KR20040041165A - 경합 핵산 단편, 재조합 유전자의 정량용 키트, 이것을이용한 재조합 유전자의 정량 방법 - Google Patents

경합 핵산 단편, 재조합 유전자의 정량용 키트, 이것을이용한 재조합 유전자의 정량 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20040041165A
KR20040041165A KR10-2004-7003979A KR20047003979A KR20040041165A KR 20040041165 A KR20040041165 A KR 20040041165A KR 20047003979 A KR20047003979 A KR 20047003979A KR 20040041165 A KR20040041165 A KR 20040041165A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
nucleic acid
recombinant
competitive
competitive nucleic
Prior art date
Application number
KR10-2004-7003979A
Other languages
English (en)
Inventor
히사시 가토
히데오 오하시
아키히로 히노
다케시 마쓰오카
히데오 구리바라
사토시 후토
Original Assignee
내셔널 푸드 리서치 인스티튜트
쇼와산교가부시키가이샤
닛폰 세이훈 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔널 푸드 리서치 인스티튜트, 쇼와산교가부시키가이샤, 닛폰 세이훈 가부시키가이샤 filed Critical 내셔널 푸드 리서치 인스티튜트
Publication of KR20040041165A publication Critical patent/KR20040041165A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
    • C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
    • C12Q2545/107—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis with a competitive internal standard/control

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 경합적 PCR법에 적합하게 이용되는 경합 핵산 단편, 유전자 재조합체의 유전자의 정량용 키트, 경합적 PCR법에 의한 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법을 제공한다. 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 부분에 대응하는 최소한 하나의 제1 경합 핵산 분자와, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 부분에 특이적인 유전자에 대응하는 최소한 하나의 제2 경합 핵산 분자를 결합하여, 동일 핵산 상에 배치한 경합 핵산 단편; 상기 경합 핵산 단편과, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자와 제1 경합 핵산 분자를 증폭시키기 위한 제1 프라이머쌍과, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자와 제2 경합 핵산 분자를 증폭시키기 위한 제2 프라이머쌍을 함유하는, 유전자 재조합체의 유전자의 정량에 사용하기 위한 키트; 및, 상기 경합 핵산 단편 또는 상기 키트를 사용하여 경합적 PCR 법을 행하는 것을 특징으로 하는, 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법을 제공한다.

Description

경합 핵산 단편, 재조합 유전자의 정량용 키트, 이것을 이용한 재조합 유전자의 정량 방법{COMPETITIVE NUCLEIC ACID FRAGMENT, KIT FOR QUANTIFYING RECOMBINANT GENE AND METHOD OF QUANTIFYING RECOMBINANT GENE USING THE SAME}
콩이나 옥수수 등의 농작물중의 유전자 재조합 작물 혼입량의 정량에는 경합적 PCR법이 널리 이용되고 있다. 경합적 PCR법은, 정량의 내부표준이 되는 경합 핵산분자를 합성하여 피험액에 가하고, 동일한 프라이머쌍을 가하여 경합적으로 PCR을 행하여, 생성한 표적 핵산분자와 경합 핵산분자의 양(밴드 농도)이 동등하게 되었을 때의 내부표준으로서 가한 경합 핵산분자의 양을 피험액 중의 표적 핵산분자의 양으로 추정하는 방법이다. 이 때 이용하는 경합 핵산분자는, 표적 핵산분자의 서열과 동일한 프라이머쌍으로 증폭하도록 디자인되어 있다. 따라서, 경합 핵산분자는, 동일한 프라이머쌍으로 증폭시켰을 때 표적 핵산분자 유래의 밴드와 판별하도록, 표적 핵산분자에 짧은 서열을 삽입하거나, 일부의 서열을 결실시켜 그길이를 변화시키거나, 또는 특정한 제한효소 부위를 도입 또는 결실시킨 것이 이용되고 있다.
경합 핵산분자와 표적 서열의 PCR에서의 증폭율이 동등한 경우에는, 두 가지의 DNA 단편은 공통의 프라이머를 서로 빼앗기 때문에 경합의 정도가 높고, 프라이머의 고갈에 의한 증폭반응의 정지가 대략 동시에 일어난다. 이 경우는 평탄역(plateau)에 달한 후의 양자의 비가 초기 주형량을 반영한 것이 된다. 종래 행하여지고 있었던 경합적 PCR법에 의한 유전자 재조합 작물의 정량에서는, 미리 유전자 재조합 작물 혼입량을 알고있는 시료로부터 얻어진 DNA 용액을 포함하는 피험액에, 단계적으로 희석한 경합 핵산분자를 가하여 PCR 반응을 행하고, 등량점을 밝혀내는 것에 따라 표적 핵산분자의 양이 결정되고 있었다. 이 측정법을 행하기 위해서는 100% 유전자 재조합인 종자와 100% 비재조합의 종자를 입수해야 하여, 그와 같은 종자의 입수는 일반적으로 대단히 곤란하다. 또, 첨가하는 경합 핵산분자의 양은 표적으로 하는 서열(내재성 유전자 또는 유전자 재조합 작물에 특이적인 유전자)에 따라 각각 다르고, 또 복제수가 아니라 DNA의 양으로 규정되어 있고, 정량 분석 조작이 번잡하여 정밀도에서도 문제가 있었다.
본 발명은, 작물중의 유전자 재조합 작물 혼입량의 정량에 이용되는 경합적 PCR법에 적합하게 이용되는 경합 핵산 단편, 이것을 포함하는 유전자 재조합체의 유전자 정량용 키트, 및 이것을 이용한 경합적 PCR법에 의한 유전자 재조합체의 유전자 정량 방법에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명의 제1목적은, 경합적 PCR법에 적합하게 이용되는 경합 핵산 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2목적은, 유전자 재조합체의 유전자의 정량용 키트를 제공하는것이다.
본 발명의 제3목적은, 경합적 PCR법에 의한 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태는, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 부분에 대응하는 최소한 하나의 제1 경합 핵산분자와, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 부분에 특이적인 유전자에게 대응하는 최소한 하나의 제2 경합 핵산분자를 결합하여, 동일 핵산상에 배치한 경합 핵산 단편이다.
