって、およびPCR−EIAによって、混合カンジダ血症検体として同定された3つのサンプルのうちの2つはまた、C.glabrataおよびC.albicansの両方を含むとして同定されたが、1つの混合カンジダ血症は、PCR「A」および「B」アッセイによってC.glabrataのみとして同定された(C.albicansは検出されなかった)(表2)。
All−CAN−TETプローブは、すべてのCandida spp.、S. cerevisiae、A. fumigatus、およびA. flavusを検出したが、試験した他の真菌DNA、細菌DNA、またはヒトDNAは検出されなかった(表4)。精製したAspergillus spp., DNAをAll−CAN−TETプローブで検出したが、使用された機械的サンプル調製法は、インタクトな細胞からAspergillus DNAを放出しなかった。従って、異なるサンプル調製方法が、臨床的サンプルからAspergillus DNAを得るために使用される必要があり、そしてCandidaおよびS. cerevisiae DNAのみが、本明細書中で記載されるように処理された臨床的物質において検出されることが期待される。
本発明者らは、ウサギ血液を播種したBacT/Alert培養ボトル中に懸濁したC.albicans blastoconidiaを用いて、TaqMan(登録商標) PCR結果を、本発明者ら(Fujitaら)の実験室において開発したPCR−EIA法からの結果と比較した。C.albicans B311 blastoconidia株を、ウサギの全血を含む200μlのBacT/Alert血液培養ブロス(ブロス対ウサギ=8:1)当たり0、101、102、103、104、または105の濃度にて導入した。
Claims (4)
- 配列番号11〜16に対応するヌクレオチド配列またはその相補鎖からなる、単離された核酸。
- 検出可能な部分に付着した、請求項1に記載の単離された核酸。
- 前記検出可能な部分は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ジゴキシゲニン標識、またはビオチン−アビジン標識を含む、請求項2に記載の単離された核酸。
- 本明細書に記載される方法。
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BR9909826A (pt) * | 1998-04-21 | 2000-12-26 | Us Gov Health & Human Serv | Par de iniciadores de oligonucleotìdeos, oligonucleotìdeo, e, processo para detectar a presença de h. capsulatum em uma amostra |
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EP1818402A3 (en) * | 2001-05-31 | 2008-04-02 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Method of evaluating the function of phagocyte and utilization thereof |
WO2003027329A1 (en) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acids for the identification of fungi and methods for using the same |
WO2004029216A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Diagnosis of invasive mold infection |
JP2004290171A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-10-21 | Akira Hiraishi | 微生物の分子生物学的同定技術 |
AU2006233776A1 (en) | 2005-04-14 | 2006-10-19 | National University Of Ireland, Galway | A method for detecting C. albicans |
US20070082351A1 (en) * | 2005-09-20 | 2007-04-12 | Advandx, Inc. | Reagents, methods and kits for classification of fungi and direction of anti-fungal therapy |
AU2006294692B2 (en) * | 2005-09-27 | 2012-01-19 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Compositions and methods for the detection of candida species |
JP2007159411A (ja) * | 2005-12-09 | 2007-06-28 | Canon Inc | プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
US7659067B2 (en) * | 2006-02-16 | 2010-02-09 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The U.S. Environmental Protection Agency | Method for identification of medically relevant fungi |
RU2348695C2 (ru) | 2006-05-23 | 2009-03-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа |
GB0621864D0 (en) * | 2006-11-02 | 2006-12-13 | Univ Manchester | Assay for fungal infection |
JP5196858B2 (ja) * | 2007-05-14 | 2013-05-15 | キヤノン株式会社 | プローブセット、プローブ担体、検査方法及びdna検出用キット |
MX2010005111A (es) | 2007-11-16 | 2010-05-27 | Du Pont | Metodo para la deteccion y/o analisis de levaduras y moho en liquidos filtrables. |
EP2235214B1 (en) * | 2007-12-26 | 2014-07-09 | Gen Probe Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING CANDIDA ALBICANS NUCLEIC ACID |
MX352246B (es) * | 2009-03-18 | 2017-10-25 | Instituto Potosino De Investig Cientifica Y Tecnologica A C | Metodo in vitro para la deteccion de candida glabrata, kit de diagnostico y usos de los mismos. |
WO2011121288A2 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Myconostica Limited | Assays for candida glabrata |
CN102031289B (zh) * | 2010-08-18 | 2013-01-30 | 李国辉 | 一种检测近平滑念珠菌的dna探针、基因芯片及其应用 |
US9127321B2 (en) * | 2010-10-06 | 2015-09-08 | The Translational Genomics Research Institute | Method of detecting Coccidioides species |
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ATE122103T1 (de) * | 1988-03-28 | 1995-05-15 | Amoco Corp | Nachweis von eukaryotischen mikroorganismen. |
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JP2558420B2 (ja) * | 1992-10-23 | 1996-11-27 | 扶桑薬品工業株式会社 | 感染症診断用プローブ |
US5426027A (en) * | 1993-05-20 | 1995-06-20 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary | Nucleic acid probes and methods for detecting Candida DNA cells in blood |
US5763169A (en) | 1995-01-13 | 1998-06-09 | Chiron Diagnostics Corporation | Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021106618A (ja) * | 2016-01-04 | 2021-07-29 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | Candida種を検出するための方法及び組成物 |
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