CN102712944B - 用于均质、实时检测lamp产物的序列特异性方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于在环介导的等温扩增(LAMP)过程中产生序列特异性的二级扩增产物的方法和组合物。常规的LAMP产生大量连结成为自我互补的发夹的高分子量DNA结构，其不适于通过惯常的基于探针的杂交方法检测，这使得在封闭管形式中多重检测两种或更多种靶标或序列变体是极其困难的。本文中提供了，例如，用于产生缺少竞争性发夹结构的、带有包埋在低分子量产物中的原始靶序列的片段的二级LAMP产物的方法，发夹结构的所述缺少增强基于探针的靶序列检测。这些二级产物能够例如，在LAMP过程中被实时产生，并且能够提供，使用例如均质实时荧光形式而在单一管中检测多种靶序列的选择。
Description
本申请要求2009年11月5日递交的美国临时申请号61/258,404的权益，在此通过引用方式全文并入本文。
1.领域
在一个方面，本方法涉及改善的、用于对使用环介导的等温扩增(LAMP)产生的靶序列进行实时序列特异性检测的方法。
2.背景
在临床医学中，核酸扩增是最有价值的手段之一，例如用于传染性疾病、遗传病症和遗传特征的诊断。LAMP是简单、快速、特异和成本划算的核酸扩增方法(见美国专利号6,974,670和美国专利号6,410,278)。与例如PCR的扩增方法不同，LAMP可在等温条件下进行，这消除了对双链DNA产物进行热变性以促进下一轮DNA合成的需要(见Notomi等人，Nucl.Acid Res.28(12):e63(2000)(此后称为“Notomi等人”))。另外，与例如NASBA(基于核酸序列的扩增)或SDA(链置换扩增)的扩增方法不同，LAMP不需要使用除链置换DNA聚合酶之外的任何酶，这使得其成本更加划算。然而，常规的LAMP产生大量的高分子量DNA，其中含有连结成为自我互补的发夹结构的、许多拷贝的原始靶序列，由于其高的解链温度和强的自我折叠趋势，所述原始靶序列不适于被常规的基于探针的杂交方法（例如分子信标）检测。
因此，存在对于改善使用LAMP的序列检测的需求。
3.概述
一方面，本文提供了允许实时、序列特异性检测（例如多重检测）靶核酸分子内的核酸序列的方法和组合物，其是通过利用一种或多种信号引物或引物对与环介导的等温扩增(“LAMP”)反应相结合来产生包含目的靶核酸分子部分或其互补物的核酸检测产物，其中所述核酸检测产物不包含发夹核酸序列或结构，从而使得核酸检测产物特别适于检测。例如，可通过常规的报告探针的杂交或将报告基团掺入一种或多种信号引物中而检测所述核酸检测产物。
另一方面，本文提供了允许实时、序列特异性、多重检测一种、两种或更多种靶核酸分子中的两种或更多种核酸序列的方法和组合物，其是通过利用信号引物或引物对与LAMP反应相结合以产生包含目的核酸靶部分或其互补物的核酸检测产物，其中所述核酸检测产物不包含发夹核酸序列或结构，从而使得核酸检测产物特别适于检测。
例如，可通过常规的报告探针的杂交或将报告基团掺入一种或多种信号引物中而检测所述核酸检测产物。此外，例如，与例如在LAMP过程中相结合而实时产生所述核酸检测产物，且提供了使用例如实时荧光形式而在单一反应容器（例如管）中检测多种核酸检测产物的选择。
在一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列的区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构，并且其中所述区域不位于发夹结构的环区域中;和
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含一个发夹结构。
上述方法，可进一步包括检测所述第一信号延伸产物。在一个实施方案中，所述信号引物包含杂交区域和报告子区域，其中所述杂交区域与核酸靶序列的区域杂交，并且其中所述报告子区域产生荧光信号。
在另一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构;
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含发夹结构;
(c)使核酸扩增引物与第一信号延伸产物的环区域杂交，并使杂交的核酸扩增引物在所述第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物和第三信号延伸产物，其中所述第二信号延伸产物缺乏发夹结构;且其中所述第三信号延伸产物在其5’端具有发夹结构。
在另一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号产物的方法，其中所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构;
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上杂交以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含发夹结构;
(c)使核酸扩增引物与所述第一信号延伸产物的环区域杂交，并且使杂交的核酸扩增引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物，其中所述第二信号延伸产物是双链并且缺少发夹结构;和
(d)使核酸信号引物与所述第二信号延伸产物杂交，并且使杂交的核酸信号引物在第二信号延伸产物上延伸以产生第三信号延伸产物，其中所述第三信号延伸产物在其5’端具有发夹结构。
上述方法可进一步包括检测所述第二和/或第三信号延伸产物。
在另一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中并行产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构;
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含发夹结构;
(c)使核酸扩增引物与第一信号延伸产物的环区域杂交，使杂交的核酸扩增引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物和第三信号延伸产物，其中所述第二信号延伸产物缺少发夹结构;并且其中所述第三信号延伸产物是单链的且在其5’端具有发夹结构;和
(d)使核酸信号引物与第三信号延伸产物杂交，使杂交的核酸信号引物在所述第三信号延伸产物上延伸以产生第四信号延伸产物，其中所述第四信号延伸产物包含双链核酸。
在另一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构;
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含发夹结构;
(c)使核酸扩增引物与第一信号延伸产物的环区域杂交，使杂交的核酸扩增引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物，其中所述第二信号延伸产物是双链的并且缺少发夹结构;
(d)使核酸信号引物与第二信号延伸产物杂交，使杂交的核酸信号引物在第二信号延伸产物上延伸以产生第三信号延伸产物，其中所述第三信号延伸产物是单链的并且在其5’端具有发夹结构;和
(e)使核酸信号引物与第三信号延伸产物杂交，并使杂交的核酸信号引物在所述第三信号延伸产物上延伸以产生第四信号延伸产物，其中所述第四信号延伸产物包含双链核酸。
在一个实施方案中，上述方法还包括检测第四信号延伸产物。
在本文所示的方法的某些实施方案中，并行使用了两种或更多种靶序列或序列变体，其中使用了与所述两种或更多种靶序列杂交的两种或更多种核酸信号引物。在一个实施方案中，所述两种或更多种靶序列是存在于同一连续的核苷酸序列中或存在于两种不同核苷酸序列中的序列。在另一个实施方式中，所述两种或更多种靶序列或序列变体源自一种生物体或源自两种或更多种不同的生物体。在一些实施方案中，实时检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在某些实施方案中，在封闭的管形式中检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在其它实施方案中，在扩增后检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
在一个实施方案中，通过杂交探针检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在一个这种实施方案中，所述杂交探针是单核苷酸差异敏感探针。在另一个实施方案中，杂交探针是荧光的。在具体的实施方案中，所述杂交探针是分子信标。在另一个具体的实施方案中，所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物是使用荧光探针或SERS标记的探针检测的。
在本文所示方法的某些实施方案中，所述信号引物包括杂交区域和报告子区域，其中所述杂交区域与核酸靶序列的区域杂交，并且其中第一、第二、第三或第四信号延伸产物是通过报告子区域检测的。在一个实施方案中，报告子基团产生荧光信号。在另一个实施方案中，所述报告子基团是荧光发夹。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物是通过修饰手段检测的，以促进掺入到信号引物之一中的信号产物的捕获。
在一个实施方案中，本文提供了用于产生核酸检测产物的方法，所述方法包括:
在允许发生互补核酸杂交和核酸延伸反应的条件下将靶核酸分子和引物核酸F3，FLP，FSP，RLP，RSP和R3相组合，其中:
(i)所述靶核酸和每个引物核酸都包含5’端(“5’”)和3’端(“3’”);
(ii)引物核酸F3，FLP和FSP中的每一个与靶核酸分子的不同部分互补，在靶核酸分子中如下以3’至5’的顺序：F3，FLP，FSP;
(iii)FLP以3’至5’的顺序包含：第一部分(F2)，其与靶核酸分子的部分(F2c)互补；和第二部分(F1c)，其与在F2c的5’、但在FSP所互补的靶核酸分子部分(FSc)的3’的靶核酸分子部分(F1c)相同;
(iv)FSP以3’至5’的顺序包含与靶核酸分子的部分(FSc)互补的第一部分(FS)，和任选地第二部分(S1)，所述第二部分包含可检测的、不与靶核酸互补的核酸序列;
(v)引物核酸R3，RLP和RSP中的每一个按照如下在靶核酸分子中以5’至3’的顺序与靶核酸的不同部分相同:R3，RLP，RSP;
(vi)RLP以3’至5’的顺序包含第一部分(R2)，其与靶核酸分子的部分(R2)相同；和第二部分(R1c)，其与在R2的3’、但在与RSP相同的靶核酸部分(RS)上游的靶核酸分子的部分(R1)互补;且
(vii)RSP以3’至5’的顺序包含第一部分，其与FSc的5’的靶核酸分子部分(RS)相同；和任选地第二部分(S2)，其包含不与靶核酸互补的可检测的核酸序列，从而产生核酸检测产物：其以5’至3’的顺序包含R1c，R2，R1，RS，FSc，和(任选地)S1c，其中S1c与S1互补。在某些实施方案中，所述靶核酸分子包含部分D，其在FSc的5’和RS的3’，从而所产生的核酸检测产物以5’至3’的顺序包含R1c，R2，R1，RS，D，和（任选地)S1c。通常，所产生的核酸产物仅包含单一拷贝的D。另一方面，所述方法还包括检测所述核酸检测产物的存在和/或量。在某些实施方案中，此种方法包含检测核酸检测产物中D的存在。
在另一个实施方案中，所述方法还包括产生核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含S1(任选的)，FS，RSc，R2c和R1。在某些实施方案中，所述靶核酸分子包含部分D，其在FSc的5’和RS的3’，从而所述方法还包括产生核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含S1(任选的)，FS，Dc，RSc，R2c和R1，其中Dc与D是互补的。通常，所产生的这种核酸产物仅包含一个拷贝的Dc。另一方面，所述方法还包括检测所述核酸检测产物的存在和/或量。在某些实施方案中，所述方法包括检测核酸检测产物中Dc的存在。
在某些实施方案中，所提供的方法用于从多种不同的靶核酸分子产生多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种)不同的核酸检测产物，其中对于每种目的靶核酸分子使用了如本文中所描述的单独的核酸引物(F3，FLP，FSP，R3，RLP，RSP)组。在某些实施方案中，所述多种核酸检测产物是在单一反应容器（例如管或孔）中产生的。在其它方面，检测了多种不同的核酸检测产物，例如在单一反应容器（例如管或孔中，例如以封闭的管形式）检测的。
在这种实施方案中，引物核酸FLP和RLP是适用于LAMP核酸扩增反应中的扩增引物。不愿被任何特定的机制或理论所束缚，这种方法包括FLP和RLP介导的LAMP核酸扩增反应。
在这种实施方案中，引物核酸FSP和RSP是信号引物的实例。
在这种实施方案中，引物核酸F3和R3是置换引物的实例。
在另一个实施方案中，本文中提供了用于产生核酸延伸产物的方法，所述方法包括:
在允许发生互补核酸杂交和核酸延伸反应的条件下将下列相组合：
(i)靶核酸分子，其包含3’和5’末端发夹结构，和
(ii)核酸引物(FSP)，其以3’至5’的顺序包含：与位于3’发夹结构的5’和5’发夹结构的3’的线性核酸分子的部分(FSc)互补的第一部分(FS)，和任选地，包含不与靶核酸分子互补的可检测的核酸序列的第二部分(S1)，从而使FSP与靶核酸分子杂交；和
延伸FSP，从而产生核酸延伸产物，其以5’至3’的顺序包含FSP和基本上与全部5’端发夹结构互补的核酸序列。在另一个实施方案中，所产生的核酸延伸产物还包括与基本上所有FSP互补的3’末端。
如本文中所使用的，3’发夹结构是指包含核酸分子的3’末端的自我互补的发夹结构。类似地，如本文中所使用的，5’发夹结构是指包含核酸分子的5’末端的自我互补的发夹结构。因此，包含5’和3’末端发夹结构的核酸分子在其自身的每个末端含有自我互补的发夹结构。