본 발명의 제2 양태는, 제1 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 서열 내부에 부분적으로 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 변이를 가지는 것이며, 제2 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 서열 내부에 부분적으로 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 변이를 가지는 것인, 상기 1 양태의 경합 핵산 단편이다.
본 발명의 제3 양태는, 제1 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 서열의 양단의 프라이머 결합 영역과 동일한 프라이머 결합 영역을 양단에 가지고, 상기 내재성 유전자 서열과는 상이한 분자량을 가지는 것이며, 제2 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 서열의 양단의 프라이머 결합 영역과 동일한 프라이머 결합 영역을 양단에 가지고, 상기 재조합 유전자 서열과는 상이한 분자량을 가지는 것인, 상기 제1 양태의 경합 핵산 단편이다.
본 발명의 제4 양태는, 내재성 유전자가 콩의 렉틴 유전자인, 상기 제1∼3 양태 중 어느 하나의 경합 핵산 단편이다.
본 발명의 제5 양태는, 내재성 유전자 부분이 Le1인 상기 제1∼4 양태 중 어느 하나의 경합 핵산 단편이다.
본 발명의 제6 양태는, 재조합 유전자 부분이 유전자 재조합 콩 RRS(Roundup Ready Soy bean)에 특이적인 부분인 제1∼5 양태 중 어느 하나의 경합 핵산 단편이다.
본 발명의 제7 양태는, 서열번호1의 염기서열을 가지는 상기 제1 양태의 경합 핵산 단편이다.
서열번호1
gccctctact ccacccccat ccacatttgg gacaaagaaa ccggtagcgt tgccagcttc
ttagcactga cgtctgaatg tgccgcttcc ttcaacttca ccttctatgc ccctgacaca
aaaaggcttg cagatgggcg tcaaccccca agttcctaaa tcttcaagtt ttcttgtttt
tggatctaaa aaactgaaaa attcagcaaa ttctatgttg gttttgaaaa aagattcaat
ttttatgcaa aagttttgtt cctttaggat tgacgttcag aattccgtgt aatcagcatc
agtggctaca gcctgcatgc ttcacggtgc aagcagccgg cccgca
본 발명의 제8 양태는, 서열번호2의 염기서열을 가지는 상기 제1 양태의 경합 핵산 단편이다.
서열번호 2
gccctctact ccacccccat ccacatttgg gacaaagaaa ccggtagcgt tgccagcttc
ttagcactga cgtctgaatg tgccgcttcc ttcaacttca ccttctatgc ccctgacaca
aaaaggcttg cagatgggcg tcaaccccca agttcctaaa tcttcaagtt ttcttgtttt
tggatctaaa aaactgaaaa attcagcaaa ttctatgttg gttttgaaaa aagattcaat
ttttatgcaa aagttttgtt cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cgacgttcag
aattccgtgt aactgcatgc ttcacggtgc aagcagccgg cccgcaaccg cccgcaaatc
ctctggcctt tccggaaccg tccgcattcc cggcgacaag tc
본 발명의 제9 양태는, 상기 제1∼8 양태 중 어느 하나의 경합 핵산 단편과, 유전자 재조합체 유전자의 내재성 유전자와 제1 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제1 프라이머쌍과, 유전자 재조합체 유전자의 재조합 유전자와 제2 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제2 프라이머쌍을 포함하는, 유전자 재조합체의 유전자를 정량하는데에 사용하기 위한 키트이다.
본 발명의 제10 양태는, 상기 제1∼8 양태 중 어느 하나의 경합 핵산 단편을 사용하여 경합적 PCR법을 행하는 것을 특징으로 하는, 유전자 재조합체의 유전자를 정량하는 방법이다.
본 발명의 제11 양태는, 상기 제9 양태의 키트를 사용하여 경합적 PCR법을 행하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합체의 유전자를 정량하는 방법이다.
본 발명의 제12 양태는, 피험액 중에 존재하는 유전자 재조합체 유전자의 내재성 유전자의 복제수가, 500∼50000가 되도록 조정하는 것을 특징으로 하는 상기 제10 또는 11 양태의 유전자 재조합체의 유전자를 정량하는 방법이다.
본 발명의 제13 양태는, 피험액 중에 존재하는 유전자 재조합체 유전자의 내재성 유전자와 경합시키기 위한 경합 핵산 단편의 농도가 20 복제/㎕∼4000 복제/㎕의 범위인 것을 특징으로 하는 제10 또는 11 양태의 유전자 재조합체의 유전자를정량하는 방법이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 명세서 중, 「유전자 재조합체」란, 식물체 또는 그 종자에 원래는 포함되어 있지 않는 유전자 즉 외래유전자가 유전자 재조합에 의해서 도입된 유전자 재조합체를 말한다. 유전자 재조합체의 유전자에는, 식물체 또는 그 종자 중에 원래 존재하는 내재성 유전자와, 외부에서 재조합에 의해서 도입된 재조합체에 특이적인 유전자(외래유전자) 및 외부에서 재조합에 의해서 도입된 DNA 서열이 포함된다. 본 발명의 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법에 의한 정량의 대상이 되는 것으로서는, 유전자 재조합체 식물, 예를 들면, 콩, 옥수수, 밀, 쌀, 유채, 고구마, 솜, 파파야와 같은 작물, 그 종자, 및 이들을 원료로 하여 제조된 식품 등이 포함된다.
지금까지의 경합적 PCR법으로서는, 내재성 유전자에 대한 경합 핵산분자와 재조합체에 특이적인 유전자에 대한 경합 핵산분자는 따로따로 구축되어, 각각의 분자량을 바탕으로 희석하여 사용하고 있기 때문에, 희석이 부정확한 경우에는 측정값에 편차를 보인다고 하는 결점이 있다.
