CN107406884A - 核酸扩增和文库制备 - Google Patents

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Abstract

用于制备具有减少的非特异性扩增假产物的多个扩增产物的方法和试剂盒。

Description

核酸扩增和文库制备
发明领域
本公开内容涉及核酸扩增，特别涉及用于制备具有减少的非特异性扩增假产物(artifacts)的多个扩增产物的方法。
背景
通过下一代测序(NGS)技术的靶向基因组测序已成为有力的平台用于生物医学和农业基因组分析，例如人身份和祖先鉴定、疾病诊断、植物种质分子表征和分子育种。尽管NGS平台的容量快速提升，但NGS即用型DNA文库的制备已成为限制性因素。多路PCR是一个用于高通量产生DNA文库的理想平台。然而，因为在单个反应中引物对的数量从几对急剧增加至数百或甚至数千对，在多路PCR期间的引物二聚体形成和产生的引物二聚体在随后的文库制备步骤中的干扰成为对成功NGS应用的阻碍。因此，对于生物医学和农业应用二者，对以流水线、高通量和低成本的方式制备DNA测序文库的方法、组合物和试剂盒存在需要。
附图简述
图1A提供了使用本文公开的方法制备DNA文库的示意图。目的DNA靶标用在3’末端(引物的黑色区域)用硫代磷酸酯键修饰的引物，经PCR扩增。PCR产物然后用T7外切核酸酶和Klenow片段的组合消化，随后使用T4 DNA连接酶与NGS衔接头连接。连接产物经纯化和通过NGS平台测序。
图1B图示了使用本文公开的方法从扩增反应除去引物二聚体。在PCR期间产生的潜在的引物二聚体通过T7外切核酸酶和Klenow片段消化成小的寡聚物，因此在与NGS衔接头连接时从与靶DNA PCR片段的竞争中排除。
图2说明了自在3'末端用4-6个硫代磷酸酯键修饰的引物扩增的PCR片段被保护免于T7外切核酸酶和Klenow片段的消化。显示了大小分级的消化的PCR产物和未消化的对照的BioAnalyzer图像。(L) BioAnalyzer DNA1000梯。(1) 自具有4个硫代磷酸酯键的引物扩增的未消化的产物。(2) 自具有5个硫代磷酸酯键的引物扩增的未消化的产物。(3) 自具有6个硫代磷酸酯键的引物扩增的未消化的产物。(4) 自未修饰的对照引物扩增的未消化的产物。(5) 自具有4个硫代磷酸酯键的引物扩增的消化的产物。(6) 自具有5个硫代磷酸酯键的引物扩增的消化的产物。(7) 自具有6个硫代磷酸酯键的引物扩增的消化的产物。(8)自未修饰的对照引物扩增的消化的产物。结果证实了在3’末端具有硫代磷酸酯键的引物修饰可保护产生的PCR片段免于T7外切核酸酶和Klenow片段降解。
图3显示通过用T7外切核酸酶和Klenow片段的组合消化除去引物二聚体。每个引物在3’末端用6个硫代磷酸酯键修饰。用一对人工引物产生人工引物二聚体，每个引物也在3’末端包含6个硫代磷酸酯键。将PCR产物和引物二聚体合并和用不同水平的T7外切核酸酶和Klenow片段消化。显示了大小分级的PCR片段和引物二聚体的10%聚丙烯酰胺凝胶的图像。(A) PCR产物和引物二聚体。(B) 各自5个单位的T7外切核酸酶和Klenow。(C) 各自2.5个单位的T7外切核酸酶和Klenow消化。(D) 各自1个单位的T7外切核酸酶和Klenow。(E) 没有酶消化的对照。(F) DNA梯(Sigma-Aldrich)。结果证实了当用硫代磷酸酯键修饰的引物进行PCR扩增时，通过T7外切核酸酶和Klenow片段的组合，引物二聚体可选择性地自靶DNAPCR片段降解。
图4说明了在用T7外切核酸酶和Klenow片段消化后，玉米靶DNA PCR片段与NGS衔接头的连接。按上文图2和图3所示，玉米DNA使用修饰的引物扩增。连接的靶DNA的拷贝数(通过TaqMan实时PCR定量)对没有连接酶的样品和用连接酶孵育30或60分钟的样品作图。结果证实了用在3’末端含有硫代磷酸酯键的引物扩增的PCR片段可用T7外切核酸酶和Klenow片段消化，并随后与NGS衔接头连接。
图5显示在用T7外切核酸酶和Klenow片段消化后，人384-路PCR片段与NGS衔接头的连接。用384对在3'末端用5个硫代磷酸酯键修饰的引物的库扩增人DNA，和PCR产物用T7外切核酸酶和Klenow片段消化。连接的靶DNA的拷贝数(通过TaqMan实时PCR定量)对以下反应作图。(A) 衔接头的无T4 DNA连接酶对照。(B) 衔接头的T4 DNA连接酶对照。(C) 消化的PCR产物和衔接头的无T4 DNA连接酶对照。(D) 未消化的PCR产物和衔接头的T4 DNA连接酶对照。(E) 消化的PCR产物和衔接头的T4 DNA连接酶连接试验。对照的背景连接由T4 DNA连接酶制备中的杂质(最可能是多核苷酸DNA激酶)引起。在试验E中衔接头连接的PCR片段的浓度为约0.45 nM。结果证实了用在3’末端含有硫代磷酸酯键的引物扩增的高度多路的人DNA PCR片段可用T7外切核酸酶和Klenow片段消化，和随后与NGS衔接头连接。
图6提供了溴化乙锭-染色的10%聚丙烯酰胺凝胶的图像。泳道A：未消化的3,072-路PCR产物。泳道B：T7外切核酸酶和Klenow聚合酶消化的3,072-路PCR产物。泳道C：3,072-路文库的测序衔接头引物扩增的未消化的文库。泳道D：3,072-路文库的测序衔接头引物扩增的消化的文库。泳道E：DNA梯(Sigma-Aldrich)。DNA梯从下往上为：50 bp, 100 bp, 200bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp等。泳道F：作为A的对照的无模板样品。泳道G：作为B的对照的无模板样品。泳道H：作为C的对照的无模板样品。泳道I：作为D的对照的无模板样品。泳道C和H (未消化的)在大约150 bp具有双条带，其与衔接头-引物二聚体连接扩增产物一致。泳道D和I (消化的)缺少该双条带。这些结果证实了用T7外切核酸酶和Klenow片段消化通过减少文库中的引物-二聚体连接产物，改进测序文库质量。
发明内容
