CN103509790A - 利用单管巢式实时聚合酶链反应(pcr)的改良结核菌诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用单管巢式实时聚合酶链反应（PCR）的改良结核菌诊断方法，尤其是一种利用两组结核菌特殊引物（Primer）的单管巢式PCR方法，本发明的方法诊断迅速，有利于特异且具有高敏感性的结核菌诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用单管巢式实时聚合酶链反应（PCR）的改良结核菌诊断方法，尤其是一种利用两组结核菌特殊引物的单管巢式PCR方法，本发明的方法诊断迅速，有利于特异且具有高敏感性的结核菌诊断。
背景技术
一般来说，结核是呼吸道感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)而引发的感染性疾病中的一种，经预测全世界约有三分之一的人口感染了结核菌，依据世界卫生组织2010年统计，一年约有880万人成为新的结核患者，其中约有110万人死于结核。韩国国内的结核携病率虽呈减少趋势，但是结核患者中女性和儿童患者人数与日俱增，成为一大社会健康问题。为了降低这种结核的发病率及死亡率，结核治疗及管理显得非常重要，需要特异性敏感性的检测方法。
在结核的检查室诊断方法中，主要采用抗酸染色法和抗酸分支杆菌培养检测法。通常使用的抗酸染色法价格低且可迅速出来结果，被广泛应用于结核检测，但是结核菌菌数必须达到5×103～4个，才能检测出来，与培养法相比，敏感性低，无法区别结核菌和非结核性抗酸菌。与此相比，培养法作为结核诊断的标准方法，只需有101～2个结核菌即可检测出结果，但是结核菌的特性上需要很长时间（四至八周），无法实现迅速检测。另外，利用咳痰作为检查对象进行检查时，很难检查出肺部以外的结核，对于不容易取得咳痰的患者、儿童和女性患者，以及结核和HIV交叉感染的患者来说，会有患者呼吸器官的干酪样坏死及抗酸菌数量减少等情况，导致不易诊断结核。
为了更加迅速和精密地检测结核，开发出聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时聚合酶链反应(real-time PCR)等确认结核菌DNA的核酸扩增检测(nucleic acid amplification test,NAAT)。其中最典型的一种PCR就是对检体DNA的特异部位进行235个以上的增幅，以电泳确认，与染色法和培养法相比，可 在当天出来准确的检查结果，但是此方法需要熟练的操作，也会发生因DNA增幅产物对核酸诊断检查环境的污染，导致伪阳性结果。为了进行更便利更安全的检测，利用荧光染料标记的特异低核苷酸探测剂（oligonucleotide probe），对增幅产物进行实时确认的实时PCR被广泛应用于结核诊断。以实时PCR为本的常用化研究或试剂盒中，大部分以单管实时PCR进行诊断。
但是在检体中存在较少数量结核菌的咳痰中，为了确认结核菌，使用AFB染色法，若要确认阳性，至少每1毫升的咳痰中须存在105个以上的菌数方可。为了检测检体内少量存在的结核菌，需要敏感性更高的诊断方法。另外在结核患者中，肾脏结合患者使用小便作为检体，易于检测结核菌，但是其他情况则很难通过小便来检测出结核菌。对于肺结核的情况，从肺中分解出结核菌，核酸（cell-free nucleic acid）再通过血液循环系统进入肾脏，从小便中排出，因此可检测出从小便中排出的的结核菌DNA。但是从小便中排出的结核菌大部分被拦截在肾脏的丝球体网上，为了检测出小便中排出的结核菌，需检测无法被丝球体网拦截的小结核菌，约70kDa或100bp以下的核酸可从小便中检测到结核菌。
用于增幅标记的IS6110，copy数为1～20copy，在诸多研究中，其中以IS6110为标记的PCR的敏感性最高。但是MTB complex染色序列与多个NTM类似，最近在MTB strain中，报道出不具有此遗传基因的菌株。因此在本发明中，除DNA标记外，以RNA为标记，对用于RNA polymerase的rpoB遗传基因，和MTB上所存在R)-1遗传基因进行编译的ESAT-6(6kDa early secreted antigenic target protein)遗传基因同时增幅，从而解决伪阳性和伪阴性的问题，从而制造出高敏感性和特异性的实时PCR。
PCR的应用法中，聚合酶链反应法是可以提高PCR增幅的特异性及敏感性的方法，多用于纯度较低的DNA或RNA的增幅上。此方法是对两种引物进行连续PCR的方法，利用目标遗传基因，进行1st PCR，使用在第一PCR产物内边的第二引物，进行2nd PCR。
在本发明中，进行实时PCR时，使用两个遗传基因，将各遗传基因特异的两组引物放入同一管中进行增幅，利用单管巢式PCR，与现有的实时PCR相比，可提高特异性和敏感性，可在多种检体中进行结核诊断。
