TW260672B - - Google Patents

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Description

A6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（i ) 背景 本發明是有關D N A之擴大作用，且特別是利用連接 酶鏈反應（下文稱爲、lcr# )同時擴大多重標的序列 。本案爲共有且共審理之美國系列案N 〇 · 07/860 ，702 (於 1992 年 3 月 31 日立榷） 之部份績篇，該案已列爲本案參考文獻。 本案是有關和L C R有關之許多其他申請案，包括： 美國系列No . 131 ，936 (於1987年12月 1 1日立槽）目前審埋中；爲美國系列No . 720，739之編篇，立檔於1 9 9 1年6月2 5曰， 目前審理中：美國系列No . 470 ，674於1990 年1月2 0日立檔，目前放棄：及其部份績篇即美國系列 No . 634 ，771 ，立檔於1991年1月9日；目 前審理中。可注意到已發表的EP — A— 3 2 0 ，3 0 8 ，相當於美國系列No . 1 3 1 ，9 3 6，及已發表的 EP — A— 439 182 ，相當於美國系列號No . 6 3 4，7 7 1 ，均以其全文列爲本案參考。 L C R是用於對數擴大可偵測標的分子之方法。其中 涉及二對探針。第一或主要對可與標的序列的一股在近鄰 接位置處雜交，如此以和模板有關的方式連接在一起而形 成經重編的主要分子。第二對可與經重編的主要分子雜交 〇1_(〇1?由8&〇1(111&11等人於£?—八一 3 2 0 3 0 8 第 一個描述，之後許多文章提及此。如見Wall ace，E P-A - 3 3 6 7 3 1 » Orge 1 > W O 8 9 / 0 9 8 3 5 (請先W讀背面之注意事！？再¾寫本頁〕 .裝， 訂. 線. 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（220 X 297公釐） 82.3. 40,000 年月日:多乎83. ft— 補无 辦專利申請案中文說明書修正頁 民國83年6月修正
五、發明説明（ ） ；Richards» WO 8 9 / 1 2 6 9 6 ；及 Barany, Proc. (1991)。LCR 的一 9 0 / 0 1 0 6 9 USA 88： 189-193 GaP' LCR，述於 EP-A-.4 3 Segev,WO 9 1 不使用可形成 ;S e g e v，W 〇 Natl Acad S c i 個變化稱爲' 9 1 8 2 及 丨/ 0 1 0 6 9 ° 平齊端雙股之二對探 一至少有一個探針先包括有一個 雙股爲 ' 非平齊 該連
所生成之 連接酶之 合反應。 或額外的 基）_，在 連接酶催 一個探針 於' 鹼基序列 互補物， 之5 >端 了使L C 必須予以 錄酶，以 三磷酸完 第五探針 PC 適當受質 一個 '"經修飾的 鹼基殘基）於一 一般L C R條件 化之.融合反應， 末端及下一個探 缺口 "具 可生成經 或由其中 及另一探 R可擴大 、校正， 及與缺口 成。或者 互補之第 R或聚合 體實例 修飾之 生成的 針之3 標的， )0第 相對之 ，也可 六探針 酶鏈反 的；> 及 接酶催 端#具 基團上 下，可 ‘或者（ 針之間 中，自 末端， 聚核苷 /端之 探針間 一種方 標的股 補充與 針，而是 飾的#端 得所生成 '經修 /或使 化兩個探針雙股 有（1 ) 一個阻 (例如 强迫地 2 )轾 形成~ 一個以 於是當 酸）雜 間生成 之缺口 式，可 互補之 標的互 探針對之 ，其使得 的雙股非 之間的融 斷部份（ 或3 一羥 部份參與 基，其在 .5 —磷酸 令該阻斷 略去之驗 個 '"缺口，。 上探針中消去短的 其與標的（或標的 交時，可在一探針 —凹處或 必須塡滿 利用聚合 多量的去 補之第五 缺口。爲 (即修飾 酶或逆轉 氧核苷酸 探針及與 應是擴大D N A的一種不同的方 ^ ;'λ \k R. li ,¾ /1] t ΰ U 'i； Ιί ·ΙΜ0Ν8πΜ)«.Γμ210χ ι liA';Lwiin·而之;i.t.^-J/i扑5·.邛本 s 一 線
T60G72 A 6 _—___Π6 五、發明説明（° ) 法。其係應用雜交於雙'股標的相對股之二個引子。聚合酶 liA';LKIi»竹而之ii.t卞'?外螭艿本'® 一 利用標的爲模板，經由依序加入適當的互補核苷酸而啓動 . · 引力之伸展。PCR述於美國專利案4 ，8 8 3 ，1 9 5 及4 ，8 8 3 ，2 0 2中，其完全揭示已列爲本案參考。 P C R已使用於多樣方式，以決定單一反應中多重標 的序列之存在。EP — A— 3 6 4 2 5 5描述使用多重 引子組，以利用P C R同時擴大多重標的序列。類似的揭 示由 Chamber lain 等人述於 N—u cl. Acids Res., 16 :1141-56 (1988)。 線 此外，Nickerson, et al., proc Natl. Acad. Sci .USA, 87:8923-8927 (1990)提出一種寡核苷酸連接作用 分析‘（、OLA')以應用於多重標的序列，在發展出·、 多重、非同位素告知者基 '團’之前。〇 L A應用二個連在 一起之連續探針，且偵測所連接之產物，充作標的序列存 在與否之指示。 除了這些揭示之外’多重LC R尙未可公開。技藝中 並無充份之準則提供，可令多重L C R之槪念確實可行。 此主要是由於P C R條件無法應用於l c R之故。 發明要點 因此，吾等目前明示出以至多7個不同的探針組進行 多重L C R之可行性。於一方面，本發明是一種可同時在 二種以上標的序列上進行L C R擴大作用之方法。方法包 括以下步驟： a .提供反應溶液，其中含有呈單股核酸之樣品核酸 ^ -Λ ：!< K n 1¾ ill t fcv| VA 'i： 1¾ ilL I CNS I f 0«. |M 210 X '^97 ^ ^ ) <β〇072 Α6 Β6 經濟部中央標準局Η工消費合作社印*'< 五、發明説明（4 ) ，該樣品推想具有一個以上的大半檩的核酸序列： b .對每一推想的檩的序列，在反應溶液中準備至少 4個核酸探針（一種探針組），其中：i)該探針中第一 及第二爲主要探針，第三及第四爲其次的核酸探針；ii ) 第一探針爲單股，可與榇的核酸主要股的第一片段雜交： iii )第二探針爲單股，可與標的核酸主要股的第二片段雜 交；iv)標的主要股第一片段之5 /端，相對於標的主要 股的第二片段3 >端定位，而當該探針與標的核酸的主要 股雜交時，使得第一探針可與第二探針連接，由是形成具 有第一部份及第二部份之經重編的主要分子；v)第三探 針可與經重編的主要分子之第一部份雜交；及vi )第四探 針可與經重編的主要分子第二部份雜交，經重編的主要分 子之第一部份，相對於經重編之主要分子第二部份定位， 如此當第三及第四探針與該經重編之主要分子雜交時，使 第三探針與第四探針可相連接，由是形成一個經重編的次 要分子；且 其中針對推想的各標的序列，準備在一澳度下之探針 組，使得可在其他探針組各自存在下相連；且 c .重覆以下循環 i)該探針與樣品中之核酸雜交； ii )進行連接以形成經確認之分子：及 iii )將樣品中的核酸變性.： 由是以相繼循環，可針對反應溶液中存在的各推想的 標的序列，增加經重編的主要及次要分子之量。 (請先閲讀背面之注意事項再場窝本頁) 本纸張又度迺用中國國家標準（CNS) f 4规格（210 X 297公釐） 6 82.3. 40,000 A6 B6 60672 五、發明説明（5 ) 於一般例子中，連接可以連接酶、或連接酶及聚合酶 來進行。通常C步驟之循環重覆1 0至1 0 〇次，較好由 2 0至約6 0次。 一般而言，擴大作用產物之偵測可利用與各探針組有 關的獨特的可偵測標幟，各可偵測檩幟可與他者區別。檫 幟較好包括特異的結合成員，如半抗原或聚核苷酸。標概 可用於偵測、或分離或二者。於較佳構型中，探針組中各 自檫以二個不同的檩幟，如此經重編分子當雜交在一起時 ，檫以二個標幟，至少一個是獨特的標幟且另一個標幟爲 一般標幟，各探針組相同。 於一較佳策略中，一般的檫幟用於偵測，而獨特的檩 幟用於自至少另一探針組之經重編分子中分出一探針之經 重編分子。可利用在單一固相上不同的結合位置完成分離 ，或是利用其特徵在於可使互相區別之固相進行。 