CN104024428B - 自我竞争型引物及运用此自我竞争型引物的方法 - Google Patents

Abstract

在此揭示一种自我竞争型引物，其可用以基于样本核酸的选定区域内相较于参考核酸的选定区域是否具有核苷酸变异而优先扩增具有变异的样本核酸。自我竞争型引物包含5’‑竞争域与3’‑延长域。5’‑竞争域与3’‑延长域的序列分别和参考核酸的第一与第二区域互补。第一区域包含参考核酸的选定区域以及紧接于选定区域下游的至少一核苷酸残基。第二区域位于选定区域的下游，且不包含该选定区域，第一与第二区域有至少一核苷酸重迭。在此亦揭示于一样本中相对于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸的方法。

Description

自我竞争型引物及运用此自我竞争型引物的方法

技术领域

本发明关于用以侦测变异的方法与引物组。具体来说，本发明关于一种自我竞争型引物，其可用以优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸。

背景技术

基因突变(gene mutation)指一特定基因或调控序列的核苷酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。突变可以是点突变(point mutation；即，单一核苷酸置换)、一或多个核苷酸的缺失(deletion)或插入(insertion)、多个核苷酸的置换(substitution)或在染色体层级的互换(crossing-over)。

在分子遗传学的领域中，辨识基因突变或核苷酸变异非常关键。举例来说，已知有许多基因和癌症的发生和/或进程息息相关，而医学界正尝试针对此类基因发展分子标靶。在进行标靶疗法时，一或多个目的基因的序列变异可能会影响治疗的效果。因此，侦测癌细胞中的一或多个基因突变有助于设计出最适合特定病患的治疗计划。

目前已发展出多种可侦测基因突变或核苷酸变异的技术。举例来说，可利用桑格式直接测序法(Sanger’s direct sequencing)来测定目标序列，以得知发生突变的一或多个核苷酸。然而此种直接测序的灵敏度不高，且操作上费时费力，因而限制了此技术在临床与研究领域等的应用。

或者是可采用对核苷酸变异序列具有专一性的引物和/或探针，以正向侦测此类变异。传统上，在设计用以侦测突变的引物或探针时，必须先知道突变部位的序列。以常用来侦测基因突变的对偶基因特异性寡核苷酸聚合酶链反应(allele specificoligonucleotide-polymerase chain reaction，简称ASO-PCR)为例，需使用对野生型或突变型序列具专一性的引物，并藉由是否可进行扩增反应，来判断是否有突变序列。ASO-PCR的缺点之一在于其专一性通常不高，因而造成较高的假阳性比例。此外，专一性较低时会导致原本不应被扩增的样本核酸被错误地扩增，此时会将引物序列引入至扩增产物中，而使得扩增产物的序列与样本核酸的真实序列不同。样本核酸的错误扩增会使得后续的确认步骤(如测序)失去意义，因为此时的扩增产物无法反映样本核酸的真正序列。此外，在ASO-PCR方法中，一个反应系统中只能利用一种引物，因而一次只能侦测一种序列(野生型或突变型)。因此，当一相同位置可能出现多种核苷酸变异时，必须设计多种引物以确保能涵盖所有的突变序列，且必须进行独立的反应，才能正确地侦测到所有的突变。

另一种常用的侦测技术是连接酶链式反应(ligase chain reaction，简称LCR)，此技术常和其它以扩增为基础的反应(如PCR)合并使用。LCR采用热稳定的连接酶以及两组引物组，每一引物组包含二个引物，当这两个引物彼此非常靠近时会在连接酶的作用下连接，因而能够用以鉴别单一核苷酸变异(如点突变、单一核苷酸缺失与单一核苷酸插入)。LCR固然有其自身的优点，但无法用以侦测具有多重核苷酸变异的突变序列。

更有甚者，当运用于疾病诊断时，由活体组织取得的样本可能同时含有野生型细胞以及突变型细胞。当可想见，野生型细胞的数量通常远高于突变细胞，这可能会影响突变序列的扩增与侦测。

有鉴于上述问题，相关领域亟需提出一种能够正确地侦测核苷酸变异的方法，包括单一核苷酸与多核苷酸变异。

发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在于指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本发明至少部分是基于一种新颖的引物设计方案，此种设计方案使得在扩增过程中，能够优先扩增带有变异序列的核酸(相较于参考核酸)，且因而可用以侦测核苷酸变异。

本发明的一个方面是关于一种自我竞争型引物，其可用以基于一样本核酸的一选定区域内相较于一参考核酸的一选定区域具有或不具有一核苷酸变异，而优先扩增具有核苷酸变异的该样本核酸。

依据本发明的一个实施例，所述的自我竞争型引物包含一5’-竞争域与一3’-延长域。上述5’-竞争域包含与参考核酸的第一区域互补的一序列，其中上述第一区域包含该参考核酸的选定区域以及紧接于该选定区域下游的至少一个核苷酸残基。所述的3’-延长域包含与参考核酸的第二区域互补的序列，其中上述第二区域位于该参考核酸的该选定区域下游，且不包含该选定区域；此外，上述的第一区域与第二区域有至少一个核苷酸的重迭。所述的3’-延长域可作为PCR式扩增反应中的正向引物，且能够相对于不具有核苷酸变异的样本核酸(即，非变异样本核酸)而优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本核酸)。