韩国专利公开号第1020030063935号公开了本发明的相关专利，分枝杆菌科中菌种h s p 65遗传基因增幅用引物及利用该引物的分枝杆菌科中菌种的鉴定方法。本方法涉及在分枝杆菌科的菌种上的引物组及利用该引物组的分枝杆菌科中菌种的鉴定方法， 尤其是一种对分枝杆菌科中菌种hsp65遗传基因进行增幅的引物组，以及利用该引物组使分枝杆菌科中菌种hsp65遗传基因进行PCR增幅，利用存在于增幅的核酸内的特定限制酵素部位，进行RFLP分析（Restriction Fragment Length Polymorphism Anaylsis）从而鉴定分枝杆菌菌种的方法。
发明内容
本发明所要解决的第一技术问题是提供一种提高特异性和敏感性，在多种检体中诊断结核的方法；
本发明所要解决的第二技术问题是提供一种提高特异性和敏感性，在多种检体中可诊断结核的组成物；
本发明所要解决的第三技术问题是提供一种在多种检体中可诊断结核的引物及/或探针。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种引物组，所述引物组由序号1-4，序号6-9及序号12-15的引物构成。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种结核菌检测试剂盒，所述结核菌检测试剂盒包括本发明中所述的引物组。
优选为，所述试剂盒还包括探针。
优选为，所述探针选自由序号5、序号10-11及序号16构成的群。
优选为，所述探针的5′端和3′端标有荧光剂，所述5′端标有的荧光剂是选于由6-羧基荧光素、六氯乙烷-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素及花青素5构成的群，所述3′端标有的荧光剂是6-羧甲基-若丹明或BHQ(black hole quencher)-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
优选为，所述结核菌选于由Mycobacterium tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti构成的群。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种结核菌检测方法，包括从样品中抽取DNA，针对所述DNA进行实时定量PCR，将序号1-2、序号6-7及序号12-13的第一引物和序号3-4、序号8-9及序号14-15的第二引物与所述DNA放入同一管内，进行增幅的阶段。
优选为，所述管还包括探针；优选为，所述探针选自由序号5、序号10-11及序号16构成的群；优选为，所述探针的5′端和3′端标有荧光剂。
本发明的试剂盒在进行PCR时，可包括综合酵素、再生蒸馏水及Dntp等，也可包括说明书等。
本发明的一实施方式中，所述第一引物及所述第二引物的浓度为10pg。
本发明的一实施方式中，所述样品优选为咳痰、小便或肿瘤组织，但不局限于此。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种定量方法，其特征在于，所述遗传基因定量方法包括以下阶段：a.在存在于单管的序号1-4、序号6-9及序号12-15的引物组成物中，混合自试料抽取出的菌的DNA，准备遗传基因分析试料的阶段；b.在所述a阶段的遗传基因分析试料中，进行实时巢式PCR，获取PCR产物的阶段；c．对所述b阶段的PCR产物进行定量，获取定量曲线的阶段；及d.利用所述定量曲线，对存在自试料抽取的菌的DNA的rpoB及IS6110遗传基因特异遗传基因定量的阶段。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种改善结核菌敏感性及特异性方法，其特征在于，所述改善结核菌敏感性及特异性方法是在利用巢式实时PCR检测结核菌的方法中，将序号1-2、序号6-7及序号12-13的第一引物和序号3-4、序号8-9及序号14-15的第二引物放入同一管内，进行增幅，对选自Mycobacterium tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti构成群的结核菌的敏感性和特异性进行改善的方法。
接下来说明本发明。
使用Mycobacterium tuberculosis的标准菌株，进行敏感性比较分析的结果显示，利用单管巢式实时PCR的诊断法与单一实时PCR诊断法相比，敏感度高出100倍以上。
在巢式PCR方法中，双管巢式PCR的一般试料的DNA量很受限制，多用于一次无法检测出PCR的情况，实施第一次聚合酶链反应后的产物，作为在第二次增幅中的添加试料，可是反应顺利进行，一对引物可进行次数相对较少的反应，与现有的PCR相比，可提高100倍的敏感性和特异性。
但是在换管后经过两次增幅过程，会发生污染问题，为了解决这种问题，将两组引物放入同一管内，进行单管巢式PCR，在减少污染的同时，其敏感度与现有的PCR相比，也有明显的提高。
本发明的有益效果是：依照本发明的方法，无需培养即可直接诊断结核菌，在咳痰检体等病原体数较少的检体或是小便检体中，利用两组结核菌的特异引物进行单管巢 式PCR，检测速度迅速，有利于特异且具有高敏感性的结核菌诊断。
附图说明
图1是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，rpoB遗传基因的single real-time PCR敏感性图；