在某些实施方案中，所述方法可由多种不同的靶核酸分子产生多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种)不同的核酸延伸产物，其中对于每种目的靶核酸分子使用单独的FSP。
在另一个实施方案中，本文提供了用于产生核酸检测产物的方法，所述方法包括:
在允许发生互补核酸杂交和核酸延伸反应的条件下将下列相组合：
(i)靶核酸分子，其包含3’和5’末端发夹结构，
(ii)核酸引物(FSP)，其以3’至5’的顺序包含：与位于3’发夹结构的5’和5’发夹结构的3’的线性核酸分子的部分(FSc)互补的第一部分(FS)，和任选地，包含不与靶核酸分子互补的可检测的核酸序列的第二部分(S1)，和
(iii)核酸引物(RLP)，其以3’至5’的顺序包含：与5’末端发夹结构的环部分相同的第一部分(R2)，和5’末端发夹结构的发夹部分内的、与R2的3’的靶核酸分子的部分(R1)互补的第二部分(R1c)；
从而产生了核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含：RLP(R1c和R2)，R1，和与基本上所有的FSP互补的核酸序列。在另一个实施方案中，所述方法还包括产生核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含FSP(S1(任选的)和FS)，FS，RSc，R2c和基本上所有的R1，其中RSc与RS互补，且R2c与R2互补。另一方面，所述方法还包括检测核酸检测产物的存在和/或量。
在某些实施方案中，靶核酸分子包含位于FSc的5’和RS的3’的部分D，从而所述方法包括产生核酸检测产物，所述核酸检测产物以5’至3’的顺序包含：RLP(R1c和R2)，R1，D和与基本上所有FSP(S1(任选的)和FS)互补的核酸序列。另一方面，所述方法还包括检测核酸检测产物的存在和/或量。在另一个实施方案中，所述方法包括检测核酸检测产物中D的存在。在另一个实施方案中，所述方法可进一步包括产生核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包括：FSP，Dc，RSc，R2c和R1，其中Dc与D互补。另一方面，所述方法还包括检测核酸检测产物的存在和/或量。在某些实施方案中，所述方法包括检测核酸检测产物中Dc的存在。
在某些实施方案中，所述方法可由多种不同的靶核酸分子产生多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种)不同的核酸检测产物，其中对于每种目的靶核酸分子使用如本文中所述的单独的核酸引物(FSP和RLP)组。
本文还提供了用于产生和检测如本文所提供的二级LAMP产物的试剂盒，所述试剂盒包括(i)核酸信号引物，其中核酸信号引物的至少一部分与第一靶序列的区域杂交，(ii)核酸扩增引物，其中所述扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分与信号引物所杂交的靶序列区域的3’的第一靶序列区域杂交，所述5’末端部分包含与扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域的5’的第一靶序列的区域基本上相同的核苷酸序列，和(iii)置换引物，其与核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域的3’的第一靶序列的区域杂交。
在某些实施方案中，任何上述试剂盒还包括(i)第二核酸信号引物，其中所述第二核酸信号引物的至少一部分与第二靶序列的区域杂交，(ii)第二核酸扩增引物，其中所述扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分与第二信号引物所杂交的靶序列区域的3’的第二靶序列区域杂交，所述5’末端部分包含与第二扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域的5’的第二靶序列的区域基本上相同的核苷酸序列，和(iii)第二置换引物，其与核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域的3’的第二靶序列的区域杂交。
在另一个实施方案中，任何上述试剂盒还包括(i)第三核酸信号引物，其中所述第三核酸信号引物的至少一部分与第三靶序列的区域杂交，(ii)第三核酸扩增引物，其中所述扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分与第三信号引物所杂交的靶序列区域的3’的第三靶序列区域杂交，所述5’末端部分包含与第三扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域的5’的第三靶序列的区域基本上相同的核苷酸序列，和(iii)第三置换引物，其与核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域的3’的第三靶序列的区域杂交。此外，本文涵盖了这样的试剂盒，其中使用本文所描述的方法扩增和检测4，5，6，7或更多种靶序列。
在一个实施方案中，任何上述试剂盒还包括杂交探针。在一个具体实施方案中，所述杂交探针是分子信标。在一些实施方案中，任何上述试剂盒中的信号引物还包含报告子区域。在一个实施方案中，此类报告子基团产生荧光信号。在一个具体实施方案中，所述报告子基团是荧光发夹。在一个实施方案中，任何上述试剂盒中的核酸靶序列是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的序列。
本文提供的方法、组合物和试剂盒的应用包括例如微生物的检测、疾病（例如传染性疾病、遗传病症和遗传特征）的诊断。例如，本文提供的方法和试剂盒可被用于任何下述生物学或临床应用中，其中需要实时检测生物学样品中特定的核酸，例如基因、基因序列或基因突变(例如缺失，插入或点突变)，RNA（例如mRNA或rRNA）。在一个具体实施方案中，本文所提供的方法和试剂盒可用于检测药物抗性的肺结核，通过例如检测来自生物样品的核酸中结核分枝杆菌的特定rpoB突变的存在。
4.附图说明
图1显示了使用信号引物(FSP)，扩增引物(FLP)和置换引物(F3)的LAMP反应，其中产生了延伸产物P1，P2和P3。
图2A显示了使用P1作为模板、以扩增引物(RLP)和置换引物R3进行的LAMP反应，其中产生了延伸产物P1.2和P1.3。
图2B显示了使用P1作为模板，使用信号引物(RSP)、扩增引物(FLP)和置换引物(F3)进行的LAMP反应，其中产生了延伸产物P1.1，P1.2和P1.3。
图3A显示了使用P2作为模板，使用扩增引物(RLP)和置换引物(R3)进行的LAMP反应，其中产生了延伸产物P2.2和P2.3。
图3B显示了使用P2作为模板，以信号引物(RSP)、扩增引物(RLP)和置换引物(R3)进行的LAMP反应，其中产生了延伸产物P2.2和P2.3。
图4显示了使用LAMP产生的P2.2产物作为模板，以信号引物(FSP)进行的扩增反应，其中产生了延伸产物P2.2.1，P2.2.2和P2.2.2.1。
图5显示了使用LAMP产生的P2.2.2.1产物作为模板，以扩增引物(RLP)和信号引物(FSP)进行的扩增反应，其中产生了延伸产物P2.2.2.1.2，P2.2.2.1.3和P2.2.2.1.1。
图6显示了使用P2.2.2.1产物作为模板，以信号引物(FSP)进行的扩增反应，其中产生了延伸产物P2.2.2.1.1c。
图7显示了结核分枝杆菌rpoB基因的区域(SEQ ID NO:36)。
图8显示了结核分枝杆菌katG基因(SEQ ID NO:37)的区域。所示的核苷酸相应于GenBank登录号NC_000962区域:互补物(2153889..2156111)的核苷酸771-1112(从katG基因(基因座标签“Rv1908c”)的第一编码核苷酸进行的编号)。
图9显示了结核分枝杆菌inhA基因(SEQ ID NO:38)的区域。所示的核苷酸相应于GenBank登录号NC_000962区域:1673440..1674183的核苷酸1673281-1673580(位于fabG1(aka mabA)基因(基因座标签“Rv1483”)的调控区域中的非编码核苷酸)，其是含有inhA基因的操纵子的一部分。
图10显示了结核分枝杆菌gyrB基因(SEQ ID NO:39)的区域。所示的核苷酸相应于核苷酸412-720(从gyrB基因(基因座标签“Rv0005”)的第一编码核苷酸编号)。
图11显示了分别与FLP-gyr和QP-gyr相连的荧光团/猝灭剂用于检测LAMP反应过程中靶序列的存在的用途。
5.发明详述
5.1.术语
如本文中所使用的，如下使用下列术语和用语:
如本文中所使用的，除非另有所指，术语“约”和“大约”是指在被此术语修饰的值以上或以下不超过20%的值。
核酸是指由两种或更多种单体核苷酸构成的分子，并且可包括：例如核糖核酸(RNA)，例如pre-mRNA，mRNA或rRNA分子；脱氧核糖核酸，例如cDNA或gDNA、单链核酸、双链DNA核酸；或包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、天然存在的核苷酸、天然存在的核苷酸的类似物、核苷酸的类似物或其组合的核酸。核酸可包括例如，肽核酸(PNA)。
“核酸引物”或“引物”是指包含3’末端–OH基团的核酸分子，其与互补核酸序列杂交后可被延伸（例如通过酶促核酸复制）。核酸引物通常包含约10-200，约20-100，约20-50，约30-100，约30-50或约20-30个核苷酸。通常，引物的至少10个连续的核苷酸与靶核酸分子互补，例如完全互补。
“信号引物”或“核酸信号引物”是这样的核酸引物，其至少包含第一部分，所述第一部分与扩增引物(见下文)所互补且可杂交的靶核酸分子的部分5’的靶核酸分子的部分互补且杂交。信号引物任选地包含所述第一部分5’的第二部分，其不与靶核酸分子互补。信号引物包含3'-OH基团，当信号引物与靶序列杂交时其可例如被延伸（例如通过DNA聚合酶），其中靶序列作为用于延伸的模板。信号引物与靶核酸分子杂交以及经杂交的信号引物延伸之后，产生了延伸产物，所述延伸产物包含：与在延伸过程中用作模板的靶核酸的部分互补的序列。信号引物可进一步包含一个或多个可检测的部分，例如一种或多种经标记的报告子分子，例如荧光分子。示例性的信号引物FSP和RSP显示在图1，2B，3B和4-6的图示中。当与一种或多种扩增引物结合使用时，可在加入扩增引物之前、与其并行地或在其之后向包含靶核酸分子的反应中加入信号引物。
“扩增引物”或“核酸扩增引物”是适于在LAMP反应过程中进行靶核酸分子的扩增的核酸引物。在例如下列文献中一般性地描述了LAMP反应：美国专利6,974,670，美国专利6,410,278和Notomi等人，Nucl.AcidRes.28(12):e63(2000)(此后称为“Notomi等人”)，通过引用方式全文并入本文。扩增引物以3’至5’的顺序包含：第一部分，其与靶核酸分子的部分互补；和第二部分，其与位于扩增引物的第一部分所杂交的部分的5’、但在信号引物所杂交的靶核酸分子的最近部分的3’的靶核酸分子的部分相同。扩增引物包含3'-OH基团，当扩增引物的第一部分与靶序列杂交时，其例如可通过DNA聚合酶被延伸，其中所述靶序列被用作延伸的模板。在扩增引物与靶核酸分子杂交和经杂交的扩增引物延伸之后，产生了延伸产物，其包含与在延伸过程中用作模板的靶核酸的部分互补的序列。这一延伸产物包含扩增引物和与所述扩增引物的第二部分互补的核酸序列，所述核酸序列位于离所述扩增引物部分足够数目的核苷酸远的位置，从而通过所述延伸产物的核酸序列与扩增引物部分的杂交而形成发夹结构。如此，此种延伸产物包含发夹序列并且能够形成发夹结构。不愿被任何特定理论或机制所束缚，扩增引物及其最近的信号引物与靶核酸分子相杂交后，杂交的引物沿着靶核酸分子的相对位置使得经杂交的扩增引物的延伸从靶核酸分子上置换杂交的信号引物及其延伸产物。示例性的扩增引物，FLP和RLP显示在图1-3和5中。
扩增产物、经扩增的产物或扩增子是通过扩增引物的杂交和延伸所产生的靶序列的拷贝。这些术语是指含有原始靶序列的拷贝（包括扩增反应的中间产物）的单链或双链扩增引物延伸产物。
二级扩增产物或二级产物是通过信号引物的杂交和延伸所产生的靶序列的拷贝。二级扩增产物或二级产物包含经扩增的靶序列的内部区段。这些术语也指信号引物的单链和双链延伸产物，包括产生最终双链形式的过程中的中间体。
“置换引物”是与扩增引物下游的靶核酸分子的部分互补和杂交的核酸引物。一种或多种置换引物可以例如与扩增引物联合使用而用于进行或起始LAMP反应。不愿被任何特定理论或机制所束缚，在置换引物及其最近的扩增引物与靶核酸分子杂交后，经杂交的引物沿着靶核酸分子的相对位置使得经杂交的置换引物的延伸从靶核酸分子上置换经杂交的扩增引物及其延伸产物。示例性的置换引物F3和R3显示在图1-3中。
“靶核酸分子”可以指可含有通过本文所述的方法能够检测的目的核酸的任何核酸。例如，靶核酸分子可被用于产生如本文中所述的核酸延伸产物和/或核酸检测产物。在某些实施方案中，靶核酸分子是脱氧核糖核酸(DNA)。靶核酸分子可以指取自样品的核酸，或者可以指源自从样品获得的原始核酸的核酸，例如通过一轮或多轮复制、扩增（例如，通过等温扩增）（例如一个或多个LAMP反应和/或从样品获得的原始核酸的反转录）所产生的核酸。靶核酸分子可包含对于一种或多种检测应用特别有意义的部分D或其互补物Dc。除非另行说明，术语“靶核酸分子”、“靶核酸”、“靶核酸序列”和“靶序列”在本文中可互换交换地使用。
靶核酸分子可存在于，例如生物学样品中。生物学样品可包括例如动物，植物或微生物组织、细胞、培养物和排泄物，或其提取物。此种微生物样品可包括但不限于生物学样品，例如细菌，病毒或支原体属样品，并且可例如包含基因组DNA，RNA，mRNA，rRNA等。生物学样品可来自受试者样品或患者样品，例如支气管肺泡灌洗物，支气管洗液，咽部渗出物，气管抽吸物，血液样品，血清样品，血浆样品，骨样品，皮肤样品，软组织样品，肠道样本，生殖道样本，乳汁，淋巴样品，脑脊液，胸膜液，痰样品，尿样，鼻分泌物，泪，胆汁样品，腹水样品，脓，滑液，玻璃液，阴道分泌物，精液和尿道样品。在一些实施方案中，从受试者获得了两种、三种或更多种样品。在具体的实施方案中，从受试者的两种或更多种组织、器官和/或分泌物获得了两种或更多种样品。