根据本发明某些实施例，上述自我竞争型引物为非嵌合型引物。在其它替代性实施例中，上述自我竞争型引物为嵌合型引物。

在本发明多种不同实施方式中，3’-延长域的最后一个核苷酸与位于参考核酸的选定区域下游1–37个核苷酸的核苷酸残基互补。

根据本发明某些实施例，自我竞争型引物的5’-竞争域与3’-延长域可直接或间接透过3’-5’链接(linkage)或5’-5’链接而相接。在此二个功能域直接链接的情形中，自我竞争型引物由5’-竞争域与3’-延长域所组成。在替代性的实施例中，自我竞争型引物可更包含一核苷链(nucleosidic linker)或非核苷链(non-nucleosidic linker)以连接5’-竞争域与3’-延长域。非核苷链的例示性实施例可为肽、碳水化合物、脂类、脂肪酸、C2–C18烷基链(alkyl linker)、磷酸根(phosphate group)、磷酸酯(phosphate ester)、亚磷酰胺(phosphoramidite)、聚乙二醇链(poly(ethylene glycol)linker)、乙二醇链、侧链烷基链(branched alkyl linker)、丙三醇(glycerol)或杂环基团(heterocyclic moiety)。本发明的一个实施例中使用了C3间隔物(C3spacer)作为非核苷链。

在一个实施例中，自我竞争型引物的5’-竞争域的序列为GGTAGTTGGAGCTGGTGGCG(SEQ ID NO:SEQ ID NO:1)、3’-延长域的序列为GAATATAAACTTGTGGTAGTTGG(SEQ ID NO:2)，且5’-竞争域与3’-延长域由C3间隔物所连接。在另一实施例中，自我竞争型引物的5’-竞争域的序列为ACCGTGCAGCTCATCACGCAG(SEQ ID NO:8)、3’-延长域的序列为CTCACCTCCACCGTGCA(SEQ ID NO:9)，及且5’-竞争域与3’-延长域系由C3间隔物所连接。

本发明的一个方面是关于一种PCR式的扩增方法，其可基于一样本核酸的选定区域中是否具有核苷酸变异(相较于参考核酸的选定区域)，而优先扩增变异样本核酸。

根据本发明一个实施例，上述扩增方法包含一扩增步骤，

其利用根据本发明上述态样/实施例的自我竞争型引物来扩增样本核酸，而使得具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本核酸)可相对于不具有核苷酸变异的样本核酸(即，非变异样本核酸)而优先扩增。

本发明又一个方面是关于一种PCR式的侦测方法，其可用以侦测一样本核酸的选定区域中是否具有核苷酸变异(相较于参考核酸的选定区域)。

根据本发明的一个实施例，上述侦测方法包含扩增步骤与侦测步骤。在扩增步骤中，利用根据本发明上述态样/实施例的自我竞争型引物来扩增样本核酸以产生一扩增产物；其后在侦测步骤中决定样本核酸的选定区域中是否出现核苷酸变异。

在一个实施例中，上述侦测步骤包含测序该扩增产物。额外地或可任选地，上述侦测步骤包含定量选定区域中具有核苷酸变异的扩增产物和/或选定区域中不具有核苷酸变异的扩增产物。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1A至图1C为示意图，概要地说明根据本发明实施方式的自我竞争型引物的设计方案；以及

图2为照片，呈现出根据本发明的实施例对变异序列进行优先扩增的电泳结果。

附图中组件符号的简单说明：

100 自我竞争型引物

110 5’-竞争域

115 选定区域

120 3’-延长域

200 参考核酸

210、310、310’ 第一区域

215、315、315’ 选定区域

220、320 第二区域

300 非变异样本核酸

300’ 变异样本核酸

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。同时，在此处“至少一”以及“一或多”等词汇当包含一、二、三或更多种。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施方式的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

在本说明书中，“样本”指任何含有核酸的样本。所述的样本可为“生物样本”，其包含以下成分或由以下成分所组成：分离自动物或植物的细胞、组织或组成份(如体液)。上述动物较佳可为人类。在本说明书中，生物样本包含取自需要医学处置的个体的临床样本。例示性的生物样本包括但不限于衍生自以下的样本：血液、唾液、痰液、尿液、粪便、皮肤细胞、毛囊、精液、阴道液、骨骼片段、骨髓、脑部成分、脑脊髓液、羊膜液与组织切片。当可理解，这些例示并非用以限定视为适用于本发明的样本类型。

“核酸”(nucleic acid)一词在此处指由二或更多个核苷酸(nucleotide)、核苷酸(nucleoside)或核碱基(nucleobase，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)所形成的链状分子。核酸包括但不限于DNA或RNA病毒的基因组或其部分；细菌基因组或其部分；真菌、植物或动物基因组或其部分；信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、质粒DNA、线粒体DNA或合成DNA或RNA。核酸可为线状(如mRNA)、环状(如质粒)或分支状；且亦可为双链或单链形式。

在此处“核苷酸”(nucleotide)为核酸的次单元，且是由杂环碱基(heterocyclicbase)、糖类(sugar)与一或多个磷酸基(phosphate group)所组成的化合物。最常见的核苷酸是以嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)的衍生物作为碱基，而糖类则是五碳脱氧核糖(pentose deoxyribose)或五碳核糖(pentose ribose)。常见的嘌呤有腺嘌呤(adenine，A)与鸟嘌呤(guanine，G)；而常见的嘧啶有胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶(thymine，T)与尿嘧啶(uracil，U)。

此处所述的核酸“序列”(sequence)系指组成一核酸的核苷酸的排序。在本说明书中，核酸具有一5′端与一3′端；除非另有说明，单链核苷酸序列的左手端为5′端；而右手端为3′端。“下游”(downstream)一词指位于所述核苷酸序列的3′方向的一核苷酸序列；而“上游”(upstream)一词则是指位于所述核苷酸序列的5′方向的一核苷酸序列。

在此处，“变异”(variant)一词指一参考(reference)核酸分子的一或多个核苷酸发生了改变；上述的改变包含一或更多个新核苷酸的插入、一或更多个核苷酸的缺失或一或更多个既有核苷酸的置换。广义来说，“核苷酸变异”一词在此包含了点突变、多点突变、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、缺失、插入与转位(translocation)。