本公开内容的一个方面包括制备具有减少的非特异性扩增假产物的多个扩增的核酸产物的方法。该方法的第一个步骤包括在扩增条件下使一种或多种核酸与至少一对扩增引物接触，以形成多个扩增产物，其中每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团。该方法进一步包括使所述多个扩增产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物，其中与用缺少核酸酶-抗性基团的引物进行的标准的核酸扩增反应相比，所述多个消化的扩增产物具有减少水平的非特异性扩增假产物。在一些实施方案中，非特异性扩增假产物是引物二聚体产物。在某些重复(iteration)中，与标准的核酸扩增反应相比，非特异性扩增假产物减少至少约50%、至少约75%或至少约90%。通常，所述多个消化的扩增产物各自在其5'末端具有磷酸基团。根据在消化步骤期间使用的酶，所述多个消化的扩增产物各自是平端的，或所述多个消化的扩增产物各自具有3'突出端。
在一些实施方案中，扩增的核酸是基因组DNA、细胞器DNA、cDNA或RNA。在某些实施方案中，核酸酶-抗性基团选自硫代磷酸酯键、2' O-甲基基团、2'氟代基团或其组合。在特定的实施方案中，核酸酶-抗性基团是硫代磷酸酯键。在进一步的实施方案中，5'至3'外切核酸酶选自T7外切核酸酶、T5外切核酸酶、λ外切核酸酶、RecJf或其组合。在特定的实施方案中，5'至3'外切核酸酶T7外切核酸酶。在某些实施方案中，3'至5'单链-特异性外切核酸酶选自外切核酸酶I、外切核酸酶T或其组合。在其它的实施方案中，校对聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或其组合。在特定的实施方案中，校对聚合酶外切核酸酶是T4 DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。在一些实施方案中，该方法进一步包括连接一个或多个衔接头至所述多个消化的扩增产物，以形成多个衔接头-连接的扩增产物。
本公开内容的另一方面提供了制备测序文库的方法。该方法包括在扩增条件下使多种核酸与多个扩增引物对接触，以形成多个扩增产物，其中每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团。该方法的下一个步骤包括使所述多个扩增产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物。该方法的最后步骤包括连接一个或多个衔接头至所述多个消化的扩增产物，以形成测序文库。
本公开内容的进一步的方面包括用于制备缺少非特异性扩增假产物的多个扩增产物的试剂盒。该试剂盒包含(a) 一对或多对扩增引物，其中每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团，(b) 5'至3'外切核酸酶，和(c) 3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶。
本公开内容的其它方面和重复在下文更详细地描述。
详细描述
本公开内容提供了用于制备具有减少的非特异性扩增假产物的多个扩增的核酸产物的方法和试剂盒。所述方法包括使用扩增引物扩增需要的靶核酸，所述引物各自包含在3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团。所述方法进一步包括用5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶消化得到的扩增产物，使得核酸酶敏感性核苷酸从扩增产物的末端除去，和在扩增反应期间形成的引物二聚体被降解成包含核酸酶-抗性基团的短的寡核苷酸(参见图1A和图1B)。因此，本文公开的方法和试剂盒提供了有效的、流水线、高通量和低成本的方式，以制备适合于下一代测序平台或其它下游应用的文库。
I.制备多个扩增产物的方法
本公开内容的一个方面提供了制备具有减少的非特异性扩增假产物的多个扩增的核酸产物的方法。通常，该方法包括在扩增条件下使一种或多种核酸与至少一对扩增引物接触，以形成多个扩增产物，其中每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团。该方法进一步包括使所述多个扩增产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物，其中与用缺少核酸酶-抗性基团的引物进行的标准的核酸扩增反应相比，所述多个消化的扩增产物具有减少水平的非特异性扩增假产物。
(a) 扩增步骤
该方法的第一个步骤包括在扩增条件下使一种或多种目的核酸与至少一对扩增引物接触，以扩增核酸。每个扩增引物是包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团的寡核苷酸。
(i) 包含核酸酶-抗性基团的扩增引物
每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团。各种核酸酶-抗性基团可包括在本文公开的扩增引物中。合适的核酸酶-抗性基团包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键、二氨基磷酸酯键、酰胺键、2' O-甲基基团、2'氟代基团、丙炔碱基或其组合。在一些实施方案中，核酸酶-抗性基团可以是硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，核酸酶-抗性基团可以是硫代磷酸酯键和2' O-甲基基团或2'氟代基团的组合。本领域技术人员理解其它组合是可能的。
在一些实施方案中，每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个核酸酶-抗性基团。在特定的实施方案中，每个扩增引物包含在其3'区域中的4、5、6、7、8、9或10个核酸酶-抗性基团。在某些实施方案中，每个扩增引物包含在其3'区域中的5、6、7或8个硫代磷酸酯键。每个扩增引物可进一步包含在其3'区域中的1、2、3或4个2' O-甲基基团和/或2'氟代基团。
