KR100664992B1 - 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트，검정방법 및이에 사용되는 표준 플라스미드 - Google Patents

유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트，검정방법 및이에 사용되는 표준 플라스미드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 종래 검정이 불가능하여 왔던 옥수수 MON863과 같은 계통에 대하여 특이적인 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것이다.
MON863, 프라이머

Description

유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트，검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드{Primer Set for Detection of Genetically Modified Organism, Detection Method, and Standard Plasmid used thereto}
도 1은 유전자 변형체인 MON863 계통 옥수수의 외래 도입유전자를 포함하는 유전자의 구조도이다.
도 2는 본 발명에 따른 표준 플라스미드의 구성도이다.
도 3a는 본 발명에 따른 CRTA1-F/CRTA3-R 프라이머 쌍에 의한 PCR 산물에 대한 전기영동사진이다.
도 3b는 본 발명에 따른 CRTA1-F/CRTA4-R 프라이머 쌍에 의한 PCR 산물에 대한 전기영동사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 CRTA1-F/CRTA4-R 프라이머 쌍에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 p3SNTM-9에 삽입된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 표준 플라스미드의 실시간 PCR 결과치를 이용하여 작성된 정량곡선(a) 및 표준곡선(b)를 나타낸다.
본 발명은 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 종래 검정이 불가능하여 왔던 옥수수 MON863과 같은 계통에 대하여 특이적인 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것이다.
유전자 변형식물이란 유전공학기술을 이용하여 특정 생물로부터 유용한 유전자를 취해 이를 기존의 작물에 도입함으로써 그와 동일한 유전자 기능을 발휘하도록 조작된 식물을 의미한다. 유전자 변형 식물은 동식물 및 미생물 등 유전자 변형생물체를 통칭하는 GMO(Genetically Modified Organism)에 속하며, 또한 형질전환작물로 통용되기도 한다. 특히 이러한 유전자 변형식물 중 농작물의 유전자 변형은 주로 제초제에 대한 내성, 병해충에 대한 저항력, 생산력의 증가, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 특성을 지니게 하거나, 영양가치가 높은 식물을 개발하는 등의 분야에 초점을 맞추어 개발되어 왔으며, 현재까지 여러 GMO 농작물이 이미 상용화되었거나 준비 중에 있다.
한편, 유전자 변형 농산물의 상업화가 급진전되면서 유럽을 중심으로 이의 안전성에 대한 우려가 증가되고 있으며, 안전성 기준 또한 점차 강화되고 있다. 특 히, 우리나라는 많은 곡물을 미국에서 수입하고 있으며, 국내 수요량의 90％ 정도를 수입에 의존하고 있는 수입콩의 경우 GM 콩의 수치가 30％를 넘는 것으로 추정되고 있다.
이에 따라 우리나라는 소비자단체의 의견수렴과 일본, EU의 GMO 표시관리 실태조사 등의 준비과정을 거쳐 2001년 3월 1일부터 유전자 변형농산물에 대한 표시제를 시행하기에 이르렀다. 현재 표시제 대상 품목은 콩, 옥수수, 콩나물, 감자로 규정하고 있으며, 표시 의무자는 유전자변형 농산물의 판매자이며 비의도적인 혼입허용치를 3％까지 적용하고 있다.
특히, 위 표시제 대상품목 중 유전자 변형 옥수수의 경우, 각각의 유전자 변형 계통에 따라 도입된 유전자 및 운반체의 구조가 달라 기존의 안전성이 승인되어 유통 중인 유전자 변형 옥수수 7계통에 대하여는 DNA를 이용한 검정방법이 개발되어 있다. 하지만, 최근 국내 안전성 승인을 통과하여 유전자 변형 농산물 표시제의 표시대상 품목으로 추가됨으로써 수입이 예상되고 있는 해충저항성 유전자 변형 옥수수 1계통에 대하여는 검정이 불가능한 실정에 있어 상기 검정 불가 대상인 옥수수 1계통에 대한 추가적인 검정 방법이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로,
본 발명의 목적은 유전자 변형체 특히 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유한 유 전자 변형체의 검정에 매우 유용한 프라이머 세트를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 변형체 특히 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유한 유전자 변형체의 신속하고, 정확한 검정방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 변형체 특히 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유한 유전자 변형체의 검정에 사용되어지는 표준 플라스미드를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 5 에서 선택된 어느 하나의 프라이머를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유하는 것임을 특징으로 하는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 MON863 계통의 유전자 변형 옥수수임을 특징으로 하는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포 함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 준비하는 단계, 상기 준비된 프라이머 세트를 이용하여 당해 유전자 변형체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행 결과로부터 유전자 변형체의 정성 또는 정량 분석 결과를 얻는 단계를 포함하는 유전자 변형체의 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유하는 것임을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 상기 유전자 변형체는 MON863 계통의 유전자 변형 옥수수임을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 상기 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 6 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 이용하여 유전자 변형체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 수행한 PCR 산물과, 상기 PCR 산물이 특정 위치에서 삽입되어지는 벡터로 구성되는 유전자 변형체의 정량검정을 위한 표준 플라스미드를 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 특히 바람직하게는 종래 검정 가능 대상에 포함되지 않았던 유전자 변형 옥수수 1계통인 MON863 계통의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공함에 특 징이 있다.