於第二方面，本發明是偵測許多標的核酸序列中各自 存在、不存在或含量之方法，此方法利用包括以下步驟之 多重連接酶鏈反應： a .準備反應溶液，其中含有呈單股核酸之樣品核酸 ，該樣品推想具有一個以上大半的標的核酸序列： b .對各推想的標的序列，於反應溶液中準備至少二 個且視所需4個核酸探針組（探針組），其中：i )該探 針的第一及第二爲主要探針，且視所需的第三及第四爲次 要的核酸探針；ii )第一探針是單股，可與檫的核酸主要 股的第一片段雜交；iii )第二探針是單股，可與標的核酸 本紙張尺度通用中國S家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公牙） ----------------Ί,-------裝------.ΤΓ-----!.« (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 82.3. 40,000 烴濟部中央標準局8工消費合作社印*'机 ^6〇G72 A6 ___ B6_ 五、發明説明（6 ) 主要股的第二片段雜交：iv )標的主要股第一片段的5 一 端，相對於標的主要股第二片段之3 /端定位，使得當探 針與檩的的核酸主要股雜交時第一探針可與第二探針連接 ，由是形成具有第一部份及第二部份之經重編的主要分子 ;v )第三探針可雜交至經重編的主要分子之第一部份： 及vi )第四探針可雜交至經重編的主要分子之第二部份， 經重編的主要分子第一部份相對於經重編主要分子之第二 部份定位，使得當第三及第四探針與該經重編之主要分子 雜交時，可連接第三探針至第四探針，由是形成經重編之 次要分子； 其中各探針組中至少一個探針含有一個可偵測的標峨 ，與各探針組相關聯之可偵測標幟可與和其他探針組有關 聯之可偵測組區別，由是決定出各推想的標的序列之存在 、不存在或含置；且 其中針對各推想之標的序列，準備一澳度之探針組， 使得在其他探針組各自存在下可連接；以及 c .進行以下循環： i )探針與樣品中之核酸雜交： ii )進行該連接以形成經重編之分子：及 iii )將樣品中之核酸變性； 由是以各循環，針對反應溶液中存在之各推想的標的 序列可增加經重編的主要及視所需的次要分子之含置；及 d .偵測與各探針相關之可偵測標幟，充作反應溶液 中標的核酸存在或含量之測度。 ---------------.'··,,--------裝------玎-----^ ^ (請先聞讀背面之注意事碩再場寫本頁) 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.3. 40,000 60672 A6 B6 經濟邾中央標準局"K工消費合作社印»|衣 五、發明説明（7) 在本發明此方面，上述之標的、分離及偵測之相同變 化也是有用的。_ 最後，本發明是有關免疫層析裝置及多重分析物複雜 偵測之方法。裝ff包括可經由毛細作用運送流髏之多孔材 質長條，該長條可令至少第一及第二獨特之捕獏試劑固化 在其上分開的第一及第二不連績點上，以與運送之流體接 觸，該獨特的第一及第二捕獏試劑分別與不同的第一及第 二分析物具特異性，其中第二個不連嫌點與第一個不連績 點在垂直及水平方向上均有距離，而垂直係指流體流動之 方向。較好，裝置含有三個以上不連績點，且各點互相在 垂直及水平方向均有空間，以形成點之實質上呈直線斜列 0 裝置之用法包括將接觸端與疑似含有分析物之試液接 觸其條件使得溶液可以毛細作用至少運送最遠的捕獲點； 並決定各捕獲點，是否分析物結合至該捕獲點。 方法及裝置可用於習知之特異結合分析物，如抗原及 抗體，以用於聚核苷酸分析物。 附圖說明 圖1示出用於多重LC R偵測中之免疫層析長條。 圖2 a及2 b示出於實例7病人樣品中進行的多重 L C R之免疫層析長條結果。 圖3示出在實例10病人樣品上進行多重LCR之免 疫層析長條結果。 ------------------------裝------.玎-----^.« (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本纸張尺及迺用中國國家標準（CNS) 4規格（210 X 297公釐） 82.3. 40,000 60672 A6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印*''衣 五、發明説明（8 ) 詳細說明 如本案中所用的，'多重'過程係指於同時進行方法 或過程，並於相同的反應容器中針對二個以上，通常是三 個以上不同的標的序列進行。因此，多重LCR是於許多 標的上利用針對各推想的檫的序列使用至少4個探針一組 來進行LCR。以類似方式，、N— plex*LCR， 其中N是數字，係指進行L C R以擴大或偵測一個以上之 N檫的序列。 '標的序列'或 '標的核酸'是核酸（DNA或 RNA)之片段。片段長度可由約10或15至數百個核 苷酸。於LCR，標的片段通常由約3 0至約6 0個核苷 酸，且序列是已知的。標的是'推想的'係指若其存在可 預期或預料，或若其或其變型是可預期或預料的。如，於 純接合體中欲決定二個相互獨特的內偶基因中何者存在之 多重LCR，圍繞在二個對偶基因之序列是推想的標的序 列，即使已知僅一者預期將存在。對各對偶基因而言，可 能的替代物也均是推想的標的。 如上所示之 '連接'包括將二探針連接的許多已知方 法。較佳的方法是使用耐熱的連接酶，然其他連接酶及連 接劑也不排除。連接酶述於EP — A— 3 2 0 3 0 8及 EP-A-3 7 3 9 6 2中，其也列爲本案參考。連接 也可以化學方法或以光連接作用完成。連接也包括'校正 #經修飾端之可能的中間步驟，如EP — A — ----------------------裝------，玎-----^ ^ (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度迺用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -10 82.3. 40,000 60672 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印3衣 五、發明説明（9 ) 4 3 9 1 8 2中所敎示的。校正包括以伸展之試劑（如 聚合酶）充塡缺口，以及解離阻斷基（如利用核酸內切酶 IV ) 〇 反應溶液之製備通常是自病人收集樣品，並瓦解細胞 以釋出DN A或RNA。可使用去污劑，但也可包括其他 製備樣品之已知方法。特殊的緩衝溶液組成可得自文獻及 實例。改變迫切條件，通常採加熱，可使DNA或RNA 呈單股。 用於多重L C R之探針通常與用於習知L C R的探針 無異。然而，各探針組中之可偵測標幟必須是均可區別的 ，利用訊號區別或利用空間區別。如下文將詳述的，訊號 TE別係指經由訊號上之差異（如不同的螢光發射波長或不 同顏色）區別基本上在相同位置（即均質分析）上之檩的 之能力。相反的，空間區別係指依據訊號之位置或所在區 別標的之能力。空間區別也稱之爲分離，且以大小、分子 量、電荷密度、或磁性或特異結合特性等完成。當然，在 相同系統中也可以且常企求可利用此二種區別方式。 當爲了闡明結果較好是分離時，較佳的具髗實例是使 用二種標幟：至少其一是獨特的或可區別的檫幟。另一檫 幟可爲共通的，且由各探針組共有，或也可爲獨特的。依 據所使用之特殊策略（見下文），共通的標幟或獨特的標 幟任一者均可用於偵測，且另一者用於分離。 所謂·^標幟#係指具有可偵測特性之分子或部份。標 幟可以是可直接測知的，如半抗原或多核苷酸尾部所用的 (請先閲讀背面之注意事項再埸寫本頁) 裝. 訂. 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.3. 40,000 260672 A6 B6 經濟邾中央標準局工消f合作社印製 五、發明説明（10) 。當以間接標幟用於偵測或產訊目的，其可配合產訊實體 複合物使用。、產訊實體#爲可提供可偵測特性之分子或 部份。產訊實«可以是直接的，如於膠態粒子（如膠態金 或硒）；或可爲間接的，如於酵索（如鐮性磷酸海，；5 — 半乳糖苷酸或萍菜過氧化酶）。間接的產訊實體需有額外 的組份、如受質，爲技藝中已知的*產訊實雔複合物"包 括一個產訊實體共轭至特異的結合配對上，如抗髋或多核 替酸。此種共軛物可依任何已知之共軛作用方法製備。 有用的標幟包括放射性同位素，尤其充作共通檫幟。 然而，也可以使用放射性同位素之獨特檫幟，當放射可區 別時。另外，螢光團及化學發光團較好是充作共通檫幟， 雖然可將之充作獨特標幟（當訊號是可區別時，如在波長 基準下）。