CN104611434A - 一种折叠引物及其pcr扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸扩增技术及其应用，尤其是一种折叠引物及其PCR扩增方法，通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，当低于其折叠温度时引物的3’5’端互补退火自我封闭；从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火，有效排除引物之间的竞争，有利于实行分级退火实现在一个试管内互不干扰地进行多重反应；使靶序列的特异扩增占据优势地位，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，有利于同时扩增和检出样本中多种靶核酸，特别是其中的低拷贝靶核酸。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是一种折叠引物及其PCR扩增方法。
背景技术
二十多年前聚合酶链式反应(PCR，Mullis.k 1985)、耐热DNA聚合酶(Taq酶Saiki等1986)以及自动化热循环器(PCR仪——Thermo Cycler.PE Cetus公司1987)先后问世，PCR核酸扩增技术以其在数小时内选择性扩增感兴趣的基因(核酸)片段达百万倍(拷贝)的巨大潜力，直接推动了分子克隆、生物与遗传工程、核酸序列分析(DNA,RNA测序)等分子生物学技术和分子生物学研究飞跃发展，促进了从微生物到人类的基因组计划的实施和完成。仅数年间，世界各种生物实验室中，PCR核酸扩增技术迅速占据了统治地位。目前核酸扩增技术已成为几乎所有涉及生物的研究与应用领域(包括生物与遗传工程，临床与预防医学，农、林、牧、渔以及食品、药品等生物相关产业)的分子生物学关键技术。使用核酸扩增技术从各种样本中获取、检出感兴趣的核酸序列，为各种核酸(基因)的进一步分析提供快捷可靠而又经济的手段；特别是证实含有1个或多个突变(变异、缺失、插入)，或者遗传多态(单核苷酸多态，SNP)的靶核酸的存在，进而达到确认或鉴定生物种、株(型)直到辨认个体的目的。现在，核酸扩增—鉴定的高效性、灵敏性和可行性已经没有人怀疑了，核酸扩增—鉴定—测序—进一步分析已成为生命科学研究的重要模式和必经之路，核酸扩增正在成为所有生物相关学科和产业应用最广泛、最重要的实用技术。
聚合酶链式反应(PCR)是现有各种核酸扩增方法中效率最高、应用最广的基本核酸扩增方法。许多其他核酸扩增方法也是在其基础上发展起来。其基本原理是：是引物与目标(靶)核酸的互补退火与新生互补链的合成(延伸)：在适宜核酸合成的溶液(生化)环境中(含有必需的DNA聚合酶、至少一对寡核苷酸引物、靶DNA(模板)、Mg+、4dNIP以及适当且稳定pH的缓冲系统等)，在设定为核酸变性、退火和延伸3个温度循环变化的条件下，当温度上升到变性温度时模板靶DNA变性(解链)，降至退火温度时引物与互补的靶DNA结合退火，在延伸温度期间，通过DNA聚合酶催化作用，引物以靶DNA为模板，自其3端开始沿着5′—3′方向延伸，合成一条与靶DNA完全互补的新核苷酸链；第二个循环时，新合成的链作为反向引物的模板从另一个方向延伸，合成新链到前一个引物起始为止，从而限定了新链的设计长度，每个循环扩增产物以指数倍增，如此循环往复经过30个循环之后，完全同一的扩增产物可达到几十万到100万倍。可见引物的退火是核酸扩增反应中最关键的一步。
PCR技术虽然具备上述极大的优势，但传统PCR也存在着固有的极易产生二聚体等非特异扩增、扩增产物极易污染以及多重反应时优势扩增掩盖低拷贝靶序列扩增三大缺陷，严重影响分析的准确性。在各种生物实验室里，它以最方便和高效的方式为我们获取无数有意义的核酸，同时也产生大量足以破坏试验结果的错误产物。故，该技术的应用需要专业的人员和严格的条件控制下才能产生较可靠的结果。而为了克服上述PCR核酸扩增技术固有的缺陷，也为适应核酸扩增技术在研究和应用各个领域的需要，20多年来分子生物学家们进行了不懈的努力，创造出多种改进的或派生的PCR技术，企图解决现有技术中存在的上述技术问题，例如技术文献为《Annealing controlprimer and its uses》的公开了一种退火控制引物是在引物3′端和5′端之间插入2-15个通用碱基(脱氧肌苷等)组成一个调节器用于控制引物的退火，据称可适用于核酸扩增的所有领域，能有效地抑制非特异扩增和提高扩增和检出靶核酸的特异性；但未提及排除竞争和检出超微量靶核酸，特别是未提到在多重反应中检出低拷贝靶核酸的能力。