“参考核酸”一词在此指一核苷酸的序列为感兴趣的已知参考序列。上述参考序列可为一“野生型”(或称“非突变”或“正常”)序列，其选定区域中不带有突变。或者是，参考序列可为一突变序列。本发明所属技术领域中具有通常知识者当可想见，当参考核酸的选定区域内包含野生型序列时，所述的变异样本核酸可为任何突变序列。或者是，当参考核酸的选定区域内具有已知的突变序列时，所述变异样本核酸可为野生型序列或任何其它突变序列。在参考核酸为双链形式的情形中，编码链(coding strand)与模板链(templatestrand)任一者的序列皆可作为参考序列。

在此处“样本核酸”指欲用以探究其“选定区域”中是否有一或多核苷酸变异的一核苷酸序列。在样本核酸为双链DNA的情形中，其包含了编码链以及与编码链互补的模板，其中编码链的序列是由5’到3’的方向排列，而模板链的序列是由3’到5’的方向排列。在本说明书中，“变异样本核酸”的选定区域中有至少一核苷酸变异，所述变异是相较于参考序列的选定区域而言。在此处，样本核酸的选定区域的序列与参考核酸的选定区域的序列相同时，此样本核酸亦称为“非变异样本核酸”。

“引物”一词在此指一单链核苷酸序列，当引物处于适当的环境(如具有适当缓冲液、盐类、温度和/或pH值)下且环境中存有核苷酸以及用于核酸聚合的成分(如，DNA聚合酶(DNA-dependent polymerase)或RNA聚合酶RNA-dependent polymerase)时，引物能够作为一引物延长产物的合成起始点。一般来说，引物的序列实质上与欲复制的核酸链互补；或该引物至少包含一区域与欲复制的核酸链具有足够的互补性而能够进行退火，并由该引物处开始进行5′到3′方向的链延长。上述引物可为DNA引物、RNA引物或一嵌合型(chimeric)DNA/RNA引物。在多数但非必要的情形下，引物为短的合成核酸，长度通常为约12–100个核苷酸；较佳为约30–60个核苷酸。

“杂合”(hybridization)与“退火”(annealing)等词在此可交替使用，且指具有足够互补性的二条核苷酸序列经由华森-克李克(Watson-Crick)碱基配对或其它非正规的配对而形成了复合物(complex)或杂合体(hybrid)。杂合作用可能发生在两条DNA之间、两条RNA之间或一条DNA与一条RNA之间。杂合作用会在分子生物相关领域中公知的多种适当条件(如温度、pH值、盐类浓度等)下发生。

在此处，“扩增”(amplification)一词指能够增加样本中特定核苷酸序列含量的方法或过程。聚合酶链反应(PCR)是相关领域熟知的扩增反应，下文将进一步详述此处所用的PCR过程。在此处，“反应混合物”(reaction mixture)与“混合物”(mixture)等词可交替使用，并用以指称可用于后续聚合酶链反应中的组成物。

“优先扩增变异样本核酸”在此指促进变异样本核酸的扩增并阻碍非变异核酸的扩增。当可理解，根据本发明的原理与精神，当反应混合物中同时存有变异与非变异样本核酸时，这两种样本核酸都会在自我竞争型引物的作用下被扩增。然而，基于此处创新的引物设计，变异样本核酸的扩增效率会远高于非变异样本核酸的扩增效率。因此，即便当反应混合物中，变异样本核酸的含量相较于非变异样本核酸的含量仅占了一小部分时，本发明所提供的引物与方法仍能够正确地将变异样本核酸扩增至可侦测的含量。

为了提供一种可用以优先扩增(且因而能够侦测)在选定区域中具有一或多核苷酸变异的样本核酸的方法，此处设计了一种自我竞争型引物，其具有两个功能域(即，一5’-竞争域以及一3’-延长域)能够分别结合至样本核酸上不同但互相重迭的区域。下文提供了关于此自我竞争型引物与相关方法的详细信息。

(I)自我竞争型引物

参照图1A至图1C来说明此处提出的引物设计方案，以利了解本发明的内容。必须了解，图1A至图1C中所示的序列是为了说明本发明且仅为例示；因此申请专利范围不受这些序列的限制。

图1A所例示的参考核酸200包含人类大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(v-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，简称KRAS)基因外显子1的第1至第40个核苷酸。此参考核酸200的编码股与模板股序列分别为5’-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCG-3’(SEQ ID NO:3)以及3’-TACTGACTTATATTTGAACACCATCAACCTCGACCACCGC-5’(SEQ ID NO:4)。基于讨论的目的，下文的说明中选用模板股的序列作为参考核酸200的序列。在本说明书的脉络中，在参考核酸200中选定了一个区域，以探究此选定区域215中是否带有或不带有一或多核苷酸变异。在本实施例中，参考核酸200(模板链)中的选定区域215的序列为3’-TCGACCACC-5’(SEQ IDNO:5，即KRAS外显子1的第30至38个核苷酸，图1A中以粗体底线标记)。

理论上，欲探究的选定区域的核苷酸长度并无特殊限制。根据本发明的非必要实施方式，选定区域最多可带有20个核苷酸。举例来说，选定区域的长度可为约1、5、10、15或20个核苷酸。

为了要提供能够侦测选定区域中核苷酸变异的方法，所设计的自我竞争型引物具有两种功能域，分别杂合至参考核酸上不同但重迭的区域。下文进一步详述此自我竞争型引物。

此处提出的自我竞争型引物包含一5’-竞争域以及一3’-延长域，两者分别和参考核酸的第一区域与第二区域互补。上述3’-延长域可作为正向引物，而能够在以PCR为基础的样本核酸扩增过程中优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本核酸)，所述的优先扩增指相对于不具有核苷酸变异的样本核酸(即，非变异样本核酸)而言。