그러나 본 발명에서는 두 가지 이상의 경합 핵산분자를 결합시키고, 동일한 핵산 단편상에 구축되어 있기 때문에, 부정확한 희석에 기인하는 측정값의 편차가 없어져, 분석정밀도가 현저하게 향상된다.
또한 이 경합 핵산 단편을 플라스미드에 클로닝하여, 이 플라스미드를 증식시킴에 따라 동일한 핵산분자를 대량으로 생산하는 것도 가능하다.
종래, 경합적 PCR법을 이용한 유전자 재조합 작물의 정량법에서는, 피험액에 경합 핵산분자를 가하여 경합적으로 PCR 반응을 행하여, 초기 주형량을 반영한 상태로 반응이 평탄역에 달하기 위해서는, 프라이머농도, 효소농도, DNA 농도 등을 상세하게 조사해야 했다.
이에 대하여 본 발명의 반응계에서는, 측정의 결과 얻어진 DNA의 복제수가 일정한 범위에 들어가 있는 경우는, 또 바른 정량치를 얻을 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합체의 유전자의 정량에 이용하는 경합 핵산 단편은, 내재성 유전자에 대응하는 경합 핵산분자와 재조합 유전자 부분에 특이적인 유전자에 대응하는 경합 핵산분자가 동일 핵산분자 상에 결합된 것이다.
내재성 유전자로는, 그 식물체에 특이적인 것이 바람직하고, 예를 들면, 콩의 경우에는 렉틴 유전자, 옥수수의 경우에는 제인 유전자나 자당합성효소 IIb 유전자 등, 검사 대상이 되는 식물체 고유의 유전자를 이용할 수 있다.
재조합 유전자 부분에 특이적인 유전자로는, 재조합체에 특이적인 효소를 발현하는 유전자나 동시에 도입된 DNA 서열 외에, 재조합체에 특이적인 콜리플라워모자이크바이러스35S 프로모터나 라이스액틴 프로모터와 같은 프로모터 유전자, NOS 터미네이터와 같은 터미네이터 유전자, 또는 그들의 유전자로 좁혀진 영역 등을 이용할 수 있다.
경합 핵산분자는, 표적이 되는 유전자와 동일한 프라이머쌍으로 증폭하여, 또한, 표적 유전자와는 분자량이나 제한효소로 절단했을 때의 패턴이 다르도록 디자인되어 있다. 이를 위해서는, 표적 유전자의 서열을 바탕으로, PCR법 등의 방법을 이용하여, 서열 내부에, 염기의 삽입, 결실 또는 변이를 도입하면 된다. 분자량을 길고 또는 짧게 디자인한 것을 이용하는 경우는, 10∼40 염기, 바람직하게는 15∼30 염기 정도의 서열을 삽입하거나 결실시키는 것이 바람직하다. 또는 서열 내부에 변이를 도입하고, 특정한 제한효소 부위를 도입 또는 결실시킬 수도 있다.
또, 표적 유전자 서열의 양단의 프라이머 결합 영역과 동일한 프라이머 결합 영역을 양단에 가지고, 표적 유전자 서열과는 상이한 분자량을 갖도록, 예를 들면, 10∼40 염기, 바람직하게는 15∼30 염기 정도 길게 또는 짧아지도록 디자인한 것도 경합 핵산분자로서 이용 가능하다.
즉 경합적 PCR의 결과, 분자량이 상이한 밴드를 동일한 프라이머쌍으로 합성시킬 수 있으면, 경합 핵산분자의 프라이머 결합 영역에 끼인 내부서열은, 표적 서열과 다른 것이라도 된다.
2종 이상의 경합 핵산분자를 동일 핵산분자 상에 결합하여 경합 핵산 단편으로 하는 방법으로는, 접착 단편을 가지는 프라이머를 이용한 PCR법 외에, 필요한 부분을 제한효소로 절단 결찰하는 방법 등도 이용할 수 있다. 결합의 형태로는 경합 핵산분자를 직접 결합하는 방법 이외에, 경합 핵산분자 사이에 제한효소 부위를 삽입하는 것 등도 가능하다.
또, 2종 이상의 경합 핵산분자를 동일 핵산분자 상에 결합할 때의 경합 핵산분자의 서열순서는 자유롭게 선택할 수 있다. 즉, 내재성 유전자 부분에 대응하는 제1 경합 핵산분자가, 특이적인 유전자에게 대응하는 제2 경합 핵산분자의 상류측에 있어도 좋고, 또 하류측에 있어도 좋다. 또한, 본 발명의 경합 핵산 단편에는,제1 경합 핵산분자와 제2 경합 핵산분자의 사이, 또는 이들 상류측 또는 하류측에, 다른 제1 경합 핵산분자 및/또는 제2 경합 핵산분자가 존재할 수도 있고, 제1 경합 핵산분자 및 제2 경합 핵산분자 이외의 핵산분자가 존재할 수도 있다.
본 발명의 제1 경합 핵산분자 및 제2 경합 핵산분자의 크기는, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 50∼300 염기, 더욱 바람직하게는 100∼200 염기 정도가 바람직하다.
본 발명의 경합 핵산 단편의 크기도, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 100∼5000 염기, 더욱 바람직하게는 300∼1500 염기 정도가 바람직하다.
경합 핵산분자의 크기는, 짧은 쪽이 PCR에서의 특이성은 높아지지만 경합 핵산 단편을 구축할 때의 프라이머의 설계가 어렵게 되고, 너무 길면 특이성이 낮아져 또한 구축한 경합 핵산 단편을 증폭할 때에 플라스미드에 도입하는 것이 곤란해진다.
또한 본 발명의 경합 핵산 단편의 크기는, 결합하는 경합 핵산분자의 크기에 의존하지만, 너무 길면 플라스미드에 도입하는 것이 곤란해진다.
이렇게 하여 구축한 경합 핵산 단편을 플라스미드에 서브클로닝하여, 그 플라스미드를 증식시킴에 따라 동일한 핵산분자를 대량으로 생산하는 것도 가능하다. 경합 핵산 단편을 플러스미드에 서브클로닝시키는 방법으로는, 제한효소 인식 서열을 부가시키는 방법이나 TA 클로닝 등의 방법을, 그 서열에 따라서 이용할 수 있다.