如本文使用的，3'区域是指最接近分子的3'末端的寡核苷酸引物的部分。在一些实施方案中，核酸酶抗性基团可位于分子的3'末端的最后一个、倒数第二个和倒数第三个核苷酸(即，3'-第1-3个核苷酸)内，3'-第1-6个核苷酸内，3'-第1-9个核苷酸内，3'-第1-12个核苷酸内或3'-第1-15个核苷酸内。
扩增引物的长度可自约10个核苷酸至约40个核苷酸而变化。在一些实施方案中，扩增引物的长度范围可以是约10-约15个核苷酸、约15-约20个核苷酸、约20-约25个核苷酸、约25-约30个核苷酸、约30-约35个核苷酸或约35-约40个核苷酸。在特定的实施方案中，扩增引物的长度范围可以是约18-约27个核苷酸。
通常，扩增引物是单链的，与目的核酸具有互补性，和每个具有在3'末端的羟基，以引发DNA合成。扩增引物可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合。核苷酸可以是标准的核苷酸(即，A、C、G、T和/或U)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基和/或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如，肌苷)或非-天然存在的核苷酸。在核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧基甲基、羟基、甲基、磷酰基和巯基，以及碱基的碳和氮原子被其它原子置换(例如，7-去氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括锁核酸(LNA)和吗啉基类似物(morpholino)。扩增引物还可包含具有2-倍简并性(即R、Y、K、M、S和/或W)、3-倍简并性(即B、D、H和/或V)或4-倍简并性(即N)的核苷酸的混合物。
扩增引物可使用容易获得的引物设计软件(例如，Primer3, PrimerQuest Tool,NPprimer, 多路引物设计等)设计。通常，扩增引物可具有约40-60%的平均GC含量，和约58℃-约65℃的平均解链温度(Tm)。扩增引物可使用标准的寡核苷酸化学合成方法合成，和核酸酶-抗性基团可使用众所周知的方法掺入。扩增引物可包含一对或多对引物，例如，几十对引物，几百对引物或几千对引物。
扩增反应中每个扩增引物的浓度范围可以是约1 nM-约500 nM，取决于例如，引物对的数量和靶核酸的复杂性。在一些实施方案中，每个扩增引物的浓度范围可以是约1-10nM、约10-30 nM、约30-100 nM、约100-300 nM或约300-500 nM。在某些实施方案中，每个扩增引物的浓度范围可以是约10 nM-约200 nM。在其它的实施方案中，每个扩增引物的浓度范围可以是约5 nM-约50 nM。
在特定的实施方案中，一对或多对扩增引物的长度范围可以是约20-25个核苷酸，包含标准的脱氧核糖核苷酸，和包含在每个引物的3'末端的5-8个硫代磷酸酯键。
(ii) 靶核酸
通过本文公开的方法扩增的一个或多个核酸可以不同，并将会不同。在一些实施方案中，靶核酸可以是基因组DNA。基因组DNA可以是细胞核的、线粒体的或质体的。在其它的实施方案中，靶核酸可以是自信使RNA (mRNA)或非编码RNA (例如，微RNA (miRNA)、长的非编码RNA (lncRNA)、长的基因间非编码RNA (lincRNA)、小干扰RNA (siRNA)、Piwi-相互作用RNA (piRNA)、反式作用RNA (rasiRNA)、核糖体RNA (rRNA)、转移RNA (tRNA)、线粒体tRNA(MT-tRNA)、小的核RNA (snRNA)、小的核仁RNA (snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA(SL RNA)和/或端粒末端转移酶RNA组分)转录的互补DNA (cDNA)。在特定的实施方案中，核酸是基因组DNA或cDNA。本领域技术人员熟悉分离基因组DNA和制备cDNA的方法(例如，标准方案、市售可得的试剂盒等)。
靶核酸可以是野生型的，可包含单核苷酸多态性(SNP)，可包含多个核苷酸置换，可包含插入和/或缺失(indels)，和/或可包含表观遗传修饰(例如，甲基化的胞嘧啶、其它修饰的核苷酸等)。
核酸可来源于真核细胞、古细菌细胞或细菌细胞。合适的真核新报包括哺乳动物细胞(例如，人、灵长类动物、狗、猫、农场动物、动物园动物、啮齿动物、研究用动物等)、非哺乳动物的脊椎动物细胞(例如，家禽、鱼、青蛙等)、植物细胞(例如，玉米、豆类、禾本科、芸苔等)、无脊椎动物细胞(例如，昆虫、蠕虫等)、真菌细胞、单细胞生物等。
(iii) 扩增条件
所述方法的第一个步骤包括在扩增条件下使一种或多种核酸与至少一对扩增引物接触，以形成多个扩增产物。通常，扩增条件包括在合适的缓冲液的存在下与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸(例如，dNTP)接触。通常，用于扩增的DNA聚合酶具有聚合酶活性和3'至5'校对外切核酸酶活性，和可进一步包含5'至3'外切核酸酶活性和/或末端转移酶活性。DNA聚合酶可以是嗜热的(例如，Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶，其变体或其组合)。或者，DNA聚合酶可以是嗜温的(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、phi29 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶，其变体或其组合)。
扩增反应可以是基于PCR的扩增方法(例如，多路PCR、长范围PCR、常规PCR、快速PCR、热启动PCR、递降PCR (touchdown PCR)等)、多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、解螺旋酶-依赖性扩增(HAD)、切割酶扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)或连接介导的扩增。