상기 MON863 계통의 유전자 변형체는 도 1에 도시된 바와 같이 4회 반복되는 1개의 촉진 염기서열이 첨가된 컬리프라워 모자이크 프로모터(4-AS1):밀 엽록소a/b 결합 단백질의 5' 선단(wtCAB):벼의 액틴 인트론(ract1):Cry3Bb1 유전자(바실러스 써린지엔시스 유래의 Bt 독소유전자):밀의 열충격 단백질 3' 말단(tahsp17) 영역의 구조를 포함한다.
이와 같이 상기 유전자 변형체는 외래에서 도입된 유전자 내에 Cry3Bb1과 tahsp17 유전자(Cry3Bb1:tahsp17로 표기)를 함유하고 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 상기 Cry3Bb1:tahsp17 유전자의 연결부위를 특이적으로 인지한다. 따라서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 바람직하게는 MON863 계통의 유전자 변형체를 대상으로 하지만, 반드시 이에 한정될 필요는 없으며, Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유하고 있는 어떠한 유전자 변형체에도 적용되어질 수 있음은 본 발명의 내용을 통해 자명하다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 5에서 선택된 어느 하나의 프라이머를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시예에서는 서열번호 1과, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 조합하거나, 서열번호 4 기재의 프라이머와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나가 조합되어질 수 있다. 보다 바람직하게는 정성분석을 위하 여는 상기 서열번호 1과, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 프라이머쌍과 서열번호 4와, 서열번호 5의 프라이머쌍이 좋으며, 정량분석을 위하여는 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머쌍이 특히 바람직하다.
또한 본 발명에 의하면 상기 각 프라이머는 염기의 일부가 변형된 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 변형 서열은 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 나타날 수 있다. 어느 것이나, 이러한 염기서열의 변형은 Cry3Bb1:tahsp17 유전자의 연결부위에 특이적으로 인지하는 특성을 변형시키지 않는 범위내에서 실험적, 경험적으로 결정되어질 수 있다.
본 발명에 따른 각 프라이머의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 1에 제시된 바와 같다.
CRTA1-F: 5'-GGT TCT CGG GTG ATA AGA ATG AAC T-3' (25mers, 서열번호 1)
CRTA3-R: 5'-GCC GAT TAC ACA AGT ACA GAA AAC A-3' (25mers, 서열번호 2)
CRTA4-R: 5'-CTG TTG GCG ATT AGC CGA TTA-3' (21mers, 서열번호 3)
CRTA7-F: 5'-CAA GAT CGA GTT CAT CCC CGT-3' (21mers, 서열번호 4)
CRTA7-R: 5'-TCG CAC ACA CAT CAA CCA AAT T-3' (22mers, 서열번호 5)
상기 본 발명에 따른 프라이머 중 서열번호 1 및 서열번호 4의 프라이머는 정방향 프라이머로서 Cry3Bb1을 특이적으로 인식하고, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 5의 프라이머는 역방향 프라이머로서 tahsp17을 특이적으로 인식할 수 있 다.
본 발명은 상기 제시된 각 프라이머 서열을 이용하여 PCR 분석을 통해 유전자 변형체의 정성분석 내지는 정량분석을 수행하는 방법을 제공한다.