上述第一区域包含选定区域与紧接在参考核酸的选定区域下游的至少一核苷酸残基，而使得在适当的杂合环境下，5’-竞争域可和选定区域以及至少一相邻核苷酸杂合。可任选地，上述紧接在选定区域下游的核苷酸残基可为至少1至20个核苷酸残基。在另一可任选的实施例中，上述第一区域可更包含紧接在选定区域上游的至少一核苷酸残基。同样可任选地，上述核苷酸残基紧接在选定区域上游的核苷酸残基可为至少1至20个核苷酸残基。根据本发明某些实施例，上述5’-竞争域的长度可为15-40个核苷酸。

图1A例示的自我竞争型引物100的5’-竞争域110的序列为GGTAGTTGGAGCTGGTGGCG(SEQ ID NO:1，对应于野生型KRAS外显子1的第21至38个核苷酸，本说明书与图式中分别以斜体以及粗体加底线标记其选定区域115图1A)。此5’-竞争域110的序列与参考核酸200的第一区域210的序列互补，其中上述第一区域210包含参考核酸200的模板链的选定区域215、9个下游核苷酸以及两个上游核苷酸。

第二区域位于选定区域的下游。更明确地说，第二区域的3’端位于选定区域的5’端的下游至少一核苷酸处，且因此，第二区域不会涵盖参考核酸的选定区域。在可任选的实施例中，第二区域的3’端位于选定区域的5’端下游至少1至20个核苷酸处。根据本发明某些实施例，上述3’-延长域的长度可为15–40个核苷酸。

此外，上述第一区域与第二区域彼此应有至少一个核苷酸重迭，藉以促进变异样本核酸的优先扩增。如此一来，上述3’-延长域与5’-竞争域在适当的杂合环境下，会相互竞争重迭的一或多个核苷酸，以求与样本核酸杂合。在某些可任选的实施例中，上述第一区域与第二区域彼此有1–38个核苷酸的重迭。

如图1A所示，例示性3’-延长域120的序列为GAATATAAACTTGTGGTAGTTGG(SEQ IDNO:2，对应于野生型KRAS外显子1的第7至29个核苷酸)，此序列与参考核酸200的第二区域220互补。具体来说，上述第二区域220包含紧接在参考核酸200的模板链的选定区域215下游的23个连续的核苷酸残基。在本例示中，3’-延长域120由5’端起算的最后9个核苷酸与5’-竞争域110由5’端起算的前9个核苷酸相同。

根据本发明多种实施例，可透过常见的3’-5’链接或较少见的5’-5’链接将5’-竞争域和3’-延长域连接在一起。图1A所例示的5’-竞争域110和3’-延长域120是透过3’-5’链接来连接。

根据可任选的实施例，5’-竞争域直接连接至3’-延长域。或者是，可在5’-竞争域和3’-延长域之间引入一连接链。上述连接链可为核苷链或非核苷链。核苷链由一或多个核苷酸(如A、T、C、G或U，或其它较不常见的核苷酸)所组成。非核苷链的非限制性实施例可为肽、碳水化合物、脂类、脂肪酸、C2–C18烷基链、磷酸根、磷酸酯、亚磷酰胺(如间隔物亚磷酰胺9、间隔物亚磷酰胺18、间隔物亚磷酰胺C3、间隔物C12CE亚磷酰胺与吡咯啶-CE亚磷酰胺)、聚乙二醇链、乙二醇链、侧链烷基链、丙三醇或杂环基团。图1A所示的自我竞争型引物100使用非核苷链的C3间隔物130来连接5’-竞争域110的3’端以及3’-延长域120的5’端。

根据某些实施例，所述的自我竞争型引物可为非嵌合型引物，此时其5’-竞争域、3’-延长域以及核苷链(若有的话)皆为脱氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列。譬如，图1A所示的自我竞争型引物100即为非嵌合型引物，其5’-竞争域和3’-延长域接由DNA碱基所组成，且不含核苷链。

在某些替代性实施例中，自我竞争型引物可为嵌合型引物，其中5’-竞争域、3’-延长域与及核苷链(若有的话)其中之一的核苷酸序列类型和其它部分不同。作为例示而非限制，嵌合型自我竞争型引物可以是以下任一种形式：DNA型5’-竞争域直接连接至RNA型3’-延长域、DNA型5’-竞争域透过非核苷链或核苷链而间接连接至RNA型3’-延长域、RNA型5’-竞争域直接连接至DNA型3’-延长域、RNA型5’-竞争域透过非核苷链或核苷链而间接连接至DNA型3’-延长域、DNA型5’-竞争域透过RNA链间接连接至DNA型3’-延长域、RNA型5’-竞争域透过DNA链间接连接至RNA型3’-延长域等等。

当可理解，本发明提出的自我竞争型引物经设计而使得链延长(即，在新的DNA链上加入核苷酸)只会由3’-延长域的3’端开始，而利用5’-竞争域作为起始点的链延长反应会受到抑制。对于透过传统3’-5’链接而连接在一起的5’-竞争域和3’-延长域来说，不会发生以5’-竞争域为链延长始点的延长反应，因为5’-竞争域最后一个核苷酸的3’-羟基已被占据。

此外，采用上述嵌合型自我竞争型引物亦可有效率地防止由5’-竞争域起始的延长反应。已知可根据模板序列的类型将聚合酶区分为DNA聚合酶或RNA聚合酶。因此，对于嵌合型自我竞争型引物，可依据3’-延长域的类型来选择聚合酶的种类，藉以达到抑制5’-竞争域延长的目的。举例来说，若5’-竞争域由RNA碱基所组成，而3’-延长域是由DNA碱基组成，那么DNA聚合酶只会从3’-延长域的3’端起始链延长。相似地，若嵌合型自我竞争型引物的5’-竞争域由DNA碱基组成，而3’-延长域是由RNA碱基组成，则可使用RNA聚合酶以起始由3’-延长域开始的链延长过程。

