JPS63270000A - ラテックス固定化プローブを用いた迅速ハイブリッド形成試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ豆二遣１ 本発明は、特定のポリヌクレオチド配列を測定するため
の核酸ハイブリッド形成試験方法及び試薬系に関する。

特に、本発明は、比較的短時間で行なうことができる、
例えば、ハイブリッド形成の開始から生成される信号の
測定及び引き続く簡便な手法までが３０分以内で行なう
ことができるハイブリッド形成試験に関する。

核酸ハイブリッド形成試験は、対象となるポリヌクレオ
チド配列と、相補的プローブポリヌクレオチド試薬との
間の非常に特異的な塩基対に基づくものである。かかる
試験は、とりわけ、人間及び動物用の医薬、１学及び食
品科学の分野における分析方法として有用である。特に
、該方法を、バクテリア及びビールスのような病因性物
質を検出及び同定し、抗生耐性のための微生物をスクリ
ーニングし、また、悪性細胞を検出するための用いるこ
とができる。

核酸ハイブリッド形成が商業的に興味深い試験に関して
潜在的に非常に有用な基礎を与えると認識されてから多
くの年月が経過した。その間、複雑性を減少させる方向
に向かって多くの発展及び改良がなされ、該分野におい
て用いられてきた通常の方法の性質を研究するために主
として基礎研究において時間が費やされた。これらの極
めて献身的な努力にもかかわらず、現在において公知の
最良の方法は望ましくないことに煩雑なままであり、完
了までに長時間を必要としている。大きな商業的利用価
値を得るためには、試験の全所要時間を約３０分以内に
短縮させなければならないと一般的に考えられている。

今日において公知である主なハイブリッド形成方法は、
試料又はプローブポリヌクレオチドの固足止、又は両ス
トランドのハイブリッド形成のいずれかに基づくもので
あり、溶液中で引き続き、ハイブリッド化プローブとハ
イブリッド化されていないプローブとを分離するいくつ
かの選択的な方法が行なわれる。試料核酸の固定化は多
くの欠点、特に、煩雑で時間のかかる工程を含むという
重大な問題、及び、通常、完全に均質ではない試料から
の障害物質の非特異的吸収を制御することの困難さによ
って阻害される。固定化プローブを用いることができる
試験形態の導入によってこれら特定の問題はおおむね解
決されたが、本発明以前には、試験を数時間以内で行な
うことはできなかった。

ハイブリッド形成のための核酸の固定化に通常最も用い
られている固体状支持体は、ニトロセルロース又はナイ
ロンからなる微孔質な膜である。

ハイブリッド形成は典型的には、相補的核酸配列を含有
するハイブリッド形成液中に浸漬された膜を用いて行な
われる。微孔性膜は高い表面積を有するが、該表面のほ
とんどは内孔でありハイブリッド形成液の液塊と密に接
触しない、したがって、核酸の拡散行程が長くハイブリ
ッド形成速度が遅い、ハイブリッド形成後、洗浄溶液中
に浸漬することによって過剰のプローブ核酸が膜から除
去される。核酸を孔内から拡散させるのに長持間を必要
とする。酵素ｎｍ体のような更なる試薬を用いてハイブ
リッドを検出する場合、孔中に拡散させるための時間が
与えられなければならず、さらに、過剰の標識体を洗浄
工程で除去するために更なる時間が必要とされる。

溶液中核酸ハイブリッド形成が、ハイブリッド形成を起
こすために溶解性核酸を固体表面に拡散させる必要がな
いので二相系よりも迅速であると認められるという理由
によって発案された。ハイブリッド形成後、ハイブリッ
ド化した標識化プローブとハイブリッド化されていない
標識化プローブとを、ハイブリッドに選択的に結合する
ヒドロキシルアパタイトを用いて分離することができる
。しかしながら、ヒドロキシルアパタイトは多くの非放
射性標識体とも結合するために、ヒドロキシルアパタイ
ト法は放射性標識化プローブにした適用されなかった。

更に、単鎖プローブのハイブリッド化プローブに対する
選択性が絶対的なものではないために、プローブの量が
増加すると、ハイブリッドの形成が無い状態で背景信号
が増加することになる。結果として、標識化プローブを
大過剰量用いてハイブリッド形成速度を速めることがで
きない、したがって試験を完了させるには未だ長時間を
必要とする。

サンドイッチハイブリッド形成もまた、試料核酸の固定
化が必要ないために鋭意研究がなされている。これは試
料ストランドの異なるセグメントとハイブリッド形成す
る固定化プローブ及び溶解性標識化プローブが用いられ
る。しかしながら、この方法は３種の核酸が共に検出可
能なハイブリッドを形成するようにならなければならな
いためにより長いハイブリッド形成時間を要する。