在一个实施方案中，核酸使用基于PCR的方法扩增；例如，多路PCR。扩增条件包含与嗜热DNA聚合酶、dNTP和适合于PCR的缓冲液(它们是本领域已知的)接触。每个PCR循环通常包含3个步骤(即变性、退火和延伸)；循环总数范围可以是约25-约50。变性步骤的温度范围可以是约90℃-约100℃，和变性步骤的持续时间范围可以是约10秒-约10分钟。退火步骤的温度可以根据扩增引物的解链温度变化。例如，退火步骤的温度范围可以是约50℃-约65℃，和退火步骤的持续时间范围可以是约20秒-约4分钟。延伸步骤的温度范围可以是约68℃-约75℃，和延伸步骤的持续时间可以自约20秒至约4分钟变化。最后的延伸步骤之后可以是末端延长步骤，其持续约5分钟、10分钟或更长。
(b) 消化步骤
所述方法进一步包括使第一个步骤中形成的多个扩增产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物。扩增产物与5'至3'外切核酸酶的接触从扩增产物的5'末端除去核酸酶敏感性核苷酸，直到遇到一个或多个核酸酶-抗性核苷酸；每个5'末端具有磷酸基团(参见图1A)。与3'至5'单链-特异性外切核酸酶接触除去产生的3'突出端，或与校对聚合酶接触除去产生的3'突出端和/或添加3'腺嘌呤突出端。最终的结果是所述多个消化的扩增产物将是平端的或具有3'突出端。然而，当在扩增反应期间产生的引物二聚体或引物-二聚体产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触时，产生短的寡核苷酸(参见图1B)。得到的短的寡核苷酸包含扩增引物的3'区域，其包含核酸酶-抗性基团。因此，消化步骤产生即用于下游反应的消化的扩增产物，但更重要的是，自后续反应减少或消除引物-二聚体产物。
(i) 5'至3'外切核酸酶
外切核酸酶是水解磷酸二酯键和从核酸链的任一端一次一个而除去核苷酸的酶。具有5'至3'活性的外切核酸酶从5'末端除去核苷酸。5'至3'外切核酸酶可识别和切割单链和/或双链DNA模板。合适的5'至3'外切核酸酶的非限制性实例包括T7 (基因6)外切核酸酶、T5外切核酸酶、λ外切核酸酶、RecJf或其组合。在特定的实施方案中，5'至3'外切核酸酶是T7外切核酸酶。
通常，与扩增产物接触的5'至3'外切核酸酶的量的范围可以是约0.01-约20个酶单位。在一些实施方案中，5'至3'外切核酸酶的量的范围可以是约0.01个单位至约1个单位、约1个单位至约3个单位、约3个单位至约10个单位或约10个单位至约20个单位。
(ii) 3'至5'单链-特异性外切核酸酶和校对聚合酶
具有3'至5'活性的单链-特异性外切核酸酶(ssExo)从单链核酸的3'末端除去核苷酸。合适的3'至5'单链-特异性外切核酸酶的实例包括外切核酸酶I、外切核酸酶T或其组合。在一些实施方案中，外切核酸酶I可以源自大肠杆菌、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)或嗜热热球菌(Thermococcus thermophiles) (Tth)。
校对聚合酶具有3'至5'外切核酸酶活性，但缺少5'至3'外切核酸酶活性。校对聚合酶可以是嗜温DNA聚合酶、嗜热DNA聚合酶或其组合。合适的嗜温校对DNA聚合酶的非限制性实例包括Klenow DNA聚合酶(即大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段)、T4 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或其组合。合适的嗜热校对DNA聚合酶的非限制性实例包括Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或其组合。
与扩增产物接触的3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶的量的范围可以是约0.01-约20个酶单位。在一些实施方案中，用于反应的DNA聚合酶的量的范围可以是约0.01个单位至约1个单位、约1个单位至约3个单位、约3个单位至约10个单位或约10个单位至约20个单位。
(iii) 反应条件
反应温度通常根据用于消化步骤的酶的特性而变化。在一些实施方案中，消化可在单一温度下进行。例如，消化可在约10℃-约40℃、约20℃-约30℃的温度或约室温下进行。在其它的实施方案中，消化可在两个不同的温度下进行，即第一个温度接着第二个温度。例如，第一个温度范围可以是约10℃-约40℃、约20℃-约30℃或约室温，和第二个温度步骤范围可以是约40℃-约85℃或约50℃-约75℃。消化步骤的持续时间范围可以是约5分钟-约180分钟。在各个实施方案中，可进行反应约5分钟-约20分钟、约20分钟-约40分钟、约40分钟-约90分钟或约90-约180分钟的一段时间。
在一些实施方案中，消化酶可在反应结束时通过加热灭活。为此，可将反应混合物加热至范围为约60℃-约70℃、约70℃-约80℃或约80℃-约90℃的温度，持续时间范围为约1分钟-约120分钟，取决于特定酶的灭活温度。
通常，与用缺少核酸酶-抗性基团的引物进行的标准的核酸扩增反应相比，所述多个消化的扩增产物具有减少水平的非特异性扩增假产物。在一些实施方案中，与标准的核酸扩增反应相比，非特异性扩增假产物的水平可减少至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%。在某些实施方案中，所述多个消化的扩增产物基本上缺少非特异性扩增假产物。
所述多个消化的扩增产物可直接用于后续反应或下游应用，无需任何插入的纯化步骤。或者，消化的扩增产物可使用众所周知的核酸纯化方法(例如，PCR纯化试剂盒等)从核苷酸、扩增引物、酶和盐纯化。
(c)任选的连接反应