如本文中所使用的，“核酸检测产物”是包含目的靶核酸分子部分或其互补物的核酸分子，其中所述核酸检测产物不包含发夹核酸序列或结构。例如，核酸检测产物可包含在一种或多种检测应用中特别重要的靶核酸分子部分D或其互补物Dc。通常，核酸检测产物将不包含整个靶核酸分子。核酸检测产物将通常包含全部或基本上全部的信号引物，或其互补物。
当一种核酸的足够数目的核碱基可与第二种核酸的相应核碱基形成氢键从而所述两种核酸之间可发生配对时(“碱基配对”，通常为沃森-克里克碱基配对)，两种核酸是彼此“互补的”。如本文中所使用的，“互补”是指第一核酸与第二核酸的核苷酸之间配对的能力。两种核酸之间非互补的核碱基可被容忍，条件是所述两种核酸保持能够彼此特异性杂交。此外，第一核酸可在第二核酸的一个或多个区段上杂交，从而在杂交事件中不涉及介入性或邻近的区段。在某些实施方案中，第一核酸（例如核酸引物）或其特定部分与第二核酸（例如靶核酸分子或其特定部分）至少70%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%互补。
在某些实施方案中，引物或其特定部分与靶核酸或其特定部分完全互补(即100%互补)。如本文中所使用的，“完全互补”是指一种核酸的每个核碱基都能够与第二种核酸的相应核碱基进行准确的碱基配对。例如，20个核碱基的引物与400个核碱基长的靶序列是完全互补的，只要所述靶核酸上有相应的20个核碱基部分与所述引物是完全互补的。完全互补也可被用于指第一和/或第二核酸的特定部分。例如，30个核碱基的引物的20个核碱基的部分可与400个核碱基长的靶序列是“完全互补”的。如果所述靶序列具有相应的20个核碱基的部分，其中每个核碱基都与所述引物的20个核碱基部分互补，则30个核碱基的引物的20个核碱基的部分与靶序列是完全互补的。与此同时，整个30个核碱基的反义化合物与靶序列可完全互补或可不完全互补，这取决于所述引物的剩余10个核碱基是否也与所述靶序列互补。非互补核碱基的位置可以在所述核酸（例如引物）的5’端或3’端。备选地，所述非互补核碱基可以在所述核酸（例如引物）的内部位置。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即相连的)或非连续的。
如本文中所使用，“部分”是指靶核酸分子或引物内确定数目的连续(即相连的)核碱基。核酸序列的部分可以指整个序列的任何部分，但一般是指最少是可与互补核酸序列杂交的序列长度，例如至少5-8个核碱基。
可使用常规方法来确定两个核酸的互补百分比。例如，对于其中引物的20个核碱基中的18个与靶核酸分子的部分互补（因而将特异性杂交）的核酸引物，将代表90%的互补百分比。在此实例中，其余的非互补核碱基与互补核碱基可以是集簇的或分散的并且其彼此之间或与互补核碱基之间无需是连续的。如此，具有侧翼为两个与靶核酸完全互补的部分的2个(两个)非互补核碱基的、长度为18个核碱基的引物与靶核酸将具有90%的总体互补性。可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本的局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403410;Zhang and Madden，Genome Res.，1997，7，649 656)来确定这两个核酸的互补百分比。可通过例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，第8版用于Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，Madison Wis.)、使用默认的设置（其使用了Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482489)）来确定同源性百分比、序列同一性或互补性。
“杂交”是指互补核酸分子的退火。当两个核酸彼此“杂交”或当一个核酸与另一个“杂交”时，所述两个核酸分子显示出足够数目的互补核碱基从而所述两个核酸分子可在用于特定反应的特定条件（例如温度、盐和其它缓冲剂条件）下彼此退火。最常见的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如沃森-克里克，Hoogsteen或逆Hoogsteen氢键合)。杂交可在多种条件下发生。严格的条件是序列依赖性的并且是通过待杂交的核酸分子的性质和组成确定的。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员已知的并且已被详尽地描述了。见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.，Cold Spring HarborPress，1989;Ausubel等人，1987，Current Protocols in Molecular Biology;Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York;Tijessen，1993，Hybridization with Nucleic Acid Probes，Elsevier Science Publishers，B.V.;和Kricka，1992，Non-Isotopic DNA Probe Techniques，Academic Press，San Diego，California。
如本文中所使用的，如果第一核酸序列与第二核酸序列的互补序列充分互补从而这两个序列(即第一核酸序列和第二核酸序列的互补物)将特异性的彼此杂交时，两个核酸序列被称为彼此是“同一”的。在某些实施方案中，两个同一的核酸序列或其特定部分是100%同一的，即它们彼此享有精确的核碱基匹配。
5.2.用于产生核酸检测和二级LAMP产物的方法
虽然通常与LAMP等温核酸扩增联合进行，本文提供了允许产生核酸检测产物的方法，所述核酸检测产物不含那些使用常规LAMP所产生的核酸中存在的有问题的连结的二级结构(例如含有靶核酸分子的数个反向重复的茎环DNA和具有通过同一链中靶分子的交替反向重复之间的退火而形成的多个环的菜花样结构，每个都具有高的解链温度和强的在自身上折回的趋势)。例如，一方面，本文提供了允许在一种或多种靶核酸分子中实时、序列特异性地产生和检测一个或多个核酸序列的方法和组合物，其是通过利用信号引物或引物对与LAMP反应相结合而产生包含目的靶核酸分子部分或其互补物的核酸检测产物，其中所述核酸检测产物不包含发夹核酸序列或结构，从而使得核酸检测产物特别适于检测。例如，所述核酸检测产物可通过报告子探针的常规杂交或通过将报告子基团掺入到用于产生核酸检测产物的一个或多个信号引物中而被检测。此外，所述核酸检测产物可例如与LAMP过程并行（例如在LAMP过程中）地被实时产生，并且提供了在单一的反应容器（例如管）中、利用例如实时荧光形式来检测多种核酸检测产物的选择。
在一个实施方案中，本文提供了用于产生核酸检测产物的方法，所述方法包括：
在允许发生互补核酸杂交和核酸延伸反应的条件下将靶核酸分子和置换引物核酸F3和R3、扩增引物FLP和RLP、以及信号引物FSP和RSP相组合，
(i)所述靶核酸和每个引物核酸都包含5’端(“5’”)和3’端(“3’”);
(ii)引物核酸F3，FLP和FSP中的每一个都如下以靶核酸分子中3’至5’的顺序与靶核酸分子的不同部分互补:F3，FLP，FSP;
(iii)FLP以3’至5’的顺序包含：第一部分(F2)，其与靶核酸分子的部分(F2c)互补；和第二部分(F1c)，其与位于F2c的5’、但在FSP所互补的靶核酸的部分(FSc)的3’的靶核酸分子的部分(F1)相同;
(iv)FSP以3’至5’的顺序包含：第一部分(FS)，其与靶核酸分子的部分(FSc)互补；和任选地第二部分(S1)，其包含不与靶核酸互补的可检测的核酸序列;
(v)引物核酸R3，RLP和RSP中的每一个都如下以靶核酸分子中5’至3’的顺序与靶核酸的不同部分相同:R3，RLP，RSP;
(vi)RLP以3’至5’的顺序包含：第一部分(R2)，其与靶核酸分子的部分(R2)相同；和第二部分(R1c)，其与位于R2的3’、但在与RSP相同的靶核酸部分的(RS)的5’的靶核酸分子的部分(R1)互补;和
(vii)RSP以3’至5’的顺序包含：第一部分，其与FSc的5’的靶核酸分子的部分(RS)相同；和任选地，第二部分(S2)，其包含不与靶核酸互补的可检测的核酸序列，
从而产生了核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含R1c，R2，R1，RS，FSc和(任选地)S1c。在某些实施方案中，所述靶核酸分子包含D部分，其在FSc的5’和RS的3’，从而所产生的核酸检测产物以5’至3’的顺序包含R1c，R2，R1，RS，D和(任选地)S1c。另一方面，所述方法还包括检测所述核酸检测产物的存在和/或量。在某些实施方案中，所述方法包括检测核酸检测产物中D的存在。
在另一个实施方案中，所述方法还包括产生核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含S1，FS，RSc，R2c和R1。在某些实施方案中，所述靶核酸分子包含D部分，其在FSc的5’和RS的3’，，从而所述方法还包括产生核酸检测产物，其以5’至3’的顺序包含S1，FS，Dc，RSc，R2c和R1，其中Dc与D互补。另一方面，所述方法还包括检测所述核酸检测产物的存在和/或量。在某些实施方案中，所述方法包括检测核酸检测产物中Dc的存在。
在某些实施方案中，提供了用于从多种不同的靶核酸分子产生多种（例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种)不同的核酸检测产物的方法，其中对于每种目的靶核酸分子使用了如本文中所述的单独的核酸引物(F3，FLP，FSP，R3，RLP，RSP)组。在某些实施方案中，所述多种核酸检测产物是在单一的反应容器（例如管或孔中）产生的。在其它方面，检测了多种不同的核酸检测产物，例如是在单一反应容器（例如在管或孔中，例如以封闭的管形式）检测的。
在这种实施方案中，引物核酸FLP和RLP是适于在LAMP核酸扩增反应中使用的扩增引物。不愿被任何特定的机制或理论所束缚，所述方法包括FLP和RLP介导的LAMP核酸扩增反应。
在这种实施方案中，引物核酸FSP和RSP是信号引物的实例。
在这种实施方案中，引物核酸F3和R3是置换引物的实例。
虽然上述实施方案中使用了信号引物对，本文所提供的方法也允许在所述反应中使用单一的信号引物。
在这种实施方案中，所述信号引物可并行地与置换引物和扩增引物相组合。备选地，所述信号引物可在单独的时间（例如在置换引物之前或之后）被组合。例如，在某些实施方案中，可在扩增引物和置换引物之后约1分钟，2分钟，3分钟，4分钟，5分钟，1-5分钟，5-10分钟，10-15分钟，15-20分钟，20-25分钟，25-30分钟，30-60分钟或1-2小时后加入一种或多种信号引物，例如在杂交和延伸反应起始之后加入。
用于本文所述的方法的反应条件可有某些变化，例如取决于特定的靶核酸分子和引物分子的序列和杂交长度以及所选择的特定延伸产物反应，但是此种条件将是本领域技术人员所熟知的，并且可被常规地选择。一般地，适于本文所述的方法的条件是适于实施常规LAMP反应的条件。见例如美国专利号6,974,670(特别见第4-7栏)和6,410,278，以及Notomi等人，其中的每一篇都在此通过引用方式全文并入本文。
本文中还提供了用于通过实时引物延伸而检测LAMP反应的扩增产物的方法。在一个实施方案中，通过LAMP的靶序列鉴别是通过同时产生二级扩增产物而检测的，所述二级扩增产物的产生是与靶序列的扩增紧密配合的。在某些实施方案中，此二级扩增产物是在LAMP反应的过程中产生的，而无需任何其它的扩增步骤或操作。在一个实施方案中，所述二级扩增产物一旦被产生，不干扰或抑制所需靶序列的正常LAMP。本发明的方法因此可用于实时监控LAMP和检测靶序列的扩增，特别是在其中需要在单管形式中实时检测多种靶序列或序列变体的情形中。
在某些方面，用于LAMP的扩增引物与靶序列杂交，并且一般如美国专利6,974,670，美国专利6,410,278和Notomi等人所描述的扩增所述靶序列，在此将这些文献通过引用方式全文并入本文。如这些参考文献中所描述的，LAMP方法通过采用DNA聚合酶和识别靶DNA上总共六个不同的序列的一组四个特异设计的引物，以高的特异性、效率和速度在等温条件下扩增DNA。如Notomi等人中所描述的，在LAMP反应的过程中，含有靶DNA的有义链和反义链序列的内部引物(“扩增引物”)起始LAMP（见Notomi等人）。然后，通过外部引物(“置换引物”)引发的链置换DNA合成释放单链DNA（同上）。这作为模板用于DNA合成，通过与靶标的另一端杂交的第二扩增和置换引物引发，其产生哑铃型茎环DNA结构（同上）。然后，这种茎环DNA作为起始材料用于LAMP循环（同上）。在随后的LAMP循环中，一种扩增引物与产物上的环杂交并起始置换DNA合成，这产生了原始茎环DNA和新的茎环DNA（同上）。所述循环反应继续进行，其中在少于1小时中累积109个拷贝的靶标（同上）。最终的产物是含有靶标的数个反向重复的茎环DNA和含有多个由同一链中靶标的交替反向重复之间的退火形成的环的菜花样结构。作为结果，LAMP产生高分子量DNA，其由连结成为自我互补的发夹结构的许多拷贝的原始靶序列(和互补物)组成，由于它们高的解链温度和强的在自身上折回的趋势，它们不适于通过常规的基于探针的杂交方法检测。此外，LAMP反应的步骤被详细描述于例如美国专利6,974,670（第4-7栏）中，其公开内容通过引用方式全文并入本文。
然而，本文提供的LAMP反应进一步包括至少一个信号引物，其引起同时或并行产生二级扩增产物，用于检测、监测或定位通过LAMP反应产生的扩增产物。在一些实施方案中，所述二级扩增产物还可含有促进它的检测、捕获或固定的特征。
通过在反应混合物中包括至少一种信号引物而在本文所述的LAMP反应中产生二级扩增产物。在一些实施方案中，可优选包括两种信号引物，其与位于正向和反向LAMP扩增引物的引发位点之间的位点杂交。在其它的实施方案中，使用了三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种信号引物，其中所述信号引物可同时检测两种、三种、四种或更多种靶序列或序列变体。