피험액(경합적 PCR 반응 용액)은, 시료로부터 추출한 DNA용액, 경합 핵산 단편, dNTP용액, 내열성 DNA 폴리머라아제, 검지용 프라이머, 기타 PCR 반응에 필요한 염류 등을 필요에 따라 조제한 것을 이용한다. 피험액의 용량은 필요에 따라 25 ㎕로부터 100 ㎕ 정도의 사이에서 설정하는 것이 바람직하다. PCR 반응은 써멀 사이클러 (thermal cycler)로 온도를 컨트롤하여, 목적의 표적 서열 및 경합 핵산 단편이 경합적으로 증폭되도록 하는 온도와 사이클수를 확인하여, 설정하면 된다.
경합적 PCR 반응 후의 PCR 산물의 분석은, 전기영동법 등을 이용하여 분획된 DNA 밴드를 측정함으로써 행할 수 있다. 경합 핵산분자 유래의 DNA밴드, 표적 서열 유래의 DNA 밴드를 측정하여, 그 강도로부터 복제수를 이끌어 냄으로써 시료 중의 표적 유전자의 정량이 가능하게 된다.
본 발명의 유전자 재조합체의 유전자의 정량에 사용하기 위한 키트는, 상기 본 발명의 경합 핵산 단편과, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자와 제1 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제1 프라이머쌍과, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자와 제2 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제2 프라이머쌍을 포함하고 있다. 또한, 바람직하게는, dNTP, 내열성 DNA폴리머라아제, 완충액, 염류 등의 PCR 반응에 필요한 시약류를 포함하는 것이 바람직하다.
내재 유전자의 복제수와 재조합 유전자의 복제수를 구하고, 그들의 비를 계산함으로써 시료 DNA 용액 중에 포함되는 유전자 재조합 작물의 함량을 계산할 수 있다. 유전자 재조합 작물함량을 계산하는 경우에는, 100% 유전자 재조합 작물로부터 얻어진 DNA 용액으로 동일한 측정을 행하여 내재성 유전자와 재조합 유전자의 비율을 미리 구하여 놓는다. 이것을 내부표준비율이라고 하고, 측정으로 얻어진값을 이 비율로 보정하는 것으로, 보다 정확한 정량이 가능하게 된다. 내부표준비율에 의한 보정은 아래와 같이 행한다.
어느 재조합 품종 A에 1게놈당 2개의 재조합 유전자가 삽입되어 있는 경우, 내재성 유전자의 수: 재조합 유전자의 수= 1: 2로 나타낼 수 있다. 내재성 유전자 하나당으로 생각하면 재조합 유전자의 수/내재성 유전자의 수= 2가 되고, 이것을 재조합 품종 A의 내부표준비율이라고 한다. 또한 별도의 품종 B에서는 내재성 유전자의 수: 재조합 유전자의 수= 1: 1인 경우도 있어, 그 경우의 내부표준비율은 1이 된다. 이와 같이 동일 작물이라도 재조합 품종에 따라 내부표준비율이 다르기 때문에, 미리 품종을 명확히 하여 정량하는 것이 필요하다.
재조합 품종 A가 10% 혼입되어 있는 시료에 대해, 내재성 유전자의 수와 재조합 유전자의 수를 측정하여, 예를 들면 내재성 유전자의 복제수가 10,000 복제가 된 경우, 재조합 유전자의 복제수는 2,000 복제가 된다. 이 경우의 혼입율은, 2,000/10,000/내부표준비율(2)× 100= 10(%)와 계산할 수 있다.
내재성 유전자와 유전자 재조합체에 특이적인 유전자의 양의 비(내부표준비율)는, 그 유전자 재조합 작물에 따라 일정한 값을 나타내는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 콩의 경우는 대략 1: 1이며, 옥수수의 경우는 3: 1으로부터 1: 2 근처의 값을 나타낸다.
본 발명의 유전자 재조합체 유전자의 정량 방법은, 유전자 재조합체가 1∼5% 정도 혼입된 것의 유전자 재조합체의 함유량을 측정하는 데 적절하다. 이를 위해서는, 시료로부터 추출한 DNA 용액 중의 내재성 유전자의 복제수는 500 복제 이상인 것이 바람직하다. 그러나, 복제수가 지나치게 많으면, 일방적으로 반응이 진행되어 경합상태가 얻어지지 않는 경우가 있기 때문에, 50,000 복제 이하, 바람직하게는30,000 복제 이하로 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 콩을 측정하는 경우에는, 시료로부터 추출한 DNA 용액 중의 내재성 유전자의 복제수를 5,000∼50,000, 바람직하게는 5,000∼20,000이 되도록 조정한 것을 이용하면 된다.
내재성 유전자의 복제수를 경합적 PCR법으로 측정하는 경우는, 내재성 유전자의 복제수보다도 많은 양의 경합 핵산 단편을 반응액 중에 가하여 놓아야 한다. 피험액에 가하는 경합 핵산 단편의 복제수로는, 시료 유래의 내재성 유전자 복제수의 2배량 정도의 복제수를 가할 필요가 있고, 그 경우의 피험액 중에서의 경합 핵산 단편의 농도는, 2O 복제/㎕∼4,0O0 복제/㎕로 조정하면 된다.
이하, 실시예에 의해, 본 발명을 또 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 설명을 위한 것이며, 본 발명의 기술적 범위는 이들에 한정되지 않는다.
실시예 1
유전자 재조합 콩의 경합 핵산 단편의 구축
내재성 유전자 부분 Le1에 대응하는 경합 핵산분자와, 재조합 유전자 부분이 유전자 재조합 콩 RRS(Roundup Ready soybean)에 특이적인 부분에 대응하는 경합 핵산분자를, Meyer, R.et al., Z.Lebensm Unters ForschA203: 339-344(1996)와 Studer, E.et al., Z.Lebensm Unters ForschA207: 207-213(1998)를 참고로 하여 작성했다.