유전자 변형체의 정성분석은 해당 시료내에 유전자 변형체(원료 및 가공물 등)의 혼입여부를 판정하는 방법으로 유전자 증폭방법인 PCR(Polymerase Chain Reaction; 중합효소연쇄반응)을 이용하여 외래에서 도입된 유전자를 확인하며, 내재 유전자 및 외래 도입유전자에 대한 PCR산물의 DNA 밴드 유무에 따라 검출, 불검출로 구분한다. 즉, 내재 유전자와 외래 도입유전자의 PCR 산물이 모두 확인된 경우를 검출로 보며, 내재 유전자의 PCR 산물은 검출되나 도입 특이 유전자의 PCR 산물이 검출되지 않는 경우를 불검출로 볼 수 있다.
또한, 분석용 시료 2점에 대한 검정결과에서 PCR 분석결과를 종합하여 양성, 음성으로 판정할 수 있으며, 병행 분석한 2점 중 1점 이상에서 검출로 판정된 경우를 양성으로, 병행 분석한 2점 모두 불검출인 경우를 음성으로 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형체의 정성분석은 상기 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 5로 기재되는 유전자 변형체 검정용 PCR 프라이머, 바람직하게는 서열번호 1과, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 프라이머쌍 또는 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머쌍을 사용하며, 다음과 같은 단계들을 포함한다.
1) 해충저항성 유전자 변형체로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계
2) 상기 단계 1)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 PCR 프라이머 세트를 이용하여 유전자 변형체의 외래 도입유전자 Cry3Bb1:tahsp17의 일부를 증폭하는 단계
3) 증폭된 외래 도입유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계
상기 과정에 의하면 적어도 외래 도입유전자 중 Cry3Bb1:tahsp17을 포함하는 어떠한 유전자 변형체를 정성적으로 검정하는 것이 가능하며, 특히 해충저항성 유전자 변형옥수수인 MON863에 특이적으로 반응한다.
유전자 변형체의 정량분석은 시료에서 DNA를 추출한 후 이를 실시간(Real Time) PCR 장치를 이용하여 여러 개의 양성표준시료 및 음성표준시료와 동시에 실시간 PCR을 실행하여 분석한다. 현재 많이 사용되고 있는 기종은 어플라이드 바이오시스템사의 ABI 프리즘 7000, 7700, 7900 시퀀스 검출기와 코벳 리서치사의 로터진 2000, 로슈사의 라이트사이클러 등이 있다. 실시간 PCR은 일반 PCR과는 달리 형광프로브를 이용하며 이의 원리는 다음과 같다.
실시간 PCR(RT-PCR)은 일반 PCR과 같이 2개의 프라이머을 이용하는 원리는 동일하지만 형광물질이 화학적으로 결합하여 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 점에서 차이가 있다. 상기 프로브는 PCR 과정에서 두 개의 프라이머와 같이 검체대상의 DNA에 있는 상보서열에 결합한다. 프로브의 위치는 프라이머와는 약간의 거리를 두고 이격되며, DNA 폴리머라제에 의해 프라이머에 DNA가 합성되면서 이 효소는 프로브를 만나게 되고 이를 분해한다. 이는 DNA 폴리머라제는 중합반응 기능 외에도 DNA 듀플렉스를 분해하는 뉴클레아제 기능이 있기 때문이다.
통상적으로 사용되는 프로브는 양끝에 리포터(reporter:FAM)와 쿠엔쳐(quencher:TAMRA)라는 형광물질이 붙어 있는 형태를 가진다. 이는 거리상 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나 증폭이 진행됨에 따라 폴리머라제에 의해 리포터가 쿠엔쳐로부터 떨어져 나가게 되면 형광이 감지되는 원리를 이용한다. 형광의 강도는 증폭사이클이 증가함에 따라 점점 증가하며, 여러 기지농도의 유전자 변형체의 표준시료와 미지시료를 대상으로 동시에 RT-PCR을 실시하여 기지시료로부터 표준 곡선을 도출하고 이 곡선으로부터 미지 시료의 유전자 변형체의 함량을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형체의 정량분석은 상기 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 5로 기재되는 유전자 변형체 검정용 PCR 프라이머 세트, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하며, 보다 바람직하게는 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍을 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트로 사용하고, 프로브와 본 발명에 따른 표준 플라스미드가 이용되며, 다음 단계에 따라 수행되어질 수 있다.