半抗原、多核苷酸、或其他特異結合成員也可 充作一般標幟，即使將一特異結合成員自另一者中區別之 易使其理想上極適合充作獨特標幟。當應用不同的特異結 合成員時，依據下述方法之一可使用攜有不同的特異結合 配對之共軛物。 許多不同的半抗原是已知的，且在本發明中基本上可 使用任何半抗原。本發明僅需一特異結合配對是已知的， 或可製備的（'半抗原#之限定特性），且半抗原可偶合 至探針上，如此其將不致干擾雜交◊將半抗原加至探針的 許多方法是文獻中已知的。Enzo Biochemica丨（New Yor-k)及Clontech (Palo AltQ)均有描述，且有已上市之探 針標的技術，利用 3’-Amine-0N CPGTM (CUntech, Palo -----------------;-------裝------、玎-----f 球 (婧先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家揉準（CNS)甲4規格（210 X 297公;*·) 82.3. 40,000 ^60672 A6 B6 經濟部中央標準局8工消費合作社印奴 五、發明説明（Π) Alto, CA)可將一級胺粘附至3 >寡物端。類似地，利用 Arainoroodifier II ® ( Clontech)可將一級胺粘附至 5 一 寡物端。利用習知之活化及連接化學，胺類可與各種半抗 原反應。 此外，共審理中之申請案，U.S. Serial Nos. 625，566 (立檑於1990年12月II曰）及 630，908 (立檔於1990年12月20日），分 別敎示在其5/及3/端標記探針之方法。上二案均列爲 本案參考。某些可供示例之半抗原包括許多薬’物（如洋地 黃毒苷、茶鹸、芬西汀（PCP)、水楊酸等），T3、 生物素、螢光素（FITC)、丹黃醚、2，4 一二硝基 紛（DNP):及經修飾之核苷酸如溴尿嘧啶及納入Ν-乙醯基-7 —碘—芴基胺基（A I F)而修飾之鹼基；以 及其他許多。此中所述的某些半抗原揭示於共審理，共有 之專利案中：U.S. 07/808，508 (金剛烷醋 酸），U.S · 07/808，839 (昨唑及二苯並呋 喃類），二者均立檔於1991年12月17日，U.S .07/858,929 (吖啶），及U.S.07/ 858，820 (喹啉類），均立檔於1992年3月 2 7日（在此總稱爲％半抗原申請案，)。上述半抗原申 請案各自之完全揭示已列爲本案參考。 應了解（f巻捆ί大作用或偵測所需之探針數，通常爲 推想序列數目之4倍。於用於·"Ν 〃個不同細菌有機體之 分析例中，所需之探針數目爲4 ΧΝ。於突變作用之遺傳 -13 - 本纸張尺度迺用tSS家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公；* ) 82.3. 40,000 (請先閲f面之注意事項再填'窝本頁) 60672 A6 B6 經濟部中央標準局8工消费合作社印製
五、發明説明（12) 測試中，4 XT個探針之法則（其中T是假想標的之數目 )仍是一般或専常例。然而，以下描述某些例外。應牢記 在心的是，依據突變作用型式及複雜性，對各突變作用應 有數個推想之標的。如，一個單純、單一鹼基之β換作用 。若已知置換作用始終是某些式之鹸基，則可能的推想標 的序列有二：野生型及變置換作用。然而，若已知4鹸基 中任一者可在區域中置換，則推想的樓的序列有4個。一 般的法則在第一例中需8個（4 XT，Τ = 2〉探針；及 在第二例爲16個（4ΧΤ，Τ=4)。 4個探針用於各種推想標的之一般法則，不論突變型 式及複雜性均維持住。然而，於某些簡單的突變作用中， 得自一組中的二探針（任意地說，如右二），也可充作另 一組中之二（右）探針，且需少於4 XT個探針。這些單 純的突變作用包括任何小刪除、嵌入或置換，其末端係確 實已知的。只要末端是已知，刪除、嵌入或變化大小不會 影響其、單純"特性。以這些*單純|突變作用，所需之 探針數目是（2 T + 2 ) 。+ 2爲於突變作用一側之共通 探針組，而2 T代表突變作用可能的排列，即所有可能的 推想標的序列。當然，可能的排列數和突變作用本質有關 Ο 另一、特殊例子"，其中需少於於4T探針是可能的 ，此中基因之突變楢型爲如此，以致二個突變作用近的使 二突變作用間可使用一個共通探針，而在外側末端有特殊 化之探針。在本說明書內容中、足夠近〃表示可爲LCR 丨裝-------玎------½ (請先閲讀背面之注意事項再埃寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公笼） 14 82.3. 40,000 260672 A6 B6 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（13) 探針占據之距離內。典型而言，此距離爲約2 0至4 0個 鐮基。 L C R結果之閩明可包括觀察產生標的所需之循環數 ，乃可互相區別之背景曲線。對一定探針漢度而言，背景 訊號於η個循環後展現，而檫的訊號僅七個循環後展現。 爲使LCR可充作診斷工具，希望η遠大於t :即在標的 及背景間儘置可能有大的 '循環窗'。見如EP-A — 3 2 0 3 0 8。也示出訊號^發作'時之循環數隨探針 濃度而變化：探針濃度愈高，訊號發作愈快，且相反亦然 。因此頃發現較好小心地平衡多重L C R中探針之澳度。 由於所有反應以相同的循環數進行，因此所有的檫的訊號 必定在大約同時^發作'。爲確保此點可小心地平衡各探 針組之濃度，如此各反應在大約相同循環數下達到高峰或 至少可偵測之訊號水平。無法精確地預測如何調整一定探 針組之澳度，但經由簡單實驗可決定此點。 通常已知用於L C R之探針組之熔點溫度應大約相同 。然而，頃發現在多重LC R中，熔點由一側至他側可有 多至8至1 0°C之變化。 用於多重L C R之其他反應條件和較基本之L C R是 類似的。相同的緩衝溶液、p Η及鹽條件通常是可接受的 。然而，希望可加略高濃度之連接酶，如寅例中所述。此 外，若使用缺口充塡之L C R，則也希望有額外的聚合酶 Ο 如上所述，最佳的方法中包括二種標幟，一種共通檩 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂. -J'f 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)肀4规格（210 X 297公货） -15 82.3. 40,000 260672 A6 B6 經濟部中央標準居A工消费合作社印奴 五、發明説明（14) 峨及一種獨特擦幟。任一者可充作偵測標幟。爲簡化起見 ，此中所述之具雔實例以半抗原爲共通及獨特的標幟。當 然要了解，其他標幟可容易地取代至少一種半抗原，尤其 是共通半抗原。 依據一較佳的標準L C R方法，一個第一半抗原可用 來捕獲及分出經重編之分子。第二半抗原用於將經重編之 複合物與產訊實體偶合。此步驟在E P -A — 4 3 9 1 8 2中有更詳細完全之說明。例如，將g光素 部份粘附至第一¥要探針之5 >端及第一次要探針之3 一 端。此外，一個不同的半抗原、如生物素、可粘附至第二 主要探針之3 >端及第二次要探針之5 /端。因此，當經 重編之分子成二倍時，可在雙股之一端見二個生物素，及 另一端有二個螢光素。具有抗螢光素塗層之固相可用來分 別具有生物素之未連接探針中之經重編分子。（有螢光素 之未連接探針也被捕獏）。分離之複合物利用標記有可偵 測之產訊實體（如酵素）之抗生物素蛋白或抗一生物素可 測知。 於多重LCR中，此分離及偵測系統僅需略加修飾。 仍可使用在經重編分子一端爲所有探針共通之僅一種半抗 原（偵測或捕獲）。只有分子之另一端才需可區別，如經 由獨特之半抗原。有二種不同的方法是可行的。 首先，可使用共通的半抗原（如生物索）來捕獏所有 的經重編分子。之後使用特異半抗原及有可區別之產訊實 體之抗一半抗原共扼物，可瓸別不同的複合物。如（注意 (請先閲讀背面之注意事項再瑣寫本頁) Γ Λ a 本紙張尺度通用中國國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） _ 1Θ · 82.3. 40,000 ^60672 A6 B6 經濟部中央標準局8工消費合作社印焚 五、發明説明（15) 上述之方法及正確探針末端之考慮事情）標的A之探針可 標以生物素及螢光素；而標的B之探針可標以生物素及丹 黃醯：且檫的C之探針標以生物素及洋地黃毒苷。所有再 重編分子（及生物索化之探針）均捕獲於固相上。