又专利号为CN201110073636.5《用于快速恒温基因突变检测的聚合酶链反应方法》公开了一种聚合酶链式反应的方法也未提到解决竞争和多重扩增等问题。这些技术只是在不同程度上部分地减少了这些缺陷的影响，这些改进都没能从根本上改变和解决这些技术问题；使得在不断扩增靶核酸的同时产生大量的非靶扩增产物，形成非靶扩增与靶核酸扩增竞争有限资源的严重局面，轻则干扰结果判断，重则非靶核酸的优势扩增形成垄断甚至完全抑制靶核酸的扩增，导致假阴性，进而造成易污染的现状；如在临床和预防医学领域，以PCR核酸扩增技术为基础的各种分子(核酸、基因)诊断方法的研究和应用报告已遍布绝大部分传染病和遗传性疾病(病变、突变基因)，几乎覆盖所有致病病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原微生物。但在临床诊断、疾病控制和环境监测中采集的样本核酸是有限(微)量的，特别是有些病人(潜伏期、恢复期以及健康带菌者)的样本中带菌(毒、虫)量往往很低；而医学诊断不仅要求从一份样本中检出低含量病原(变)基因，还要求同时进行鉴别诊断，最好能一次试验检出多种(型、株)病原基因；这就需要更高的准确性和稳定性的多重反应，而且要求试验步骤高度简化使普通试验室人员可以操作，要求更高的试验速度快速出结果以适应及时治疗病人的需要。而现有技术中的PCR技术根本难以满足需求。
发明内容
为了解决现有核酸扩增技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种具有三重退火温度和自我封闭功能的折叠引物，及其应用于聚合酶链式反应(折叠引物PCR,但不限于此)从含有靶基因的核酸的样本中选择性扩增并检出一种或多种靶核酸序列的方法；通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，利用退火温度变化控制引物折叠自身封闭与开放进行分级退火，排除引物之间的竞争，在一个试管内多对引物互不干扰地进行多重反应；使靶序列的特异扩增占据优势地位，从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列以及扩增产物极易污染等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，有利于扩增和检出样本中微量病原DNA，特别有利于检出混合感染样本中低拷贝数的靶核酸。
具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种折叠引物，该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度(或低温退火温度)；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度。
所述折叠引物的3′端常规引物部分，其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或取代错配碱基。
所述的折叠引物5′端特殊设计引物部分，特殊设计引物部分与3′端互补序列是从第2-4碱基起至第8-20碱基添加7-19个与3′端互补碱基，而5′末端第1位则特设为与3′末端第1位错配碱基。
所述的错配碱基为C或G中的一种。
该折叠引物的PCR扩增方法，包括以下步骤：
(1)采用镁、酶分离组合试剂模式，分别配制至少含有1对折叠引物的无镁加酶组合试剂和制备含镁模板DNA；在一个PCR管内加入10ul无镁加酶组合试剂和5ul含镁模板形成完整反应体系，即可上机反应；
(2)折叠引物PCR反应:预热(解链)后先进行至少1组初始(低温)退火温度循环，在循环内或/和循环组间至少用2个初始退火温度分级退火，每组至少扩增2个循环；随后进入高温退火循环组：在循环内用1-3个高温退火温度分级退火扩增36-56个或更多循环；在60-70分钟内连续扩增60个或更多循环，可完成从简单到复杂的多重反应；