在本发明的方法的某些方面，所述信号引物在扩增引物杂交位点下游与靶序列杂交。在一个实施方案中，以与扩增引物延伸相似的方式通过聚合酶延伸所述引物。所述信号引物在靶序列中的位点处杂交，使得所述扩增引物的延伸替换置换信号引物的延伸产物。在一个实施方案中，信号引物的3'端包含与靶序列杂交的序列。在某些实施方案中，整个信号引物可与靶序列杂交，例如当其未经修饰或通过添加报告子基团、标记物或亲和性配体经化学修饰而用于通过检测时。在其它实施方案中，信号引物的5’端可包含不与靶序列杂交的序列，但是其含有促进二级扩增产物的检测或捕获的特殊的核苷酸序列(通常涉及结构特征)。在一些实施方案中，当信号引物在模板上杂交和延伸时，所述化学修饰和特殊序列被掺入到二级扩增产物中。
在一个实施方案中，用于反应的模板是具有在单链中连接的互补核苷酸序列的核酸。单链是在碱基配对解离后不分离成为两个或更多个分子的链。在另一个实施方案中，在反应中作为模板的核酸含有用于在链中的互补序列之间形成环的核苷酸序列。在一个实施方案中，模板的互补核苷酸序列可以形成碱基配对或可在相同的链中退火。在一些实施方案中，所述模板核酸包含环/发夹序列，其中在弯曲的铰链部分没有碱基配对。
如本文中所使用的，在两个核酸序列的情境中，术语互补不要求完全互补，而仅仅是足够的互补性以允许所述两个核酸在所使用的条件下退火。
本文中所使用的引物通常包含这样的核酸，其在3’端提供–OH基团，所述核酸在与互补核酸序列杂交后可被延伸，例如，通过在例如核酸扩增反应中进行的酶促核酸复制。在某些实施方案中，所述引物是寡核苷酸，其包含足够长度的核苷酸从而能够与互补链进行碱基配对并且保持在合成核酸的各种反应中所给定的环境下的必要的特异性。在一些实施方案中，引物包含约5至200个核苷酸，更优选约10至50个核苷酸。在一个实施方案中，本文所述的方法采用信号引物，其在LAMP反应中不作为扩增引物起作用。任何通过此种信号引物在非靶标模板上的错误延伸而形成的延伸产物将不进行随后的扩增。在某些实施方案中，可在扩增起始之前向扩增反应中加入信号引物而没有背景信号水平的明显增加。这可大大简化检测程序并使得有可能对LAMP反应进行均质的实时分析。
靶核酸序列可以，例如被包含在生物学样品中或从生物学样品获得。生物学样品可包括例如，动物、植物或微生物组织、细胞、培养物和排泄物，或来自它们的提取物。此种微生物样品可包括但不限于生物学样品，例如细菌、病毒或支原体样品，且可以例如包含基因组DNA，RNA，mRNA，rRNA等。
在某些实施方案中，在等温条件下通过单一的酶扩增核酸。在具体的实施方案中，本文的方法可利用互补链的聚合酶催化性链置换型合成。
在某些实施方案中，本文所描述的方法是在没有温度循环时进行的。在其中将用作模板的核酸为双链的实施方案中，所述核酸可（至少最初）经历热变性以允许引物退火。
本文所述的方法可允许检测多于一种靶标，例如以序列特异性的方式进行并行或多重检测。在一些实施方案中，进行了对两种、三种、四种、五种、六种或更多种靶序列或序列变体的检测。
一方面，本发明的方法包括用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物和进行扩增的方法，所述方法包括:
(a)使第一核酸信号引物，第一核酸扩增引物和第一核酸置换引物与核酸靶序列的区域杂交;
其中所述第一核酸信号引物的至少一部分与所述第一核酸扩增引物的3’端部分所杂交的靶序列区域下游的靶序列区域杂交;
其中所述第一核酸扩增引物包含i)3’末端部分，其与第一信号引物所杂交的靶序列区域上游的靶序列区域杂交，和ii)5’末端部分，其包含与所述第一核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域下游的靶序列的区域基本上相同的核苷酸序列;和
其中所述第一核酸置换引物与所述第一核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的靶序列区域上游的靶序列区域杂交;
(b)使所杂交的第一核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物;使所杂交的第一核酸扩增引物在核酸靶序列上延伸，从而所述第一扩增引物的延伸从核酸靶序列上置换所述第一信号延伸产物;并使第一核酸置换引物延伸，从而所述第一核酸置换引物的延伸从核酸靶序列上置换第一扩增延伸产物。
如本文中所使用的，术语“下游”是指延伸产物从所指称的引物（例如上文（a）中的第一核酸扩增引物）延伸所朝向的方向或区域。如本文中所使用的，术语“上游”是指这样的区域或方向，其离开延伸产物从所指的引物（例如上文（a）中的第一信号引物）延伸所朝向的方向或区域或与之相反。
在一些实施方案中，上述方法还包括:
(a)使第二核酸信号引物，第二核酸扩增引物和第二核酸置换引物与所述第一信号延伸产物的区域杂交;
其中所述第二核酸信号引物的至少一部分与第二核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一信号延伸产物区域下游的第一信号延伸产物区域杂交;
其中所述第二核酸扩增引物包含：i)3’末端部分，其与所述第二信号引物所杂交的第一信号延伸产物区域上游的第一信号延伸产物区域杂交，和ii)5’末端部分，其包含与第二核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一信号延伸产物区域下游的第一信号延伸产物区域基本上相同的核苷酸序列;和
其中所述第二核酸置换引物与第二核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一信号延伸产物区域上游的第一信号延伸产物区域杂交;
(b)使经杂交的第二核酸信号引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物;使经杂交的第二核酸扩增引物在所述第一信号延伸产物上延伸，从而所述第二扩增引物的延伸从所述第一信号延伸产物上置换所述第二信号延伸产物;和使所述第二核酸置换引物延伸，从而所述第二核酸置换引物的延伸从所述第一信号延伸产物上置换第二扩增延伸产物。
本文中还提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物和进行扩增的方法，所述方法包括:
(a)使第二核酸信号引物，第二核酸扩增引物和第二核酸置换引物与第一信号延伸产物的区域杂交;
其中所述第二核酸信号引物的至少一部分与所述第二核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一信号延伸产物区域下游的第一信号延伸产物区域杂交;
其中所述第二核酸扩增引物包含：i)3’末端部分，其与所述第二信号引物所杂交的第一信号延伸产物区域上游的第一信号延伸产物区域杂交，和ii)5’末端部分，其包含与所述第二核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一信号延伸产物区域下游的第一信号延伸产物区域基本上相同的核苷酸序列;
其中所述第二核酸置换引物与所述第二核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一信号延伸产物区域上游的第一信号延伸产物区域杂交;
并且其中在环介导的等温扩增反应过程中，所述第一信号延伸产物与扩增同时产生;
(b)使经杂交的第二核酸信号引物在第一信号延伸产物上延伸，以产生第二信号延伸产物;使经杂交的第二核酸扩增引物在所述第一信号延伸产物上延伸，从而所述第二扩增引物的延伸从所述第一信号延伸产物上置换所述第二信号延伸产物;和使所述第二核酸置换引物延伸，从而所述第二核酸置换引物的延伸从所述第一信号延伸产物上置换第二扩增延伸产物。
在一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列的区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构，并且其中所述区域不位于发夹结构的环区域中;和
(b)使经杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含一个发夹结构。
上述方法可例如，进一步包括检测所述第一信号延伸产物。在一个实施方案中，所述信号引物包含杂交区域和报告子区域，其中所述杂交区域与核酸靶序列的区域杂交，并且其中所述报告子区域产生荧光信号。在另一个实施方案中，所述信号引物缺少报告子基团。
在另一个实施方案中，提供了用于在环介导的等温扩增反应的过程中产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构;
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含发夹结构;
(c)使核酸扩增引物与第一信号延伸产物的环区域杂交，使杂交的核酸扩增引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物和第三信号延伸产物，其中所述第二信号延伸产物缺少发夹结构;并且其中所述第三信号在其5’端具有发夹结构;
上述方法可进一步包括检测所述第二和/或第三信号延伸产物。
在另一个实施方案中，本文提供了用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
(a)使核酸信号引物与核酸靶序列区域杂交，其中所述靶序列包含至少一个在环介导的等温扩增反应过程中产生的自我互补的发夹结构;
(b)使杂交的核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物，其中所述第一信号延伸产物包含发夹结构;
(c)使核酸扩增引物与第一信号延伸产物的环区域杂交，使杂交的核酸扩增引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物和第三信号延伸产物，其中所述第二信号延伸产物缺少发夹结构;并且其中所述第三信号延伸产物是单链的且在其5’端具有发夹结构;
(d)使核酸信号引物与第三信号延伸产物杂交，使杂交的核酸信号引物在所述第三信号延伸产物上延伸以产生第四信号延伸产物，其中所述第四信号延伸产物包含双链核酸.
在一个实施方案中，上述方法还包括检测第四信号延伸产物。
在某些实施方案中，同时检测两种或更多种靶序列或序列变体，其中使用了与所述两种或更多种靶序列杂交的两种或更多种核酸信号引物。在一个实施方案中，所述两种或更多种靶序列存在于相同的连续核苷酸序列中或存在于两个不同的核苷酸序列上。在另一个实施方案中，所述两种或更多种靶序列或序列变体源自一种生物体或源自两种或更多种不同的生物体。在一些实施方案中，实时检测第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在某些实施方案中，在封闭的管形式中检测第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在其它实施方案中，在扩增后检测第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
在一个实施方案中，通过杂交探针检测第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在一个这种实施方案中，所述杂交探针是单核苷酸差异敏感探针。在另一个实施方案中，杂交探针是荧光的。在具体的实施方案中，所述杂交探针是分子信标。在另一个具体的实施方案中，使用荧光探针或经表面增强拉曼散射(SERS)标记的探针来检测第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
在某些实施方案中，所述信号引物包含杂交区域和报告子区域，其中所述杂交区域与核酸靶序列的区域杂交，并且其中通过报告子区域检测第一、第二、第三或第四信号延伸产物。在一个实施方案中，报告子基团产生荧光信号。在另一个实施方案中，报告子基团是荧光发夹。在另一个实施方案中，所述信号引物缺少报告子基团。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物是通过修饰的手段检测的，以促进掺入到信号引物之一中的信号产物的捕获。本文所述的方法可被用于检测例如，药物抗性TB。
在一个实施方案中，在LAMP反应起始后加入信号引物。例如，可在LAMP反应起始后1分钟，2分钟，3分钟，4分钟，5分钟，1-5分钟，5-10分钟，10-15分钟，15-20分钟，20-25分钟，25-30分钟或30-60分钟，或超过1小时后加入信号引物。
在另一个实施方案中，可与加入扩增引物和/或置换引物同时、或与起始LAMP反应同时向LAMP反应中加入信号引物。
本发明还可包括用于在环介导的等温扩增反应过程中同时产生信号延伸产物和进行扩增的方法，所述方法包括:
(a)使第一信号引物与靶序列的第一链杂交;
(b)使第一扩增引物在第一信号引物上游与所述靶序列的第一链杂交，其中所述第一扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，其中所述3’末端部分与靶序列的第一链杂交，所述5’末端部分包含与靶序列的第一链的任意区域基本上相同的核苷酸序列;
(c)使经杂交的第一信号引物在靶序列的第一链上延伸以产生第一信号延伸产物，并使经杂交的第一扩增引物在靶序列的第一链上延伸从而所述第一扩增引物的延伸从靶序列上置换第一信号延伸产物;
(d)使第一置换引物在第一扩增引物的上游与所述靶序列的第一链杂交，并使所述第一置换引物从其3’端延伸以从靶序列上置换所述第一扩增延伸产物;
(e)使第二信号引物与经置换的第一信号延伸产物杂交;
(f)使第二扩增引物与所述第二信号引物上游的第一信号延伸产物杂交，其中所述第二扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分与第一信号延伸产物杂交，所述5’末端部分包含与第一信号延伸产物的任意区域基本上相同的核苷酸序列;