抗螢光 索偶合至膠態金，若標的A存在時可產生微紅棕色；抗一 丹黃醢偶合至膠態砸，若檫的B存在可產生粉紅色：且抗 -洋地黃毒苷偶合至多吡咯乳膠，若檫的C存在可產生黑 色◊另外，抗髏可偶合至不同酵素（如鹸性磷酸酶、過氧 化酶、-半乳糖苷酶），基受質或產物可產生不同顔色 Ο 由於在單一固相上有識別力之不同色是困難的，第二 及更佳之方法包括使用共通半抗原（檫幟爲偵測功能，及 使用獨特的半抗原以將在一個以上固相上之檩的與他者分 開。如，珠粒或微粒可物濕性分離（如經操作、過濾、層 析、沈降、離心、磁場等）可充作固相。這些固相之可分 離基團各以可拮抗獨特半抗原之一抗體塗覆。於多重 L C R及與固相培育後，分出基團且一個共通之產訊實體 複合物可與共通半抗原反應。藉著在一個以上不同的固相 上訊號之出現可決定不同的序列。 點一吸漬法可用於分出經重編分子。在片狀固相上不 連績位置固化許多獨特半抗原之抗體。此片段物與反應溶 液培育可分出經重編分子，此依抗體與獨特半抗原之特異 性爲基礎。同樣，共通半抗原與產訊實體共軛體合用，以 在含有經重編分子之任何所在產生訊號。固相依訊號位置 本纸張又度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公贫〉 -17 — 82.3. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) "60672 A6 B6 經濟部辛央標準局負工消費合作社印*'|衣 五、發明説明（16) (及視所褥之强度）加以解釋。 此技術之變化是應用免疫層析法，依據獨特的半抗原 爲基礎分離重編分子。並不將固相與反應溶液共培育，因 固相是一種多孔層析材質，故反應溶液由毛細作用經其而 芯結。較佳的多孔材質是硝化嫌維素。於採用點吸溃方法 時，各獨特半抗原之抗體固化在長條中各位懞上，較好是 沿著斜線，當攜有所有經重編分子之反應溶液遇到經固化 之抗體點時，帶有互補半抗原之重編分子被 '捕獲#並固 化在位置上。此技術是EP — A— 3 5 7 0 1 1所述技 術之變型，其完整揭示（且特別是和檫的核酸之免疫層析 偵測有關方面）列爲本案參考。以下實例說明此技術。 頃發現，當各種多核苷酸標的（或甚至有系統之分析 物）之捕獏點當以如圖1所示之斜線構型排列時，免疫層 析法運作極佳。有許多理由希望在二種方向上均有空間之 間隔。首先，垂直分離可用於使訊號與相鄰點有較佳之區 別。然而，若點僅在此方向有空間，則有可能使標幟累稹 在第一個陽性捕獲點上。此點下游之點被遮盖，且通常不 易發展成訊號。因此，最好點在水平方向也有空間。只在 水平方向有空間之點則需較寬之長條，以達成讀取長條所 需之解析。 又一變型方法是經重編分子可分離及/或爲序列特異 的探針雜交所偵測而非半抗原。以固相之可分離基，片狀 固相及層析介質可進行此變化法。僅有的差異是並不將獨 特的半抗原特異抗體固化在固相上，而是固化雜交探針， (請先閲讀背面之注意事項再堉寫本頁) 訂. 碌· 本紙張又度迺用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -18 - 82.3. 40,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印髮 £60672 A6 _________B6__ 五、發明説明（17) 一探針係與見於第一主要及/或第一次要探針之序列具特 異性（即：相同的探針，其攜有先前變型中之獨特半抗原 )°層析介質特異之雜交方法，進一步述於EP_A — 3 8 7 6 9 6中，其全部揭示（特別是有關分析物之免 疫層析偵測方面）列爲本案參考。 本發明之多重L C R方法，依據所應用之標的型式有 許多應用。首先，其可用於遺傳篩選或試驗。通常特殊的 遺傳疾病或特質顯現本身是基因體中一個或一定數目位置 上遺傅密碼之突變或變化。某些疾病或狀況（如鐮刀型貧 血、苯丙酮酸尿症、泰薩氏幼年型黑朦白痴病、中鏈醯基 C ο A去氫酶缺乏症、織維性囊腫）本身是DNA中單一 鹸基之點突變。其他（如織維性囊腫、Duchene’s肌肉營 養不良（DMD)，本身是表現子位置上一個或極少數之 短變化或刪除。進行多重L C R之能力，可同時進行個體 DN A在各表現子上之分析，而此中之刪除/變化係已知 爲某特定疾病之病因所在。 多重L C R之另一用途在於某些細菌或病毒疾病之診 斷，其通常由感染性有機體或病毒許多變型株中發生。如 ，人類乳頭狀病毒（HPV) 6、8、1 1、1 6、1 8 、3 1及3 3型已知均存在。全通或固有之探針及引子可 擴大所有的HPV，並不論其型式。然而，僅有1 6、 1 8型及可能的3 3型有重要的臨床意義，此因其與潰性 傷害有關。因此，多重L C R分析可使各變型同時進行型 式特異之擴大作用。此可提供醫師額外的資料，係由單純 -19 - 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 82.3. 40,000 ------------:----------裝------·玎------i.^· (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 經濟部中央標準局s工消費合作社印3< 260672 A6 ___________B6___ 五、發明説明（18) 的全適擴大作用或一種型式之單純型式特異擴大作用中無 法得知的。此途徑也對Η I V有用，其具有至少二個已知 型式，砂眼衣原II有至少1 5個血清亞型故也適用。 當僅單一有機體是引人興趣時，進行多重L C R也是 有用的。如，爲證實或改進特異性可排出多重標的序列。 如，來自ΜΟΜΡ基因及潛隱質髅之序列可選出以偵測砂 眼衣原體DNA。另外，也應包括有內部對照組，如可納 入可擴大々-球蛋白序列之探針，及可擴大欲求標的之探 針。 多重L C R的另一用途是在本質之測試。選出一列 1 0個以上之序列，其在一般族群中爲高度變化。經由決 定這些序列各自之存在或不存在，個體可因各特殊表現子 序列之存在或不存在獨特型式而1定型'。於一個二體型 式中，個體被鑑定爲'^0111001001#而個體'Β" 是’oooomoii"，其中·表示特殊表現子序列不存 在，而·表示特殊表現子序列存在。 其他用法對精藝者而言應是顯而易見的。 實例 本發明參考以下實例可更完全了解，其僅供說明不欲 限制本發明。於實例中，以下縮寫有一定義意。 • B S A係指牛血清白蛋白 •EPPS係指N - (2 —羥乙基）六氫吡阱—N 一 一（3 —丙烷磺酸）之緩衝溶液 本纸張尺度適用中國a家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） -20 _ 82.3. 40,000 (請先W讀背面之注意事項再塡寫本頁) --裝· 訂. 埭. A6 B6 經濟部中央標準局BK工消費合作社印製 五、發明説明（19) • NAD係指菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸，爲某些生物 反應之來源 •pC R係指聚合酶鏈反應 • TR I S係指參（羥甲基）胺基甲烷緩衝溶液 • TTP係指胸苷三磷酸，爲聚合酶的受質之一。 • Abbott Test Pack Plus™^ Abbott Laboratory之 商標，用來命名層析或芯給型式之免疫分析。 此分析模式進一步詳述於EP—A— 421 294，及 EP-A-357 011 ，以及其他文獻中。 實例1:寡物之合成半抗原化作用 A —序列及分析： 依循已發表之步驟，利用/?-氰基乙基亞碑酸醢胺醋 於 3 8 0 A 型 DNA 合成儀（Applied Biosystems, Fos-ter City CA)上合成以下寡核苷酸（見表1 )，其中x =衍自 3 ' — Amine-〇N CPGTM(CUntech，Palo Alto, CA)之一級胺，y =衍自 Aminomodifier II ® 之一級胺（ Clontech) ，p=衍自 Phosphate-〇N® 之碟酸（Clonte-ch)，且A、C、G及T有其通常之意義。探以5 /至 3 /自左至右寫出。針對探針對所示之熔點如下：第—及 第二雜交，及第三及第四雜交。 ---------------^----------裝------，玎------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297 ;釐） -21 - 82.3. 40,000 re〇G72 A6 B6 明 説 明 發 、 五 表 1 經濟部中央標準局0K工消費合作社印製