还有另一种例示性的方法是在自我竞争型引物中使用较不常见的5’-5’链接来连接5’-竞争域与3’-延长域。在此种情形中，若自我竞争型引物为非嵌合型引物，则应对5’-竞争域的3’端进行修饰，以防止由该处开始的链延长。至于嵌合型的自我竞争型引物，则不一定要在5’-竞争域的3’端进行此类修饰。可利用非核苷阻断物(blocker)来修饰5’-竞争域的3’端；上述非核苷阻断物譬如磷酸基或磷酸酯。譬如由3’-间隔物C3可控孔径玻璃(C3controlled-pore glass，简称C3-CPG)形成的3’-丙基磷酸酯(3’-propyl phosphate)就是一种很有效的3’端非核苷阻断物。将5’-竞争域于3’位置上的最后一个核苷酸形成反向的3’-3’链接，也能够有效地防制聚合酶将核苷酸延长，因为在其3’位置上没有可用的羟基可供起始合成反应。

另一种避免聚合酶在5’-竞争域的3’端进行延长的方法是利用核苷阻断物(nucleosidic blocker)，2’,3’-二脱氧核苷(如2’,3’-ddC-CPG)或3’脱氧核苷(如3’-dA-CPG、3’-dC-CPG、3’-dG-CPG或3’-dT-CPG)。当然，亦可采用可用以修饰抑制引物3’端的其它等效技术，而这些其它技术亦属于本发明的范围。

下文实验例中，基于以上的引物设计方案针对人类上皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor，简称EGFR)基因提出了另一种例示的自我竞争型引物。自我竞争型引物包含了5’-竞争域，其序列为ACCGTGCAGCTCATCACGCAG(SEQID NO:8)；C3间隔物；以及3’-延长域，其序列为CTCACCTCCACCGTGCA(SEQ ID NO:9)。

(II)用以相较于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸的方法

在详细介绍了此处提出的引物设计方案以及例示的自我竞争型引物之后，接着说明利用此种自我竞争型引物的PCR式的优先扩增方法。

本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，用于扩增的生物样本可能同时包含一特定目标基因的野生型序列与突变。譬如，在取自生物体组织(如肿瘤或其它疾病的病灶)的样本中，可能含有某些突变细胞。在此种情形中，突变序列(相较于野生型序列)可能仅占了一小部分，而多数传统PCR方法无法正确地将突变序列扩增到可用于后续测序或其它定性分析的程度。本发明的新颖特征之一在于此处提出的自我竞争型引物可允许变异样本核酸(如生物样本中的突变序列)相较于非变异样本核酸(如同一生物样本中的野生型序列)的优先扩增，而使得变异样本核酸扩增后的量足以进行测序或侦测。此一特性在如肿瘤治疗之类的领域特别有用，因为癌细胞的遗传组成通常可用来预测或指示疾病的进程和/或适当的治疗方案。此外，在适当的反应条件下，使用本方法所得到的扩增产物其选定区域中的序列和样本核酸相同，不会发生错误扩增的情形。

根据本发明的一个实施例，上述用以相较于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸的PCR式方法包含扩增步骤；此步骤利用根据本发明上述实施方式/实施例的自我竞争型引物(例如，但不限于自我竞争型引物100)来扩增样本核酸。具体来说，此一扩增步骤包含制备包含该自我竞争型引物与样本核酸的反应混合物，以及将此一反应混合物置于一PCR扩增条件下。一般来说，样本核酸的选定区域中可能具有或不具有一核苷酸变异(相较于参考核酸)。根据本发明的原理与精神，此方法适用于变异序列已知或未知的情形下。举例来说，上述样本可能含有图1B所例示的非变异样本核酸300以及图1C所例示的变异样本核酸300’。非变异样本核酸300的第一区域310(包含选定区域315)和第二区域320的序列皆与图1A所示的参考核酸200的第一区域210(包含选定区域215)和第二区域220相同。变异样本核酸300’的选定区域315’相较于参考核酸200的选定区域215有一个核苷酸的变异(图1C中同时以粗体、底线与斜体标记)，因此变异样本核酸300’的第一区域310’序列与参考核酸200的第一区域210和非变异样本核酸300的第一区域310不完全相同；但变异样本核酸300’的第二区域320则和参考核酸200的第二区域220以及非变异样本核酸300的第二区域320完全相同。

本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，反应混合物中可更包含其它扩增反应试剂。这些用于PCR的扩增反应试剂可包含，但不限于：缓冲剂(buffers)；反应试剂(reagents)；具有反转录酶(reverse transcriptase)活性、聚合酶(polymerase)和/或外切酶(exonuclease)活性的酶；酶辅助因子(enzymecofactors)，如镁或锰；盐类；以及脱氧三磷酸核苷(deoxyribonucleotide triphosphates，简称dNTPs)，如脱氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate，简称dATP)、脱氧三磷酸鸟苷(deoxyguanosinetriphosphate，简称dGTP)、脱氧三磷酸胞苷(deoxycytidine triphosphate，简称dCTP)、脱氧三磷酸胸苷(deoxythymidine triphosphate，简称dTTP)及脱氧三磷酸尿苷(deoxyuridine triphosphate，简称dUTP)。本领域普通技术人员可依据所用的PCR方法来选择适当的扩增反应试剂。

之后对反应混合物进行PCR处理；此处理依序包含变性步骤、退火步骤与延长步骤；兹分述如下。

在变性步骤中，将由模板链与密码链形成的双链DNA(DNAduplex)变性(即，熔化)。双链DNA确切的变性过程取决于其大小、序列与分子组成(主要是G-C键合相对于A-T键合的比例或G-C%)。在适当的温度下，双链DNA通常会在一秒内就变性，上述温度约介于80℃(一般为G-C%较低且较小的分子)至约95℃(一般为较大的分子，如人类基因组DNA)之间；在某些情形中，变性温度可能更低。