(3)扩增产物分析鉴定：可采用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；或采用高效质谱(HPMS)测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；也可采用微阵列尤其是低密度芯片技术鉴定扩增片段。
所述的镁酶分离组合试剂为不含有氯化镁和模板DNA的PCR反应全套试剂。
所述的预热(解链)，其温度为82-95℃，预解链时间为1.5-3min；所述的循环为解链、退火、延伸三步骤的循环，并且在循环过程中在前4～20个循环内的解链温度为86-95℃、解链时间为5-10s，待4～20个循环以后、采用解链温度为80-86℃、解链时间为5-10s；退火分为初始退火、高温退火；所述的初始退火温度可在循环(组)内或循环(组)间按照递增或者递减的顺序进行分级退火处理，或者在循环(组)内或循环(组)间按照交替递增或递减的顺序进行分级退火处理，每个退火温度处理的时间为5-10s；所述的初始退火温度在45-70℃；在多重PCR扩增过程中，各对引物之间的初始温度相差至少3-5℃；所述的折叠引物，其折叠温度为43-68℃，并在循环过程中，各对引物的折叠温度比其初始退火温度低1-2℃；所述的折叠引物，在PCR扩增过程中，其高温退火时的温度为65-72℃，退火的时间为5-20s；所述的延伸温度为72-75℃，延伸时间为10-20s。
所述的高温退火可以采用单一高温进行退火处理，也可以采用2-3个高温退火温度进行递增分级退火处理，其高温退火温度范围在65-72℃之间，退火时间为5-20s。
所述的延伸温度为72-75℃，延伸时间为10-20s。
所述镁、酶分离组合试剂包含缓冲系统、4dNTP、1对或多对折叠引物和Taq酶等除MgCl2和模板DNA之外的全套PCR试剂。
所述含镁模板的制备是使用含镁模板缓冲液直接从滤纸血样制备模板DNA,如用核酸纯化试剂盒提取的DNA则按每管5ul+0.5×nul(n＝欲加入的纯化DNA量)补加含镁模板缓冲液。
折叠引物的基本原理是通过温度调控引物3′5′端互补退火折叠或重叠(自身或互相封闭)或解链(开放)来控制引物与模板靶序列的退火，各条(对、组)引物设置不同的退火温度和折叠温度可以避免引物间的竞争，同时对抗传统聚合酶链式反应(PCR)经常导致非特异扩增的引物与引物或探针之间、和/或引物与非靶序列之间错配退火；能有效地克服传统PCR极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病，从而大大提高PCR的特异性，稳定性和扩增效率。因此，本发明可直接用于完善套式PCR,多重PCR，等位特异PCR,荧光定量PCR以及RNA的聚合酶链反应诸如RNA-PCR和反转录PCR、cDNA末端快速扩增(RACE)、差异显示PCR(DD-PCR)等各种基于PCR的核酸试验，能够有效地克服上述传统PCR固有的缺陷，提高特异性和扩增效率；折叠引物配合镁酶分离组合试剂反应体系，可用于研制高特异高敏感能够同时检出多种病原/病变/变异基因或SNP的新型预装管PCR分子诊断试剂盒；还可以应用于核酸延伸、杂交相关技术(例如微阵列中折叠靶标探针的设计)有效地克服非特异杂交和增强延伸的特异性，此外，在芯片和高效液相色谱(HPLC)检测核酸突变和SNP等核酸分析系统中，折叠引物PCR将提供高效、快速和高质量的样本制备。
本发明改进的核酸扩增方法(或称折叠引物PCR)依靠每条折叠引物的三重退火温度，根据需要灵活安排每个PCR试验进行分级变性、退火、延伸反应。可以在重复的循环内(组内)分级退火延伸，也可以在不同的循环间(组间)分级变性、退火和延伸；更多时候是两者相配合以获得最佳扩增效果。
简单的折叠引物PCR，例如只有一对引物和一种扩增产物的简单PCR，可设定较高的初始退火温度(60-65℃)和相应的折叠温度；通常采用组间2级退火：在预解链86-95℃/2-3分钟之后，第一组循环通常以基因组DNA为模板需要较高变性温度(86-95℃)和初级退火温度退火扩增几个循环(4-10)；第二组循环起主要以扩增子为模板改用较低变性温度(扩增子解链温度只需80-86℃)和第二级高温退火扩增36-50个循环，以最大限度地避免引物与任何非靶序列错配退火产生的非特异扩增；使用本发明创立的镁、酶分离组合试剂，可采用快速反应模式，扩增产物1000bp以下，解链只需5秒，每级退火5-15秒，75℃延伸10-15秒。可连续扩增60或更多个循环，(耗时60-70分钟)可以达到巢式PCR同样的结果检出样本中微量DNA。