序列I D 序 列 熔點 DMD表現子 編號 (°C) 編號 1. 2. yCACTGCGGGT TTTGCAGAAC AATAA pATTGTTCTGC AAAACCCGCA GT-睡吩唑 4 3. pGTAAGTAGTA CCCTGGACAA GGTx 4. yGACCTTGTCC AGGGTACTAC TTACA 5. 6. CAAGTTTTGC CTCAACAAGT GAGCA pGCTCACTTGT TGAGGCAAAA CTT-丹黃醯 8 7. 8. pGAAGCCATCC AGGAAGTGGA AAx yATTTCCACTT CCTGGATGGC TTCAA 9. yTACATCCTTC TCAATGTCCA ATAGA 10. pCTATTGGACA TTGAGAAGGA TGT-_ 12 11. pGCCCCCAAAT GCGAACATTC CATx 12. yTATGGAATGT TCGCATTTGG GGGCA 13. yACAGGCTGTC ACCACCACTC AGCCA 14. pGGCTGAGTGG TGGTGACAGC CTA-_ 74。 17 15. pCACTAACACA GACAACTGTA ATGx 16. yCCATTACAGT TGTCTGTGTT AGTGA 66。 17. yCGTGATAAGC TGACAGAGTG AAACA 18. pGTTTCACTCT GTCAGCTTAT CACG-二苯並呋喃 69。 19 19. pGTTAAGGCTT GAAAGGGCAA GTAGx 20. yCTACTTGCCC TTTCAAGCCT TAACA 68。 21. yTTTTACCTGC AGGCGATTTG ACAGA 22. pCTGTCAAATC GCCTGCAGGT AAAx - ； 44 23. pCTGTTGAGAA ATGGCGGCGT TTTx 24. yGAAAACGCCG CCATTTCTCA ACAGA 25. yTTGAATGCAA CTGGGGAAGA AATAA 26. pATTTCTTCCC CAGTTGCATT CA-丹黃醯 66。 45 27. pCAGCAATCCT CAAAAACAGA TGAx 28. yGCATCTGTTT TTGAGGATTG CTGAA 67。 29, yAAGACCTTGA AGAGCAGTTA AATCA 30. pGATTTAACTG CTCTTCAAGG TCT-睡吩昨唑 48 31. pCTGCTGCTGT GGTTATCTCC TATx 32. yAATAGGAGAT AACCACAGCA GCAGA 33. yCAAGTTATAA AATCACAGAG GGTGA 34. pCACCCTCTGT GATTTTATAA CTTx 65。 51 35. pGGTGGGTGAC CTTGAGGATA TCAx 36. yTTGATATCCT CAAGGTCACC CACCA 70。 37. 吖啶-CCTGTGGGGC AAGGTGAACG TGGA 38. pCCACGTTCAC CTTGCCCCAC AG-吖啶 人類万球 39. pGAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGx 蛋白基因 40. yCCCAGGGCCT CACCACCAAC TTCA (請先閲讀背面之注意事項再項·罵本頁) 丨裝· .11. 7線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公發） 82.3. 40,000 -22 - 260672 A6 B6 五、發明説明（21)
Oligo 1-4和Duchenne肌肉營養不良症（DMD )基 因之第4號表現子一部份具特異性，編號體系依Koenig Μ , Μ ο n a c 〇 A P，及 K u n k e 1，L Μ .在 T h e c 〇 m p 1 e t e s e q u e n c e of dystrophin predicts a rod shaped cytoskeletal protein. Cell 53 , 2 1 9 - 2 2 8 ( 1 9 8 8 )所述。依據相同之編 號II系，Oligo 5 — 8和DMD基因第8號表現子一部份 具特異性；Oligo 9 — 12和DMD基因第12號表現子 —部份具特異性；Oligo 13 — 16和DMD基因第17 號表現子一部份具特異性；OligQ 1 7 — 2 0和DMD基 因第19號表現子一部份具特異性：〇lig〇 2 1 — 2 4和 DMD基因第4 4號表現子一部份具特異性；Oligo 2 5 _ 2 8和DMD基因第4 5號表現子一部份具特異性：0-118〇 2 9 — 3 2和01^0基因第4 8號表現子一部份具 特異性；Oligo 3 3 — 3 6和DMD基因第5 1號表現子 一部份具特異性。Oligo 3 7 — 4 0和人類/9 —球蛋白基 因一部份具特異性，且均充作對照組。 /?—半抗原化作用 經濟部中央標準局8工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 某些寡核苷酸之3 >端與半抗原共軛，如表1所示。 這些半抗原依循標準的/5 -氰乙基亞磷酸醯胺酯化學共軛 ，且述於先前提及之半抗原申請案中。有關螢光標幟共軛 物顯似的步驟述於已發表之美國專利案NTIS ORDER No. PAT-APPL-7-246,688) (Cohen, et al.，1989)中。所用 之半抗原之結構示於下表2中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公¢) -23 - 82.3. 40,000 ^60672 A6 B6
(請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 丹黃醯 N·
〇.連接子 裝 訂 0 二苯並呋喃
〇·-^連接子 球 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 螢光素
本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） _ 82.3. 40,000 260672 A6 B6 五、發明説明（23) 喹啉 op 〇 = S=0 L連接子 瞎吩昨唑 -------^*0,連接子 o=s=o 6 (請先閲讀背面之注意事項再埃寫本頁) 裝· 訂_ 琛_ 經濟部中央標準局貞工消费合作社印髮 所有寡核苷酸均以逆相HP L C純化，以移去失敗序 列，且於半抗原化寡物之例子中則移去任何未抗原化者。 實例2 :生物素化作用 實例 1 中，3、4、7、8、11、12、15、 16>19'20'23'24'27'28'31' 3 2、3 5、3 6、3 9及4 0寡物之胺化端標以生物素 ，此基本上依循 Urdea, et al.，Nucl. Acids Res., 16( 本紙張尺度適用中國圉家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公:¢) 25 - 82.3. 40,000 經濟部中央標準居貝工消費合作社印製 ^60672 A6 B6 五、發明説明（24) 11):4937-4956 (1988)之方法進行。簡言之，多達1毫克 之寡物溶於1 〇 0微升之〇 . 1M磷酸鈉緩衝溶液中， PH7 . 5，並以2毫克生物素—（胺基己醣基）一 2 — N_羥基琥珀醯亞胺酯於1 〇 〇微升二甲替甲醯胺（ DMF)中，在室溫下處理16小時。 合成後，0 1 igo 22 (3 端）及33 (5 端）連 接至螢光素，係溶解多達1毫克寡物於1 0 0微升0 . 1 Μ硼酸鈉緩衝溶液，PH9 · 0中，再以2毫克螢光素異 硫氰酸酯（FITC)在室溫下處理1 5小時。另外， 0 1 igo 3 4之3 >胺化端可與F ITC反應，而非半抗原 之 01 i go 3 3。 所有標以生物素及螢光素之寡核替酸均以Sephadex® G — 2 5 ( Pharmacia, Piscataway NJ)管柱層析、製備 式凝膠電泳、及乙醇沈澱純化。 基於品管目的，進行LC R後經重編分子之原樣，於 1 Mx ®儀器上（Abbott Labs)進行追踪，利用典型的 生物素/螢光素雙重半抗原化之複合物進行，如EP-A - 4 3 9 1 8 2中所敎示的。基於此，以5 — —級胺合 成 Oligo 1、9、13、17、21、25及29。