固定化された、又は固定化することのできるプローブを
用いることがハイブリッド形成試験を簡略化する方法と
して提案されている。ある試みにおいては得られた固定
化ハイブリッドを標識化抗ハイブリッド抗体試薬の結合
によって検出する（ヨーロッパ特許公報第１６３，２２
０号を参照）、水に非懸濁性の大きな粒子を用いて数時
間の試験時間を達成する、具体的に例示された方法にお
いて提案されたプローブ用固定支持体としては、微粒子
、ビーズ、膜等が挙げられる。他の試みにおいては、試
料核酸自身を、例えば標識化光化学反応性ＤＮＡ挿入剤
と接触させることによって最初に標識化し、分離後、得
られた標識化ハイブリッドを検出する（１９８６年３月
５日に出願され、Ｎｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、米国コネチカット州Ｗｅｓｔ　
Ｒａｖｅｎに譲渡された米国特許出願１８３８．３７８
号を参照）、ここでも支持体の特定の選択によって数時
間を超える試験時間がかかる。

したがって、便宜性や試験の性能を犠牲にすることなし
に１時間以内、特に商業的には３０分以内に試験を完了
することができるようになる核酸ハイブリッド形成法の
要求に焦点があてられておリ、未だ満足されていない、
非放射性同位検出方法、特に視覚的又は分光光度測定法
を用いることができれば更に有利であろう。

ラテックスをはじめとする微粒子を、ハイブリッドを分
離し検出するために使用することが文献において提案さ
れている。　　Ｈｏ１ｅｓと５ｔａｒｋはＣｅ１ｌ　　
５　：　３０１　（１９７５）　で、５Ｖ４０ＤＮＡを
直径０．５〜１．０μｍのジアゾ化ｍ−アミノベンジル
オキシメチルセルロース粒子に共有結合させた　３Ｈ−
標識化プローブとのハイブリッド形成は完了に約２４時
間を要した。ヨーロッパ特許公報第１５４，５０５号に
おいてはラテックス粒子をはじめとする固相を、サンド
イッチハイブリッド形成において用いるためのＤＮＡプ
ローブの固定化に用いることができることが示唆されて
いる。ＤＮＡをかかる粒子に共有結合的に固定化させる
手段及び実際の試験における生成物の性能については論
じられていない、ラテックス粒子をサンドイッチハイブ
リッド形成において主として標識体として用いることも
また、ヨーロッパ特許公報第１５９，７１９号において
言及されている。ＰＣＴ公報　ＷＯ８６−０３７８２に
おいては、直径４０〜６０Ｊ１１Ｒの架橋マクロ細孔セ
ルロース系樹脂粒子上へのＤＮＡの固定化が記載されて
いる。サンドイッチハイブリッド形成の完了には、２〜
４時間のインキュベーション時間を必要とする。

λユニ１１ ここで、本発明は、ハイブリッド形成の開始から生成信
号の測定までを３０分以内で完了することのできる核酸
ハイブリッド形成試験を提供するものである。固定化プ
ローブを用いることに基づくハイブリッド形成が、それ
ぞれ独立した水懸濁性微粒子、例えばラテックス粒子を
、プローブを担持する固相として用いることにより著し
く改良される。微粒子の水への懸濁性及びその高い表面
積によって、ハイブリッド形成反応の速度が、実質的に
両核酸ストランドが溶液中に存在する際に結合が起こる
のと同じぐらいに速くなる。更に、固相の粒子性によっ
て、形成されたハイブリッドと結合した標識化物質を未
反応標識体から迅速、簡便かつ効率的に分離することが
可能になる。

ラテックスに固定化されたプローブを用いることは、標
識化抗ハイブリッド抗体による、又はハイブリッド形成
の前に試料核酸を標識化する手段を用いることによる測
定をはじめとするハイブリッド形成法において特に有利
である。どちらの場合においても、標識体、特に非放射
性同位型タイプ、例えば酵素の測定は、ラテックス−ハ
イブリッド反応生成物を分離した後に極めて速やかに行
なうことができる。標識化抗ハイブリッドを用いる場合
においても、かかる試薬をハイブリッド形成混合物に加
え、適当な手段で分離してラテックス−ハイブリッド：
標識化抗体生成物を得ることができるので、単一の分離
工程しか必要ではない。

