JP2018506989A - 核酸増幅およびライブラリー調製 - Google Patents
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Abstract
Description
I.複数の増幅生成物を調製するための方法
この方法の最初の工程は、核酸を増幅するための増幅条件下での、興味の対象である一以上の核酸と少なくとも一組の増幅プライマー対との接触を含む。各増幅プライマーは3’領域に少なくとも3つのヌクレアーゼ耐性の修飾基含むオリゴヌクレオチドである。
各増幅プライマーはその3’領域に少なくとも3つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。多様なヌクレアーゼ耐性の修飾基が、本明細書で開示された増幅プライマーに含まれ得る。適切なヌクレアーゼ耐性の修飾基は、ホスホロチオエート結合、ジチオリン酸結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、アミド結合、2’O−メチル基、2’フルオロ基、プロピン塩基(propyne bases)、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基はホスホロチオエート結合であり得る。別の実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基はホスホロチオエート結合と2’O−メチル基または2’フルオロ基の組み合わせであり得る。当業者には他の併用が可能であることがわかる。
本明細書に開示された方法によって増幅される一以上の核酸は、様々な種類であってよい。いくつかの実施態様において、標的核酸はゲノムDNAであり得る。ゲノムDNAは、細胞核、ミトコンドリア、または色素体のゲノムDNAであり得る。他の実施態様において、標的核酸は、メッセンジャーRNA(mRNA)またはノンコーディングRNA(例えば、マイクロRNA(miRNA)、長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)、遺伝子間長鎖ノンコーディングRNA(lincRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、Piwi結合RNA(Piwi-interacting RNA)(piRNA)、トランス作用性RNA(rasiRNA)、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)、ミトコンドリアtRNA(MT−tRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、スプライスリーダーRNA(SL RNA)、および/またはテロメラーゼRNAコンポーネント)から転写された相補的DNA(cDNA)であり得る。特徴的な実施態様において、核酸はゲノムDNAまたはcDNAである。当業者はゲノムDNAの単離およびcDNAの調製の方法(例えば、標準プロトコル、市販のキット、など)に精通している。
本方法の最初の工程は、複数の増幅生成物の形成のための増幅条件下での、一以上の核酸と少なくとも一組以上の増幅プライマー対との接触を含む。一般的に増幅条件は、適切な緩衝液の存在下での、DNAポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド(例えば、dNTP)との接触を含む。一般的に、増幅に用いられるDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性および3’−5’校正エキソヌクレアーゼ(proofreading exonuclease)活性を持っており、さらに5’−3’エキソヌクレアーゼ活性および/またはターミナルトランスフェラーゼ活性を含んでもよい。DNAポリメラーゼは好熱性(例えば、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Deep Vent DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、それらの変異体、またはそれらの組み合わせ)であってもよい。あるいは、DNAポリメラーゼは中温性(例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、phi29 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、それらの変異体、またはそれらの組み合わせ)であってもよい。
本方法はさらに、複数の消化された増幅生成物の形成のための、最初の工程で形成する複数の増幅生成物と、5’−3’エキソヌクレアーゼおよび、3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかとの接触を含む。増幅生成物と5’−3’エキソヌクレアーゼとの接触は、一以上のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドに出くわすまで、増幅生成物の5’末端からヌクレアーゼ感応性ヌクレオチドを除去する;ここで各5’末端はリン酸基を持つ(図1A参照)。3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼとの接触は、結果として得られる3’オーバーハングを除去し、また校正ポリメラーゼとの接触は、結果として得られる3’オーバーハングを除去し、および/または3’末端にアデニンオーバーハングを付加する。最終的には、複数の消化された増幅生成物は平滑末端または3’オーバーハングとなる。しかしながら、増幅反応中に生じたプライマーダイマーまたはプライマーダイマー生成物が、5’−3’エキソヌクレアーゼおよび、3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼと接触すると、短いオリゴヌクレオチドが生じる(図1B参照)。結果として得られる短いオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む増幅プライマーの3’領域を含む。従って消化の工程では、下流の反応の準備のための消化された増幅生成物を生じるが、より重要なことは、続く反応からプライマーダイマー生成物が減少または除去されることである。
エキソヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合を加水分解し、核酸鎖のいずれかの末端からヌクレオチドを一つずつ除去する酵素である。5’−3’活性を持つエキソヌクレアーゼは5’末端からヌクレオチドを除去する。5’−3’エキソヌクレアーゼは一本鎖および/または二本鎖鋳型DNAを認識し、切断できる。適切な5’−3’エキソヌクレアーゼの限定されない例は、T7(gene 6)エキソヌクレアーゼ、T5エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、RecJf、またはそれらの併用を含む。特徴的な実施態様において、5’−3’エキソヌクレアーゼはT7エキソヌクレアーゼである。
3’−5’活性を持つ、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ(ssExo)は、一本鎖核酸の3’末端からヌクレオチドを除去する。適切な3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼの例は、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、エキソヌクレアーゼIは、大腸菌、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、またはサーモコッカス・サーモフィルス(Thermococcus thermophilus)(Tth)由来であってもよい。
反応の温度は、一般的に、消化の工程で用いる酵素の性質に依存して、変える。いくつかの実施態様において、消化は単一の温度で進行し得る。例えば、消化は、約10℃から約40℃、約20℃から約30℃、またはおおよその室温で進行してもよい。他の実施態様において、消化は二つの異なる温度で進行し得る、すなわち、1番目の温度の後に2番目の温度。例えば、1番目の温度は約10℃から約40℃、約20℃から約30℃、またはおおよその室温の範囲でよく、2番目の温度の工程では約40℃から約85℃、または約50℃から75℃の範囲でよい。消化の工程の持続時間は約5分から約180分の範囲となり得る。様々な実施態様において、反応は、約5分から約20分、約20分から約40分、約40分から約90分、または約90分から約180分、の時間で進行し得る。
いくつかの実施態様において、アダプターが連結した複数の増幅生成物を形成するために、複数の消化された増幅生成物を一以上のアダプターと連結してもよい。アダプターはシーケンシングアダプター(sequencing adaptor)でもよい。いくつかの実施態様において、アダプターはNGSの適用に適していてもよい。例えば、アダプターは、リニアアダプター(linear adaptor)(例えば、Illumina/Solexaアダプター、TruSeqアダプター、SOLiDアダプター、TAアダプター、NEBNextアダプター、454アダプター、バーコードアダプターなど)、 サーキュラーアダプター(circular adaptor)、またはバブルアダプター(bubble adaptor)などでもよい。いくつかの実施態様において、アダプターは一般的に平滑末端であり非リン酸化であり得る。他の実施態様において、アダプターは3’のTオーバーハングおよび5’のリン酸基を含み得る。
いくつかの実施態様において、アダプターが連結した複数の増幅生成物を、次世代シーケンシング(NGS)プラットフォームを用いて、配列決定できる。NGSプラットフォームの限定されない例には、イオントレントシーケンシング、SOLiDシーケンシング、イルミナシーケンシング、ゲノムアナライザーシーケンシング(genome analyzer sequencing)、454シーケンシング、方向性ディープシーケンシング(directional deep sequencing)、ナノボールシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、などを含む。NGS技術は、臨床診断、がん診断、分子診断検査、がん治療、薬剤開発、マイクロバイオームテクノロジー、食品および農業技術、ならびに基礎研究を含む。
本開示の別の態様は、非特異的な増幅副生成物の減少を伴う、複数の増幅生成物を調製するためのキットを包含する。一般的に、各キットは(a)一以上の増幅プライマー対、ここで各増幅プライマーはその3’領域に少なくとも3つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、(b)5’−3’エキソヌクレアーゼ、および(c)3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼ、を含む。適切な増幅プライマーは先の(I)(a)(i)節に詳述され、適切な5’−3’エキソヌクレアーゼは先の(I)(b)(i)節に説明され、適切な3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼおよび校正ポリメラーゼは先の(I)(b)(ii)節に説明されている。