图2是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，rpoB遗传基因的单管巢式实时PCR敏感性图；
图3是调节引物浓度的single real-time PCR敏感性图；
图4是调节增幅周期和引物浓度的single real-time PCR敏感性图；
a．使用10p引物浓度，进行10，40cycle的single real-time PCR敏感性图；
b．使用20p引物浓度，进行10，40cycle的single real-time PCR敏感性图；
图5是依据引物浓度的单管巢式实时PCR结核菌检测敏感性的比较图；
图6是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，IS6110遗传基因的single real-time PCR敏感性图；
图7是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，IS6110遗传基因的单管巢式实时PCR敏感性图；
图8是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，ESAT-6遗传基因的single real-time PCR敏感性图；
图9是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，ESAT-6遗传基因的单管巢式实时PCR敏感性图；
图10是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，rpoB遗传基因和IS6110遗传基因的Dua1-one tube nested Rea1-time PCR敏感性图；
图11是使用结核菌标准菌株H37Rv DNA，rpoB遗传基因和IS6110遗传基因的Dua1-one tube nested Rea1-time PCR敏感性图。
具体实施方式
以下通过非限定的实施方式，详细说明本发明。本发明实施方式仅为更好说明理解本发明的原理，本发明并不局限于此。
实施方式1：标准菌株DNA分离
使用Mycobacterium tuberculosis H37Rv(ATCC 25618)作为标准菌株，自延世大学微生物学教室获取，使用如下的方法进行DNA分离(Lemarkchand et al.,2005)。放入50ul
10mg/ml lysozyme(Sigma Chem.Co.,USA)，搅拌均匀后，在37摄氏度下过夜。放入5ul的10mg/ml proteinase K(Sigma Chem.Co.,USA)5ul和70ul的10%(w/v)SDS(Sodium Dodexyl Sulfate,Sigma Chem.Co.,USA)，搅拌均匀后，在65摄氏度下进行10分钟反应。放入100ul的5M NaCl(Sodium Chloride,Ducksan,Korea)后，在65摄氏度下已经加热的CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide,SigmaChem.Co.,USA)中放入100ul，均匀搅拌后在65摄氏度下反应10分钟。放入Chloroform:isoamylalcohol (=24:1(v/v))700ul，均匀搅拌后进行圆心分离。将含有DNA的上层液移至新的管内，放入450ul的isopropanol(Ducksan,Korea)，均匀搅拌后，在零下20度下，沉淀30分钟。在4摄氏度，12,000rpm下进行30分钟的圆心分离，分离出上层液，放入1ml的70%的ethanol，颠倒管5次。再在4摄氏度下进行10分钟的圆心分离后，隔离出上层液，进行30分的干燥后，在50ul的TE中溶解DNA。确认溶解DNA的浓度后，以1ng/ul进行稀释，并用于PCR。为了防止培养失败，菌体的一部分在400ul TE(10mM Tris-HCl,pH 8.0,1mM EDTA)中混合后，采用上述过程进行DNA分离。确认分离后DNA的浓度，进行10倍的继代稀释，用于实时PCR。
实施方式2：临床检体分离
在所提供的临床检体中的咳痰检体中，核算采用如下过程进行分离。在前处理过程中，将与咳痰同量的4%NaOH(3ml)在常温下进行5分钟处理，在4摄氏度200xg下进行10分钟的圆心分离。去除分离后的上层液后，加入1ml的TRIZOL reagent，放入0.2mmglass beads，在Precellys 24(Bertin Technologies,bis Avenue Ampeere,Montigny-le-Bretonneux,法国)中进行60秒的2次的bead-beating；在摄氏4度，12,000xg下进行15分钟的圆心分离，将上层液移至1.5ml的微量离心管内，分离DNA和RNA。
在所提供的临床检体中的小便检体的DNA采用如下过程进行分离。将小便检体1ml分别放在1.5ml的微量离心管内，15,000xg进行3分钟的圆心分离，去除上层液后，加入灭菌PBS 1ml(pH7.4)后，进行强烈的涡动，接下来使用15,000xg进行3分钟的圆心分离后去除上层液。反复进行两次同一过程，然后洗涤。洗涤过程后将含有resin的DNA抽取用buffer 50μl放入，在摄氏100度下煮20分钟后，15,000xg进行3分钟的圆心 分离后，将上层液作为DNA使用。