在一些实施方案中，所述多个消化的扩增产物可与一个或多个衔接头连接以形成多个衔接头-连接的扩增产物。衔接头可以是测序衔接头。在一些实施方案中，衔接头可适合于NGS应用。例如，衔接头可以是线性衔接头(例如，Illumina/Solexa衔接头、TruSeq衔接头、SOLiD衔接头、TA衔接头、NEBNext衔接头、454衔接头、条码衔接头等)、环状衔接头或泡状衔接头。在一些实施方案中，衔接头通常可以是平端的并且未被磷酸化。在其它的实施方案中，衔接头可包含3' T突出端和5'磷酸基团。
连接在连接酶(即，催化磷酸二酯键的形成的连接酶)的存在下进行。通常，连接酶对双链DNA是特异性的，和催化平端连接或T/A连接。合适的DNA连接酶的实例包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶或其组合。在特定的实施方案中，DNA连接酶是T4 DNA连接酶。反应中包括的连接酶和衔接头的量，以及反应条件，可以改变，并且将会改变，其确定在本领域普通技术人员的技能范围内。
上述方法还可用于制备测序文库。为此，所述多个扩增产物通过在扩增条件下使多种核酸与多个扩增引物对接触产生，其中每个扩增引物包含上文详述的至少3个核酸酶-抗性基团。所述多个扩增产物然后与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物。最后，按上述将衔接头连接至消化的扩增产物，从而形成测序文库。
下游应用
在一些实施方案中，所述多个衔接头-连接的扩增产物可使用下一代测序(NGS)平台测序。NGS平台的非限制性实例包括ion torrent测序、SOLiD测序、Illumina测序、基因组分析仪测序、454测序、定向深度测序、纳米球测序、单分子实时测序等。NGS技术包括临床诊断、癌症诊断、分子诊断试验、癌症治疗、药物开发、微生物组技术、食品和农业技术和基础研究。
在其它的实施方案中，所述多个衔接头-连接的扩增产物或多个消化的扩增产物可用于其它应用，例如SNP基因分型、qPCR和基于PCR的突变检测方法、STR/微卫星分析、基于微阵列的技术、RFLP和DNA印迹分析等。
II.试剂盒
本公开内容的另一方面包括用于制备具有减少的非特异性扩增假产物的多个扩增产物的试剂盒。通常，每个试剂盒包含(a) 一对或多对扩增引物，每个扩增引物包含在其3'区域中的至少3个核酸酶-抗性基团，(b) 5'至3'外切核酸酶，和(c) 3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶。合适的扩增引物详述于上文章节(I)(a)(i)，合适的5'至3'外切核酸酶描述于上文章节(I)(b)(i)，和合适的3'至5'单链-特异性外切核酸酶和校对聚合酶描述于上文章节(I)(b)(ii)。
试剂盒可进一步包含一个或多个衔接头和/或连接酶，如上文章节(I)(c)所详述的。试剂盒可进一步包含一种或多种对各种酶合适的缓冲液，或其组合。
本文提供的试剂盒通常包括进行上文详述的方法的说明书。试剂盒中包括的说明书可粘贴于包装材料，或可作为包装插页包括在内。尽管说明书通常是书写或打印材料，但它们不限于此。本公开内容考虑能够贮存这样的说明书和将它们传送给终端用户的任何介质。这样的介质包括但不限于，电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文使用的，术语"说明书"可包括提供说明书的互联网网站地址。
因为在上述方法和试剂盒中可进行各种变化而不脱离本发明的范围，意图是上文描述和下文给出的实施例中包含的所有内容应解释为说明性而非限制性的意义。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域的技术人员通常理解的含义。以下参考资料给技术人员提供本发明使用的许多术语的一般性定义：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed.1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag(1991);和Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文使用的，以下术语具有归于它们的含义，除非另外指明。
当介绍本公开内容或其优选方面的要素时，冠词"一个"、"一种"、"该"和"所述"意指存在一个或多个要素。术语"包含"、"包括"和"具有"意图是包括性的，意指可存在除了所列的要素之外的另外的要素。
简并核苷酸可具有2-倍简并性(即，其可以是两种核苷酸之一)、3-倍简并性(即，其可以是三种核苷酸之一)或4-倍简并性(即，其可以是四种核苷酸之一，A或C或G或T)。具有3-倍简并性的核苷酸包括"B" (可以是C或G或T)，"D" (可以是A或G或T)，"H" (可以是A或C或T)，和"V" (可以是A或C或G)。具有2-倍简并性的核苷酸包括"K" (可以是G或T)，"M"(可以是A或C)，"R" (可以是A或G)，"Y" (可以是C或T)，"S" (可以是C或G)和"W" (可以是A或T)。
如本文使用的，术语"互补"或"互补性"是指通过经由特异性氢键的碱基配对的双链核酸的缔合。碱基配对可以是标准的Watson-Crick碱基配对(例如，5’-A G T C-3’与互补序列3’-T C A G-5’配对)。碱基配对还可以是Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。互补性通常对于双链体区域测量，因此排除了例如，突出端。如果仅一些碱基对是互补的话，双链体区域的两条链之间的互补性可以是部分的，并表示为百分比(例如，70%)。不互补的碱基是“错配的”。如果双链体区域的所有碱基对是互补的话，互补性还可以是完全的(即100%)。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，呈线性或环状构象，和呈单链或双链形式。为本公开内容的目的，这些术语不应解释为对聚合物的长度进行限制。该术语可包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸酯骨架)中修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。