1) 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계
2) 농도별로 희석한 표준 플라스미드와 유전자 변형체의 게놈 DNA를 각각 주형으로 하여 외래 도입유전자에 특이적인 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하고, 얻어진 분석치를 이용하여 표준정량곡선을 작성하는 단계
3) 상기 얻어진 표준정량곡선 대비 해충저항성 유전자 변형체의 게놈 DNA에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 외래 도입유전자의 혼입율(％)을 산출하는 단계
상기 본 발명에 따른 정량분석에 사용되는 프로브는 하기의 서열번호 6의 CRTA7-2 프로브가 이용된다. 하기 CRTA7-2 프로브는 tahsp17 유전자 부위를 특이적 으로 인지한다.
CRTA7-2: FAM-CGT TTG GAC GTA TGC TCA TTC AGG TTG G-TAMRA (28mers, 서열번호 6)
또한 본 발명에 따른 표준 플라스미드는 하기 표 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 p3SNTM-9 플라스미드를 제공한다.
<표 1>
플라스미드 구조 증폭산물 크기
p3SNTM-9 35S프로모터-SSⅡb내재유전자-NK603유전자-TC1507유전자-MON863 유전자/pCR2.1 벡터 612bp/pCR2.1
상기 구조의 p3SNTM-9 플라스미드는 본 발명에 따른 서열번호 4의 CRTA7-F 프라이머와 서열번호 5의 CRTA7-R 프라이머에 의해 증폭된 산물을 pCR2.1 (인비트로젠 사) 벡터에 삽입한 플라스미드로 실시간 PCR을 위한 표준 플라스미드로 사용된다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
<실시예 1> 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 제작
모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 프로브는 프라이머 익스프레스 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 이용하여 디자인하였다. 상기 프라이 머들은 제노텍사(대전, 한국)에 의해 합성되어졌고, PAGE 컬럼상에서 정제되어졌다. 프로브는 어플라이드 바이오시스템사 (포스터 시, 미국)에 의해 합성되어졌다. 이들은 5'과 3' 말단에 각각 6-카르복시플루오레세인(FAM)과 6-카르복시테라메틸 로다민(TAMRA)으로 표지되어졌다.
SSⅡb 프라이머 쌍은 옥수수를 다른 작물과 구분하기 위하여 사용되어졌으며, CaMV 35S 프라이머 쌍은 유전자 변형(GM) 옥수수를 통상적인 옥수수와 구분하기 위하여 사용되어졌다. 이들은 히데오 구리바라 등(Hideo Kuribara et al., Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maze and Soybean, Journal of AOAC International Vol. 85, No.5, 2002)의 DNA 서열을 이용하여 합성되어졌다.
한편 옥수수의 Cry3Bb1 (진 뱅크 승인 번호 M89794)과 밀의 열충격 단백질 17.3 유전자(EMBL 승인 번호 X13431) 사이의 연결 부위에 기초한 MON863 라인을 검출하기 위하여 CRTA1-F(서열번호 1), CRTA3-R(서열번호 2), CRTA4-R(서열번호 3) 및 CRTA7-F/R (서열번호 4/5) 프라이머를 각각 제작하였다.
상기 새로운 프라이머 쌍인 CRTA1-F/CRTA3-R, CRTA1-F/CRTA4-R과 CRTA7-F/R은 MON863의 게놈 DNA로부터 258bp, 271bp 산물과 111bp 산물을 증폭하는데 성공적인 것으로 나타났다. GM이 아닌 옥수수나 다른 계통 GM 옥수수, 쌀 및 보리 등 다른 11개 대조구에서는 PCR 산물이 발견되지 않았다. 따라서, 고안된 3종의 프라이머 쌍이 GM MON863 옥수수계통에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3a, 3b).
<실시예 2> 정량분석용 표준 플라스미드의 제작
유전자 변형 옥수수 MON863의 정량검정을 위하여, MON863의 도입유전자에 대한 PCR 산물을 연결하여 pCR2.1(인비트로젠사) 벡터에 삽입한 표준 플라스미드 p3SNTM-9를 히데오 구리바라 등(Hideo Kuribara et al., Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maze and Soybean, Journal of AOAC International Vol. 85, No.5, 2002)이 제시한 방법에 따라 제작하였다. 구체적으로, 상기 MON863의 도입유전자에 대한 PCR 산물은 CRTA7-F 프라이머(서열번호 4)와 CRTA7-R 프라이머(서열번호 5)를 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭한 PCR 산물은 SmaⅠ/SrfⅠ 제한효소 절단부위의 염기서열을 인위적으로 삽입하여 합성한 다른 PCR 산물과 연결, 재증폭하여 pCR2.1 벡터에 삽입하여 p3SNTM-9를 제작하였다 (도 2). 상기 p3SNTM-9에 삽입된 PCR 산물은 도 5에 나타난 바와 같이 확인되었다(서열번호 7).