实施方式3：进行Single Rea1-time PCR
使用结核菌特异的rpoB遗传基因和IS6110遗传基因，在各个遗传基因中，使用如下方法进行Single Real-time PCR。在实时PCR的反应物的组成中分别放入10pmole的2xreal-time PCR master mix(TOYOBO,osaka,Japan)
Forward primer和Reverse primer，在组成物中放入10pmole，放入5ul的DNA，最终体积为20ul。各引物和探针的盐基配列如表1所示。
PCR反应利用ABI 7500Fast(Applied Biosystem)，在变性摄氏95度下一次进行10分钟，变性摄氏95度下15秒，在退火温度60度下，进行30秒的旋转，反复40次。在各个的退火过程中，加上测定荧光的过程，测定每旋转周的荧光值。
在单管巢式实时PCR相同的条件下，为了进行比较，加入20pmole的Forward primer和Reverse primer，PCR反应利用ABI 7500Fast(Applied Biosystem)，在变性温度95度下一次进行10分钟，变性温度95度下15秒，退火温度6(摄氏度下，30秒旋转，反复50次。另外还有在各个退火过程后测定荧光的过程，按照各周期测定增加的荧光值。
实施方式4：进行单管巢式实时PCR
在rpoB和IS6110遗传基因中，选定结核菌特异的部位，进行单管巢式实时PCR。为了提高特异性和敏感性，同时使用rpoB和IS6110遗传基因，进行单管巢式实时PCR。
在实时PCR的反应物中，分别加入2.5、5、10pmole的real-time PCR master mix(TOYOBO,osaka,Japan)和1stForward primer
Reverse primer，分别加入10pmole的2nd Forward primer和Reverse primer，组成物放入10pmole，5ul的DNA，最终体积为25ul。各引物和探针的盐基配列如表1所示。
PCR反应利用ABI 7500Fast(Applied Biosystem)，在变性摄氏95度下一次进行10分钟，变性摄氏95度下15秒，在退火温度65度下，进行30秒的旋转，反复10次。进行第二次PCR时，在变性摄氏95度下一次进行10分钟，变性摄氏95度下15秒，在退火温度60度下，进行30秒的旋转，反复40次。另外还有在各个退火过程后测定荧光的过程，按照各周期测定增加的荧光值。
【表1】结核菌诊断所需引物及探针
上述实施方式的结果如下：
rpoB遗传基因的Single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌
检测敏感性图。
为了比较分析Single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌检测敏感性，将结核菌菌株H37Rv DNA在10ng至10fg进行10倍的继代稀释，用于实时PCR的template DNA。rpoB遗传基因在single real-time PCR中，使用10p浓度的引物时，在10ng至10fg的ct值分别为17.36至37.18（如图1）。在单管巢式实时PCR中，在10ng至10fg的ct值分别为10.33至27.92（如图2）。由此可见，使用单管巢式实时PCR要比使用single real-time PCR的敏感性高出100倍。
rpoB遗传基因的Single real-time PCR的结核菌敏感性。
使用单管巢式实时PCR要比使用single real-time PCR的敏感性高的原因，可以通过引物和周期影响进行确认。第二次引物的浓度分别使用10p和20p（如图3），进行现有的40周期和50周期（如图4a,4b）,可确认使用单管巢式实时PCR和使用single real-time PCR的敏感性影响。
进行40周期时，引物的浓度在10p至20p，敏感性无增加，使用与单管巢式实时PCR相同的50周期时，引物的浓度在10p至20p，比进行40周期时的敏感性降低。一组引物进行50周期是不足的，在同一浓度下进行周期时，单管巢式实时PCR的敏感性高于single real-time PCR的敏感性。
rpoB遗传基因的one tube nested Real-time PCR结核菌检测敏感性。
在单管巢式实时PCR中调节引物浓度来确认敏感性。第一引物的浓度分别为2.5p（如图5a）、5p（如图5b）、10p（如图5c）,第二引物的浓度为10p。
按照引物浓度来确认敏感性时，100fg浓度至2.5p浓度的ct值为30.48，5p浓度的ct值为29.42，10p浓度的ct值为27.42（如图5）。引物浓度不同，敏感性的差距在10倍左右。
综上所述，第一引物的浓度使用10p，第二引物的浓度使用10p，进行单管巢式实时PCR时，敏感性至少高出100倍（如表2）。
【表2】
表2是rpoB遗传基因的single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌检测敏感性的比较表。