他の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の当業者が通常理解する意味を持つ。下記の参考文献は、本発明で用いる多くの用語の一般的な定義を当業者に示す:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、下記の用語は、他に指示がない限り、下記に帰属した意味を持つ。
トウモロコシのゲノムDNAは、JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich)を用いて、非修飾の、または修飾したプライマーで、PCR増幅した。修飾したプライマーはそれぞれ、3’末端に4〜6個のホスホロチオエート結合を含んでいた。順方向プライマーは5‘−CCACGGTGCCAAGTCCGTTTGA−3’ (SEQ ID NO:1)であり、逆方向プライマーは5‘−AGGCGACGACATGGGTCAGTCA−3’ (SEQ ID NO:2)であった。各反応混合物は200nMの各プライマーを含んでいた。PCR増幅は、最初の変性を95℃/2分;94℃/30秒、60℃/30秒、および72℃/30秒を34サイクル;および72℃/5分、で行った。その後PCR生成物を、各5ユニットのT7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で、22℃、30分間消化した。消化されたPCR生成物をサイズ分画し、バイオアナライザ(Agilent)で定量化した。3’末端におけるホスホロチオエート結合でのプライマーの修飾は、結果として得られるPCR断片をT7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片の分解から保護したことを、この結果は示す(図2参照)。
トウモロコシのゲノムDNAを、JumpStart Taq ReadyMixを用いて、順方向プライマー5‘−CCACGGTGCCAAGTCCGTTTGA−3’ (SEQ ID NO:1)および逆方向プライマー5‘−AGGCGACGACATGGGTCAGTCA−3’ (SEQ ID NO:2)で、PCR増幅した。プライマーはそれぞれ3’末端を6個のホスホロチオエート結合で修飾した。人為的なプライマーダイマーは人為的なプライマーの対によって生じ、それぞれはまた3’末端に6個のホスホロチオエート結合を含んでいた。各反応混合物は200nMの各プライマーを含んでいた。PCR増幅は、最初の変性を95℃/2分;94℃/30秒、60℃/30秒、および72℃/30秒を34サイクル;および72℃/5分、で行った。PCR生成物およびプライマーダイマーは、各5ユニット、各2.5ユニット、または各1ユニットのT7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片と、22℃、30分間結合しおよび消化され、10%ポリアクリルアミドゲル上に分散された。ホスホロチオエート結合で修飾したプライマーを用いてPCR増幅を行うと、プライマーダイマー(しかし標的DNAのPCR断片でない)がT7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片の併用によって、選択的に分解されたことを、この結果は示す(図3参照)。
トウモロコシのゲノムDNAを、JumpStart Taq ReadyMixを用いて、順方向プライマー5‘−CCACGGTGCCAAGTCCGTTTGA−3’ (SEQ ID NO:1)および逆方向プライマー5‘−AGGCGACGACATGGGTCAGTCA−3’ (SEQ ID NO:2)で、PCR増幅した。プライマーはそれぞれ3’末端を6個のホスホロチオエート結合で修飾した。各反応混合物は200nMの各プライマーを含んでいた。PCR増幅は、最初の変性を95℃/2分;94℃/30秒、60℃/30秒、および72℃/30秒を34サイクル;および72℃/5分、で行った。その後、PCR生成物を、各3ユニットのT7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で、22℃、30分間消化し、次に酵素を不活化するため、80℃で15分間とした。消化されたPCR生成物を、22℃で30または60分間、続いて72℃で10分間で、イオントレントP1およびAアダプターと連結した。30μLの反応物において、各反応混合物は、1μMのアダプター、5%PEG6000、および80ユニットのT4 DNAリガーゼを含んでいた。連結生成物をPCR精製キットで精製し、30μLの水に溶出した。連結した標的DNAのPCR断片を、遺伝子特異的TaqManプローブならびにP1およびAアダプターに特異的なプライマーを用いて、TaqManリアルタイムPCRで定量化した。連結した標的DNAのPCR断片の濃度は、30分および60分の連結反応において、それぞれ約0.6nMおよび1.2nMであった。3’末端にホスホロチオエート結合を含むPCR生成物を、T7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で消化し、続いてNGSアダプターと連結できることを、この結果は示す(図4参照)。