這些 寡物部份與螢光素反應（如上述）以提供IMx分析所需 之生物素/螢光素複合物，然而，當用於多重L C R中， 則使用未半抗原化、胺化之寡物。 實例3 : L C R反應條件 -裝------ΤΓ------ ^ (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 本纸張尺及迺用中國國家律準（CNS)甲4规格（210 X 297公梦） -26 - 82.3. 40,000 C60G78 A6 B6 五、發明説明（25) 於、缺口充塡'之經修飾LCR中，使用呈各種組合 之實例2經標記之寡物，基本上如EP—A — 4 3 9 1 8 2所述。一般而言，以下試劑混合於0 . 5 毫升聚丙烯管中。 試 劑 水 反應緩衝溶液 寡核苷酸 NAD T T P 樣品 碛油 終澳度 (至最終45微升） 15mM FPPS, pH 7.8 20inM KC1 30mM MgCl2 見表3 0 . IraM 1 μ M 250毫微克D N A 2滴/管 混合物在1 〇 下加熱3分鐘、冷卻’並加入下列 置5微升體積中，生成5 0微升之最終反應體稹： --------------------------裝------ΤΓ-----J 漆 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 經濟部中央標準局具工消費合作社印製
Ml__Μ_ D Ν Α連接酶 來自嗜熱棲熱菌 D Ν A聚合酶 來自嗜熱棲熱菌 (MBR Inc . Mi lwaukee Wl) 费終濃度 3 4 00單位/ 50微升 1 . 2單位/ 50微升 本纸張又度通用中國國家螵準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 27 - 82.3. 40,000 ^60672 A6 B6 五、發明説明（26) 混合物接受預定的溫度變化共3 7個循環，循環爲 8 5°C3 0秒及4 5°C、2 0秒。熱循環於Temp CyclerTM 中進行（Coy Laboratory Product, Ann Arbor MI ) ° 表 3 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 所偵測之 表現子 使用之 寡物 每個反應管中（50微升） 各寡物之分子數 裝 表現子4 表現子8 表現子1 表現子1 表現子1 表現子4 表現子4 1 - 5 — 1 7 1 13 — 16 17-20 2 1-24 5X1 7X1 8X1 7X1 7X1 8X1 8X1 訂 線 4 8 經濟部中央標準局S工消費合作社印¾ 白蛋子子球 現現 I 表表 θ 5 9 2 3 7 3 3 2 6 3 3 o 4 3 3 X X 1 8
1 1 o IX o o IX X 7 7 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐〉 82.3. 40,000 260672 A6 B6 五、發明説明（27) 抗原及牛血清白蛋白（BSA)或鍮孔嘁血藍（KLH) 之共軛物。血清之製備及說明，述於上文之半抗原申請案 中，然生成抗髋之已知步驟已足夠。這些血清通過蛋白質 A Sepharose® ( Pharmacia)而純化。 拮抗丹黃醯之抗血清爲老鼠單株抗體，得自賓州大學 (Fan, S-T.及Karush， F. Molecular Immunology 21: 1023-1029 (1984)) ° 抗血清稀釋於0.1M TRIS pH7.8， 0.9% NaC5，0.1%BSA，l%蔗糖、及痕 量之酚紅中。此經稀釋抗血清取一部份（〇 . 2微升）以 規則方式（見圚1 )點在約4 X 5 0毫米大小之硝化織維 長條上（Schleicher and Schuell AE 9 8 ’ 5 微升）’ 抗血清之澳度如表4所示。 表 4 (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 經濟部中央標準局®:工消費合作社印製 抗血清拮抗 浪度（毫克/毫升） 吖啶 2.55 丹黃醯 0 . 5 二苯並呋喃 3 . 4 螢光素 0.5 喹啉 0 .75 睡吩昨唑 0.25 本纸張尺度逯用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -29 - 82.3. 40,000 260672 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印5衣 五 '發明説明（28) 例5 :標幟共軛物 依循 Yost, D.A. et a 1.(美國專利案 4,954,452 ( ^90 ))之方法製備膠態硒。膠體稀釋於水中以達到 5 4 5毫微米下光密度1 6 °對1毫升此懸浮液，加入1 微升抗生物素（Abbott Laboratories) ，1毫克/奄升 ’及6 0微升BSA，1 0毫克/毫升。此混合物於渦旋 合器中混合1分鐘。 實例6 :多重免疫層析 實例3之L C R反應混合物，以Abbott Test Pack PUsTM免疫層析分析，基本上依循EP — A- 3 5 7 0 1 1之方法。簡言之，實例5之膠態懸浮液（ 15微升）以緩衝溶液（14微升；0.1M TRIS PH7 . 8 ，0 · 9%NaCJ?，3%經鹸處理之酪蛋白 )稀釋，再與LCR反應產物（1微升）混合。實例4之 硝化纖維長條置於懸浮液中。5分鏟後完成層析過程，且 硝化纖維長條自反應/膠態懸浮液中移去，再乾燥。在抗 體施加處有色點之出現可顯示有特異L C R產物存在。 實例7 :病人樣品進行MDM分析 來自DMD患者之人類DNA樣品，利用〇|lgo 1 — 4 及 9 — 36 ’ 分析 4、12、17、19、44、45 、4 8及5 1表現子之存在與否。在反應混合物中納入 0 1 igo 3 7 — 4 0充作步驟中之對照組，以偵測人類 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -30 - 82.3. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再f本頁) .裝. 訂· 4琛. 260672 A6 B6 五、發明説明（29) DNA之存在。各樣品之分析分二部份進行：於一反應管 中爲實例3之混合物，含有〇丨ig0 1 3 — 2 8及3 3 _ 40 (以擴大17、19、45、48及51表現子，力口 上人類々一球蛋白）：於另一管中則是LCR反應混合物 ，含有 Oligo l — 4，9 — 1 2，2 9 — 3 2 及 3 7 — 4 0 (以擴大4、1 2、及4 4表現子，加上人類球 蛋白）。分析之進行係將樣品DNA接受實例3之LCR ，生成之混合物再依循實例6進行免疫層析。 經濟部中央標準局S工消費合作社印5*- (請先閲讀背面之注意事嗦再塡寫本頁) 裝- -Λ 琢- 圖2中示出免疫層析後之硝化織維長條照片◊圖2 a 之照片示出7個硝化纖維長條。此中示出存在有和人類冷 —球蛋白及DMD表現子1 7、4 5、4 8、5 1及1 9 (由底至頂之點）特異之擴大產物。樣品含有2 5 0毫微 克DNA，分別來自（由左至右）：鮭魚精子DNA; 5 個分別的DMD患者（病人編號示於照片中），及正常人 類DNA。類似地，圖2 b之照片示出5個硝化纖維膜長 條。此中示出存在有和人類；5 —球蛋白、及DMD表現子 1 2、4及4 4 (由底至頂之點）特異之擴大產物。樣品 含有2 5 0毫微克DNA，分別來自（由左至右）：鮭魚 精子DNA ; 3個分別的DMD患者（病人編號未示於此 照片中一由左至右爲5 2 9 4 、4 0 3 6及6 3 8號患者 )，及正常人類DNA)。 各病人失去之表現子由PC R中得知（見表5 ) 本纸張又度迺用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -31 - 82.3. 40,000 A6 B6 五、發明説明（30) 表 5 病人編號 所删除之表現子（以P C R 其餘則均被擴大 4722 17 , 19 , 45 , 48及 51 (44未試驗） 5294 4,12,17及 19 5303 45 5 396 51 638 4,12,17,19,44及 45 4 0 36 12,44(17,19，45，48及 51 未試驗） 260672 (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) .裝. 經濟部中央標準居8工消费合作社印製 實例8 :合成寡物應用於織維囊腫 依循已發表之步驟合成以下寡核苷酸（見表6)，利 用万―齦基乙基亞磷酸醯胺酯，於3 8 0A型DNA合成 儀上進行（Applied Biosystems, Foster City CA)，其 中p =衍自Phosphate-ON® (Clontech)之磷酸，生物素 利用BiotiIl-ON®(Clontech)引入，且A、T、C、G 有其常規定義。探針以5 β至3 >由左至右寫出。半抗原 化作用如寅例1所述進行。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -32 - 82.3. 40,000 260672 A6 B6 五、發明説明（31) 表 6 經濟部中央標準局w工消費合作社印¾