(g)使经杂交的第二信号引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物，并使经杂交的第二扩增引物在所述第一信号延伸产物上延伸从而所述第二扩增引物的延伸从所述第一信号延伸产物上置换所述第二信号延伸产物;和
(h)使第二置换引物与所述第二扩增引物上游的第一信号延伸产物杂交，并从其3’端延伸所述第二置换引物以从第一信号延伸产物上置换所述第二扩增延伸产物。
在此种方法的一个实施方案中，所述第一信号延伸产物和第二信号延伸产物缺少自我互补的发夹结构。在此种方法的另一个实施方案中，第一信号引物的5’末端部分不包含与靶序列的第一链的任意区域基本上相同的核苷酸序列;且第二信号引物的5’末端部分不包含与第一信号延伸产物的任意区域基本上相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述方法还包括使第一信号引物与经置换的第二信号延伸产物杂交和使经杂交的第一信号引物在第二信号延伸产物上延伸从而产生了双链信号产物。
在一个实施方案中，所述方法还包括:
(a)使第二信号引物与靶序列的第二链杂交;
(b)使第二扩增引物在第二信号引物上游与靶序列的第二链杂交，其中所述第二扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，其中所述3’末端部分与靶序列的第二链杂交，且所述5’末端部分包含与靶序列的第二链的任意区域基本上相同的核苷酸序列;
(c)使经杂交的第二信号引物在靶序列的第二链上延伸以产生第三信号延伸产物和使经杂交的第二扩增引物在靶序列的第二链上延伸，从而第二扩增引物的延伸从靶序列上置换第三信号延伸产物；
(d)使第二置换引物在第二扩增引物上游与靶序列的第二链杂交，并使第二置换引物从其3’端延伸以从靶序列上置换第三扩增延伸产物;
(e)使第一信号引物与经置换的第三信号延伸产物杂交;
(f)使第一扩增引物在第一信号引物上游与第三信号延伸产物杂交，其中所述第一扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，其中所述3’末端部分与第三信号延伸产物杂交，且所述5’末端部分包含与第三信号延伸产物的任意区域基本上相同的核苷酸序列;
(g)使经杂交的第一信号引物在第三信号延伸产物上延伸以产生第四信号延伸产物和使经杂交的第一扩增引物在第三信号延伸产物上延伸从而所述第一扩增引物的延伸从第三信号延伸产物上置换第四信号延伸产物;和
(h)使第一置换引物在第一扩增引物上游与第三信号延伸产物杂交，并使第一置换引物从其3’端延伸以从第三信号延伸产物上置换第四扩增延伸产物。
这些方法可例如，进一步包括使第二信号引物与经置换的第四信号延伸产物杂交和使经杂交的第二信号引物在第四信号延伸产物上延伸从而产生双链信号产物。
在某些实施方案中，同时使用了两种或更多种靶序列或序列变体，并且从每种所述靶序列或序列变体产生信号产物和扩增产物。在这种实施方案中，可检测两种或更多种靶标或序列变体的信号延伸产物。在一些实施方案中，通过基于探针的杂交方法检测信号延伸产物。在具体的实施方案中，所述信号延伸产物是通过分子信标检测的。
在某些实施方案中，实时检测信号产物。在其它实施方案中，在扩增后检测信号产物。在具体的实施方案中，本文所述的方法可被用于检测药物抗性的TB。
上述方法的一些实施方案还包括通过化学修饰的手段或掺入到一种或多种信号引物中的特殊核苷酸序列来检测信号产物。在一个实施方案中，通过掺入到信号引物之一中的报告子基团来检测信号产物。在具体的实施方案中，报告子基团是荧光发夹。在另一个实施方案中，所述信号引物缺乏报告子基团。在其它实施方案中，所述方法还包括通过修饰手段检测信号产物以促进掺入到信号引物之一中的信号产物的捕获。
在一个实施方案中，所述信号引物在采用它们的LAMP反应中不作为扩增引物起作用。在这种实施方案中，此特征可允许信号引物被加入到扩增反应混合物中而不促进通过其它基于引物的方法所产生的高水平背景信号。相信高水平的背景信号是由于：当引物能够作为扩增引物起作用时，非特异性引发和假性引发的非靶标DNA的随后的扩增。
图1，2A，2B，3A，3B，4，5，6和7阐释了本文所提供的方法的某些实施方案，例如，其中信号引物对被用于检测靶序列的扩增的实施方案。不愿被任何特定机制或理论所限，相信在所提供的靶标产生方案中，置换、扩增和信号引物可同时与靶序列杂交，从而每个上游引物的延伸置换下游引物的延伸产物并同时产生可扩增的靶片段和二级扩增产物。
图1显示了这样的实施方案，其中信号引物FSP被包括在LAMP反应混合物中并通过信号引物的FS部分与靶序列的FSc区域杂交而在第一扩增引物下游与靶序列杂交(如本文中所使用的和此图中所示的，术语“下游”是指延伸产物从所指称的引物（在此情形中是第一扩增引物）延伸而朝向的方向或区域)。所示的FSP信号引物序列的S1部分包括报告子基团或标记物，或者是用于促进检测或捕获的结构特征。S1可杂交或可不杂交，但是在此被显示为不杂交，以表明信号引物的不同功能特征。为了这种阐释目的，S1将含有报告子基团，但是可含有其它化学修饰或结构特征。在一些实施方案中，本文中所用的信号引物缺少图1-6中所示的S1和/或S2区域。FLP是在所述信号引物的上游与靶序列杂交的LAMP扩增引物(如本文中所使用的和此图中所阐释的，术语“上游”是指这样的方向或区域，其离开延伸产物从所指称的引物（在此情形中是信号引物)延伸所朝向的方向或区域或与之相反）。FLP含有F2部分和F1c部分，其中所述F2部分与靶序列杂交，并且其中F1c部分与新合成的链的区域互补从而其在从靶序列上置换扩增引物延伸产物之后形成环结构(见结构P2)。扩增引物FLP和信号引物FSP都是使用靶序列作为模板而通过DNA聚合酶延伸的。所述信号引物延伸产物P1是通过扩增引物FLP的延伸而从模板上被置换的。扩增引物延伸产物P2继而通过置换引物F3的延伸而从模板上被置换，产生了P2和P3产物。扩增引物延伸产物的F1c区域与相同链中的F1区域杂交，从而形成在其5’末端形成环形结构。信号引物延伸产物P1是使用本文中所描述的方法独特地产生的产物。
图2A阐释了这样的实施方案，其中第二LAMP扩增引物(RLP)和第二置换引物(R3)与信号延伸产物P1(在图1中所示的扩增过程中产生的)杂交。RLP的R2部分与P1的R2c区域杂交，并且其是使用第一信号延伸产物作为模板而通过DNA聚合酶延伸的。第二扩增引物延伸产物是通过第二置换引物R3而从模板上被置换的，产生了产物P1.2和P1.3。P1.2产物的R1c区域与相同链中的R1区域杂交，从而在其5’端形成环形结构。
图2B阐释了这样的实施方案，其中第二信号引物(RSP)，第二LAMP扩增引物(RLP)和第二置换引物(R3)与信号延伸产物P1(在图1中所示的扩增过程中产生的)杂交。RSP的RS部分在第二扩增引物的下游与P1靶序列的RSc区域杂交。RSP信号引物序列的S2部分包括报告子基团或标记物，或者是促进检测或捕获的结构特征。S2与P1可杂交或不杂交(在图2B，S2不与P1杂交)。RLP是第二LAMP扩增引物，其在信号引物的上游与靶序列杂交。RLP含有R2部分和R1c部分，其中所述R2部分与靶序列杂交，并且其中R1c部分与新合成的链的区域互补，从而其在扩增引物延伸产物从靶序列上置换后形成环结构(见结构P2)。通过DNA聚合酶延伸所述产物。信号引物延伸产物P1.1是通过扩增引物RLP的延伸而从模板P1上被置换的。扩增引物延伸产物P1.2继而通过置换引物R3的延伸而从所述模板上被置换，产生了P1.2和P1.3产物。扩增引物延伸产物P1.2的R1c区域与相同链中的R1区域杂交，从而在其5’端形成环形结构。P1.1的关键特征是其缺少将阻碍通过荧光杂交探针（例如分子信标）的手段检测靶序列的发夹结构。由于发夹的所述缺少，可通过分子信标或其它探针(例如SNP灵敏探针)来检测此类二级LAMP产物中的突变(例如单核苷酸差异或SNP)或序列变化。
图3A阐释了这样的实施方案，其中第二LAMP扩增引物(RLP)和第二置换引物(R3)与扩增延伸产物P2(在图1中所示的扩增过程中产生的)杂交。RLP的R2部分与P2的R2c区域杂交，并且通过DNA聚合酶被延伸。通过第二置换引物R3而使第二扩增引物延伸产物从其模板上被置换，产生了产物P2.2和P2.3。P2.2产物的R1c区域与相同链中的R1区域杂交，因而在其5’端形成环形结构。因为P2模板在其5’端含有环结构，所产生的P2.2产物在5’末端和3’末端都有环的特征，这产生了哑铃形的结构。
图3B显示了这样的实施方案，其中第二信号引物(RSP)、第二LAMP扩增引物(RLP)和第二置换引物(R3)与信号延伸产物P2(在图1中所示的扩增过程中产生的)杂交。RSP的RS部分在第二扩增引物下游与P1靶序列的RSc区域杂交。RSP信号引物序列的S2部分包括报告子基团或标记物，或者其为促进检测或捕获的结构特征。S2与P2可杂交或可不杂交(在图3B中，S2不与P2杂交)。RLP是第二LAMP扩增引物，其在信号引物上游与靶序列杂交。RLP含有R2部分和R1c部分，其中所述R2部分与靶序列杂交，且其中R1c部分与新合成的链的区域互补，从而其在从靶序列上置换扩增引物延伸产物后形成环结构(见结构P2.2)。通过DNA聚合酶延伸所述产物。通过扩增引物RLP的延伸而从模板P2上置换信号引物延伸产物P2.1。扩增引物延伸产物P2.2继而通过置换引物R3的延伸而从所述模板上被置换，这产生了P2.2和P2.3产物。扩增引物延伸产物P2.2的R1c区域与相同链中的R1区域杂交，因而在其5’末端形成了环形结构。因为P2模板在其5’末端含有环结构，所产生的P2.2产物在5’和3’末端都有环的特征，这产生了哑铃形的结构。
图4阐释了这样的实施方案，其中第一信号引物(FSP)与延伸产物P2.2(在图3A和3B中所示的扩增过程中产生的)杂交，其中P2.2在其5’和3’末端含有在LAMP反应过程中产生的哑铃环结构。FSP引物的FS部分与P2.2的FSc部分杂交，其是通过DNA聚合酶被延伸的。如图4中所示，延伸产物通过内部5’至3’的延伸被置换以产生P2.2.1和P.2.2.2，其中P2.2.1产物是双链，并且P2.2.2信号延伸产物在其3’末端含有环并可通过DNA聚合酶被延伸以形成双链产物P2.2.2.1。
图5阐释了这样的实施方案，其中第二扩增引物(RLP)与延伸产物P2.2.2.1(在图4中所示的扩增过程中产生的)杂交，其中RLP与P.2.2.2.1的环区域内部的序列杂交，所述区域不与相对的链形成碱基配对。RLP引物的R2部分与P.2.2.2.1的环中的R2c部分杂交，并且其通过DNA聚合酶被延伸以产生P.2.2.2.1.2，其中这种延伸打开P.2.2.2.1的环区域以形成P.2.2.2.1.2。此外，第一信号引物(FSP)与P.2.2.2.1.2杂交，其中FSP的FS部分与FSc杂交且S1部分与S1c杂交，并且其通过DNA聚合酶被延伸，其中此种延伸从P.2.2.2.1.2上置换延伸产物P.2.2.2.1.1并且还产生双链产物P.2.2.2.1.3。P.2.2.2.1.1是单链的。
图6阐释了这样的实施方案，其中第一信号引物(FSP)与延伸产物P.2.2.2.1.1杂交并且通过DNA聚合酶被延伸以产生双链产物P.2.2.2.1.1c。
在一个实施方案中，在LAMP反应起始后（例如在LAMP反应起始后1分钟，2分钟，3分钟，4分钟，5分钟，1-5分钟，5-10分钟，10-15分钟，15-20分钟，20-25分钟，25-30分钟或30-60分钟，或超过1小时之后）加入信号引物(例如图1-6中所示的FSP和/或RSP)。在一些实施方案中，不同时向扩增反应中加入信号引物和LAMP扩增引物。在一个这种实施方案中，不产生图1，2B和3B中所示的信号延伸产物，因为在加入信号引物时，LAMP反应中的所有DNA都被转化为了双链产物(例如P3(见图1))或转化为产物(例如P2.2(见图4))。在另一个这种实施方案中，产生了图4，5和6中所示类型的信号延伸产物。在一些这种实施方案中，所有所产生的信号延伸产物具有至少一个与下列的结构基本上相似或相同的结构：P.2.2.1，P2.2.2或P.2.2.2.1(如图4中所示的)之一，或者P.2.2.2.1.2或P.2.2.2.1.3或P.2.2.2.1.1.(如图5中所示的)，或者P.2.2.2.1.1c(如图6中所述的)。在其它此种实施方案中，所述方法不产生信号延伸产物，例如P1(图1中所示的)，P1.1(图2B)或P2.1(图3B中所示的)。
提供了图1-6仅用于阐释性目的，且没有显示在LAMP反应过程中所产生的全部分子种类，这些图也没有显示当二级引物（例如FSP和RSP）被包括在LAMP反应中时所形成的二级产物的多样性。类似地，图1-6仅示例了所述方法的LAMP反应的一些产物和在LAMP反应过程中所产生的一些二级产物。此外，所提供的扩增反应的延伸产物（例如P1.1）将通过许多涉及LAMP反应中的各种中间产物的途径被产生。
本文所提供的方法还涉及环引物在LAMP扩增反应中的应用，例如环引物。见例如Nagamine等人(Mol.and Cell.Probes 16，223-229(2002))。这种环引物通常与LAMP扩增反应产物的茎环杂交，但不与扩增引物所杂交的环杂交。此类环引物的用途可例如实质上减少LAMP反应时间。在这种实施方案中，本发明的方法可例如额外地含有环引物。例如，所述方法可利用一种或两种环引物而用于一种靶序列的扩增，或例如可利用三种、四种、五种、六种或更多种环引物，这取决于待扩增和/或检测的靶序列的数目。此种环引物可例如与图1，3A或3B中区域F2和F1之间的P2中的单链环杂交；或者与图2A或2B中区域R2和R1之间的P1.2中的环杂交；或者与图3A或4中P2.2中的环杂交。
本发明的方法可例如，包括在少于10分钟，少于15分钟，少于20分钟，少于30分钟，少于45分钟，少于50分钟，少于60分钟或者少于1.5小时或少于2小时，或少于3小时中产生和/或检测二级LAMP信号延伸产物。
5.3.用于核酸检测和二级LAMP产物的检测的方法
本文所述的核酸检测产物和二级LAMP产物的关键特征是不含发夹，潜在的发夹结构，或能够形成发夹结构的发夹序列，其将妨碍通过常规技术（例如分子信标）来检测惯常的LAMP产物。如此，可常规地使用本领域技术人员已知的、用于检测核酸序列的任何技术（例如通过探针或其它序列杂交）来检测本文中所述的核酸检测产物和二级LAMP产物。下面所提供的是可常规地用于此种检测的技术的示例性、非限制性实例。