本発明の特に好ましい態様においては、酵素標識化抗ハ
イブリッドを用いてハイブリッド形成生成物を測定し、
濾過によって最終的なラテックス−ハイブリッド：標識
化抗体生成物の分離を行なう。次に、７戸別した酵素標
識化ラテックス粒子を、酵素に対する色原体又は蛍光原
体基質の溶液を施した後に視覚によって又は分光光度測
定によって速やかに測定することができる。

本発明は多くの極立った有利性によって特徴付けられる
。ＤＮＡ−ラテックスは均一な懸濁液を形成するので、
水溶液と同様の方法で滴加によって、又はピペットによ
って施すことができる０粒子が液全体に分散しており、
表面積が非常に大きいので、液塊とラテックス表面との
接触は最適の状態である。したがって、溶解性核酸が粒
子表面の固定化核酸に拡散する行程が短く、迅速なハイ
ブリッド形成が得られる。

ハイブリッド形成工程が完了し、標識化結合試薬を用い
てハイブリッドを検出した後、ラテックス粒子が液全体
に分散しており大きな表面積が結合試薬に曝されるため
に、再び迅速な反応に適した系が提供される。結合が完
了すると過剰の結合試薬を除去する必要がある。これは
、粒子を濾紙上に捕集することによって都合よく行なう
ことができる０次に水溶液をか紙に通して過剰の標識化
結合試薬を洗い流すことができる。この洗浄は１分未満
で完了することができる。

粒子が濾紙上で小容量に濃縮されるので標識体からの信
号を効率的に測定することができる０例えば、酵素標識
体の比色読取りを用いる場合、発色団が１ＩｊＲ１ｉ！
された粒子のまわりの小容量中に形成され、これは、色
原体を一定容量の液体中に希釈した場合よりも迅速に測
定することができる。ハイブリッド形成、洗浄及び測定
工程が迅速であるので、ラテックス粒子を用いた試験は
３０分以内で完了することができる。

図１には試料核酸が溶液及びラテックス固定化プローブ
中にあるハイブリッド形成反応の時間経過を示している
（図中の白丸）、緩衝液を用いた結果も示されている（
図中の黒丸）、このデータにより、ハイブリッド形成が
わずか１５分後に有効に完了したことが示される。

また、後述の゛表１には、本発明の試験時間と主な従来
方法のそれとを比較した表が示されている。ハイブリッ
ド形成の開始から測定工程までは、従来方法による最良
の時間が２〜３時間の範囲内であるのに比べて、本発明
に関してはわずか２０分しか要していない。

ま　　い　−熊　　　　１ 本発明の重要な特徴は、ハイブリッド形成試験を、ハイ
ブリッド形成の開始から少なくとも分離工程まで約３０
分以内、好ましくは２０分以内、最適には約１５分で行
なうことができることにある。更に、本発明において用
いることのできる／＼イブリッド形成法は、生成信号の
測定までの完全な試験を約３０分以内、通常は約２０分
以内で完了することができるような迅速な測定系を用い
ることができる。大過剰のプローブを用いて速度を上昇
させ、実質的に両ストランドが溶液中にある場合と同様
にハイブリッド形成反応を進行させることができるので
、上記の時間は、系において用いる生成信号の測定に限
れば試験試料中の対象配列の濃度には基本的には依存し
ない。

本明細書においてタームとして用いられるラテックス微
粒子は概して、液体ハイブリッド形成媒体中で徐々に沈
降する懸濁液を形成するような寸法及び組成の、それぞ
れ独立した水懸濁性粒子であることを認識すべきである
。かかる粒子の特定の化学的組成を以下に論じるように
変化させることができる。

概して、プローブは当該技術において公知な。

又は、ハイブリッド形成による所望のポリヌクレオチド
配列の特定の測定の目的のために適用しうる方法によっ
て生成させることのできるいかなるポリヌクレオチドで
あってもよい、プローブはＤＮＡ又はＲＮＡとなり、測
定される配列に実質的に相補的な、少なくとも１種の単
鎖塩基配列からなるようになる。その長さは約１２塩基
程度の少なさから数千塩基程度の多さまでの範囲で広く
変化することができ、５０塩基未満を有するオリゴヌク
レオチド類を含む。

プローブは種々の通常の方法で得ることができる０例え
ば、ＲＮＡプローブの場合、ＲＮＡは、バクテリア性又
は細胞性転移ＲＮＡ類から、５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓリ
ポソームＲＮＡ類のような細胞の天然生成物として単離
することができる。メツセンジャーがコード化する大量
の蛋白質の生成において特定の細胞から特定のメツセン
ジャーＲＮＡ類を単離することもまた実用的である。