서열번호 7:
Figure 112006070491393-pat00009
<실험예 1> 특이 프라이머를 이용한 유전자 변형 옥수수의 검출
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 각각의 특이성을 유전자 변형 옥수수인 MON863에 대하여 하기와 같이 확인하였다.
1) 식물의 게놈DNA 분리
먼저, 유전자 변형 옥수수 MON863 계통의 게놈 DNA를 분리하였다. MON863 에 대한 옥수수분말은 몬산토 회사로부터 입수하여 1g을 50㎖ 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 및 정제하였으며, 수득 한 게놈 DNA는 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280를 이용하여 정량하였다.
2) PCR 분석
상기에서 수득한 계통의 게놈 DNA 50ng을 주형으로 하여, 프라이머 CRTA1-F/CRTA3-R 및 CRTA1-F/CRTA4-R를 이용하여 PCR을 수행하였다.
대조군으로는 주형 미첨가군, 천연형 옥수수 및 타 계통의 유전자 변형 옥수수 게놈 첨가군을 이용하였다. 각 프라이머에 대한 PCR 반응조건은 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2>
프라이머 반응조건
CRTA1-F/CRTA3-R CRTA1-F/CRTA4-R 94℃,10분→(94℃,30초→60℃,30초→72℃,30초), 40회→72℃, 7분
상기의 PCR 산물을 EtBr을 함유한 2％ 아가로스 겔상에서 전기영동으로 분석하였다. 도 3a, 3b는 PCR 산물에 대한 전기영동사진으로서 레인 1은 사이즈 마커이고, 각 레인에 대해서 레인 2는 NTC, 레인 3은 음성대조군인 천연형 옥수수, 레인 4는 MON810 옥수수 DNA, 레인 5는 Bt11 옥수수, 레인 6은 Event176 옥수수, 레인 7은 T25 옥수수, 레인 8은 GA21 옥수수, 레인 9는 NK603 옥수수, 레인 10은 TC1507 옥수수, 레인 11은 MON863 옥수수, 레인 12 및 13은 옥수수와 같은 화분과 작물인 벼와 보리의 게놈 DNA를 각각의 PCR 주형으로서 사용하여 PCR한 결과이다.
3) CRTA1-F 프라이머 및 CRTA3-R 또는 CRTA4-R 프라이머 세트를 이용한 유전자 변형 옥수수의 검정
CRTA1-F 프라이머 및 CRTA3-R 또는 CRTA4-R 프라이머를 이용한 PCR 결과, MON863 계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며, PCR 산물의 크기도 예상한 바와 같이 각각 258bp, 271bp로 확인되었다. 상기에서 생성된 PCR 산물은 MON863 계통임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였으며, 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 PCR 산물은 각각 258개, 271개의 염기로 구성되었다.
<실험예 2> 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드를 이용한 유전자 변형 옥수수의 정량적 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드를 이용하여 유전자 변형 옥수수인 MON863에 도입된 유전자의 혼입율을 정량적으로 분석하였다.
1) 식물의 게놈 DNA 분리 및 표준 플라스미드의 준비
먼저, 유전자 변형 옥수수 MON863 계통의 게놈 DNA를 분리하였다. 구체적으로, 상기 유전자 변형 옥수수 MON863 계통에 대한 옥수수 분말을 몬산토사로부터 입수하여 1g을 50㎖ 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 및 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280를 이용하여 측정하여 DNA 농도를 정량하였다.
표준 플라스미드는 대장균(E.coli TOP10)에 형질전환하여 정제한 후 2㎍을 SmaⅠ 효소로 25℃에서 2시간 처리하여 절단한 후 2％ 아가로스 겔에 전기영동하였 다. 상기 선형으로 절단된 플라스미드를 아가로스겔로부터 회수하여 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량한 후 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 카피/2.5㎕의 5단계로 각각 희석하여 표준곡선을 작성하는데 이용하였다.