프라이머 Le1nO1-5', Le1nO1-3'로 합성되는 부분보다도 외측에 넓은 프라이머 Le1out-5'와 Le1out-3'를 설계했다. 다음에 Le1nO1-5', Le1nO1-3'로 합성되는 서열을 중앙부근에서 절단한다고 가정하여, 그 단면에 대한 프라이머를 작성했다. 그 프라이머의 5'측에 21bp의 접착부가 되는 부분을 설치하고, Le1Mu1-5', Le1Mu1-3'로 했다. Le1out-5'와 Le1out-3'로 합성한 PCR 산물을 주형으로서, Le1out-5'와 Le1Mu1-3', Le1Mu1-5'와 Lelout-3'로 각각 PCR을 행했다. 그 결과, 접착 부분을 가진 PCR 산물이 합성되었다. 이 PCR 산물을 혼합하면, 접착 부분이 상보적인 서열로 되어 있기 때문에 접착 부분에서 결합되고, 내부에 21bp의 뉴클레오티드가 삽입된 염기서열이 구축되었다. Le1out-5'와 Le1out-3'으로 다시 PCR을 행하여 증폭하여 PCR 산물을 얻었다.
RRS의 경합 핵산분자도 동일하게 작성했다. 서열번호1에 포함되는 RRS 특이적인 경합 핵산분자를 구축할 때는 RRout-5'과 RRout-3', 및 RRMu1-5'과 RRml1-3'를 이용했다.
경합적 PCR에 이용되는 프라이머의 염기서열
Le1n01-5' :5'-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c-3'(서열번호 3)
Le1n01-3' :5'-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg-3'(서열번호 4)
RR04-5' :5'-ccc caa gtt cct aaa tct tca agt-3'(서열번호 5)
RR05-3' :5'-tgc ggg ccg gct gct tgc a-3'(서열번호 6)
RS01-5' :5'-cct tta gga ttt cag cat cag tgg-3' (서열번호 7)
RS01-3' :5'-gac ttg tcg ccg gga atg-3' (서열번호 8)
경합적 핵산단편의 구축에 이용되는 프라이머의 염기서열
Le1out-5' :5'-gca ccc caa aac cct cgt ctc t-3'(서열번호 9)
Le1out-3' :5'-ctg cat gtg ttt gtg gct tag tgt-3'(서열번호 10)
LelMul-5' :5'-tta gca ctg acg tct gaa tgtgcc gct tcc ttc aac-3'(서열번호 11)
LelMul-3' :5'-aca ttc aga cgt cag tgc taagaa gct ggc aac gct-3'(서열번호 12)
RRout-5' :5'-tgg cgc cca tgg cct gca tg-3' (서열번호 13)
RRout-3' :5'-cct tcg caa gac cct tcc tct ata-3' (서열번호 14)
RRMul-5' :5'-tta cac gga att ctg aacgtc aat cct aaa gga aca-3' (서열번호 15)
RRMul-3' :5'-gac gtt cag aat tcc gtg taatca gca tca gtg gct-3' (서열번호 16)
RRMu2-5' :5'-gac gtt cag aat tcc gtg taactg cat gct tca cgg-3' (서열번호 17)
RRMu2-3' :5'-tta cac gga att ctg aac gtcgct gta gcc act gat-3' (서열번호 18)
*밑줄친 부분의 서열이 접착부분임
상기 2종류의 경합 핵산분자를, 접착 단편을 가지는 하기의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의해서 결합시켰다.
Le1에 특이적인 경합 핵산분자를 주형으로서 Le1n01-5'와 RR+ Le1-3'로 PCR을 행했다. 동일하게 RRS에 특이적인 경합 핵산분자를 주형으로서 Le1+ RR-5'와 RR05-3'로 PCR을 행했다. 얻어진 PCR 산물을 혼합하고, Le1n01-5'과 RR05-3'로 PCR을 행하고, 동일 핵산분자 상에 2종류의 경합 핵산분자가 존재하는 경합 핵산 단편을 구축했다. 그 염기서열은 서열번호 1에 나타내는 바와 같다.
접착단편을 가지는 프라이머의 염기서열
RR+Le1-3':5'-agg aac ttg ggg gtt gacgcc cat ctg caa gcc-3'(서열번호 19)
Le1+RR-5' :5'-ttg cag atg ggc gtc aacccc caa gtt cct aaa-3'(서열번호 20)
* 밑줄친 부분의 서열이 접착부분임.
구축한 경합 핵산 단편은, TOPO TA C1oning Kit(Invitrogen Co.)를 이용하여 플라스미드 PCR R2.1-TOPOR에 클로닝했다. 플라스미드는 부속의 컴피턴트(competent)셀과 혼합하고, 블루/화이트 셀렉션 처리한 암피실린첨가의 LB 한천배지에 접종했다. 접종한 배지는 37℃에서 24시간 배양하여, 삽입되어 있는 화이트 콜로니를 골라 마스터플레이트에 접종했다. 동시에 Le1n01-5'와 Le1nO1-3' 또는 RR04-5'과 RR05-3'를 가하여 놓은 PCR 반응액에 균체를 가하여, PCR을 행하여 디자인된 길이의 밴드가 얻어지는 것을 확인했다.
희망의 길이의 밴드가 얻어진 콜로니를 LB 부이용배지(Difco Laboratories)로 균증식 후「QIAGEN Plasmid Maxi Kit」(QIAGENGmbH)를 이용하여 정제했다. 얻어진 환형 DNA를 제한효소 HindIII(TaKaRa Shuzo C0., LTD.)로 처리하여 직쇄상으로 하여, 경합 핵산 단편으로 했다. 또한 동시에 시퀀스 해석을 행하여 전체 염기서열에 변화가 없는 것을 확인했다. (서열번호 1)
또한, 서열번호 5, 6과는 상이한 재조합 유전자 부분을 검지하는 프라이머(서열번호 7, 8)를 이용하여, 동일하게 경합 핵산 단편을 구축했다. 시퀀스 해석을 행하여 전체 염기서열에 변화가 없는 것을 확인했다. (서열번호 2)
<재조합체 유전자의 정량>
경합 핵산 단편을 포함하는 용액의 260nm의 흡광도를 측정하여, 그 결과와 분자량을 바탕으로 소정의 복제수가 되도록 희석하여 이용했다.