术语"核苷酸"是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可以是标准的核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如，肌苷)或非-天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧基甲基、羟基、甲基、磷酰基和巯基，以及碱基的碳和氮原子置换为其它原子(例如，7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉基类似物。
用于测定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，这样的技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由此编码的氨基酸序列，和比较这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列。基因组序列也可以此方式测定和比较。通常，同一性分别是指两个多核苷酸或多肽序列的准确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸一致性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定它们的百分比同一性进行比较。两个序列(无论是核酸还是氨基酸序列)的百分比同一性是两个比对的序列之间准确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。通过Smith和Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法，提供核酸序列的近似比对。通过使用由Dayhoff, Atlas ofProtein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358,National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA开发和由Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)标准化的评分矩阵，该算法可应用于氨基酸序列。该算法测定序列的百分比同一性的实例性实施由Genetics ComputerGroup (Madison, Wis.)在"BestFit"实用型应用中提供。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的其它合适的程序通常是本领域已知的，例如，另一个比对程序是BLAST，以默认参数使用。例如，BLASTN和BLASTP可使用以下默认参数应用：遗传密码=标准；滤器=无；链=两条；截止=60；期望值=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；通过HIGH SCORE分类；数据库=无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于GenBank网站。
实施例
以下实施例说明了本发明的某些方面。
实施例1：用修饰的引物扩增的PCR片段的扩增和消化
玉米基因组DNA用修饰或未修饰的引物，使用JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich)经PCR扩增。修饰的引物各自在3’末端包含4-6个硫代磷酸酯键。正向引物是5’-CCACGGTGCCAAGTCCGTTTGA-3’ (SEQ ID NO:1)和反向引物是5’-AGGCGACGACATGGGTCAGTCA-3’ (SEQ ID NO:2)。各反应混合物包含200 nM的各引物。PCR扩增以95℃/2分钟的初始变性；34个循环的94℃/30秒、60℃/30秒和72℃/30秒；和72℃/5分钟进行。PCR产物然后在22℃用各自5个单位的T7外切核酸酶和Klenow片段消化30分钟。消化的PCR产物在Bioanalyzer (Agilent)上大小分级和定量。结果证实在3’末端用硫代磷酸酯键的引物修饰保护产生的PCR片段免于T7外切核酸酶和Klenow片段降解(参见图2)。
实施例2：用修饰的引物扩增的PCR片段的引物二聚体的除去
玉米基因组DNA用正向引物5’- CCACGGTGCCAAGTCCGTTTGA-3’ (SEQ ID NO:1)和反向引物5’-AGGCGACGACATGGGTCAGTCA-3’ (SEQ ID NO:2)，使用JumpStart Taq ReadyMix，经PCR扩增。引物各自在3’末端用6个硫代磷酸酯键修饰。用一对人工引物产生人工引物二聚体，每个引物也在3’末端含有6个硫代磷酸酯键。各反应混合物包含200 nM的各引物。PCR扩增以95℃/2分钟的初始变性；34个循环的94℃/30秒、60℃/30秒和72℃/30秒；和72℃/5分钟进行。将PCR产物和引物二聚体合并，并用各自5个单位、各自2.5个单位或各自1个单位的T7外切核酸酶和Klenow片段在22℃消化30分钟，和在10%聚丙烯酰胺凝胶上解析。结果证实当用硫代磷酸酯键修饰的引物进行PCR扩增时，引物二聚体(而非靶DNA PCR片段)被T7外切核酸酶和Klenow片段的组合选择性降解(参见图3)。
实施例3：连接NGS衔接头至用修饰的引物扩增的消化的PCR片段