使用IS6110遗传基因的single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌检测敏感性图。
为了比较分析Single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌检测敏感性，将结核菌菌株H37Rv DNA在10ng至10fg进行10倍的继代稀释，用于实时PCR的template DNA。IS6110遗传基因在single real-time PCR中，使用10p浓度的引物时，在10ng至10fg的ct值分别为14.95至35.71（如图6）。在单管巢式实时PCR中，在10ng至10fg的ct值分别为5.83至30.62（如图7）。由此可见，使用单管巢式实时PCR要比使用single real-time PCR的敏感性高出约100倍。
使用rpoB遗传基因和IS6110遗传基因的single real-time PCR和one tube nestedReal-time PCR的结核菌检测敏感性图。
为了提高rpoB one-tube nested real-time PCR的敏感性，添加IS6110遗传基因，进行dual-one tube nested real-time PCR。为了比较分析单管巢式实时PCR的结核菌检测敏感性，将结核菌菌株H37Rv DNA在10ng至10fg进行10倍的继代稀释，用于实时PCR的template DNA。使用10p浓度的引物时，在10ng至10fg的ct值分别为4.99至24.9（如图8）。为了提升敏感性，在10、40周期进行15、25周期的结果可确认10fg至1fg的敏感性（如图9）。
由此可见，使用单管巢式实时PCR要比使用dual-one tube nested real-time PCR的敏感性高出约100倍。
综上所述，第一引物的浓度使用10p，第二引物的浓度使用10p，选择15周期后进行25周期的单管巢式实时PCR时，敏感性至少高出100倍（如表3）。
【表3】
表3是rpoB遗传基因和IS6110遗传基因的single real-time PCR和one tube nestedReal-time PCR及dual one-tube nested real-time PCR的结核菌检测敏感性比较表。
使用ESAT-6遗传基因的single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌检测敏感性图。
为了比较分析Single real-time PCR和one tube nested Real-time PCR的结核菌检测敏感性，将结核菌菌株H37Rv DNA在10ng至10fg进行10倍的继代稀释，用于实时PCR的template DNA。ESAT-6遗传基因在single real-time PCR中，使用10p浓度的引物时，在10ng至10fg的ct值分别为19.5至35.6（如图1）。在单管巢式实时PCR中，在10ng至10fg的ct值分别为9.61至27.9（如图2）。由此可见，使用单管巢式实时PCR要比使用single real-time PCR的敏感性高出约100倍(如图8及图9)。
在标准菌株中，利用rpoB和IS6110遗传基因的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的结核菌检测特异性图。
使用标准菌株DNA制成的single real-time PCR和one dual one-tube nested real-time PCR的结核菌检测特异性图，经确认，仅在MTB complex中进行特异反应（如表 4）。
【表4】
表4是使用标准菌株的特异性确认表。
在标准菌株中，利用rpoB和ESAT-6遗传基因的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的结核菌检测特异性图。
使用标准菌株DNA制成的single real-time PCR和one dual one-tube nested real-time PCR的结核菌检测特异性图，经确认，仅在MTB complex中进行特异反应（如表5）。
【表5】
临床检体中利用rpoB和IS6110遗传基因的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性有用性评价。
为了确认新开发的dual one-tube nested real-time PCR敏感性和特异性，使用临床检体。利用正常人的咳痰和小便确认特异性，使用被判为结核患者的患者检体确认敏感性。
7-1）临床咳痰检体中的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性有用性评价。