ヒトゲノムDNAを、KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosciences)を用いて、384組のプライマー対のプールで、PCR増幅した。プライマーはNIHヒト膵臓がんシーケンシングプロジェクト(NIH human pancreatic cancer sequencing project)によって設計され、発表された多量なプライマーセットのサブセットであった。各プライマーは、プライマーの3’末端を5個のホスホロチオエート結合で修飾した。各384プレックスのPCR増幅反応物は10nMの各プライマーを含んでいた。PCR増幅は、最初の変性を95℃/2分;98℃/20秒、59℃/2分、および72℃/30秒を30サイクル;および72℃/5分、で行った。PCR生成物を、3ユニットのT7エキソヌクレアーゼおよび5ユニットのクレノウ断片で、22℃、30分間で消化し、次に75℃、20分間で熱失活した。消化されたPCR生成物を、22℃で30分間、続いて72℃で10分間で、イオントレントP1およびAアダプターと連結した。30μLの反応物において、各連結反応物は、1μMのアダプター、6%PEG6000、および80ユニットのT4 DNAリガーゼを含んでいた。連結生成物をAgencourt AMPure XP system (Beckman Coulter, Inc.)で精製し、30μLの水に溶出した。精製した生成物を、P1アダプター特異的TaqManプローブならびにP1およびAアダプターに特異的なプライマーを用いて、TaqManリアルタイムPCRで定量化した。図5に示すように、3’末端にホスホロチオエート結合を含むプライマーで増幅した、高度に多重化されたヒトDNAのPCR断片を、T7エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で消化し、続いてNGSアダプターと連結できた。
3,072組のプライマー対のセットは、120から300ヌクレオチドの長さの範囲となるトウモロコシのゲノム領域を増幅するために設計された。各プライマーの3’末端を6個のホスホロチオエート結合で修飾した。トウモロコシのゲノムDNAを、この3,072組のプライマー対のプールで、PCR増幅した。標的領域のPCR増幅は、0.75ユニットのJumpStart(商標) AccuTaq(商標) LA Polymerase (Sigma-Aldrich)、300μMの各dNTP、5ngのトウモロコシのゲノムDNA、5mM MgCl2、1.5%/v DMSO、50mMトリス塩酸、15mM硫酸アンモニウム(pH9.3)、0.1%ツイーン20(Tween-20)、および各プライマーが7.5nMである、3,072プレックスのプライマープールを含む10μL中で行った。PCR増幅は、最初の変性を96℃/2分;94℃/20秒、59℃/2分30秒、および68℃/30秒を34サイクル;および最後の伸長を68℃/5分、で行った。鋳型なしの対照(すなわちゲノムDNAなし)の反応を、同一条件下で実行した。
Claims (31)
- 減少した非特異的な増幅副生成物を伴う、複数の増幅された核酸生成物を調製するための方法であって、以下を含む方法:
a)複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下において、一以上の核酸と少なくとも一組の増幅プライマー対とを接触させる、ここで各増幅プライマーはその3’領域に少なくとも3つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む;
b)複数の増幅生成物と、5’−3’エキソヌクレアーゼおよび、3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかを接触させて、複数の消化された増幅生成物を形成する、ここで複数の消化された増幅生成物は、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を持っていないプライマーを用いて行う標準的な核酸増幅反応と比較して、非特異的な増幅副生成物のレベルが減少している。 - 複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、その5’末端にリン酸基を有する、請求項1記載の方法。
- 複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、平滑末端である、または複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、3’オーバーハングを持つ、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- ヌクレアーゼ耐性の修飾基が、ホスホロチオエート結合、2’O−メチル基、2’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項1から3までのいずれかに記載の方法。
- 5’−3’エキソヌクレアーゼが、T7エキソヌクレアーゼ、T5エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、RecJf、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項1から4までのいずれかに記載の方法。
- 3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項1から5までのいずれかに記載の方法。
- 校正ポリメラーゼが、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウDNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項1から5までのいずれかに記載の方法。
- 非特異的な増幅副生成物がプライマーダイマー生成物である、請求項1から7までのいずれかに記載の方法。
- 非特異的な増幅副生成物が、標準的な核酸増幅反応と比較して、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約90%減少する、請求項1から8までのいずれかに記載の方法。
- アダプターが連結した複数の増幅生成物を形成するために、一以上のアダプターと複数の消化された増幅生成物との連結をさらに含む、請求項1から9までのいずれかに記載の方法。