玉米基因组DNA用正向引物5’- CCACGGTGCCAAGTCCGTTTGA-3’ (SEQ ID NO:1)和反向引物5’-AGGCGACGACATGGGTCAGTCA-3’ (SEQ ID NO:2)，使用JumpStart Taq ReadyMix经PCR扩增。引物各自在3’末端用6个硫代磷酸酯键修饰。各反应混合物包含200 nM的各引物。PCR扩增以95℃/2分钟的初始变性；34个循环的94℃/30秒、60℃/30秒和72℃/30秒；和72℃/5分钟进行。PCR产物然后用各自3个单位的T7外切核酸酶和Klenow片段在22℃消化30分钟，接着在80℃消化15分钟以灭活酶。消化的PCR产物与Ion Torrent P1和A衔接头在22 ℃连接30或60分钟，接着72℃ 10分钟。各反应混合物包含1 µM的衔接头、5% PEG 6000和80个单位的T4 DNA连接酶/30 µL反应。连接产物用PCR纯化试剂盒纯化，和在30 µL的水中洗脱。连接的靶DNA PCR片段通过TaqMan实时PCR，使用基因-特异性TaqMan探针和P1和A衔接头特异性的引物定量。对于30分钟和60分钟的连接反应，连接的靶DNA PCR片段的浓度分别为约0.6 nM和1.2 nM。结果证实在3’末端含有硫代磷酸酯键的PCR产物可用T7外切核酸酶和Klenow片段消化，然后与NGS衔接头连接(参见图4)。
实施例4：连接NGS衔接头至人PCR片段
人基因组DNA用384对引物的库，使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPABiosciences)经PCR扩增。引物是来自由NIH人胰腺癌测序计划设计和公布的大引物集合的子集。各引物用5个硫代磷酸酯键在引物的3’末端修饰。各384-路PCR扩增反应包含10 nM的各引物。PCR扩增以95℃/2分钟的初始变性；30个循环的98℃/20秒、59℃/2分钟和72℃ /30秒；和72℃/5分钟进行。PCR产物用3个单位的T7外切核酸酶和5个单位的Klenow片段在22℃消化30分钟，接着在75℃热灭活20分钟。消化的PCR产物与Ion Torrent P1和A衔接头在22℃连接30分钟，接着72℃ 10分钟。各连接反应包含1 µM的衔接头、6% PEG 6000和80个单位的T4 DNA连接酶/30 µL反应。连接产物用Agencourt AMPure XP系统(Beckman Coulter,Inc.)纯化和在30 µL的水中洗脱。纯化的产物通过TaqMan实时PCR，使用P1衔接头-特异性的TaqMan探针和P1和A衔接头特异性的引物定量。如图5所示，用在3’末端含有硫代磷酸酯键的引物扩增的高度多路的人DNA PCR片段可用T7外切核酸酶和Klenow片段消化，随后与NGS衔接头连接。
实施例5：包含消化的和未消化的3,072-路PCR产物的衔接头连接的文库的比较
一组3,072个引物对经设计以扩增长度范围为120-300个核苷酸的玉米(Zea mays)基因组区域。各引物用6个硫代磷酸酯键在3'末端修饰。玉米基因组DNA用该3,072对引物的库经PCR扩增。靶区域的PCR扩增在10 µL中进行，其含有0.75个单位的JumpStart™ AccuTaq™ LA聚合酶(Sigma-Aldrich)、各自300 μM的dNTP、5 ng玉米基因组DNA、5 mM MgCl2、1.5%/v DMSO、50 mM Tris-HCl、15 mM硫酸铵(pH 9.3)、0.1% Tween-20和3,072-路引物库，各引物为7.5 nM。PCR扩增以96℃/2分钟的初始变性；34个循环的94℃/20秒、59℃/2分钟30秒和68℃/30秒；和最后延伸68℃/5分钟进行。无模板对照(即，无基因组DNA)反应在相同的条件下运行。
PCR后，样品(i)用核酸酶的组合消化并dA加尾，或(ii)磷酸化和dA加尾。核酸酶消化在12.5 μL反应中进行，其含有10 μL的PCR产物、1.5个单位的T7外切核酸酶(NewEngland BioLabs Inc.)、1.5个单位的DNA聚合酶I大Klenow片段(New England BioLabsInc.)、1.44 mM DTT和16 mM MgCl2。消化反应在25℃孵育30分钟。消化反应后立即加入1.25 U/μL JumpStart™ Taq DNA聚合酶(Sigma-Aldrich)和5 mM dATP的0.5 μL混合物并混合。然后将反应在72℃孵育20分钟。该步骤同时将3' dA突出端添加至扩增子，和热灭活T7外切核酸酶和Klenow聚合酶。对于比较，未消化的样品在13 μL反应中经磷酸化和dA加尾，该反应由10 μL的PCR产物, 0.625个单位的JumpStart™ Taq DNA聚合酶(Sigma-Aldrich), 5个单位的T4多核苷酸激酶(New England BioLabs Inc.), 192 μM另外的dATP, 5 mM DTT, 10 mM MgCl2组成。磷酸化和dA加尾反应在37℃孵育30分钟，接着在72℃20分钟以热灭活酶。
消化的和未消化的样品各自与Illumina测序衔接头在50 μL反应中连接，以产生测序文库。各连接反应包含800个单位的T4 DNA连接酶(New England BioLabs Inc.), 700nM Illumina相容的P5和P7衔接头-双链体, 12%/v PEG 6000, 50 mM Tris pH 7.4, 10mM MgCl2, 10 mM DTT和1 mM ATP。50 μL连接反应在20℃孵育30分钟。在使用1 μL的1:100稀释的各文库, 5 μL的2x JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma-Aldrich)和200 nM P5和P7衔接头特异性PCR引物的10 μL反应的PCR扩增后，测序文库通过电泳在10%聚丙烯酰胺凝胶上分析。也运行无模板对照样品。热循环条件是95℃/2分钟的初始变性；18个循环的95℃/15秒、59℃/20秒和72℃/20秒，最后延伸72℃/5分钟。
结果显示在图6中。泳道C和D分别包含测序衔接头引物-扩增的未消化的文库和消化的文库样品。泳道H和I分别包含对于测序衔接头引物-扩增的未消化的文库和消化的文库样品的无模板对照样品。在这些泳道的每个中，存在正好高于100 bp标记条带的条带，其与测序衔接头-衔接头连接扩增产物一致。在未消化的泳道C和H中在该条带上方大约150bp处是与衔接头-引物二聚体连接扩增产物一致的条带。这些条带不存在于消化的泳道D和I。这些结果证实，3,072-路PCR产物用T7外切核酸酶和Klenow片段消化通过减少文库中的引物-二聚体连接产物，改进测序文库质量。