序列I D 序 列 C F突變 編號 作用 41. 丹黃醯-GTGGAATCAC ACTGAGTGGA GA G551D 42. pTCTCCACTCA GTGTGATTCC AC 43. pTCAACGAGCA AGAATTTCTT T-生物素 44. 生物素-AAAGAAATTC TTGCTCGTTG A 45. 生物素-ATTCAATAAC TTTGCAACAG TG W1282X 46. pCACTGTTGCA AAGTTATTGA AT-生物素 47. pAAGGAAAGCC TTTGGAGT 48. _吩Uf唑-ACTCCAAAGG CTTTCCTT 49. 螢光素-GGCACCATTA AAGAAAATAT CAT AF508 50. pATGATATTTT CTTTAATGGT GCC 51. pTGGTGTTTCC TATGATGAAT ATA-生物素 52. 生物素-TATATTCATC ATAGGAAACA CCA (請先閲讀背面之注意事項再堉寫本頁) -裝. .ΤΓ. 線. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.3. 40,000 經濟部中央標準局β工消費合作社印S-R. 2G0G72 五、發明説明（32) 實例9 : L C R反應條件 實例8經標的之寡物用 如 EP-A-3 2 0-3 0 劑满度： 試劑 水 反應緩衝溶液 寡核苷酸4 1 , 4 2 , 43及44 寡核苷酸4 5 , 4 6 , 4 7及4 8 寡核苷酸49 , 50 , 5 1及52 NAD B S A 樣品 礦油 混合物在1 0 0°C下加 入下列於5微升體積： 試劑 D N A連接酶 來自嗜熱棲熱菌 A6 B6 於平齊的LCR中，此基本上 8中所述進行，使用以下的試 最終澹度 (以生成45微升之最終體稹） 50inM FPPS, pH 7.8 150mM KC1 lOmM MgC 1 2 各3 . 3 X 1011套數 各4 . 2 X 1011套數 各2 . 7 X 1011套數 Ο . IraM 5微克 250毫微克D N A 2滴/管 3分鐘，冷卻至室溫，再加 最終漉度 3400單位/ 50微升 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂
J 線_ 本纸張尺度適用中®國家標準（CN’S)甲4规格（210 X 297公釐） -34 - 82.3. 40,000 260672 A6 B6 烴濟部中央標準局员工消費合作社印一衣 五、發明説明（33) 混合物接受預定的溫度變化共4 5個循環，此循環爲 8 5 °C 3 0 秒及 5 7 °C 2 0 秒。熱循環於 TerapCyclerTM* 進行（Coy Laboratory Products, Ann Arbor MI)。 實例1 0 :分析病人樣品之纖維嚢腫突變 織維囊腫病人之人類DNA樣品，利用Oligo 41 — 5 2分析突變作用G5 5 1D、W1 2 8 2X及 △ F 5 0 8之存在。分析之進行係將樣品DNA接受實例 9之LCR，生成之混合物再依實例6進行免疫層析。試 劑如前般製備（見實例4 一 6 )。 於圖3中示出免疫層析後硝化纖維長條之照片。其中 示出與CF突變作用W1 2 8 2X、AF5 0 8及 G 5 5 1 D特異之擴大產物之存在（點由底及左至頂及右 )。樣品爲：1)水（無DNA) ，2)病人爲 G 5 4 2X突變作用之雜接合體3 )病人爲W1 2 8 2X 突變作用之雜接合體，4 )病人爲AF 5 0 8突變作用之 雜接合體，及5 )病人爲G 5 5 1 D突變作用之雜接合體 。水或G 5 4 2X DNA經擴大作用後並無點出現（1 及2號長條）。在3號長條中只出現一點，且此點接近長 條之左方（抗-瞎吩-忭唑之固化區），表示僅 W 1 2 8 2 X DNA有陽性擴大作用。在4號長條上只 出現一點，且此點近長條之中段（抗—螢光素固化區域） ，表示僅5 0 8 DNA有陽性擴大作用。在5號長 條上只出現一點，且此點近長條之右方（抗一丹黃醢固化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)肀4规格（210 X 297公釐） .35 - 82.3. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再埃寫本頁) -_裝· 訂. .線 A6 B6 280672 五、發明説明（34) 區域），表示僅G5 5 ID DNA有陽性擴大作用。 雖然1 2個寡物均存在於所有反應管中，使得可自所 有之種突變中擴大DNA，然只有各樣品中存在的特異 DNA才會被確實地擴大。各病人爲其特殊突變作用之雜 接合體，表示各個也攜有一個正常基因。無一例中顯示正 常基因可爲任一寡核苷酸擴大。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝. 訂. 線· 經濟部中央標準局A工消費合作社印製 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -36 - 82.3. 40,000

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  1. 260672
    A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 附件一： 第82102966號專利申請案 修正 中文申請專利範圍修正本 Ί 年月曰 士Η 士83. 6. 03補无 民國83年6月修正 •一種進行多重連接酶鏈反應之方法，此方法包括 以下步 a 該樣品 b 想標的 )各探 要的核 主要股 核酸主 端相對 至標的 是形成 ;v ) vi )第 重編之 份位置 使第三 分子； 其 驟： .提供反應溶 推想具有一種 •對各推想的 序列探針組， 針組之第一及 液，其 以上之 標的序 各探針 第二爲 酸探針；ii )第一探 之第一片段； 要股之第二片 於標的主要股 核酸主要股時 —個具有第一 第三探 四探針 主要分 ，當第 探針連 且 中對各 針可雜 可雜交 子第一 三及第 接至第 m J弟 段；iv 第二片 ，可使 部份及 交至經 至經重 部份相 四探針 四探針 含有呈單股 眾多標的核 列，於反應 組含至少四 主要探針， 針爲單股， 二探針爲單 )標的主要 段之 端 第一探針連 核酸之樣 酸序列； 溶液中加 種探針， 且第三及 可雜交至 股，可雜 股的第一 位置，當 結至第二 第二部份之經重編的 重編之主要分子第一 編之主要分子的第二 對於經重編主要分子 與該經重編主要分子 ，由是形成一個經重 品核酸， 入各種推 其中：i 第四爲次 標的核酸 交至標的 片段5 一 探針雜交 探針，由 主要分子 部份：及 部份，經 之第二部 雜交時可 編之次要 推想之標的序列，提供之探針組濃度爲可於 ----------------1 -------裝------訂 ^^ (請先閱讀背面之注意事^再項寫本頁) 表紙分又度澶用中SS家標準（CNS)甲〇見格（2丨Ο X 297公釐> 80672, B7 C7 D7 六、申請專利範圍 其他探針組同時存在下達成此連接反應者；及 C .重覆以下循環： i)探針與樣品中之核酸雜交： ii )進行連接反應以形成經重編之分子：及 iii )將樣品中之核酸變性： 經由後續循環，針對存在於反應溶液中之各推想的標 的序列，可增加經重編之主要及次要分子之量。 2 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該連接反 應係以連接酶，或連接酶與聚合酶同存下進行。 