复合或复杂的折叠引物PCR，即在同一反应溶液内含有一对以上引物和/或产生一种以上扩增产物的PCR，例如套式PCR(包括半套式PCR)、多重PCR、多重/套式PCR、反转录(RT)PCR、差异显示(DD)PCR、RACE等都可以应用折叠引物。需要采用组内分级退火与组间分级退火相配合，通常较大和较难扩增的片段可设计较高退火温度，安排退火在前和较长退火时间；较小片段和容易扩增的片段，安排退火在后适用较短退火时间。
与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，排除引物之间的竞争，有利于在一个试管内互不干扰地进行多重反应；当低于其折叠温度时常规引物部分和特殊设计引物部分的两端互补退火进而自我封闭；从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火，使靶序列的特异扩增占据优势地位，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，特别有利于扩增和检出样本中微量病原DNA。
附图说明
图1为折叠引物结构模式示意图。
3’端为常规引物部分；5’端为特殊设计引物部分；靠近5’端的碱基为与3’端末端的错配碱基；3’端的I为脱氧肌苷；5’端的灰色部分除去最末尾的错配碱基后的碱基为与3’端末端的互补碱基。
图2为折叠引物互相退火封闭状态示意图。
图3为折叠引物解链恢复常态示意图。
图4为折叠引物单管多重PCR检测4种人疟原虫模拟混合感染结果电泳图。
M:DNA分子量标志(100bp阶梯)；
1-4泳道：2种原虫混合模板；
5-8泳道：3种原虫混合模板；
9-12泳道：4种原虫混合模板。
每组最高最低密度相差100倍(2个虫/ul:200个虫/ul)。
P.falciparum恶性疟原虫；P.vivax间日疟原虫；P.malariae三日疟原虫。P.ovale卵形疟原虫。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例
如图1、图2和图3，一种折叠引物，该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度(或低温退火温度)；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度。
所述折叠引物的3′端常规引物部分，其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或取代错配碱基。
所述的折叠引物5′端特殊设计引物部分，特殊设计引物部分与3′端互补序列是从第2-4碱基起至第8-20碱基添加7-19个与3′端互补碱基，而5′末端第1位则特设为与3′末端第1位错配碱基。
所述的错配碱基为C或G中的一种。
该折叠引物的PCR扩增方法，包括以下步骤：
(1)采用镁、酶分离组合试剂模式，分别配制至少含有1对折叠引物的无镁加酶组合试剂和制备含镁模板DNA；在一个PCR管内加入10ul无镁加酶组合试剂和5ul含镁模板形成完整反应体系，即可上机反应；
(2)折叠引物PCR反应:预热(解链)后先进行至少1组初始(低温)退火温度循环，在循环内或/和循环组间至少用2个初始退火温度分级退火，每组至少扩增2个循环；随后进入高温退火循环组：在循环内用1-3个高温退火温度分级退火扩增36-56个或更多循环；在60-70分钟内连续扩增60个或更多循环，可完成从简单到复杂的多重反应；
(3)扩增产物分析鉴定：可采用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；或采用高效质谱(HPMS)测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；也可采用微阵列尤其是低密度芯片技术鉴定扩增片段。
所述的镁酶分离组合试剂为不含有氯化镁和模板DNA的PCR反应全套试剂。