在变性步骤之后，将反应混合物冷却至退火温度，而使得自我竞争型引物的5’-竞争域与3’-延长域能够彼此竞争与样本核酸的一链(在图1A至1C所示的实施例中为模板链)退火的机会。本领域具有通常知识者当可理解，互相杂合的两序列不必然需要完全互补。请同时参见图1B与1C，此时5’-竞争域110不但可和非变异样本核酸300的模板链杂合，也会和变异样本核酸300’的模板链杂合。然而，相较于由5’-竞争域110和非变异样本核酸300所形成的杂合体，由5’-竞争域110和变异样本核酸300’所形成杂合体较不稳定；因此由5’-竞争域110和变异样本核酸300’所形成的杂合体较易变性，因而使得3’-延长域120有较高的机会黏合至变异样本核酸300’(相较于3’-延长域120黏合至非变异样本核酸300的机会)。因而，在后续的延长步骤中，会促进变异样本核酸300’的扩增，并减少非变异样本核酸300的扩增。在同一个反应系统中，变异样本核酸序列300’的扩增效率提升，再加上非变异样本核酸序列300的扩增效率降低，导致了变异样本核酸序列300’的优先扩增。

在非必要的实施例中，上述退火步骤可包含两个阶段，其中第一阶段所用的退火温度高于第二阶段所用的退火温度。

在退火步骤之后，将温度调整到延长温度，以使得核苷酸能够延长。理想的延长温度为本领域所熟知；一般来说，延长温度约为70-80℃。然而，在考虑相关因素(如所用的聚合酶种类)后，亦可采用其它温度。

之后使反应混合物在变性、退火与延长等步骤间循环，以持续扩增样本核酸(包含变异与非变异样本核酸)。此处提出的PCR处理可运用于任何已知的PCR热循环装置(thermocycler)及其均等物。此外，此处提出的PCR式方法兼容于大多数的既有PCR处理。因而，能够将本方法运用于各种PCR技术，包括但不限于非对称聚合酶链反应(asymmetricPCR)、热启动聚合酶链反应(hot start PCR)、迷你引物聚合酶链反应(miniprimer PCR)、多引物聚合酶链反应(multiplex-PCR)、巢式聚合酶链反应(nested PCR)，实时定量PCR聚合酶链反应(RT-PCR)、反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR)、固相聚合酶链反应(solid phase PCR)与递减聚合酶链反应(touchdown PCR)。

举例来说，本说明书一实验例中所用的循环条件包括：于约95℃下变性约10分，而后进行45个循环的变性(约94℃、约60秒)、退火(约60℃、约60秒)与延长(约72℃、约60秒)，其后在约72℃下进行约10分钟的最终延长步骤。在另一实验例中(数据未显示)所用的循环条件包括：于约95℃下变性约10分，而后进行45个循环的变性(约94℃、约60秒)、第一退火(约65℃、约180秒)、第二退火(约57℃、约60秒)与延长(约72℃、约60秒)，其后在约72℃下进行约10分钟的最终延长步骤。

本发明的又一个方面是关于一种PCR式的方法，其可用以决定相较于一参考核酸的选定区域，一样本核酸的选定区域中是否具有一核苷酸变异。

根据本发明一实施例，上述包含一扩增步骤与一侦测步骤。在所述的扩增步骤中，根据上文所述的方法，利用自我竞争型引物进行变异样本核酸的优先扩增。之后，在侦测步骤中，决定样本核酸的选定区域中是否具有或不具有核苷酸变异。

举例来说，可对扩增步骤中得到的PCR产物进行测序，以确认样本中样本核酸的序列。

下文举出多种实施例来阐明本发明的部分实施方式，以使本发明所属技术领域中具有通常知识者能藉以实践本发明。因此不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。本发明所属技术领域中具有通常知识者基于此处提的说明，当可在不需过度推衍的情形下运用本发明。此处提及的所有文献，皆视为已完全引用而成为本说明书的一部份。

<实验例I>

变异KRAS基因片段的优先扩增

由马偕医院(中国台湾)取得总计153个临床样本，样本系采集自癌症患者的病灶，样本采集均取得患者的告知后同意。处理样本以分离其中的核酸分子。在初期实验中，进行PCR式优先扩增所用的试剂如下：PCR2X Master Mix缓冲液(JMR)10μl、0.2μM自我竞争型引物(5’-竞争域：SEQ ID NO:1；连接链：C3间隔物；3’-延长域：SEQ ID NO:2)、0.2μM反向引物(CCTCTATTGTTGGATCATA；SEQ ID NO:6)、DNA样本100ng，加水使最终体积为20μl。此外，利用传统PCR正向引物(AGGCCTGCTGAAAATGACTG；SEQ ID NO:7)，在相同的条件下进行传统PCR。利用ABI9700PCR设备进行优先扩增或传统PCR，反应中所用的循环条件为：变性温度95℃持续10分钟；之后温度循环为94℃(60秒)、60℃(60秒)与72℃(60秒)，进行45个循环；最后在72℃(10分钟)下进行延长。

在PCR完成后，自PCR槽中取出一样本，并在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。样本与对照标记皆以溴化乙锭(ethidiumbromide，EtBr)染色并以荧光侦测显影，同时以电荷耦合组件相机撷取影像。将琼脂糖凝胶上的产物带切下，并测序其中所含的核酸，已决定样本是否含有突变的变异株。测序结果显示利用此处提出的PCR式优先扩增方法能够优先扩增总计12种位于KRAS基因选定区域内(外显子1第30–38个核苷酸残基)的突变株，且因而使得这些突变株可被侦测；表一摘要整理了这些突变株的突变序列与突变位置。野生型KRAS基因片段包含SEQ ID NO:3所示的编码序列(即KRAS基因外显子1的第1至40个核苷酸)。

表一

突变株编号	核苷酸位置	突变核苷酸
			1	30	A>T
2	31	G>A
			3	31	G>C
4	34	G>A
			5	34	G>T
6	34	G>C
			7	35	G>A