为了确认临床咳痰检体中的结核菌的检测率，利用现有常用的Real MTB-ID(M& D,Korea)，进行single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性比较，确认使用正常人咳痰的特异性。使用患者咳痰的实验结果显示，在Single PCR中，结核菌的检出率为12/26（46.1%）的话，在dual one-tube nested real-time PCR的检出率为26/26（100%）。（如表6）
【表6】
表6是确认咳痰检体中敏感性和特异性的表。
7-2）临床小便检体中的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性有用性评价。
为了确认临床小便检体中的结核菌的检测率，利用现有常用的AdvanSureTM TB/NTM real-time PCR(LG生命科学，大田)，进行single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性比较，确认使用正常人小便的特异性。使用患者小便的实验结果显示，在Single PCR中，结核菌的检出率为3/56（5.4%）的话，在dual one-tube nested real-time PCR的检出率为29/56（51.8%）。（如表7）
【表7】
表7是确认小便检体中敏感性和特异性的表。
7-3）临床组织检体中的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性有用性评价。
为了确认临床Granuloma（肉芽肿，含有活泼生长的纤维芽细胞和毛细管芽细胞的肉芽肿块）组织检体中的结核菌的检测率，利用现有常用的Real MTB-ID(M&D,Korea)，进行single real-time PCR和新开发的dual one-tube nested real-time PCR的敏感性比较，在Single PCR中，结核菌的检出率为25/76（32.9%）的话，在dual one-tube nested real-time PCR的检出率为44/76（57.9%）。（如表8）
【表8】
| Single PCR | nested qPCR | |
| MTB | 25(32.9％) | 44(57.9％) |
| - | 51(67.1％) | 32(42.1％) |
| total | 76 | 76 |
表8是在临床组织(Granuloma)中single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性有用性评价的表。
临床检体中利用rpoB和ESAT-6遗传基因的single real-time PCR和dual one-tube nested real-time PCR的敏感性有用性评价。
涂片结果可确认阳性及阴性患者的咳痰检体，使用现有的涂片检查法和培养检查法 进行比较分析，对定量的实时PCR法的有用性进行评价。
为了确认临床咳痰检体中结核菌的检出率，使用现有常用的rpoB遗传基因single PCR和新开发的rpoB和ESAT-6遗传基因dual real-time PCR，进行敏感性比较。使用患者咳痰DNA检体，其在Single PCR中，结核菌的检出率为18/27（66.6%）的话，在dual one-tube nested real-time PCR的检出率为22/27（82.7%）。（如表9）
【表9】
GCG TCG GTC GCT ATA AGG TCA AC(SEQ ID NO.1)
ACC CTC GTG CAA GCG GAC CAG ATA T(SEQ ID NO.2)
GGT CGC TAT AAG GTC AAC AAG AAG(SEQ ID NO.3)
ACC CTC GTG CAA GCG GAC CAG(SEQ ID NO.4)
CTG CAT GTC GGC GAG CCC ATC ACG(SEQ ID NO.5)
AAC GGC TGA TGA CCA AAC TC(SEQ ID NO.6)
AAG CGG CGC TGG ACG AGA TC(SEQ ID NO.7)
GTC GAA CGG CTG ATG ACC AAA CT(SEQ ID NO.8)
TCC GAA GCG GCG CTG GAC GA(SEQ ID NO.9)
ACC CGC GGC AAA GCC CGC AGG(SEQ ID NO.10)
ACC ACG ATC GCT GAT CCG GCC ACA(SEQ ID NO.11)
TTC GGA GGC G TAC CAG GGT GTC(SEQ ID NO.12)
CC GCG CCA GGT TCT GCA GCG C(SEQ ID NO.13)
GGA GGC GTA CCA GGG TGT C(SEQ ID NO.14)
CCG CGC CAG GTT CTG CA(SEQ ID NO.15)
GCA AAA ATG GGA CGC CAC GGC TAC C(SEQ ID NO.16)
Claims (18)
1.一种引物组，其特征在于，所述引物组由序号1-4，序号6-9及序号12-15的引物构成。
2.一种结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述结核菌检测试剂盒包括权利要求1中所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，还包括探针。