所述的预热(解链)，其温度为82-95℃，预解链时间为1.5-3min；所述的循环为解链、退火、延伸三步骤的循环，并且在循环过程中在前4～20个循环内的解链温度为86-95℃、解链时间为5-10s，待4～20个循环以后、采用解链温度为80-86℃、解链时间为5-10s；退火分为初始退火、高温退火；所述的初始退火温度可在循环(组)内或循环(组)间按照递增或者递减的顺序进行分级退火处理，或者在循环(组)内或循环(组)间按照交替递增或递减的顺序进行分级退火处理，每个退火温度处理的时间为5-10s；所述的初始退火温度在45-70℃；在多重PCR扩增过程中，各对引物之间的初始温度相差至少3-5℃；所述的折叠引物，其折叠温度为43-68℃，并在循环过程中，各对引物的折叠温度比其初始退火温度低1-2℃；所述的折叠引物，在PCR扩增过程中，其高温退火时的温度为65-72℃，退火的时间为5-20s；所述的延伸温度为72-75℃，延伸时间为10-20s。
所述的高温退火可以采用单一高温进行退火处理，也可以采用2-3个高温退火温度进行递增分级退火处理，其高温退火温度范围在65-72℃之间，退火时间为5-20s。
所述的延伸温度为72-75℃，延伸时间为10-20s。
所述镁、酶分离组合试剂包含缓冲系统、4dNTP、1对或多对折叠引物和Taq酶等除MgCl2和模板DNA之外的全套PCR试剂。
所述含镁模板的制备是使用含镁模板缓冲液直接从滤纸血样制备模板DNA,如用核酸纯化试剂盒提取的DNA则按每管5ul+0.5×nul(n＝欲加入的纯化DNA量)补加含镁模板缓冲液。
具体的，本发明的首选之一是用于优化套式PCR。普通套式PCR为扩增低含量模板，在同一模板靶序列的上下游设计内、外侧两对引物，进行两轮PCR反应；第一轮PCR用一对外侧引物扩增产生较长的扩增子片段；第二轮PCR在新PCR管内以1-2ul第一轮扩增产物作为模板，用一对内侧引物扩增较短的扩增子片段，以提高检出的敏感性和特异性，是检出微量病原微生物常用的方法。但因需要中间换管作2次加样，进行2轮PCR反应，试验步骤繁多、操作复杂，费时费工，容易失误，且极易污染和产生二聚体等非特异扩增，严重影响结果判断，难于在临床和公共卫生检验中实际应用。应用本发明折叠引物原理，很容易将传统套式PCR改造成单管单轮一次反应的快速套式PCR；通过设置不同退火温度控制，进行分级退火延伸，能有效地克服普通套式PCR的上述缺陷，实现套式PCR单管一次连续扩增60个循环，完全抛弃中间换管、二次加样和第二轮扩增的繁琐步骤，即可达到套式2轮PCR的敏感性和特异性，能够扩增和检出超低丰度甚至单拷贝模板DNA。
上述折叠引物单管单轮套式PCR的设计包括(但不限于此)：通常将套式PCR的内、外侧两对引物均设计成折叠引物(或外侧引物对保持为普通引物，内侧引物对设计为折叠引物)，外侧引物对的初级退火温度至少比内侧引物高3-5℃，每条引物自身退火封闭温度低于其初级退火温度1-3℃或以上。利用折叠引物的三重退火温度，在同一个反应管内互不干扰地先后进行组间2-3级退火延伸；第一组用较高退火温度循环(60度以上)，使外侧引物与模板先行退火延伸，扩增14-20个循环，产生相当数量较长片段扩增子；此时退火温度较低的内侧引物不参加反应，也不易与其他序列错配。第二组转入较低退火温度循环，外侧引物自身退火封闭，不参加反应，从而避免了潜在的错配退火可能产生的非特异扩增；内侧引物即以扩增子为模板产生较短的靶序列片段，由于在相当数量扩增子的基础上，在排除了非特异退火和没有竞争的条件下，内侧引物迅速形成扩增优势，连续扩增30-40循环，达到两轮PCR扩增的效果。也可以在第二组扩增10-20循环之后，利用折叠引物的二级退火温度转入安全性较高的第三组高温退火循环，继续扩增最后20-30个循环，获得更好的效果。
本发明另一个首选实例是优化多重PCR。在同一个反应体系中加入1对以上引物，扩增至少2个靶序列的多重PCR，因其快捷、经济、可同时检测多个目标基因，有利于设定内部对照，早已在遗传性疾病诊断、病原微生物检测、转基因鉴定、临床研究以及科研等领域广泛使用；但因传统多重PCR要求同一反应的所有引物退火温度和条件都是类似的，而决定每条引物退火温度的互补模板序列长度和组成往往是不一致的，多重PCR试验不仅设计复杂，且试验的平衡非常困难，受PCR固有缺陷的限制，特别是样本中各个靶序列的拷贝数和每条引物的扩增效率难免的差异，各个靶序列的扩增严重不平衡，低拷贝靶序列的扩增受挫甚至完全被掩盖，出现假阴性，导致多重PCR经常失败，这是多重PCR难于实际应用的主要原因。应用本发明的折叠引物原理，可以设计在同一个反应管内高灵敏高特异地检出和鉴定多个靶序列的折叠引物多重PCR；依靠具有三重退火温度的折叠引物，可以在同一个反应体系(单管)内进行多级反应；多个不同退火温度的折叠引物按设计要求按次序在其最佳退火温度进行退火；从而使多个不同起始拷贝数的靶序列可以先后退火同步扩增，有利于检出低拷贝数靶序列。在排除各种非特异扩增的干扰的条件下，实行温度控制的分级退火延伸，可以安排每对引物在很少竞争的环境里退火延伸,从而实现真正意义上的多重扩增和检出。