8	35	G>T
			9	35	G>C
10	37	G>A
			11	37	G>T
12	38	G>A

表二摘要整理了传统PCR扩增以及本发明提出的优先扩增的结果。当可理解表二中所述的KRAS突变样本可能同时含有KRAS突变序列KRAS与野生型序列或仅含有KRAS突变序列，而KRAS野生型样本则仅含有KRAS野生型序列。

直接测序的结果显示，在69个经优先扩增后确认含KRAS突变序列的样本中，传统PCR扩增只能侦测到其中54个；而有99个经传统PCR扩增后认定为KRAS野生型的样本中，有15个经优先扩增与直接测序后确认为KRAS突变型样本。由这些结果推算出传统PCR侦测KRAS突变的假阳性比率为约15%，且其侦测敏感度为约78%。相较之下，经此处提出的优先扩增后，能够正确地侦测出所有KRAS突变与野生型样本(假阳性：0%；假阴性：0%；敏感度：100%)。由此实验例可以得知，本发明提出的优先扩增能够用以侦测样本(如临床样本)中的变异序列。

表二

分别纯化含有KRAS突变与野生型序列的质粒DNA，并制备成原液(最终浓度每微升(μl)10⁵拷贝)。将含有KRAS突变序列的原液以10的倍数依序稀释为10²–10⁵份/μl，接着分别将1μl的稀释后原液和9μl的KRAS野生型原液(10⁵份/μl)混合后作为优先扩增的DNA样本，并根据上文所述的方式进行优先扩增。图2的照片呈现了表一所示的KRAS突变株4、12的电泳结果。

如图2所示，此处提出的优先扩增方法能够分别扩增纯KRAS野生型样本以及纯KRAS突变株样本。图2中，左方起算第一与第二条带分别为分子标记与负对照组(未添加核酸样本)。当可注意到，在图2中，纯KRAS突变株样本(左方起算第4、5条带)的强度比纯KRAS野生型样本(左方起算第3条带)的强度来得高。这些结果证实了此处提出的方法可相对于非变异样本核酸(如，此处的KRAS野生型样本)而优先扩增变异样本核酸(如，此处的KRAS突变株4、12)。

在含有KRAS野生型序列与一KRAS突变序列(突变株4或12)的混合物中，本方法同样会相对于KRAS野生型序列而优先扩增KRAS突变株序列，而使得KRAS突变序列被扩增到足以用于后续直接定量的程度。在图2中可以观察到，随着反应混合物中KRAS突变序列浓度逐渐增加，产物带的强度也随之变强(参见左方起算第6–9与10–13条带)。由于在这些样本中非变异样本核酸(即，KRAS野生型序列)的浓度是固定的，可以推论出强度的增加应该是变异样本核酸(在本实验例中为KRAS突变序列)的优先扩增所造成的。

<实验例II>

变异EGFR基因片段的优先扩增

由马偕医院(中国台湾)取得总计179个临床样本，样本系采集自癌症患者的病灶，样本采集均经过患者的告知后同意。处理样本以分离其中的核酸分子。在初期实验中，进行PCR式优先扩增所用的试剂如下：PCR2X Master Mix缓冲液(JMR)10μl、0.2μM自我竞争型引物(5’-竞争域：SEQ ID NO:8；连接链：C3间隔物；3’-延长域：SEQ ID NO:9)、0.2μM反向引物(CAAACTCTTGCTATCCCAGGAG；SEQ ID NO:13)、DNA样本100ng，加水使最终体积为20μl。此外，利用传统PCR正向引物(GAAACTCAAGATCGCATTCATG；SEQ ID NO:14)，在相同的条件下进行传统PCR。反应中所用的循环条件与上文实验例I所述相同。

于本实验例中，野生型EGFR基因片段(即，EGFR基因的第2344至2373个核苷酸)包含SEQ ID NO:10(5’-CTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAG-3’；编码链)所示的序列，以及SEQID NO:11(3’-GAGTGGAGGTGGCACGTCGAGTAGTGCGTC-5’；模板链)所示的序列，其中EGFR基因片段的选定区域(第2361–2370个核苷酸残基)的序列为3’-CGAGTAGTGC-5’(SEQ ID NO:12)。

在PCR反应完成后，根据上文实验例I所述的方法来处理扩增产物，测序结果显示利用此处提出的PCR式优先扩增方法能够优先扩增总计5种位于EGFR基因选定区域内(第2361–2370个核苷酸残基)的突变株，且因而使得这些EGFR突变株可被侦测；表三摘要整理了这些EGFR突变株的突变序列与突变位置。

表三

核苷酸位置	突变核苷酸
		2361	G>A
2364	C>T
		2367	C>T
2369	C>T
		2370	G>A

表四摘要整理了传统PCR扩增以及本发明提出的优先扩增的结果。当可理解表四中所述的EGFR突变样本可能同时含有EGFR突变序列与EGFR野生型序列或仅含有EGFR突变序列，而野生型样本则仅含有EGFR野生型序列。

直接测序的结果显示，在85个经优先扩增后确认含EGFR突变序列的样本中，传统PCR扩增只能侦测到其中60个；而有119个经传统PCR扩增后认定为EGFR野生型的样本中，有25个经优先扩增与直接测序后确认为EGFR突变型样本。由这些结果推算出传统PCR侦测EGFR突变的假阳性比率为约21%，且其侦测敏感度为约66%。相较之下，经此处提出的优先扩增后，能够正确地侦测出所有EGFR突变与野生型样本(假阳性：0%；假阴性：0%；敏感度：100%)。由此实验例可以得知，本发明提出的优先扩增能够用以侦测样本(如临床样本)中的变异序列。