在一个实施方案中，可通过杂交探针来检测包含在如上文所述的和图1-6中所阐释的产生的二级产物的序列D中的特定靶序列。杂交探针可以是与靶核酸序列杂交并促进其检测的任何核酸。通常，杂交探针是各种长度(例如从约10，25，50或100碱基，直至约200，300，400，500，600.700，800，900，1000，1200，1500或2000个碱基长)的核酸片段，其用于检测核酸样品中与探针中的序列互补的核苷酸序列(DNA靶标)的存在。在一些实施方案中，探针通过与单链核酸杂交而起作用，由于探针和靶标之间的互补性，所述单链核酸的碱基序列允许探针-靶标碱基配对。在某些实施方案中，为了检测探针与其靶序列的杂交，用可检测的标志物对所述探针加标签或进行标记。可检测的标志物可以是例如放射性同位素、基于抗体的标志物、基于荧光的标志物、或任何其它标志物。在一个实施方案中，所述分子标志物是非放射性的。在另一个实施方案中，所述探针以荧光标记物进行标记。在具体的实施方案中，使用杂交探针的靶标检测方法采用荧光猝灭技术。在一些实施方案中，经标记的探针首先被变性(通过加热或在碱性条件下)成为单DNA链，然后与靶核酸杂交。在具体的实施方案中，所使用的分子标志物适于实时监测特定核酸的合成。
在一个实施方案中，通过使用含有供体荧光团和接受体荧光团的寡核苷酸来检测特定的靶序列，从而当所述寡核苷酸是未杂交的和/或当它与其互补序列杂交时，在荧光特性方面有可检测的差异。在这种形式中，当所述寡核苷酸杂交时，供体荧光通常增加且能量转移/猝灭减少。例如，在任一端被标记的自我互补的寡核苷酸可形成发夹，其使得两个荧光团(例如5'和3'端)极为贴近，其中可发生能量转移和猝灭。自我互补的寡核苷酸与第二种寡核苷酸上其互补物的杂交破坏所述发夹并增加两种染料之间的距离，因而减少猝灭。已知此种发夹结构是非常稳定的，从而向未猝灭的、经杂交形式的转化通常是慢的并且仅中等地被促进。
在具体的实施方案中，可使用分子信标来检测特定的靶序列。当它们与其靶标杂交时，所述分子信标是经历自发荧光构象改变的核酸探针。Tyagi和Kramer，“Molecular Beacon:Probes that Fluoresce uponHybridization”Nature Biotechnology 14，303-308(1996)，通过引用方式全文并入本文。分子信标是具有内部猝灭的荧光团的发夹型分子，当它们与靶标核酸序列结合时，其荧光被恢复。特别地，分子信标是含有检测子序列的发夹，所述检测子序列在形成茎的发夹的自我互补臂之间的环中。碱基配对的茎必须解链以使检测子序列与靶标杂交并引起猝灭的减少。分子信标特别适于实时监测特定核酸的合成（同上）。当用于核酸扩增测定中时，用分子信标进行的基因检测是均质且灵敏的，并且可在密封的管中进行（同上）。典型的分子信标探针约25个核苷酸长。在这种典型的探针中，中间的约15个核苷酸与靶DNA互补并且不彼此配对，且每一端的5个(约5个)核苷酸彼此互补且不与靶DNA互补。然而，在本发明的方法中，可使用从10，15或20个核苷酸长到30，40，50，60，70，80，100，150，200，300或直至500个核苷酸长的探针，并且所述探针的中间区域和末端区域的长度可变化。使用分子信标对于SNP的检测是特别有利的。
在某些实施方案中，可使用“双发夹”探针，并且使用此类探针的方法由B.Bagwell等人所描述(1994.Nucl.Acids Res.22，2424-2425;美国专利号5,607,834)，通过引用方式并入本文。这些结构在发夹内含有靶结合序列并因此涉及靶标和发夹的自我互补序列之间的竞争性杂交。
在其它实施方案中，使用了经SERS标记的杂交探针(例如SERS免洗测定)。在例如下列中详细描述了此类探针，Natan，Proceedings of theNanoEurope(2008)，其公开内容通过引用方式全文并入本文。在其它实施方案中，使用了用于与美国专利号5,550,025(涉及亲脂性染料和限制性位点的掺入)和美国专利号5,593,867(涉及荧光极化检测)中所描述的信号引物一起使用的检测方法;并且美国专利号5,550,025和美国专利号5,593,867的公开内容通过引用方式全文并入本文。
在某些实施方案中，可使用杂交探针（例如分子信标）来检测单链核酸产物。如果产物是双链DNA，其可经受热或其它变性方法以将其转化为单链产物。在具体的实施方案中，杂交探针与单链信号延伸产物、经受了变性的双链信号延伸产物杂交，但是不与含有发夹的双链产物杂交。此类P1.1的产物的关键特征是它们缺少将阻碍通过荧光杂交探针的手段（例如分子信标）检测靶序列的发夹结构。由于所述发夹的这种缺少，可通过分子信标或其它探针(例如，SNP灵敏探针)检测此种二级LAMP产物中的突变(例如，单核苷酸差异或SNP)或序列变化。此外，如果此种序列经受热变性，分子信标能够结合P1.3(见图2B)或P2.2.2.1.3(见图5)。分子信标也能够结合P1.2，因为P1.2中的D序列是单链的(见图2B)。在其它实施方案中，分子信标优先结合例如P2.2.2.1.1的延伸产物(见图5)，因为这种产物是单链的。
在一些实施方案中，二级LAMP产物可以以扩增后形式被检测。在这种实施方案中，在完成本文所述的LAMP扩增反应之后，可向反应混合物中加入本文所述的杂交探针。在一些实施方案中，在本文所述的LAMP反应起始之后至少5，10，15，20，30，45分钟或1小时之后加入杂交探针。在其它实施方案中，在扩增反应终止之后，向反应中加入杂交探针。在一些实施方案中，在加入杂交探针（例如分子信标）之前，通过热变性停止LAMP反应。
在其它实施方案中，可在扩增反应的过程中检测二级LAMP产物。在一些实施方案中，与至少一种信号引物同时向反应混合物中加入本文所述的杂交探针。在本发明的方法的其它实施方案中，向所述反应中同时加入至少一种LAMP扩增引物，至少一种信号引物和至少一种杂交探针。
在一个实施方案中，在本发明的方法中使用的信号引物自身可作为报告子基团起作用。
在某些实施方案中，信号引物的5’端可包含不与靶序列杂交但含有促进二级扩增产物的检测或捕获的特殊核苷酸序列(通常涉及结构特征)的序列。化学修饰的实例包括亲和性配体(例如，亲和素，链霉亲和素，生物素，半抗原，抗原和抗体)和报告子基团(标记物，例如放射性同位素，荧光染料，发生反应以产生可检测的反应产物的酶，和可见的染料)。特殊核苷酸序列的实例包括(i)将通过经标记的寡核苷酸探针与双链二级扩增产物的杂交形成三螺旋的序列，和(ii)双链的DNA结合蛋白的识别位点，当在扩增过程中使所述位点成为双链时，其能够结合所述双链的DNA结合蛋白(例如，抑制子，调控蛋白，限制性核酸内切酶，RNA聚合酶)。
在一个实施方案中，信号引物可含有捕获基团或报告子基团，且靶序列本身或扩增引物可任选地提供第二捕获或报告子基团。备选地，当需要捕获和报告子基团二者时，信号引物可含有捕获和报告子基团二者，它们仅在信号寡核苷酸成为双链时联合作用。仅当靶序列的存在诱导引发、延伸、置换和再引发时形成这种结构。这种双功能性信号引物也可形成各种均质检测方法的基础，例如荧光各向异性或荧光能量转移。
当所述方法采用与双链靶序列的相反的链杂交的两种信号引物时，所述信号引物之一可包含特殊的核苷酸序列或化学修饰以促进二级扩增产物的捕获或固定，而另一种信号引物可含有可检测的报告子基团或标记物以用于检测经捕获或固定的二级扩增产物。标记物和报告子基团用于检测核酸的应用以及配体、化学修饰和核酸结构特征用于捕获或固定核酸的应用是本领域中熟知的。
在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的信号引物自身可作为报告子基团起作用。在一些实施方案中，引物FSP的序列S1和/或引物RSP的序列S2(见图1，2B，3B，4，5和6)可作为报告子基团起作用。在某些实施方案中，信号引物的报告子基团含有荧光团。在具体的实施方案中，信号引物的报告子基团含有荧光发夹。在其它实施方案中，信号引物的报告子基团不是荧光发夹。在一个实施方案中，所述信号引物含有报告子基团(例如荧光标记物)和靶结合序列，所述报告子基团完全或部分地位于所述信号引物的单链区域的一端，所述靶结合序列位于所述信号引物的单链区域的另一端。在另一个实施方案中，信号引物的靶结合序列被包含在信号引物的两个含有荧光团的区域的中间，从而在与靶标杂交之前，靶结合序列被包含在分子内碱基配对的二级结构内。
美国专利号5,928,869中描述了荧光发夹技术，通过引用方式全文并入本文。这种技术采用检测子寡核苷酸，用于通过以靶标依赖性的方式减少荧光猝灭来检测核酸靶序列。在这种方法中，靶结合序列完全或部分地位于单链“尾”区域中。因此，二级结构(例如发夹)无需解折叠以与靶标初始杂交。检测子寡核苷酸形成分子内碱基配对的二级结构并含有连接的供体/接受体染料对，使得荧光猝灭在没有靶标时发生。靶标存在时检测子寡核苷酸中分子内碱基配对二级结构的解折叠或线性化增加染料之间的距离并减少荧光猝灭。碱基配对的二级结构的解折叠通常涉及二级结构和互补链的序列之间的分子间碱基配对，从而二级结构被至少部分地破坏。在这种技术的实施方案之一中，限制性核酸内切酶识别位点(RERS)存在于两种染料之间，从而二级结构和互补链之间的分子间碱基配对也使得RERS成为双链且可被限制性核酸内切酶剪切或产生缺口。通过限制性核酸内切酶进行的剪切或产生缺口将供体和接受体染料分离到分别的核酸片段上，这进一步促成减少的猝灭。
在一个实施方案中，引物FSP的序列S1和/或引物RSP的序列S2含有荧光发夹。如果引物FSP的序列S1含有荧光发夹，其将在如下列中所示的延伸过程中变为解折叠的：图2B(延伸产物P1.3)，图4(延伸产物P2.2.2.1)，图5(延伸产物P.2.2.2.1.2和P.2.2.2.1.3)或图6(延伸产物P2.2.2.1.1c)，并将因此产生荧光信号。
本文中所涉及的是用于通过含有报告子基团的信号引物（例如S1或S2）来检测靶标扩增的方法，其中报告子基团可含有荧光标记物，并且其中所述报告子基团在为双链时产生荧光信号，但是当为单链时是惰性的。例如，在这种实施方案中，当产生产物P.2.2.2.1.3(见图5)或产物P2.2.2.1.1c(见图6)时，报告子基团将产生荧光信号信号。
此外，也可使用与靶标位点R4和F4杂交并从所述位点延伸的携带发夹的引物产生荧光二级产物(见图1-5)。
在任何采用荧光猝灭技术的所述方法中，可监测荧光参数方面的相关改变(例如，供体荧光强度的增加，接受体荧光强度或解折叠之前和之后荧光比率的减少)作为靶序列的存在的指示。
在一个实施方案中，杂交探针或报告子基团可产生发光信号。
备选地，在其它实施方案中，所述信号引物可以是未修饰的，例如没有用于促进二级扩增产物的检测或捕获的报告子基团、捕获基团或结构特征。可基于其大小（例如通过凝胶电泳和溴乙锭染色）来检测二级扩增产物。
本发明的方法可大大简化基于引物的检测方法的程序，所述方法以往依赖于两个连续的扩增反应以获得高灵敏性和特异性，其中第二个反应是以内部嵌套的信号产生性扩增引物进行的。
5.4.用于产生和检测二级LAMP产物的试剂盒
本文中提供了用于产生和检测核酸检测产物和二级LAMP产物的试剂盒，所述试剂盒包括(i)核酸信号引物，其中所述核酸信号引物的至少一部分与第一靶序列区域杂交，(ii)核酸扩增引物，其中所述扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分在信号引物所杂交的第一靶序列区域上游与第二靶序列区域杂交，且所述5’末端部分包含与3’末端部分所杂交的第二靶序列区域下游的靶序列的第三区域基本上相同的核苷酸序列，和(iii)置换引物，其与第四靶序列区域杂交，所述第四靶序列区域在核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第二靶序列区域的上游。
本文中还提供了用于产生和检测核酸检测产物和二级LAMP产物的试剂盒，所述试剂盒包括第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含LAMP反应成分，所述第二组分包含用于产生核酸检测产物和二级LAMP产物的成分。在一个此种实施方案中，所述试剂盒的第一组分包含(i)扩增引物，其中所述扩增引物包含3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分与靶序列的第一区域杂交，所述5’末端部分包含与3’末端部分所杂交的第二靶序列区域下游的靶序列的第二区域基本上相同的核苷酸序列，和(ii)置换引物，其与核酸扩增引物的3’末端部分所杂交的第一靶序列区域上游的第三靶序列区域杂交。
在这种实施方案中，所述试剂盒的第二组分可以包含核酸信号引物，其中所述核酸信号引物的至少一部分与第四靶序列区域杂交，所述第四靶序列区域位于扩增引物所杂交的第一靶序列区域的下游。在一个实施方案中，可将所述第一组分内容与所起始的LAMP反应相组合。在一个这种实施方案中，反应是通过加入DNA聚合酶加工链置换活性而起始的。此外，在这种实施方案中，可加入第二组分（例如晚于反应混合物而加入），例如在反应起始30秒后，在反应起始约1分钟后，在LAMP反应起始1.5分钟后，2分钟后，3分钟后，4分钟后，5分钟，6，7，8，9，10，11，12，3，14，15，20，25，30，35，40，45分钟后或直至1小时后。在另一个实施方案中，在起始LAMP反应之前将所述第一组分和第二组分相组合。在另一个实施方案中，在反应起始时将所述第一组分和第二组分相组合，例如其中将所述第一组分、第二组分和DNA聚合酶相组合以开始扩增反应。
在某些实施方案中，任何所述试剂盒可进一步包括(i)与第二靶序列杂交的第二核酸信号引物，(ii)与第二靶序列杂交的第二核酸扩增引物，和(iii)与第二靶序列杂交的第二置换引物。
在另一个实施方案中，任何所述试剂盒可进一步包含(i)与第三靶序列杂交的第三核酸信号引物，(ii)与第三靶序列杂交的第三核酸扩增引物，和(iii)与第三靶序列杂交的第三置换引物。在另一个实施方案中，任何所述试剂盒可进一步包含(i)与第四靶序列杂交的第四核酸信号引物，(ii)与第四靶序列杂交的第四核酸扩增引物，和(iii)与第四靶序列杂交的第四置换引物。此外，本文涉及这样的试剂盒，其中使用本发明的方法扩增和检测5，6，7或更多种靶序列。
在一个实施方案中，任何所述试剂盒可进一步包括杂交探针。在一个具体实施方案中，所述杂交探针是分子信标。