분석시료로부터의 DNA 추출에는「DNeasy Plant Maxi Kit」(QIAGENGmbH)를 이용했다. 추출한 DNA 용액은 230nm, 260nm, 280nm의 흡광도를 측정했다. DNA의 순도는 260/230= 1.8 이상, 260/280= 1.8으로부터 2.0를 기준으로 사용의 가능여부를 판단했다. 또한 DNA 용액의 260nm의 흡광도가 1.0일 때를 50mg/m1로서 농도를 계산하여, 20ng/㎕로 희석하여 분석에 이용했다. 희석에는 멸균 증류수를 이용했다.
경합적 PCR법에 의한 정량은 이하와 같이 행했다. 피험액(PCR 반응액)은, 반응 최종농도가 1×PCR 완충액(Applied Biosystems Japan Ltd.), 0.16mmo1/L dNTP, 1.5mmo1/L 염화마그네슘, O.5μ mo1/L 검지용 프라이머(내재성 유전자와 제1 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제1 프라이머쌍(두 가지의 프라이머의 합계) 또는, 재조합 유전자와 제2 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제2 프라이머쌍(두 가지의 프라이머의 합계)중 어느 한 쪽), 0.625units Ampli Taq Gold DNA 폴리머라아제(Applied Biosystems Japan Ltd.)가 되도록 혼합하고, 측정 대상의DNA 용액 2.5㎕와 소정의 복제수의 경합 핵산 단편을 가하여, 전량을 25㎕로 했다. 여기서 사용한 검지용 프라이머는 전술한 바와 같다.
PCR 반응조건은, 96℃로 10분 유지한 후, 96℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 1사이클로서, 40사이클의 증폭을 한 후, 72℃에서 7분간 유지/지지했다. PCR 산물의 해석에는 AgaroseL03「TAKARA](TaKaRa ShuzoCO., LTD.) 또는「AgaroseX」(NIPPONGENECO., LTD.)를 이용했다. 전기영동후의 겔의 화상은 CCD 카메라로 취입, 화상 해석 장치에 의해서 밴드의 강도를 측정하여 수치화했다.
경합 핵산 단편을 주형으로서, Le1n01-5'와 Le1n01-3'의 프라이머쌍으로 PCR을 행한 경우, 얻어지는 PCR 산물의 분자량은 139bp이 된다. 콩 DNA를 주형에 이용한 경우는, 그 분자량은 118bp이 되었다. 한편, 경합 핵산분자를 주형으로서 RR04-5'와 RR05-3'의 프라이머쌍으로 PCR을 행하면, 얻어지는 PCR 산물의 분자량은 201bp 이 되고, RRS에서 얻어진 DNA를 주형에 이용한 경우는, 180bp의 PCR 산물이 얻어졌다.
측정후의 수치는 다음과 같이 계산하여, 각 유전자의 복제수로 환산했다. 경합적 PCR법에서의 측정으로서는, 하나의 레인에 두개의 밴드가 나타난다. 하나는 경합 핵산분자 유래, 또 하나는 표적 서열 유래의 밴드이다. 실시예 1에서는, 경합 핵산분자의 분자량이 표적 서열보다도 21bp 정도 길어지도록 디자인되어 있기 때문에, 위에 경합 핵산분자 유래의 밴드, 아래에 표적 서열 유래의 밴드가 나타난다.
화상 분석 장치에 의해서 수치화된 경합 핵산분자 유래의 밴드강도를 A, 표적 서열 유래의 밴드강도를 B로 한다. 이 실시예에서는, 피험액에 가하는 경합 핵산 단편의 양을 5 수준 설정하여 행했다. 얻어진 데이터로부터 A/B의 값을 구하여 C로 한다. 경합 핵산분자 5수준으로 각각 5개의 C 치(C1로부터 C 5)가 얻어지기 때문에, 1og(경합 핵산분자의 복제수)를 횡축에, 1og(C)의 값을 종축에 잡으면 근사직선이 얻어진다. 통상 상관계수(r2)= 0.99정도의 값이 얻어진다. 근사직선이 Y= 0가 되는 점, 즉 log(경합 핵산분자의 복제수)= 1og(C)로 되는 점이 등량점이라고 불리는 값으로, 시료 DNA 용액 중에 포함되는 표적 서열의 복제수이다. 얻어진 복제수의 비를 계산하여, 시료 DNA 용액 중에 포함되는 유전자 재조합 콩의 함유량을 구한다.
시험예 1
본 발명의 재조합체 유전자 정량법의 정밀도를 확인할 목적으로, 유전자 재조합 작물(GMO)함량을 미리 1%, 3%, 5%, 10%로 조제한 콩 분말로부터 얻어진 DNA 용액을 이용하여 측정을 행했다. 시험은 실시예 1로 구축한 경합 핵산 단편을 이용하여, 상기의 정량 방법으로 했다. 동일한 시료에 대해 5회 분석했다. 결과를 이하에 나타낸다.
표 1
GMO 함량 (%) 측정치 ±표준편차
1.0 0.9±0.1
3.0 2.9±0.1
5.0 5.0±0.3
10.0 9.1±0.7
표 1로부터 명확히 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법의 정량의 정밀도는 대단히 높은 것이 확인되었다.
비교시험예 1
유전자 재조합 작물(GMO)함량을 미리 0.5%, 1%, 5%로 조제한 시료를 이용하여 동일한 실험을 행했다. 경합 핵산분자는, 내재성 유전자에 대한 것과 재조합 유전자에 대한 것을 별도의 플라스미드에 클로닝하여, 정제한 것을 이용했다. 기타 분석 방법은 상기에 나타낸 바와 같다. 결과를 이하에 나타낸다.