本发明的再一首选实例是用于设计和优化套式/多重PCR联合的单轮快速诊断试验。在临床检验中经常需要同时检测和鉴定两种及多种病原(类似种、株或不同基因型)、病变或变异基因，而临床样本中病原含量可能很低，不同病原的拷贝数也不相同甚至相差悬殊，导致低拷贝病原难于检出；如上所述使用多对折叠引物完全可以在一个试管内分级退火延伸，在极少竞争甚至零竞争的环境下实现高敏感高特异的套式/多重联合反应，快速、准确地同时检出和鉴定多种病原、病变核酸。
本发明的又一首选实例是用于设计和优化荧光定量PCR(FQ-PCR)。FQ-PCR具有利用监测反应系统中荧光信号的与靶核酸的扩增同步积累的关系，通过标准曲线对未知模板核酸进行定量分析，无需开管取样电泳，有效消除了PCR污染和高度自动化等优点，目前已在许多领域广泛应用。除因设备昂贵、探针设计和标准曲线制备复杂等使其实际应用受限之外，尚有许多需要解决的问题，特别是在检出多种靶核酸的多重反应中，与传统PCR同样存在需多管反应，引物与模板的竞争问题，导致低拷贝核酸的检出困难或假阴性。使用折叠引物可以在引物3′5′端分别标记荧光基团和淬灭基团，无需另外设计探针，有助于在简化FQ-PCR试验设计的同时减少非特异错配退火，降低本底荧光。同样利用折叠引物的三重退火温度，可以在单管内多对引物分级退火延伸，实现互不干扰的多重反应，更准确、简便、快捷地同时检出多种病原。
本发明的又一首选实例是用于优化和完善反转录PCR(RT-PCR)。RT-PCR是以信息RNA(mRNA)为模板联合逆转录反应与PCR扩增获得目的基因的完整序列或特定的基因DNA序列，常应用于分析基因的转录产物和检测RNA病毒等。常规RT-PCR分为两步：首先在反转录酶作用下将mRNA反转录成cDNA第一链；第二步以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链，再以cDNA第一、第二链为模板，用基因特异的上下游引物进行PCR扩增获得大量的cDNA.为简化步骤和避免污染，也为了研究和检测多因素相关基因及其表达谱的需要现已建立了一步RT-PCR和多标志物RT-PCR；前者在一个管内至少2对引物；后者在反转录之后，使用多对基因特异引物进行多管PCR扩增,不可避免都存在传统PCR(引物之间和引物与非靶序列之间错配退火)非特异扩增和易污染等问题，影响结果的敏感性和特异性。使用折叠引物将使一步RT-PCR不仅简单快捷，而且更加灵敏准确；多标志物RT-PCR的多对基因特异引物设计为折叠引物，则可以在一个管内通过分级退火延伸，实现无竞争干扰的多重扩增，特别有利于研制可同时检出和鉴定多种(型、株)病毒的多重RT-PCR分子诊断试剂盒。
本发明的又一首选实例是用于优化和完善差异显示RT-PCR(DDRT-PCR)。DDRT-PCR是将mRNA逆转录与PCR技术相结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，作为观察和分析基因表达差异和基因新功能的有效方法，已广泛应用于生物、医学、农业等生命科学的各个领域。但DDRT-PCR也存在不少问题，突出的是PCR竞争和假阳性问题，因为无论是随机引物和瞄定引物还是第二代差异显示系统根据酶切位点和接头序列设计的通用引物都属于普通PCR引物，且不同的模板mRNA分子具有不同的2级结构，在PCR反应中都避免不了常规PCR极易产生非特异扩增、竞争抑制低拷贝靶序列的扩增等固有的缺陷，如果采用折叠引物设计，将有助于克服常规PCR引物的上述缺陷，有效抑制竞争和非特异扩增减少假阳性。
本发明的又一首选实例是用于优化和完善cDNA末端快速扩增(RACE)。RACE是以部分已知区域序列为起点扩增基因转录本未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。在使用dT接头引物逆转录获得cDNA第一链后，需使用含接头序列的引物和2个基因特异引物进行2轮PCR扩增。正如传统巢式PCR一样，步骤多和易污染是突出问题。如将上述引物设计成折叠引物，有可能在简化步骤、排除污染的同时实现单管单轮巢式PCR扩增。