ＲＮＡプローブのｉｎ　ｖｉｔｒｏ合或は、非常に活性
なネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ）バクテリオファージＳＰ６転写プロモー
ターを含有するベクターによって行なうことができる。

プロモーターに隣接する多制限エンドヌクレアーゼ部位
を有するベクターも利用できる。ＤＮＡプローブをベク
ター中にクローン化し、次にこれをバクテリア性宿主中
で増殖する。クローン化されたＤＮＡプローブの多ＲＮ
Ａ複製は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてバ
クテリオファージＳＰ６からｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成す
ることができる。

ＤＮＡプローブは種々の原料から調製することができる
。特定の無菌試料中のバクテリアを測定するように意図
されたハイブリッド形成試験のために、純粋なバクテリ
ア性ゲノムを固定化することができる。この試験によっ
てリポソームＲＮＡ類及び転移ＲＮＡ類のような、大量
のバクテリア性ＲＮＡ類を検出することができるであろ
う。一方、特定のＤＮＡ配列を周知のプラスミド又はウ
ィルスベクター中にクローン化してハイブリッド化プロ
ーブとして用いることができる。

試験される試料は、いかなる対象物であってもよく、通
常は医薬、獣医学、環境又は工業的に重要な物質である
１人間及び動物の検体、体液及び排出物を本発明によっ
て試験することができ、例としては、尿、血液、乳、脳
を髄液、唾液、排せつ物、肺息、咽喉スワブ（ｔｈｒｏ
ａｔ　ｓｗａｂ）、生殖器スワブ（ｇｅｎｉｔａｌ　５
ｖａｂ）及び排出物、直腸スワブ（ｒｅｃｔａｌ　ｓｗ
ａｂ）及び鼻咽頭息が挙げられる。特に重要な試験は、
尿及び脳を髄液中のバクテリアの検出である。患者又は
他のものから得られた試験試料が細胞を含む場合、試料
を処理して核酸を溶離させる。それが単鎖の場合は本方
法によって試験することができる。核酸が二重鎖である
場合はそれらを変性させるための工程を用いる。変性は
好ましくは廓騰水中で加熱することによって、又はアル
カリ処理（例えば０．１Ｍ水酸化ナトリウム）によって
行なわれ、いくつかの場合においては、これを、同時に
細胞を溶解するために用いることができる。対象物質が
ＲＮＡである場合は、アルカリ条件はＲＮＡを低質化さ
せるのでアルカリ変性を用いることはできない。また、
核酸の溶離を、機械的分解（凍結／解凍、摩擦、音波処
理）、物理的／化学的分解（Ｔｒｉｔｏｎ、　Ｔｗｅｅ
ｎ、ドデシル硫酸ナトリウム、浸透ショック又は加熱）
、又は酵素溶解（リゾチーム、ブロテイナーゼＫ、ペプ
シン）によって得ることができる。これらの方法によっ
て、本発明のハイブリッド形成方法により試験すること
のできる単鎖形態の核酸を有する試験媒体が得られる。

本発明の微粒子は、水に懸濁し、ハイブリッド条件下で
安定であるような組成のものであり、好ましくは、核酸
プローブの共有結合を可能にする表面の化学基を有して
いる。好適には、濾過による分離を用いる場合にはかか
る手段を容易に行なうのに十分な寸法を有するものであ
ることが好ましく、又は、磁気分離を行なうために帯磁
性又は磁化可能であることが好ましい。

７濾過を行なうためには、直径約１牌であり、カルボニ
ルかあるいはアミドの表面基を有するポリスチレンラテ
ックス粒子がこの目的に関して理想的である。カルボキ
シレート及びアミドで変性されたラテックスはＭａｎ　
ｉの方法（米国特許第４．０９４，８４１号）によって
合成される。更に一般的には、ラテックス類は、乳化重
合及び懸′ｓＪｉ合法によって製造することができる［
　Ｂａｎｇｓ　＋Ｌ、　Ｂ、　　（Ｌ　９８４）、　Ｕ
ｎｉｆｏｒｍ　Ｌａｔｅｘ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　。

米国インディアナ州インディアナポリスのＳｅｒａｇｅ
ｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｒｎｃ、］　、膨潤乳化
重合を用いることもできる［ＵｇｅＬｓｔａｄ　、　Ｊ
、ら、　Ａｄｖ。

Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ
、、　１３　：　ｌ　Ｏ１〜１４０　（１９８０）］。

ラテックス粒子は、しばしば、約１．０５ｇ／、ｄの比
重を有するポリスチレン又は架橋ポリスチレンからなる
。１．ｏｏｇ／−程度の低い比重を有する粒子はビニル
−トルエン／１ｅｒｔ−ブチルスチレンのコポリマーに
よって合成することができる。