표 2
GMO 함량(%) 측정치 ± 표준편차
0.5 0.6±0.4
1.0 1.4±0.2
5.0 5.7±0.3
시험예 1에 비교하여, 표준편차가 크고, 정량의 정밀도가 낮은 것이 확인되었다.
시험예 2
본 발명의 재조합체 유전자 정량법의 정밀도를 확인할 목적으로, 실시예 1의 경합 핵산 단편을 이용하여 시험을 행했다. 유전자 재조합 작물(GMO) 함량을 미리 1%, 3%, 5%, 10%로 조제한 콩 분말로부터 얻어진 DNA 용액을 이용하여 측정했다. 내재성 유전자에 대한 경합 핵산 단편의 농도는, 2000복제/㎕, 1200복제/㎕, 800복제/㎕, 400복제/㎕, 200복제/㎕의 5수준으로 설정했다. 그 때에 얻어진 각 유전자의 복제수와 정량의 결과를 이하에 나타낸다.
표 3
GMO 함량(%) Lel 복제수 RRS 복제수 정량 결과
1.0% 10543 118 1.0%
1.0% 12618 135 1.0%
1.0% 24945 234 0.9%
3.0% 12793 391 2.9%
3.0% 11776 395 3.1%
3.0% 19054 602 3.0%
5.0% 12560 659 4.9%
5.0% 14725 734 4.7%
5.0% 24547 1318 5.0%
10.0% 5861 587 9.4%
10.0% 5482 572 9.8%
10.0% 19952 2230 10.4%
Le1의 복제수가 5000로부터 30000복제의 사이에 포함되는 경우에는, 정량의 정밀도가 보다 높은 것이 확인되었다.
또, RRS 특이적인 경합 핵산분자를 구축할 때에, RRout-5'와 RRout-3', 및 RRMu2-5'과 RRMu2-3'를 이용하여, 동일한 조작을 행함으로써 서열번호2의 경합 핵산 단편이 얻어졌다. 이 경합 핵산 단편을 주형으로서, Le1nO1-5'와 Le1nO1-3'의 프라이머쌍으로 PCR을 행한 경우, 얻어지는 PCR 산물의 분자량은 139bp이 된다. 콩 DNA를 주형에 이용한 경우는, 그 분자량은 118bp이 되었다. 한편, 경합 핵산분자를 주형으로서 RR04-5'와 RR05-3'의 프라이머쌍으로 PCR을 행하면, 얻어지는 PCR 산물의 분자량은 201bp 이 되고, RRS에서 얻어진 DNA를 주형에 이용한 경우는, 180bp의 PCR 산물이 얻어졌다. 또, RS01-5'와 RS01-3'의 프라이머쌍을 이용하면 142bp과 121bp의 PCR 산물이 얻어졌다.
실시예 2
유전자 재조합 옥수수의 경합 핵산 단편의 구축
유전자 재조합 옥수수의 스크리닝 검사용 경합 핵산 단편을 작성했다. 옥수수의 내재성 유전자로는 자당합성효소 IIb의 서열을 이용했다. 이것은 SS01-5'과 SS01-3'의 프라이머에 의해서 증폭되는 부분이다. 이 경합 핵산 단편은 유전자 재조합 옥수수의 스크리닝 검사에 이용하는 것을 목적으로 하고 있기 때문에, 유전자 재조합 작물에 널리 사용되어 있는 콜리플라워모자이크바이러스35S 프로모터에 특이적인 서열을 검지하기 위한 부위와, 제초제 내성 품종 GA21(개발자: 몬산토사)에 특이적인 서열을 검지하기 위한 부위를 포함했다. 전자의 영역을 검지하기 위한 프라이머가 CaM01-5', CaM01-3'이며, 후자를 검지하기 위한 프라이머가 GAO1-5', GAO1-3'이다.
이하에 상기 유전자 재조합 옥수수의 스크리닝 검사용 경합 핵산 단편의 서열을 나타낸다. 네모친 부분은 삽입부분을 나타낸다.
서열번호21
상기 경합 핵산 단편을 이용한 옥수수의 분석에 이용되는 프라이머 서열의예를 이하에 나타낸다.
SS01-5':5'-ctc cca atc ctt tga cat ctg c-3'(서열번호 22)
SS01-3':5'-tcg att tct ctc ttg gtg aga gg-3'(서열번호 23)
CaM01-5':5'-cct ctc caa atg aaa tga act tcc t (서열번호 24)
CaM01-3':5'-att gat gtg ata tct cca ctg acg t-3'(서열번호 25)
GA01-5':5'-atc cgg ttg gaa agc gac tt-3'(서열번호 26)
GA01-3':5'-gaa gcc tcg gca acg tca-3'(서열번호 27)
본 발명의 경합 핵산 단편은, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 부분에 대응하는 최소한 하나의 제1 경합 핵산분자와, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 부분에 특이적인 유전자에 대응하는 최소한 하나의 제2 경합 핵산분자를 결합하여, 동일 핵산상에 배치한 것이며, 동일 핵산 단편상에 필요한 경합 핵산분자가 존재하기 때문에, 이들을 희석하여 컨트롤로 한 경우, 복수의 경합 핵산분자의 복제수에 어긋남이 없어진다. 이로 인하여, 이 경합 핵산 단편을 이용한 경합적 PCR법에 의해 재조합체 유전자를 정량하면, 종래의 방법과 비교하여 희석에 의한 정밀도 저하가 현저하게 억제되어, 정밀도가 양호하게 측정할 수 있게 된다. 본 발명의 정량 방법에 의하면, 유전자 재조합 작물, 예를 들면, 유전자 재조합 콩의 재조합체 혼입율이 5% 전후인 것의 정량을, 간편하게 행할 수 있다.