在一些实施方案中，任何上述试剂盒中的信号引物还包含报告子区域。在一个实施方案中，这种报告子基团产生荧光信号。在一个具体实施方案中，所述报告子基团是荧光发夹。在一个实施方案中，任何上述试剂盒中的核酸靶序列是结核分枝杆菌的序列。
5.5.试剂盒和方法的应用
本文所描述的方法和试剂盒可允许例如，两种或更多种(潜在)靶标或序列变体的多重检测。特别地，本发明的方法和试剂盒可允许实时和在单一封闭的管形式中进行对(潜在的)靶标的这种检测。
本发明的方法的应用可包括例如，检测样品中的目的遗传材料，例如，检测样品中特定的微生物核酸。应用可包括例如，传染性疾病、遗传病症和遗传特征的诊断。特别地，本文提供的方法和试剂盒可用于任何下列生物学或临床应用中，其中需要实时检测生物学样品中的基因、基因序列、基因中的突变(例如缺失，插入，点突变或SNP)。更特别地，当需要检测生物学样品中的两种或更多种基因、基因序列、或基因中的突变时，所述试剂盒和方法可以是特别有利的。
例如，在一个示例性的、非限制性实例中，本文所提供的方法和试剂盒的一种应用是检测样品（例如患者样品）中的细菌、病毒或寄生虫核酸。例如，本文所提供的方法和试剂盒可用于检测细菌中与药物抗性相关的突变。在一个具体实施方案中，本文所述的方法和试剂盒可用于检测分枝杆菌(例如结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌（M.avium），麻风杆菌（M.leprae），非洲分枝杆菌（M.africanum），细胞内分枝杆菌（M.intracellulare），耻垢分枝杆菌（M.smegmatis），田鼠分枝杆菌（M.microti），牛分枝杆菌（M.bovis），偶发分枝杆菌（M.fortuitum）和/或罕见分枝杆菌（M.peregrinum））的存在或检测分枝杆菌中的药物抗性突变。分枝杆菌引起全世界可观的人类发病率和死亡率，特别是作为由结核分枝杆菌引起的复发感染和在患有AIDS的患者中出现鸟分枝杆菌复合体(MAC)疾病(见Musser，Clin.Microbiol.Reviews 8(4):496-514(1995))的结果。在更具体的实施例中，本文所述的方法和试剂盒可用于检测如实施例1和2中所描述的结核分枝杆菌中的药物抗性突变。
因此，本文所提供的方法和试剂可用于诊断肺结核，和/或与分枝杆菌相关的其它传染性疾病，用于诊断是否存在药物抗性的分枝杆菌菌株和/或鉴别引起所述药物抗性的特定突变。在另一个具体的实施方案中，本发明的方法可用于简单和有成本划算地诊断患者中的MAC或其它传染性疾病，和/或用于鉴别患者中对MAC的微生物抗性的基础。在一个实施方案中，所述患者是人。在另一个实施方案中，所述患者是AIDS患者。
下面所示的实施例是用于协助理解本文所提供的主题且不应被解释为特定地限制本文中所描述和要求保护的发明。本领域技术人员眼界之内的本发明的变化（包括所有现在已知或今后开发的等同方案的取代），以及制剂的改变或实验设计的微小变化也在本申请的范围之内。
6.实施例
6.1实施例1
此实施例阐述了信号引物和本文所提供的方法在LAMP反应中的应用，以产生促进检测rpoB基因中与结核分枝杆菌对抗生素利福平的抗性相关的突变的核酸检测产物。
图7显示了用于通过LAMP扩增的结核分枝杆菌rpoB基因的区域(仅显示了两条互补靶标链之一;GenBank登录号:L27989，核苷酸2211-2546)。显示了被各种引物识别的序列(命名是在图1-6a中所使用的那些)以及目的靶区域(Dc)。在这一实施例中，Dc代表81个核苷酸的“核心”序列，其编码结核分枝杆菌中RNA聚合酶的活性位点。95％的已知对于抗生素利福平有抗性的结核分枝杆菌菌株在该核心序列中含有突变。此外，此核心序列中所有已知的突变都已知与结核分枝杆菌中的利福平抗性相关(Musser，Clin.Microbiol.Rev.8，496-514，1995，通过引用而并入)。这些抗性相关突变中的大多数是单核苷酸改变。
基于Eiken基因组网址
(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html)上提供的指南设计了rpoB靶序列的LAMP引物。设计了加速总体LAMP反应的所谓环引物（如Nagamine等人所描述的，Molecular and Cellular Probes(2002)16，223-229)，以识别环序列F4和R4。所述信号引物被设计为识别在图7中标示为FS的区域互补的序列。
以下是各种引物的DNA寡核苷酸序列:
正向LAMP引物，FLP(SEQ ID NO:1):
5’ACCACCGGCCGGATGTTGGATGACCACCCAGGACGTGGAGGCGAT
反向LAMP引物，RLP(SEQ ID NO:2):
5’CCGGCGGTCTGTCACGTGAaGGCCGTAGTGtGACGGGTGCACGT
正向外引物，F3(SEQ ID NO:3):
5’CGGGTCGGCATGTCGCGGATGGAGC
反向外引物，R3(SEQ ID NO:4):
5’CCCTCAGGGGTTTCGATCGGGCACAT
正向信号引物，FSP(SEQ ID NO:5):
5’CGCCGCGATCAAGGAGTTCTTC
正向环引物，FLoop(F4)(SEQ ID NO:6):
5’ATCAACGTCTGCGGTGT
反向环引物，RLoop(R4)(SEQ ID NO:7):
5’CCGGGCTGGAGGTCCGC
SEQ ID NO:2(反向LAMP引物)中由小写字母显示的核苷酸是在那些核苷酸位置有别于GenBank序列的。将这些改变设计到引物中以破坏引物内潜在有问题的二级结构，而仍允许与靶序列杂交和环介导的靶序列扩增。
在适于LAMP的反应条件下(见下文)，此引物集合通过图1-6中所示的一系列延伸和置换步骤扩增带有rpoB的81bp核心的所需靶区域(D及其互补序列Dc)。信号引物FSP在这些反应步骤中的存在引起分子P2.2.2.1.1及其互补链(P2.2.2.1.1c)的形成(图6)。在扩增之前，这些二级LAMP产物中的每一个都含有单一拷贝的81个核苷酸的rpoB核心序列(任一链)，其可含有或可不含有与利福平抗性相关的突变，这取决于基因组靶序列中是否存在所述突变。这些二级LAMP产物的关键特征是不存在将覆盖rpoB核心序列从而妨碍通过常规的基于杂交的探针手段（例如分子信标）来检测此靶序列的潜在的发夹。
如El-Hajj等人(J.Clin.Micro.39，4131-4137(2001)，通过引用方式并入本文)所述的，可使用一组5种经不同标记的分子信标来在封闭的单管测定中检测81 rpoB核心序列中任何突变的存在。所述测定依赖于下列事实：分子信标仅与完全互补于探针的靶序列杂交。因此，仅当靶序列与探针完全互补时才产生荧光信号—少至靶序列中一个单核苷酸的改变都将防止分子信标结合，使所述信标以非荧光发夹状态折叠。可通过采用5种分子信标的组合（它们一起跨越整个核心序列）来检测81bp核心序列中任何突变的存在，其中每个信标带有不同颜色的荧光团且每个都被设计为与所述核心序列的不同区段内的野生型序列互补。在野生型靶标的存在下，所有的分子信标将与其相应的靶区段结合，每种信标产生不同颜色的荧光，将产生五种不同的荧光信号。任何指定区段中的突变都将阻止对应于那个区段的信标的结合并导致没有相应的荧光信号，而对应于其余野生型区段的信标将继续结合靶标并发荧光。因此，缺少5个荧光信号中的任一个就表示存在利福平抗性的结核分枝杆菌。存在来自所有5种分子信标的信号表示对于利福平的敏感性。
下列分子信标(取自J.Clin.Micro.39，4131-4137(2001))可用于检测LAMP二级产物中所含有的rpoB序列中的突变：
探针A(SEQ ID NO:31):5’-得克萨斯红-TTTTTT-荧光素-CGAGCTCAGCTGGCTGGTGCCTCG-dabcyl-3’
探针B(SEQ ID NO:32):5’-四氯荧光素-GCTACGAGCCAATTCATGGACCAGACGTAGC-dabcyl 3’
探针C(SEQ ID NO:33):5’-四甲基罗丹明-TTTTTT-荧光素-CCGACGCCGACAGCGGGTTGTTCGTCGG-dabcyl-3’
探针D(SEQ ID NO:34):5’-罗丹明-TTTTTT-荧光素-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-dabcyl-3’
探针E(SEQ ID NO:35):5’-荧光素-CCTGCCGCCGACTGTCGGCGCTGGCAGG-dabcyl-3’
每种探针中加下划线的序列与rpoB核心内的野生型序列互补。探针A，C和D与野生型序列的链Dc杂交，而探针B和E结合链D或野生型序列。可使用除上文所列的那些以外的分子信标来代替本文中所示的那些。有可能用少于5种分子信标来覆盖所述81bp的核心序列。关键特征是，合起来，分子信标的组合应跨越81bp的核心序列，并且每种单独的信标（或探针)必须能够区分其预期靶区段的序列内的任何单核苷酸变化。对于单管测定，每种信标还必须经染料标记，所述染料能够区别于标记所述测定中所使用的其它信标的染料。
用于rpoB基因的81bp核心序列中的突变的封闭管均质测定可如下进行：由包含在痰样品或阳性生长培养物中的细菌制备结核分枝杆菌的基因组DNA，如Down等人所描述的（J.Clin.Micro.34，860-865.(1996))。然后使所产生的基因组DNA样品经受LAMP扩增反应。可在96孔微量滴定板中进行扩增，其中每个孔含有由下列组分组成的50μL总反应体积:1M甜菜碱(Sigma)，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，4mM MgSO4;0.1% tritonX-100;dATP，dCTP，dGTP和dTTP各400μM;16个单位的Bst DNA聚合酶靶片段(New EnglandBiolabs);引物FLP和RLP，各800nM;引物F3和F4，各200nM;环引物F4和R4，各400nM;信号引物FSP，800nM;分子信标探针A，B，C，D和E，各200nM;和靶标样品(5μL)。在组合了所有组分后，将反应孔密封，然后在Applied Biosystems 7700Prism荧光光谱热循环仪上、在60℃孵育。使扩增进行60min，并在整个扩增反应的过程中测量每个孔中的荧光。由在扩增开始后的第3和第6分钟之间取的读数确定每种探针的背景荧光，并且这些值被用作每种探针的基线。
将混合物在60℃孵育60min后，将反应混合物简短地加热至90℃可以是有利的，其终止LAMP过程，并且可促进分子信标探针与从信号引物产生的LAMP二级产物的杂交。
从各种已知rpoB突变的LAMP测定所预期的结果显示在表1中。
表1.由rpoB＊的各种已知突变所预期的LAMP测定结果
＊注意:表1中所列的突变取自Musser，Clin Microbiol.Rev.，1995，496-514;然而，该出版物中所提供的编号方案是基于经翻译的大肠杆菌rpoB序列与结核分枝杆菌序列的一部分之间的比对而指定的(原始由Telenti等人(Lancet 341，647-650，1993)提供，并且不是实际的结核分枝杆菌密码子/核苷酸的真实位置。使用rpoB的完整基因序列作为参考序列(由Miller等人确定，Antimicrob.Agents Chemother.38，805-811，(1994);GenBank登录号L27989)，更正了表1中的编号系统以反映结核分枝杆菌的rpoB中核苷酸和密码子的实际位置)。表1中所示的突变的位置相对于结核分枝杆菌序列中第1个密码子的第1个核苷酸。表2含有Telanti/Musser和Miller等人的编号方案的比较。表2中还显示了被设计用于检测(通过杂交失败)所示密码子中的突变的分子信标探针。
表2.rpoB编号系统的比较
6.2.实施例2
此实施例阐述了信号引物在LAMP反应中的应用以促进同时检测结核分枝杆菌中与异烟肼抗性相关的突变。已知katG基因的密码子315或inhA转录物中的核糖体结合位点中的突变对最多75%的抗性菌株负有责任(Piatek等人，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44:103-110)。通过采用两个靶标特异性LAMP反应和相关的信号引物及分子信标，本实施例中所描述的测定法被设计为用于在单一的反应管中同时检测katG和inhA突变。所述反应管还含有用于第三个LAMP反应的引物和探针，所述第三个LAMP反应被设计为用于扩增结核分枝杆菌gyrB基因的区域作为验证来自细菌的DNA的存在的手段。通过置换(在LAMP过程中)与经荧光标记的正向lamp引物的5’端杂交的带有猝灭剂标签的寡核苷酸而实现gyrB靶标的基于LAMP的检测。
图8-10显示了待通过LAMP扩增的结核分枝杆菌katG，inhA和gyrB基因的区域(仅显示了两条互补靶标链之一)。显示了各种引物(命名是如图1-6a中所使用的那些)所识别的序列，以及目的靶区域(Dc)。在这个实施例中，Dc代表已知含有对于异烟肼的突变的、katG基因或inhA的RBS的区域。这些与抗性相关的突变是单核苷酸改变。
根据Eiken基因组网址
(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html)上所提供的指南来设计各种靶序列的LAMP引物。根据Nagamine等人(Molecular and CellularProbes(2002)16，223-229)所描述的，设计加速总体LAMP反应的所谓环引物以识别环序列F4和R4。信号引物被设计为识别与如图8和9中标示为FS的区域互补的序列。
表3含有本实施例中所使用的引物和探针的列表。分子信标MBP-kat和MBP-inh取自Piatek等人(Antimicrob.Agents Chemother.44，p.103-110，(2000))。每种分子信标的加下划线的部分与那个靶区段内的野生型序列互补。含有靶区段中的突变的靶序列将不与分子信标杂交，并且将不产生荧光信号。选择标记分子信标(MBP-katG和MBP-inh)和引物FLP-gyr的荧光团，使得可在同一个管中独立地观察它们。表3中的荧光团的一种合适的组合是：染料1=荧光素;染料2=四氯荧光素;染料3=罗丹明。