- 複数の消化された増幅生成物の精製なしに連結が進行する、または複数の消化された増幅生成物の精製後に連結が進行する、請求項10記載の方法。
- (a)の工程で用いられる一以上の核酸がゲノムDNAまたは相補的DNA(cDNA)である、請求項1から11までのいずれかに記載の方法。
- 各増幅プライマーの3’領域に少なくとも5つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、請求項1から12までのいずれかに記載の方法。
- ヌクレアーゼ耐性の修飾基がホスホロチオエート結合である、請求項13記載の方法。
- シーケンシングライブラリーを調製するための方法であって、以下を含む方法:
a)複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下において、複数の核酸と複数の増幅プライマー対とを接触させる、ここで各増幅プライマーはその3’領域に少なくとも3つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む;
b)複数の増幅生成物と、5’−3’エキソヌクレアーゼおよび、3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかを接触させて、複数の消化された増幅生成物を形成する;
c)一以上のアダプターと複数の消化された増幅生成物とを連結して、シーケンシングライブラリーを形成する。 - 複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、その5’末端にリン酸基を有する、請求項15記載の方法。
- 複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、平滑末端である、または複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、3’オーバーハングを持つ、請求項15または16のいずれかに記載の方法。
- ヌクレアーゼ耐性の修飾基が、ホスホロチオエート結合、2’O−メチル基、2’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項15から17までのいずれかに記載の方法。
- 5’−3’エキソヌクレアーゼが、T7エキソヌクレアーゼ、T5エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、RecJf、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項15から18までのいずれかに記載の方法。
- 3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項15から19までのいずれかに記載の方法。
- 校正ポリメラーゼが、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウDNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項15から19までのいずれかに記載の方法。
- 複数の消化された増幅生成物の精製なしに(c)の工程が進行する、または複数の消化された増幅生成物の精製後に(c)の工程が進行する、請求項15から21までのいずれかに記載の方法。
- (a)の工程で用いられる複数の核酸が、ゲノムDNAまたは相補的DNA(cDNA)である、請求項15から22までのいずれかに記載の方法。
- 各増幅プライマーの3’領域に少なくとも5つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、請求項15から23までのいずれかに記載の方法。
- ヌクレアーゼ耐性の修飾基がホスホロチオエート結合である、請求項24記載の方法。
- 非特異的な増幅副生成物を有さない複数の増幅生成物を調製するためのキットであって、以下を含むキット:
a)一以上の増幅プライマー対、ここで各増幅プライマーはその3’領域に少なくとも3つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む;
b)5’−3’エキソヌクレアーゼ;
c)3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれか。 - ヌクレアーゼ耐性の修飾基が、ホスホロチオエート結合、2’O−メチル基、2’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項26記載のキット。
- 5’−3’エキソヌクレアーゼが、T7エキソヌクレアーゼ、T5エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、RecJf、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項26または27のいずれかに記載のキット。
- 3’−5’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項26から28までのいずれかに記載のキット。
- 校正ポリメラーゼが、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウDNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項26から29までのいずれかに記載のキット。
- 一以上のアダプターおよびDNAリガーゼをさらに含む、請求項26から30までのいずれかに記載のキット。
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