Claims (31)

1.用于制备具有减少的非特异性扩增假产物的多个扩增的核酸产物的方法，所述方法包括：
a) 在扩增条件下使一种或多种核酸与至少一对扩增引物接触，以形成多个扩增产物，每个扩增引物包含在其3'区域中的至少三个核酸酶-抗性基团；
b) 使所述多个扩增产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物，其中与用缺少核酸酶-抗性基团的引物进行的标准核酸扩增反应相比，所述多个消化的扩增产物具有减少水平的非特异性扩增假产物。
2.权利要求1的方法，其中所述多个消化的扩增产物各自具有在其5'末端的磷酸基团。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多个消化的扩增产物各自是平端的，或所述多个消化的扩增产物各自具有3'突出端。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中核酸酶-抗性基团选自硫代磷酸酯键、2' O-甲基基团、2'氟代基团或其组合。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中5'至3'外切核酸酶选自T7外切核酸酶、T5外切核酸酶、λ外切核酸酶、RecJf或其组合。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中3'至5'单链-特异性外切核酸酶选自外切核酸酶I、外切核酸酶T或其组合。
7. 权利要求1-5中任一项的方法，其中校对聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或其组合。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中非特异性扩增假产物是引物二聚体产物。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中与标准的核酸扩增反应相比，非特异性扩增假产物被减少至少约50%、至少约75%或至少约90%。
10.权利要求1-9中任一项的方法，进一步包括连接一个或多个衔接头至所述多个消化的扩增产物，以形成多个衔接头-连接的扩增产物。
11.权利要求10的方法，其中所述连接在没有纯化所述多个消化的扩增产物的情况下进行，或所述连接在纯化所述多个消化的扩增产物后进行。
12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中步骤(a)中使用的一种或多种核酸是基因组DNA或互补DNA (cDNA)。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中每个扩增引物的3'区域包含至少5个核酸酶-抗性基团。
14.权利要求13的方法，其中所述核酸酶-抗性基团是硫代磷酸酯键。
15.用于制备测序文库的方法，所述方法包括：
a) 在扩增条件下使多种核酸与多个扩增引物对接触，以形成多个扩增产物，每个扩增引物包含在其3'区域中的至少三个核酸酶-抗性基团；
b) 使所述多个扩增产物与5'至3'外切核酸酶和3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶接触，以形成多个消化的扩增产物；和
c) 连接一个或多个衔接头至所述多个消化的扩增产物，以形成测序文库。
16.权利要求15的方法，其中所述多个消化的扩增产物各自具有在其5'末端的磷酸基团。
17.权利要求15或16的方法，其中所述多个消化的扩增产物各自是平端的，或所述多个消化的扩增产物各自具有3'突出端。
18. 权利要求15-17中任一项的方法，其中核酸酶-抗性基团选自硫代磷酸酯键、2' O-甲基基团、2'氟代基团或其组合。
19.权利要求15-18中任一项的方法，其中5'至3'外切核酸酶选自T7外切核酸酶、T5外切核酸酶、λ外切核酸酶、RecJf或其组合。
20.权利要求15-19中任一项的方法，其中3'至5'单链-特异性外切核酸酶选自外切核酸酶I、外切核酸酶T或其组合。
21. 权利要求15-19中任一项的方法，其中校对聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或其组合。
22.权利要求15-21中任一项的方法，其中步骤(c)在没有纯化所述多个消化的扩增产物的情况下进行，或步骤(c)在纯化所述多个消化的扩增产物后进行。
23. 权利要求15-22中任一项的方法，其中步骤(a)中使用的所述多种核酸是基因组DNA或互补DNA (cDNA)。
24.权利要求15-23中任一项的方法，其中每个扩增引物的3'区域包含至少5个核酸酶-抗性基团。
25.权利要求24的方法，其中核酸酶-抗性基团是硫代磷酸酯键。
26.用于制备缺少非特异性扩增假产物的多个扩增产物的试剂盒，所述试剂盒包含：
a) 一对或多对扩增引物，每个扩增引物包含在其3'区域的至少3个核酸酶-抗性基团；
b) 5'至3'外切核酸酶；和
c) 3'至5'单链-特异性外切核酸酶或校对聚合酶。
27. 权利要求26的试剂盒，其中核酸酶-抗性基团选自硫代磷酸酯键、2' O-甲基基团、2'氟代基团或其组合。
28.权利要求26或27的试剂盒，其中5'至3'外切核酸酶选自T7外切核酸酶、T5外切核酸酶、λ外切核酸酶、RecJf或其组合。
29.权利要求26-28中任一项的试剂盒，其中3'至5'单链-特异性外切核酸酶选自外切核酸酶I、外切核酸酶T或其组合。
30. 权利要求26-29中任一项的试剂盒，其中校对聚合酶选自T4 DNA聚合酶、KlenowDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或其组合。
31.权利要求26-30中任一项的试剂盒，其进一步包含一个或多个衔接头和DNA连接酶。
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