4.根据权利要求3所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述探针选自由序号5、序号10-11及序号16构成的群。
5.根据权利要求3所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5'端和3'端标有荧光剂。
6.根据权利要求5所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述5'端标有的荧光剂是选于由6-羧基荧光素、六氯乙烷-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素及花青素5构成的群，所述3'端标有的荧光剂是6-羧甲基-若丹明或BHQ(black hole quencher)-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
7.根据权利要求2所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述结核菌选于由Mycobacterium tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti构成的群。
8.一种结核菌检测方法，其特征在于，包括从样品中抽取DNA，针对所述DNA进行实时定量PCR，将序号1-2、序号6-7及序号12-13的第一引物和序号3-4、序号8-9及序号14-15的第二引物与所述DNA放入同一管内，进行增幅的阶段。
9.根据权利要求8所述的结核菌检测方法，其特征在于，所述管还包括探针。
10.根据权利要求9所述的结核菌检测方法，其特征在于，所述探针选自由序号5、序号10-11及序号16构成的群。
11.根据权利要求9所述的结核菌检测方法，其特征在于，所述探针的5'端和3'端标有荧光剂。
12.根据权利要求8所述的结核菌检测方法，其特征在于，所述结核菌选于由Mycobacterium tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti构成的群。
13.根据权利要求8所述的结核菌检测方法，其特征在于，所述第一引物及所述第二引物的浓度为10pg。
14.根据权利要求8所述的结核菌检测方法，其特征在于，所述样品为咳痰、小便或肿瘤组织。
15.一种定量方法，其特征在于，所述遗传基因定量方法包括以下阶段：
a.在存在于单管的序号1-4、序号6-9及序号12-15的引物组成物中，混合自试料抽取出的菌的DNA，准备遗传基因分析试料的阶段；
b.在所述a阶段的遗传基因分析试料中，进行实时巢式PCR，获取PCR产物的阶段；
c．对所述b阶段的PCR产物进行定量，获取定量曲线的阶段；及
d.利用所述定量曲线，对存在自试料抽取的菌的DNA的rpoB及IS6110遗传基因特异遗传基因定量的阶段。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选自管内序号5、序号10-11及序号16构成群的探针。
17.一种改善结核菌敏感性及特异性方法，其特征在于，所述改善结核菌敏感性及特异性方法是在利用巢式实时PCR检测结核菌的方法中，将序号1-2、序号6-7及序号12-13的第一引物和序号3-4、序号8-9及序号14-15的第二引物放入同一管内，进行增幅，对选自Mycobacterium tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti构成群的结核菌的敏感性和特异性进行改善的方法。
18.一种试剂盒的结核菌检测用途，其特征在于，所述试剂盒的结核菌检测用途包括由序号1-4、序号6-9及序号12-15的引物构成的引物组。
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Application publication date: 20140115 Assignee: The Limited by Share Ltd sent iotti Assignor: YONSEI University WONJU INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION Contract record no.: 2016990000118 Denomination of invention: Utilize the improvement tubercule bacillus diagnostic method of single tube nido real-time polymerase chain reaction (PCR) Granted publication date: 20150930 License type: Exclusive License Record date: 20160325 |
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