除了FLP-gyrB上的荧光标记物和猝灭探针QP-gyr外，用于gyrB靶标的LAMP引物取自Iwamoto等人(J.Clin.Micro.41，p.2616-2622，2003)。
表3.用于基于LAMP的扩增和katG，inhA及gyrB靶标的检测的寡核苷酸
在适于LAMP(见下文)的条件下，通过图1-6中所示的一系列延伸和置换步骤，引物的该集合将扩增在katG的密码子315和核糖体结合序列inhA中带有潜在的赋予抗性的突变的靶区域(D和互补物Dc)。信号引物FSP在这些反应步骤中的存在，引起分子P2.2.2.1.1及其互补链(P2.2.2.1.1c)的形成(图6)。在扩增之前，这些二级LAMP产物各含有单一拷贝的所靶向的katG或inhA序列(任一链)，其可含有或可不含有与异烟肼抗性相关的突变，这取决于基因组靶序列中是否存在这种突变。这些二级LAMP产物的关键特征是不存在将覆盖所靶向的序列从而妨碍通过常规的基于杂交的探针手段（例如分子信标）来进行检测的潜在的发夹。
通过对分别与FLP-gyr和QP-gyr相连的荧光团/猝灭剂对的LAMP介导的分离而在扩增过程中检测gyrB靶标。图11显示了此过程中所涉及的步骤。QP与位于FLP的5’端的F1c序列互补，并且在不存在靶标时，这两种寡核苷酸彼此杂交，这使得猝灭剂dabcyl与荧光团(染料)极为贴近。在这种配置中，荧光被猝灭。如果存在靶标，FLP被延伸且延伸产物P2(双链体)从模板上被置换。在这个阶段中，探针QP仍临时地与FLP延伸产物的F1c区段相杂交。然而，所述被猝灭的、P2的双链形式(P2-双链体)和FLP延伸产物的发夹形式(P2-发夹)之间将存在平衡。通过FLP延伸产物的发夹形成引起猝灭剂探针QP的置换，这将dabcyl与荧光团分离并产生荧光信号。在gyrB LAMP产物的情形中，热力学分析(未显示)表明，在平衡时，相对于F2-双链，强烈地有利于F2-发夹，条件是QP的浓度<100微摩尔。
对于rpoB基因的81bp核心序列中的突变，可如下进行封闭管的均质测定：如Down等人(J.Clin.Micro.34，860-865.(1996))所描述的，从包含在痰样品或阳性生长培养物中的细菌制备来自结核分枝杆菌的基因组DNA。然后，使所产生的基因组DNA样品经受LAMP扩增反应。可在96孔微量滴定板中进行扩增，其中每个孔含有由下列组分组成的50μL总反应体积:1M甜菜碱(Sigma)，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，4mM MgSO4;0.1% tritonX-100;dATP，dCTP，dGTP和dTTP各400μM;16个单位的Bst DNA聚合酶靶片段(New England Biolabs);引物FLP和RLP，各800nM;引物F3和F4，各200nM;环引物F4和R4，各400nM;信号引物FSP，800nM;分子信标MBP-kat和MBP-inh，各200nM;猝灭剂探针QP-gyr，1600nM;和靶标样品(5μL)。在组合了所有组分后，将反应孔密封，然后在AppliedBiosystems 7700Prism荧光光谱热循环仪上、在63℃孵育。使扩增进行60min，并在整个扩增反应的过程中测量每个孔中的荧光。由在扩增开始后的第3和第6分钟之间取的读数确定每种探针的背景荧光，并且这些值被用作每种探针的基线。
在将混合物在63℃孵育60min后，将反应混合物简短加热至90℃可以是有利的，这终止了LAMP过程并且可促进分子信标探针与产生自信号引物的LAMP二级产物的杂交。
表4中显示了由对各种已知的赋予异烟肼抗性的突变进行的LAMP测定所预期的结果。
表4.对于katG和inhA基因座中的各种已知突变预期的LAMP测定结果
Claims (28)
1.用于在环介导的等温扩增反应过程中产生核酸信号延伸产物的方法，所述方法包括:
a)使第一核酸信号引物、第一核酸扩增引物和第一核酸置换引物的部分与核酸靶序列的互补部分杂交，
其中所述第一核酸信号引物杂交于靶序列上的第一核酸扩增引物所杂交区域的下游；
其中所述第一核酸扩增引物包含i)3’末端部分，其与核酸靶序列的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与靶序列的部分杂交但是与其互补；和
其中所述第一核酸置换引物杂交于靶序列上的第一核酸扩增引物所杂交区域的上游；
b)使经杂交的第一核酸信号引物在核酸靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物；
c)使经杂交的第一核酸扩增引物在核酸靶序列上延伸，其中这样的延伸从核酸靶序列置换第一信号延伸产物，并产生第一扩增延伸产物；
d)使经杂交的第一核酸置换引物延伸，其中这样的延伸从核酸靶序列置换第一扩增延伸产物，并产生第一置换延伸产物；和
e)检测所述第一信号延伸产物；
其中所述第一信号延伸产物不含自我互补的发夹结构并且与所述第一扩增延伸产物在环介导的等温扩增反应中同时产生。
2.权利要求1的方法，还包括：
a.使第二核酸信号引物、第二核酸扩增引物和第二核酸置换引物的部分与第一信号延伸产物的互补部分杂交；
b.使经杂交的第二核酸信号引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物；
c.使经杂交的第二核酸扩增引物在第一信号延伸产物上延伸，其中这样的延伸从第一信号延伸产物置换第二信号延伸产物，并产生第二扩增延伸产物；
d.使第二核酸置换引物延伸，其中这样的延伸从第一信号延伸产物置换第二扩增延伸产物，并产生第二置换延伸产物；和
e.检测所述第二信号延伸产物。
3.用于在环介导的等温扩增反应过程中同时产生信号延伸产物和扩增延伸产物的方法，所述方法包括:
a.使第一信号引物的部分与第一单链靶序列杂交；
b.使第一扩增引物的部分杂交于第一单链靶序列上的所述第一信号引物所杂交的部分的上游，
其中所述第一扩增引物包含i)3’末端部分，其与第一单链靶序列的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与第一单链靶序列的部分杂交但是与其互补；
c.使第一置换引物杂交于第一单链靶序列上的第一扩增引物所杂交区域的上游；
d.使杂交的第一信号引物在第一单链靶序列上延伸以产生第一信号延伸产物；
e.使杂交的第一扩增引物延伸，从而其从靶序列置换第一信号延伸产物；
f.使杂交的第一置换引物延伸，从而其从靶序列置换第一扩增延伸产物；
g.使第二信号引物的部分与置换的第一信号延伸产物杂交；
h.使第二扩增引物的部分杂交于第一信号延伸产物上的杂交的第二信号引物所杂交的部分的上游，其中所述第二扩增引物包含i)3’末端部分，其与第一信号延伸产物的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与第一信号延伸产物的部分杂交但是与其互补；
i.使第二置换引物杂交于第一信号延伸产物上的第二扩增引物所杂交的部分的上游；
j.使杂交的第二信号引物在第一信号延伸产物上延伸以产生第二信号延伸产物；
k.使杂交的第二扩增引物在第一信号延伸产物上延伸，从而其从第一信号延伸产物置换第二信号延伸产物；
l.使杂交的第二置换引物延伸，从而其从第一信号延伸产物置换第二扩增延伸产物；和
m.检测第一和第二信号延伸产物。
4.权利要求3的方法，其中第一信号延伸产物和第二信号延伸产物不含自我互补的发夹结构。
5.权利要求3的方法，还包括：
a.使第二信号引物的部分与第二单链靶序列杂交，所述第二单链靶序列是第一单链靶序列的变性互补物；
b.使第二扩增引物的部分杂交于第二单链靶序列上的第二信号引物所杂交部分的上游，
其中所述第二扩增引物包含i)3’末端部分，其与第二单链靶序列的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与第二单链靶序列的部分杂交但是与其互补；
c.使第二置换引物杂交于第二单链靶序列上的第二扩增引物所杂交部分的上游；和
d.使杂交的第二信号引物在第二单链靶序列上延伸以产生第三信号延伸产物；
e.使杂交的第二扩增引物在第二单链靶序列上延伸，从而其置换第三信号延伸产物；
f.使杂交的第二置换引物延伸，从而其置换第三扩增延伸产物；
g.使第一信号引物的部分与置换的第三信号延伸产物杂交；
h.使第一扩增引物的部分杂交于第三信号延伸产物上的第一信号引物所杂交部分的上游；
其中所述第一扩增引物包含i)3’末端部分，其与第三信号延伸产物的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与第三信号延伸产物的部分杂交但是与其互补；
i.使第一置换引物杂交于第三信号延伸产物上的第一扩增引物所杂交部分的上游；
j.使杂交的第一信号引物在第三信号延伸产物上延伸以产生第四信号延伸产物；
k.使杂交的第一扩增引物在第三信号延伸产物上延伸，从而其从第三信号延伸产物置换第四信号延伸产物；
l.使杂交的第一置换引物延伸，从而其从第三信号延伸产物置换第四扩增延伸产物；和
i.检测第三和第四信号延伸产物。
6.权利要求5的方法，还包括：使第二信号引物与置换的第四信号延伸产物杂交，和使杂交的第二信号引物在第四信号延伸产物上延伸，从而产生双链的信号产物。
7.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中同时使用了两种或更多种靶序列或序列变体，并且其中使用了与所述两种或更多种靶序列杂交的两种或更多种核酸信号引物。
8.权利要求7的方法，其中所述两种或更多种靶序列是在相同的连续核苷酸序列或两个不同的核苷酸序列中存在的序列。
9.权利要求7的方法，其中所述两种或更多种靶序列或序列变体源自一种生物体或源自两种或更多种不同的生物体。
10.权利要求1，2，3或5的方法，其中实时或以封闭管的形式或通过杂交探针检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
11.权利要求10的方法，其中所述杂交探针是单核苷酸差异敏感探针或荧光探针或分子信标或SERS标记的探针。
12.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中信号引物包含杂交区域和报告子区域，其中所述杂交区域与核酸靶序列的区域杂交，并且其中通过报告子区域检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
13.权利要求12的方法，其中所述报告子基团是产生荧光信号的荧光发夹。
14.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物是通过修饰手段而被检测的，以促进掺入到信号引物之一中的信号产物的捕获。
15.权利要求1，2，3，4，5，6，7或11的方法用于检测药物抗性的肺结核的用途。
16.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中在扩增后检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
17.权利要求16的方法，其中使用荧光探针或经SERS-标记的探针检测所述第一、第二、第三或第四信号延伸产物。
18.试剂盒，其包括(i)核酸信号引物，其中所述核酸信号引物的至少一部分与核酸靶序列的互补部分杂交，(ii)核酸扩增引物，其中所述扩增引物杂交于靶序列上的信号引物的杂交部分的上游，并且其中所述扩增引物包含i)3’末端部分，其与靶序列的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与靶序列的部分杂交但是与靶序列的部分互补，和(iii)置换引物，其在核酸扩增引物所杂交部分的上游杂交于靶序列的互补部分。
19.权利要求18的试剂盒，其还包含杂交探针。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述杂交探针是分子信标。
21.权利要求18的试剂盒，其中所述信号引物包含报告子区域。
22.权利要求21的试剂盒，其中报告子基团产生荧光信号。
23.权利要求22的试剂盒，其中报告子基团是荧光发夹。
24.权利要求18的试剂盒，其中所述核酸靶序列是结核分枝杆菌的序列。
25.权利要求18的试剂盒，其中所述核酸序列还包含(i)第二核酸信号引物，其与第二靶序列杂交，(ii)第二核酸扩增引物，其与第二靶序列杂交，和(iii)第二置换引物，其与第二靶序列杂交。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述核酸序列还包含(i)第三核酸信号引物，其与第三靶序列杂交，(ii)第三核酸扩增引物，其与第三靶序列杂交，和(iii)第三置换引物，其与第三靶序列杂交。
27.权利要求26的试剂盒，其中所述核酸序列还包含(i)第四核酸信号引物，其与第四靶序列杂交，(ii)第四核酸扩增引物，其与第四靶序列杂交，和(iii)第四置换引物，其与第四靶序列杂交。
28.权利要求1的方法，还包括：
a.使第二延伸引物、第二扩增引物和第二置换引物的部分与第一扩增延伸产物的互补部分杂交，其中第一扩增延伸产物包含第一单链核酸靶序列的拷贝；
其中第二核酸信号引物杂交于第一扩增延伸产物上的第二核酸扩增引物所杂交部分的下游；
其中第二核酸扩增引物包含i)3’末端部分，其与第一扩增延伸产物的部分互补；和ii)5’末端部分，其不与第一扩增延伸产物的部分杂交但是与其互补；和
其中第二核酸置换引物杂交于第一扩增延伸产物上的第二核酸扩增引物所杂交部分的上游；
b.使杂交的第二核酸信号引物在第一扩增延伸产物上延伸以产生信号引物延伸产物，其中所述信号延伸产物在其3’末端包含环结构；
c.使杂交的第二核酸扩增引物在第一扩增延伸产物上延伸，其中这样的延伸从第一扩增延伸产物置换信号延伸产物；
d.使杂交的第二核酸置换引物延伸，其中这样的延伸从第一扩增延伸产物置换新形成的扩增延伸产物，从而产生哑铃形状的扩增延伸产物，其在其5’和3’末端包含环结构。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20150603 |
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