在此有必要指出的是，上述实施例和实例仅仅只是对本发明作进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制。
Claims (8)
1.一种折叠引物，其特征在于：该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度(或低温退火温度)；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度。
2.如权利要求1所述折叠引物，其特征在于，所述折叠引物的3′端常规引物部分，其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或取代错配碱基。
3.如权利要求1所述的折叠引物，其特征在于，所述的折叠引物5′端特殊设计引物部分，特殊设计引物部分与3′端互补序列是从第2-4碱基起至第8-20碱基添加7-19个与3′端互补碱基，而5′末端第1位则特设为与3′末端第1位错配碱基。
4.如权利要求3所述的折叠引物，其特征在于，所述的错配碱基为C或G中的一种。
5.如权利要求1所述的折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用镁、酶分离组合试剂模式，分别配制至少含有1对折叠引物的无镁加酶组合试剂和制备含镁模板DNA；在一个PCR管内加入10ul无镁加酶组合试剂和5ul含镁模板形成完整反应体系，即可上机反应；
(2)折叠引物PCR反应:预热(解链)后先进行至少1组初始(低温)退火温度循环，在循环内或/和循环组间至少用2个初始退火温度分级退火，每组至少扩增2个循环；随后进入高温退火循环组：在循环内用1-3个高温退火温度分级退火扩增36-56个或更多循环；在60-70分钟内连续扩增60个或更多循环，可完成从简单到复杂的多重反应；
(3)扩增产物分析鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；或采用高效质谱(HPMS)测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；也可采用微阵列尤其是低密度芯片技术鉴定扩增片段。
6.如权利要求1所述的折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于，所述的镁酶分离组合试剂为不含有氯化镁和模板DNA的PCR反应全套试剂。
7.如权利要求1所述的折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于，所述的预热(解链)，其温度为82-95℃，预解链时间为1.5-3min；所述的循环为解链、退火、延伸三步骤的循环，并且在循环过程中在前4～20个循环内的解链温度为86-95℃、解链时间为5-10s，待4～20个循环以后、采用解链温度为80-86℃、解链时间为5-10s；退火分为初始退火、高温退火；所述的初始退火温度可在循环(组)内或循环(组)间按照递增或者递减的顺序进行分级退火处理，或者在循环(组)内或循环(组)间按照交替递增或递减的顺序进行分级退火处理，每个退火温度处理的时间为5-10s；所述的初始退火温度在45-70℃；在多重PCR扩增过程中，各对引物之间的初始温度相差至少3-5℃；所述的折叠引物，其折叠温度为43-68℃，并在循环过程中，各对引物的折叠温度比其初始退火温度低1-2℃；所述的折叠引物，在PCR扩增过程中，其高温退火时的温度为65-72℃，退火的时间为5-20s；所述的延伸温度为72-75℃，延伸时间为10-20s。
8.如权利要求1所述的折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于，所述的高温退火可以采用单一高温进行退火处理，也可以采用2-3个高温退火温度进行递增分级退火处理，其高温退火温度范围在65-72℃之间，退火时间为5-20s。
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