3 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中c步驟之 循環重覆2 0至約6 0次。 4 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中各探針組 中至少各有一探針攜有可偵測標幟，可偵測標幟各自可互 相區別。 5 .根據申請專利範圍第4項之方法，其中該可偵測 標幟包括半抗原，其依據不同的特異結合成員之特異性是 可區別的。 6 .根拽申請專利範圍第1項之方法，其中探針組各 自標的以二種不同的標幟，如此當雜交一起時經重編分子 可被標以二種標幟，其中至少—種是獨特的標幟，其在每 個探針組間均是不同的。 7 .根據申請專利範圍第6項之方法，其中另一探針 是一種共通探針，其在各探針組是相同的。 8 .根據申請專利範圍第7項之方法，其中共通標職 (請先閱讀背面之注意事項再項寫本頁) 裝. 木氓认&戍缝用中SS家样準（CNS)甲4規格（210 X 297公餐·） 260672 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 用於偵測，且選自下列包括放射性同位素、螢光囲、化學 發光團及半抗原。 9 .根據申請專利範園第6項之方法，其中獨特的標 幟包括獨特的特異結合成員，如此各獨特的特異結合成員 可與其他所有的特異結合成員區別。 1 〇 .根據申請專利範圍第9項之方法，其中獨特的 標幟包括特異的半抗原。 1 1 .根據申請專利範圍第9項之方法，其中獨特的 標幟包括特異的雜交探針。 1 2 .根據申請專利範圍第9項之方法，其中獨特的 特異結合成員係用於自至少具一探針組之經重編分子中分 離出具另一探針組之經重編分子。 1 3 .根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中分離 之達成係將各特異結合成員之特異結合配對固化在固相之 不同位值。 1 4 .根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中分離 之達成係將各特異結合成員之特異結合配對固化在固相上 ，固相之特徵在於有可互相區分之特性。 1 5 . —種利用多重連接酶鏈反應偵測眾多標的核酸 序列中每種標的核酸序列存在、不存在或含量之方法，此 方法包括以下步驟： a .提供反應溶液，其中含有呈單股核酸之樣品核酸 ，該樣品推想具有一種以上之眾多標的核酸序列： b .針對各推想的標的序列，在反應溶液中加入具有 本紙決疋度违用中KS家標準（CNS)甲4現格（210 X 297 乂* > Q (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) £60£?2 A7 B7 C7 D7 45濟郎中喪浮辛负ΚΓ工肩費合作u印.¾ 六、申請專利範圍 至少2個及視所需要四個核酸探針組（探針組），其中： i )探針之第一及第二爲主要探針，且視所需的第三及第 四爲次要核酸探針；ii )第一探針是單股，可雜交至標的 核酸主要股之第一片段：iii )第二探針是單股，可雜交至 標的核酸主要股之第二片段：iv )標的主要股之第一片段 5 >端相對於檫的主要股之第二片段3 ^端位置，如此當 探針雜交至標的核酸主要股時，可使得第一探針連接至第 二探針，由是形成一個具有第一部份及第二部份之經重編 之主要分子：v )第三探針可雜交至經重編之主要分子之 第一部份；及vi )第四探針可雜交至經重編之主要分子之 第二部份，經重編之主要分子第一部份相對於經重編主要 分子之第二部份位置；使得當第三及第四探針雜交至經重 編主要分子時，第三探針可連接至第四探針，因此形成經 重編的次要分子； 其中各探針組中至少一探針含有可偵測標幟，與各探 針組相關聯的可偵測標幟可與其他探針組相關聯之可偵測 標幟區別，於是可決定各推想的標的序列之存在、不存在 或含量：且 其中針對各推想的標的序列，提供之探針組濃度爲可 在其他探針組同時存在下達成此連接反應者：及 c .進行以下循環： i)探針與樣品中之核酸雜交： ii )進行該連接反應以形成經重編的分子；及 iii )將樣品中之核酸變性： (請先閲讀背面之注意事頊再項寫本頁) 裝. -ΤΓ· 表坻认又戍邁用中残3家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公梦） B7 C7 D7 £60678 六、申請專利範圍 藉由每次循環，針對存在於反應溶液中之各推想的檫 的序列，可增加經重編的主要及視所需的次要分子之量； 以及 d.偵測與各探針組相關聯之可偵測檩幟，作爲反應 溶液中檫的核酸存在或含量之測度。 16 .根據申請專利範圍第15項之方法，其中連接 以連接酶、或連接酶及聚合酶進行。 1 7 ·根據申請專利範圍第1 5項之方法，其中該第 三及第四探針加入反應方法時，c步驟之循環重覆1 〇至 約1 0 0次。 1 8 .根據申請專利範圍第1 5項之方法，其中C步 驟之循環重覆由2 0至約6 0次。 19 .根據申請專利範圍第15項之方法，其中探針 標記以二種標幟，如此經重編分子標以二種標幟，其中至 少一者爲獨特標幟，此在各探針組均是不同的。 2 0 .根據申請專利範圍第1 7項之方法，其中探針 標以二種標幟，如此經重覆分子標以二種檫幟，其中至少 一者爲獨特標幟，其與探針組中各個不同，且另一者是一 種共通標幟。 2 1 .根據申請專利範圍第2 0項之方法，其中共通 標幟用於偵測，且選自下列包括放射性同位素、螢光團、 化學發光團及半抗原。 2 2 .根據申請專利範圍第2 0項之方法，其中獨特 的標的物包括半抗原，且各獨特的半抗原與其他所有的獨 ------------------1 -------裝-------.玎------^ (請先閱讀背面之注急事項再Μ..Κ本頁) A7卿 ζ D7 14濟郎十央螵準X4费合作社印Ϊ 六、申請專利範圍 特半抗原不同。 2 3 .根據申請專利範圍第2 0項之方法，其中獨特 的標幟包括特異雜交探針。 2 4 .根據申請專利範圍第2 2項之方法，其中獨特 的半抗原用於分離不同的經重編分子。 2 5 .根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中分離 之達成係將各獨特半抗原之特異結合配對固化在固相上不 同位置。 2 6 .根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中分離 之達成係將各獨特半抗原之特異結合配對固化在固相，該 固相之特徵在於可互相區別。 2 7 · —種用於多重分析物多重偵測之免疫層析裝置 ，包括： 一多孔材質之長條物，其可由毛細作用運輸流體，該 長條物至少具有第一及第二獨特的捕獲試劑固化其上，其 固化位置係於遠離接觸運送液體之終端的第一及第二不連 續點，該獨特的第一及第二捕獲試劑分別對不同的第一及 第二分析物有特異性， 其中該第二分離點在垂直及水平方向上均與第一不連 續點分開，垂直係指流體流動之方向。 2 8 .根據申請專利範圍第2 7項之裝置，其中準備 三個以上不連續點，且該點互相在垂直及水平方向均有空 間，而形成實質上線形之點斜列。 2 9 . —種進行免疫層析之方法，此方法包括： (磧先閲讀背面之注寺？事項再靖wr本頁) .裝. 訂 % 本紙张用中g园家律準（CNS)甲4规格（210 X 297公* ) A7c；________£!_ 六、申請專利範圍 提供多孔材質之長條物，其可以毛細作用運輸流體， 該長條物上至少固化有第一及第二獨特的捕獲試劑，其固 化位置係於遠離接觸運送液體之終端的第一及第二不連續 點，該獨特的第一及第二捕獲試劑分別對不同的第一及第 二分析物有特異性，其中第二不連續點在垂直及水平方向 均與第一不連續點隔開，垂直表示流體流動方向；且提供 疑似含有分析物之試驗溶液； 將接觸端與試液接觸，其條件係可令溶液經毛細作用 而運送至至少最遠之捕獲點： 決定各捕獲點，其中分析物將結合至捕獲點上。 3 0 .根據申請專利範圍第2 9項之方法，其中分析 物中至少一種爲標的多核苷酸。 3 1 .根據申請專利範圍第3 0項之方法，其中標的 多核Μ酸以至少一種半抗原標幟，半抗原及抗-半抗原抗 體係用來捕獲在捕獲點上之分析物。 (請先閱讀背面之注意事項再項寫本頁) 裝‘ -11‘ ". 表用中家標準<CNS)甲·！規格（2丨0 X 297公釐）
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