表四

由上述说明与实验结果可以得知，本发明提出了一种新颖的自我竞争型引物，此种引物可以让一样本中的野生型与突变型序列同时进行扩增。此特性的优点之一在于取自病灶或疾病部位的样本通常同时含有野生型与突变序列，且前者的量通常远高于后者，但本发明仍可正确地扩增其中的突变序列。譬如，上文实验例I与实验例II中所用的部分样本系取自癌症患者的病灶，而这些样本中所含的突变序列非常少(相较于野生型序列)。在此种情形下，传统PCR通常无法将突变序列扩增到足供后续测序或以其他方法定性的程度。然而，以上的实验结果显示，当传统PCR无法正确侦测到所有突变样本时，本发明提出的优先扩增方法提供了一个无假阳性、无假阴性且敏感度为100%的侦测方法。本发明的另一优点在于所述的优先扩增与侦测方法非常灵敏，其侦测极限优于先前技术。

此外，由于3’-延长域并未与选定区域相重迭，可将错误扩增(即复制产物中选定区域的序列与样本核酸的原始序列不同)的机率降至最低甚或是零。在于需要目标基因或基因片段的确实序列(或表现型)的情形中，此种特征尤显重要，因为出现错误扩增的扩增产物时，会影响分析的可靠度，且会使得后续的测序分析失去意义。举例来说，在进行标靶疗法时，通常会基于患者的目标基因或其片段的实际序列来决定治疗方式，若是因为错误扩增而使得扩增产物的序列无法呈现该患者的真实基因序列，可能会影响后续治疗的效果。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求范围所界定者为准。

Claims (19)

1.一种自我竞争型引物，其用以基于相较于一参考核酸的一选定区域，一样本核酸的一选定区域内具有或不具有一核苷酸变异，而优先扩增具有该核苷酸变异的该样本核酸，该自我竞争型引物包含：

一5’-竞争域，包含与该参考核酸的一第一区域互补的一序列，其中该第一区域包含该选定区域与紧接在该参考核酸的该选定区域下游的至少一核苷酸残基；以及

一3’-延长域，包含与该参考核酸的一第二区域互补的一序列，其中该第二区域位于该选定区域的下游且不包含该参考核酸的该选定区域，并且该第一区域与该第二区域彼此重迭至少一核苷酸，且其中该3’-延长域作为一正向引物，以在该样本核酸的一聚合酶链反应式扩增过程中，相较于不具有该核苷酸变异的该样本核酸而优先扩增具有该核苷酸变异的该样本核酸。

2.如权利要求1所述的自我竞争型引物，其特征在于，该自我竞争型引物为一非嵌合型引物。

3.如权利要求1所述的自我竞争型引物，其特征在于，该自我竞争型引物为一嵌合型引物。

4.如权利要求1所述的自我竞争型引物，其特征在于，该5’-竞争域与该3’-延长域直接或间接以一3’-5’链接或一5’-5’链接而连接。

5.如权利要求1所述的自我竞争型引物，其特征在于，该自我竞争型引物由该5’-竞争域与该3’-延长域所组成。

6.如权利要求1所述的自我竞争型引物，其特征在于，更包含一连接链以连接该5’-竞争域与该3’-延长域。

7.如权利要求6所述的自我竞争型引物，其特征在于，该连接链为一非核苷链，其选自由一肽、一碳水化合物、一脂类、一脂肪酸、一C2–C18烷基链、一磷酸根、一磷酸酯、一亚磷酰胺、一聚乙二醇链、一乙二醇链、一侧链烷基链、一丙三醇与一杂环基团所组成的群组。

8.如权利要求6所述的自我竞争型引物，其特征在于，连接链为一核苷链。

9.如权利要求6所述的自我竞争型引物，其特征在于，该5’-竞争域与该3’-延长域皆为脱氧核糖核酸序列，且该连接链为一C3烷基链。

10.如权利要求1所述的自我竞争型引物，其特征在于，该参考核酸为与一癌症或一遗传疾病相关的基因或其片段。

11.一种非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其用以基于相较于一参考核酸的一选定区域，一样本核酸的一选定区域内具有或不具有一核苷酸变异，而优先扩增具有该核苷酸变异的该样本核酸，该方法包含：利用一自我竞争型引物来扩增该样本核酸，其中该自我竞争型引物包含：

一5’-竞争域，包含与该参考核酸的一第一区域互补的一序列，其中该第一区域包含该选定区域与紧接在该参考核酸的该选定区域下游的至少一核苷酸残基；以及

一3’-延长域，包含与该参考核酸的一第二区域互补的一序列，其中该第二区域位于该选定区域的下游且不包含该参考核酸的该选定区域，并且该第一区域与该第二区域彼此重迭至少一核苷酸，且其中该3’-延长域作为一正向引物，以在该样本核酸的该聚合酶链反应式扩增过程中，相较于不具有该核苷酸变异的该样本核酸而优先扩增具有该核苷酸变异的该样本核酸。

12.如权利要求11所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，该自我竞争型引物为一非嵌合型引物。

13.如权利要求11所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，该自我竞争型引物为一嵌合型引物。

14.如权利要求11所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，该5’-竞争域与该3’-延长域直接或间接以一3’-5’链接或一5’-5’链接而连接。

15.如权利要求11所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，该自我竞争型引物由该5’-竞争域与该3’-延长域所组成。

16.如权利要求11所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，更包含一连接链以连接该5’-竞争域与该3’-延长域。

17.如权利要求16所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，该连接链为一非核苷链，其选自由一肽、一碳水化合物、一脂类、一脂肪酸、一C2–C18烷基链、一磷酸根、一磷酸酯、一亚磷酰胺、一聚乙二醇链、一乙二醇链、一侧链烷基链、一丙三醇与一杂环基团所组成的群组。

18.如权利要求16所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，连接链为一核苷链。

19.如权利要求16所述的非诊断目的的聚合酶链反应式方法，其特征在于，该5’-竞争域与该3’-延长域皆为脱氧核糖核酸序列，且该连接链为一C3烷基链。