Claims (13)

  1. 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 부분에 대응하는 최소한 하나의 제1 경합 핵산분자와, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 부분에 특이적인 유전자에 대응하는 최소한 하나의 제2 경합 핵산분자를 결합하여, 동일 핵산상에 배치한 경합 핵산 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 서열 내부에 부분적으로 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 변이를 가지는 것이며, 상기 제2 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 서열 내부에 부분적으로 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 변이를 가지는 것인 경합 핵산 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자 서열의 양단의 프라이머 결합 영역과 동일한 프라이머 결합 영역을 양단에 가지고, 상기 내재성 유전자 서열과는 상이한 분자량을 가지는 것이며, 상기 제2 경합 핵산분자가, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자 서열의 양단의 프라이머 결합 영역과 동일한 프라이머 결합 영역을 양단에 가지고, 상기 재조합 유전자 서열과는 상이한 분자량을 가지는 것인 경합 핵산 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내재성 유전자가 콩의 렉틴 유전자인 경합 핵산 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내재성 유전자 부분이 Le1인 경합 핵산 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 유전자 부분이 유전자 재조합 콩 RRS(Roundup Ready Soybean)에 특이적인 부분인 경합 핵산 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 경합 핵산 단편.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 경합 핵산 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항 기재의 경합 핵산 단편과, 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자와 제1 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제1 프라이머쌍과, 유전자 재조합체의 유전자의 재조합 유전자와 제2 경합 핵산분자를 증폭하기 위한 제2 프라이머쌍을 포함하는, 유전자 재조합체의 유전자의 정량에 사용하기 위한 키트.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항 기재의 경합 핵산 단편을 사용하여 경합적PCR법을 행하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법.
  11. 제9항 기재의 키트를 사용하여 경합적 PCR법을 행하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 피험액 중에 존재하는 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자의 복제수가 500∼50000이 되도록 조정하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 피험액 중에 존재하는 유전자 재조합체의 유전자의 내재성 유전자와 경합시키기 위한 경합 핵산 단편의 농도가 20 복제/㎕ 내지 4000 복제/㎕의 범위인 것을 특징으로 하는 유전자 재조합체의 유전자의 정량 방법.
KR10-2004-7003979A 2001-09-21 2002-09-24 경합 핵산 단편, 재조합 유전자의 정량용 키트, 이것을이용한 재조합 유전자의 정량 방법 KR20040041165A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001289755 2001-09-21
JPJP-P-2001-00289755 2001-09-21
PCT/JP2002/009773 WO2003027283A1 (fr) 2001-09-21 2002-09-24 Fragment d'acide nucleique competitif, trousse pour quantifier un gene de recombinaison et procede pour quantifier un gene de recombinaison en utilisant cette trousse

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20040041165A true KR20040041165A (ko) 2004-05-14

Family

ID=19112202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2004-7003979A KR20040041165A (ko) 2001-09-21 2002-09-24 경합 핵산 단편, 재조합 유전자의 정량용 키트, 이것을이용한 재조합 유전자의 정량 방법

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP4317450B2 (ko)
KR (1) KR20040041165A (ko)
WO (1) WO2003027283A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297668C (zh) * 2004-05-20 2007-01-31 厦门大学 转基因产品的低密度基因芯片检测方法
JP4925607B2 (ja) * 2005-05-11 2012-05-09 国立医薬品食品衛生研究所長 遺伝子組換え加工食品の定量的検知方法
WO2014005278A1 (en) * 2012-07-03 2014-01-09 Jr-Kai Huang Self-competitive primer and method of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19906169A1 (de) * 1999-02-08 2000-08-10 Bioinside Ges Fuer Biodiagnost Testkit und Verfahren zum quantitativen Nachweis von gentechnisch veränderter DNS in Lebensmitteln mittels fluoreszenzgekoppelter PCR
JP2001238700A (ja) * 2000-03-03 2001-09-04 Takara Shuzo Co Ltd 異種個体の存在割合の測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2003027283A1 (ja) 2005-01-06
JP4317450B2 (ja) 2009-08-19
WO2003027283A1 (fr) 2003-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105112520B (zh) 原种事件a5547-127以及在生物样品中鉴定此类事件的方法和试剂盒
CN103103262B (zh) 原种事件a2704‑12以及用于鉴定生物样品中此事件的方法和试剂盒
KR100624667B1 (ko) 유전자 재조합체의 정량법 및 그것에 이용하는 표준 분자
KR20040041165A (ko) 경합 핵산 단편, 재조합 유전자의 정량용 키트, 이것을이용한 재조합 유전자의 정량 방법
KR100826561B1 (ko) 유전자변형 면화의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법및 이에 사용되는 표준 플라스미드
KR20010086586A (ko) 이종 개체 존재비율의 측정 방법
KR102429219B1 (ko) 콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 마커 조성물 및 이의 용도
KR102081973B1 (ko) 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 snp 마커
KR102142389B1 (ko) Cmv-p1 저항성 고추 품종의 판별을 위한 분자마커 및 이의 용도
JP2022144656A (ja) Ｓａｒｔ－１変異を有する低アミロース形質イネ
KR101820048B1 (ko) 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트
KR100838105B1 (ko) 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법
KR102081964B1 (ko) 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 snp 마커
CN114438247B (zh) 花生蔗糖含量主效位点的连锁分子标记组合、引物组合物、鉴定方法及其应用
KR20030084184A (ko) 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트
KR102713177B1 (ko) 반짝이콩씨스트선충에 대한 콩 자원의 저항성 판별을 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
CN112094940B (zh) 与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用
KR102266997B1 (ko) 국내 자포니카 벼 품종의 유전자 연관지도 작성용 kasp 마커 세트
KR100664992B1 (ko) 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트，검정방법 및이에 사용되는 표준 플라스미드
JP2010057503A (ja) イグサ品種「ひのみどり」の識別マーカー
KR101955073B1 (ko) 무 판별용 snp 마커
KR20240153461A (ko) PfrFAD3b 변이를 이용한 리놀레산 함량이 증가한 들깨 판별용 조성물 및 판별 방법
JP4441638B2 (ja) イグサ品種「ひのみどり」の識別マーカー
KR20070040055A (ko) 녹말분지효소를 이용한 유전자변형 벼의 검출 방법
KR20030003785A (ko) 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 ｄｎａ 증폭 키트 및이를 이용한 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid