CN100582241C - 一种可制作标准曲线的临床定量检测基因芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可制作标准曲线的临床定量检测基因芯片的制备方法，属于生物技术领域。本发明的方法包括衍生DNA的的设计、人工合成衍生DNA、衍生DNA的克隆、芯片制作、基因芯片上标准曲线的制作、临床样本的定量检测等步骤。方法用一段HIV的检测靶分子作试验，可以获得相关系数大于0.99的标准曲线。用已知浓度的检测靶分子进行测试，测定结果与加入的DNA量是一致的。本发明的方法与其他常规定量方法比较，可以节省成本，测定结果更准确。同时，本发明的方法可将基因芯片的高通量检测与定量检测结合，扩大基因芯片的应用范围。
Description
技术领域：
本发明涉及一种可制作标准曲线的临床定量检测基因芯片的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
基因芯片技术是90年代中期快速发展起来的分子生物学高新技术，其原理是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效检测的方法(如图1)。该技术在医学诊断方面具有广阔的应用前景。但目前研制的临床检测基因芯片只能进行定性检测，而定量检测在临床上对于确定病程进展、拟定治疗方案、确定给药时机和剂量等方面有重要的价值。基因芯片不能定量就很大程度限制了该技术的应用范围。
定量基因芯片研制的难度在于制作标准曲线。常规的定量检测如图2A所示，首先将标准品按浓度梯度稀释，分别测定标准品的浓度与测定值，并建立浓度与测定值之间的关系曲线，以待测样品的测定值在标准曲线上找出其对应的浓度。而基因芯片是在一个反应管中完成多个DNA位点的检测，每个位点的检测反应同时进行，最后通过芯片上的探针位点检测到的杂交信号确定样本中各位点的靶分子DNA的浓度高低。如用常规检测中的标准曲线制作方法，同一标准品分子的不同浓度混合后在芯片上只能由同一个探针分子进行识别，因此是无法区分不同浓度的。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种简便易行的可制作标准曲线的临床定量检测基因芯片的制备方法。
本发明内容包括：
1.建立一种基因芯片上制作标准曲线的方法。基因芯片的所有反应是在同一个反应中进行的，所以，模拟常规方法中的同一标准品DNA的不同浓度加入反应体系中后只有一种浓度，即是各浓度的加和，并且只有一个浓度测定值。本发明采用不同的DNA分子(各分子间的序列不同)作为标准品，并且不同的DNA分子用不同的浓度，将序列互不相同、浓度成梯度的分子混合后，即得到一套制作标准曲线的标准品DNA(图2B)。这样就可以在基因芯片上制作标准曲线。
2.设计了一种标准品DNA获取方法。当标准品分子的反应效率与检测分子的反应效率相同时，才能得到标准曲线。而不同的DNA分子的反应效率是有差异的，因此，并非所有与检测分子不同的DNA分子都能用作标准品。本发明设计了一种衍生DNA获取方法，即：选择与检测靶分子DNA有不同碱基排列顺序，但检测效率与检测分子相同的衍生DNA，用该衍生DNA作为标准曲线制作的标准品可满足基因芯片上制作标准曲线的要求。
本发明的优点在于：
本方法简便易行，测定结果准确，可在基因芯片上制作标准曲线的方法，解决了基因芯片技术不能应用于临床定量检测的问题。
附图说明：
图1为基因芯片检测方法的模式图。
图2为基因芯片与常规方法测定浓度的比较图。图中：A为常规方法测定样本浓度；B为基因芯片测定样本浓度。
图3为衍生DNA序列设计方案图。
图4为定量基因芯片点阵图。
图5为基因芯片制作标准曲线的方法及其验证图。
具体实施方式：
1.衍生DNA的设计。衍生DNA的设计方案用图3所示的模式图表示，衍生DNA以被检测的靶分子DNA为基础，不同的被检测序列需要设计一套相应的衍生DNA序列。如图3，第一行为被检DNA序列，由于检测序列的两端是用于PCR扩增标记的引物，因此在衍生DNA的两端用于PCR扩增标记的序列部分与检测序列相同。中间的探针部分，每隔5-8个碱基，随机地挑出1-2个碱基，交换其在两条链上的位置，如检测DNA上的第一链为5’-AGT
ACACG
AC-3’，第二链为3’-TCA
TGTGCTG-5’，衍生DNA序列中如果选择修改第4和地10个碱基，修改后的第一链为5’-AGT
ACACG
AC-3’，第二链为3’-TCA
TGTGC
TG-5’。这样的衍生DNA序列与检测DNA有不同的序列，但它们的“G+C”含量没有改变，每个碱基所在位置的碱基对也没有改变。如前所述，这样的衍生DNA与被检测的靶分子DNA之间的检测活性是相同的。上述方法反复应用，即可设计处多条衍生DNA。在衍生DNA设计时，衍生DNA不仅与被检的靶分子DNA的序列不同，衍生DNA之间的序列也不能相同。一般，每1个被检测的靶分子DNA需要有5-7条衍生DNA序列。衍生DNA的条数与标准曲线制作时标准品的浓度梯度数一致。
2.人工合成衍生DNA。由于每一个检测序列都需要有一套相应的衍生DNA，因此需要人工合成衍生DNA。其合成方法可用化学方法全合成，也可用化学方法合成多条短分子，然后用PCR方法拼接。按常规的DNA合成方法即可实现。
3.衍生DNA的克隆。合成的衍生DNA采用常规的方法克隆到T-载体(T-vector)上，然后鉴定测序是否与设计DNA序列一致。鉴定后的衍生DNA克隆进行质粒扩增，保存备用。
4.芯片制作。芯片上的探针DNA片段不能包括检测时的PCR扩增引物序列，因此需要针对每一条衍生DNA序列以及检测靶分子设计一对PCR扩增引物。然后用PCR方法扩增衍生DNA和检测靶分子DNA的探针部分的片段，将这些探针DNA按现有方法制作成基因芯片(DNA阵列)，点阵图见图4。
5.基因芯片上标准曲线的制作。用衍生DNA的质粒克隆作模板，用质粒上插入位点附近的序列作引物，通过PCR扩增方式获得线状的衍生DNA序列作为标准品DNA，通过常规的紫外方法定量后确定各标准品的浓度，再计算其分子拷贝数。配制标准品DNA混合液，以取5个标准品DNA为例，分别将5个标准品DNA编号为I，II，III，IV和V，混合液中标准品I取107拷贝/微升，标准品II取106拷贝/微升，标准品III取105拷贝/微升，标准品IV取104拷贝/微升，标准品V取103拷贝/微升。将标准品混合液1微升加入标记反应管中，同时加入被检测靶分子DNA，用5’末端标记的检测引物按常规的PCR扩增方法进行扩增，同时进行标记，标记物按常规方法与基因芯片进行杂交，检测杂交信号，根据5个位点的浓度和杂交信号即可获得标准曲线。检测样本DNA(靶分子DNA)的浓度即可从标准曲线上获得，见图1。
6.本方法在HIV检测中的应用。用1个HIV检测靶分子DNA为例，该序列及其衍生DNA序列见表1，按上述方法，标准品DNA和检测DNA用dUTP-Cy5标记，与相应的基因芯片杂交，激光扫描图谱见图5，根据扫描数据，制作标准曲线，其标准品DNA的拷贝数与荧光信号值之间呈指数关系，其相关系数达到0.99以上，表明其标准曲线是非常可靠的。用含有106，105，104的检测靶分子的DNA样本加入该体系，根据标准曲线推算的靶分子数在数量级上是一致的。由于临床上的病原物的定量测定(临床上叫滴度)测定是以数量级为单位，同一数量级内的差异没有意义。因此，这一方法可在临床上应用。
7.本方法在定量检测中的应用。现有的定量检测，需同时测定标准曲线，如果检测样本很少，制作标准曲线消耗的试剂使检测成本提高。而基因芯片定量检测，每一个样本检测时，同时制作标准曲线，标准曲线制作不另计算成本，使检测成本降低。同时，由于标准曲线制作与检测样本是在同一反应中完成，不存在不同反应管的差异问题，测定结果较常规的定量方法更准确。
本方法可扩展到一张芯片上测定多个靶位点或多个病原物的检测，这样将基因芯片的高通量检测与定量检测结合，使基因芯片的应用范围扩展。
检测序列及衍生序列如下表：
表1.检测序列及衍生序列：
表中：检测序列来至HIV的特异cDNA序列。无划线的部分为公共的引物序列，黑色并划线部分为衍变了的探针序列。
Claims (1)
1、一种可制作标准曲线的临床定量检测基因芯片的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：
a.衍生DNA的设计：衍生DNA以被检测的靶分子DNA为基础，在衍生DNA的两端用于PCR扩增标记的序列部分与检测序列相同；中间的探针部分，每隔5-8个碱基，随机地挑出1-2个碱基，交换其在两条链上的位置，如检测DNA上的第一链为5’-AGT
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TG-5’，衍生DNA序列中如果选择修改第4和地10个碱基，修改后的第一链为5’-AGTACACG
AC-3’，第二链为3’-TCA
TGTGC
TG-5’；这样的衍生DNA序列与检测DNA有不同的序列，但它们的“G+C”含量没有改变，每个碱基所在位置的碱基对也没有改变，衍生DNA与被检测的靶分子DNA之间的检测活性是相同的；在衍生DNA设计时，衍生DNA不仅与被检的靶分子DNA的序列不同，衍生DNA之间的序列也不能相同；每1个被检测的靶分子DNA有5-7条衍生DNA序列，衍生DNA的条数与标准曲线制作时标准品的浓度梯度数一致；
b.人工合成衍生DNA：用化学方法全合成，或用化学方法合成多条短分子，再用PCR方法拼接得到衍生DNA；
c.衍生DNA的克隆：合成的衍生DNA克隆到T-载体上，测序鉴定其序列是否与设计DNA序列一致，鉴定后的衍生DNA克隆进行质粒扩增，保存备用；
d.芯片制作：芯片上的探针DNA片段不包括检测时的PCR扩增引物序列，需针对每一条衍生DNA序列以及检测靶分子设计一对PCR扩增引物，再用PCR方法扩增衍生DNA和检测靶分子DNA的探针部分的片段，将这些探针DNA按常规基因芯片制作方法制作成DNA阵列的基因芯片；
e.基因芯片上标准曲线的制作：用衍生DNA的质粒克隆作模板，用质粒上插入位点附近的序列作引物，通过PCR扩增方式获得线状的衍生DNA序列作为标准品DNA，通过紫外方法定量后确定各标准品的浓度，再计算其分子拷贝数；
f.检测时，将标准品DNA混合，混合物中不同的标准品的浓度成梯度，与待检测样本一起反应，不同标准品与相应的探针杂交，根据浓度与测定值之间的关系，即可制作标准曲线；待测样本的测定值在标准曲线上可查到相应的浓度，即可进行临床样本的定量检测。
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