2) 실시간 PCR 분석을 이용한 유전자 변형 옥수수 외래 도입유전자의 혼입율 분석
상기에서 수득한 계통의 옥수수게놈 DNA 20ng과 각 5단계별 카피수로 희석한 표준플라스미드 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 카피/2.5㎕ 및 표준 플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 각각 주형으로 하여, 프라이머(CRTA7-F/CRTA7-R) 각 1.25μM과 프로브 (CRTA7-2) 0.25μM를 첨가하여 실시간 PCR을 수행하였다. 각 프라이머와 프로브에 대한 실시간 PCR 조건은 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3>
프라이머 반응조건
CRTA7-F/CRTA7-R 50℃, 2분→95℃, 10분→(95℃, 30초→59℃, 1분), 40회
3) 표준 플라스미드를 이용한 정량성 확인
p3SNTM-9 플라스미드를 5단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 하여 CRTA7-F 프라이머, CRTA7-R 프라이머 및 CRTA7-2 프로브로 실시간 PCR을 수행한 결과, 상기의 p3SNTM-9 플라스미드 카피수에 의하여 증폭되는 실시간 PCR의 상관계수가 0.99이상으로 나타나 정량분석을 표준플라스미드로 이용 가능함을 확인하였다 (도 6a, 6b).
또한, 상기 표준 플라스미드의 실시간 PCR 결과치를 이용하여 작성된 표준곡 선에 따른 유전자 변형 옥수수 MON863 계통의 외래 도입유전자의 도입된 카피수를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 유전자 변형 옥수수 MON863 계통에 도입된 외래유전자의 카피수는 35,812로 나타났으며, 보정계수는 0.58로 나타났다(표 4).
<표 4>
GM옥수수 내재유전자(SSⅡb)카피수 도입유전자 카피수 보정계수
MON863 62,246 35,812 0.58
결론적으로 본 발명에 의한 유전자 변형 농산물 검정용 PCR 프라이머와 프로브 및 플라스미드는 GMO의 검사키트로 상업화할 수 있으며, 특히 유통중이거나 수입된 농산물 및 식품으로 사용되는 유전자변형 옥수수의 간편하고 정확한 정성 및 정량분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 의하면 유전자 변형체의 검정을 신속하면서 정확하게 수행할 수 있으며, 특히 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 종래 검정이 불가능하여 왔던 옥수수 MON863과 같은 계통에 대하여 특이적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 현재 유통중이거나 수입되는 농산물 및 식품의 유전자 변형체의 정성 및 정량적인 분석에 매우 유용하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1 또는 서열번호 4기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트
  3. 제 2항에 있어서, 유전자 변형체는 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유하는 것임을 특징으로 하는 프라이머 세트
  4. 제 2항에 있어서, 유전자 변형체는 MON863 계통의 유전자 변형 옥수수임을 특징으로 하는 프라이머 세트
  5. 서열번호 1 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 준비하는 단계, 상기 준비된 프라이머 세트를 이용하여 당해 유전자 변형체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행 결과로부터 유전자 변형체의 정성 또는 정량 분석 결과를 얻는 단계를 포함하는 유전자 변형체의 검정방법
  6. 제 5항에 있어서, 유전자 변형체는 Cry3Bb1:tahsp17 유전자를 함유하는 것임을 특징으로 하는 검정방법
  7. 제 5항에 있어서, 유전자 변형체는 MON863 계통의 유전자 변형 옥수수임을 특징으로 하는 검정방법
  8. 제 5항에 있어서, 정성분석은 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 의 프라이머쌍 또는 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍이 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법
  9. 제 5항에 있어서, 정량분석은 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍이 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법
  10. 제 5항 또는 제 9항에 있어서, 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 6 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법
  11. 서열번호 7의 염기서열을 가지는 유전자와, 상기 유전자가 특정위치에 삽입되어지는 벡터로 구성되는 유전자 변형체의 정량검정을 위한 표준 플라스미드
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002034943A1 (fr) 2000-10-26 2002-05-02 National Food Research Institute Procede de quantification de modification genetique et molecule standard a utiliser dans ledit procede
KR100474115B1 (ko) 2001-06-01 2005-03-08 대한민국 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머
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