非常に高い比重（１，１９ｇ／−以下）を有する粒子は
ポリメチルメタクリレートによって製造することができ
る。他のポリマー類及びコポリマー類を用いて粒子を製
造することができる。最良のものは、ハイブリッド形成
媒体の比重及びＤＮＡ又はＲＮＡプローブを粒子面に結
合させるのに用いる化学作用に依って選択される。

プローブを固定化させるのに用いる微粒子の最も重要な
特徴は水懸濁性である。なぜならば主としてこの特性に
よって、観察される速いハイブリッド形成速度が得られ
るからである０本明細書において用いる水懸濁性とは、
懸濁液中に最初に加えられた粒子の実質的に全て、又は
少なくとも大部分が、所望の反応時間中に概して均一に
分散された状態で保持され、ハイブリッド形成溶液中に
沈降したり、浮き上がったりしないことを意味している
と理解されよう。したがって、微粒子が許容されるｇ、
ｓＪ液を形成する速度の限界は、（溶液の表面から容器
の底までの距離という点よりは）ハイブリッド形成溶液
の容量、及びハイブリッド形成時間によって若干変化す
る。通常の反応容量及び３０分以下の所望のハイブリッ
ド形成時間が与えられた場合、有用な水懸濁性は、ハイ
ブリッド形成混合物における懸濁液の濁り度が、約３０
分未満の間に、約７０％程度、より通常には５０％程度
、好ましくは２５％程度減少しない、ということによっ
て定義される。

ラテックス微粒子は、粒子径、表面電荷、及び比重、並
びに懸濁される液体の粘度、比重及び温度をはじめとす
る数多くのパラメータの関数として懸濁液を形成する。

径に関すれば、非常に小さな粒子は試験の引き続く工程
においてハイブリッド形成媒体から分離するのがより困
難になる。一方、非常に大きな粒子では固定化核酸プロ
ーブに十分な表面積が得られず、ハイブリッド形成中に
懸濁状態に保持するのに適していない。

最適のハイブリッド形成条件を得るためには、粒子が可
能な限りハイブリッド形成媒体全体に均一に分散した状
態で保持されることが重要である。これによって、溶解
性核酸と固定化プローブとの間の拡散行程が最小になる
。

液体混合物中で通常のハイブリッド形成条件が与えられ
た場合、有用な粒子は一般的に、直径約０．１〜約２０
Ｑ、より通常には約０．５〜約５μのものであるが、０
　、０５ｐＩといった小さなもの又は５０μといった大
きなものであってもよい０粒子の比重は概して、約１．
ｏｇ７−から約１．２ｇ／−まで変化するが、約１．０
３ｇ／、Ｊ〜約１．０８ｇ／μｍの比重のものが特に好
ましい。多孔度は一般的に粒子の重要な特徴ではない。

核酸のような巨大分子と接触することのできる大きな径
の孔は粒子の表面積を増加せしめ、それによって粒子の
重量あたりの付着核酸量をより大きくすることができる
。しかしながら。

かかる孔は、また、粒子の洗浄効率を低下させる。

粒子の組成は、核酸を固定化させる表面基を有するよう
なものであればよい、かかる基の例は、カルボキシレー
ト、アミド、エポキシド及びホスフェートであり、これ
らの官能基は通常、粒子形成の最終段階においてラテッ
クス上に導入され、直接、又は更なる化学的変性を経た
後に用いることができる。

マグネタイ）（Ｆｅ３０ａ）のような常磁性無機物の粒
子を上記記載のポリマーで被覆することも可能である。

これらの粒子は磁性体に引きつけられ、液体試験媒体か
らのラテックスの分離を容易にする。また、無機物の表
面と反応し、及び／又は表面上で重合することのできる
有機シラン類で常磁性無機物を被覆して直接的０．１〜
１．５μｍの水懸濁性粒子を得ることもできる四ｈｉｔ
ｅｈｅａｄ。

Ｒ，Ａ、らの米国特許第４．５５４．０８８号（１９８
５年）］、有機シラン類は、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ
の結合に引き続き用いることのできる官能基を有するこ
とができる。

静電的及び／又は疎水性相互作用を介した吸着によって
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブをラテックス粒子に付着させ
ることができるが、プローブが保存中にラテックスから
解離することがないという理由で共有結合による付着が
好ましい、広範囲にわたる共有結合技術を用いることが
できる。好適な方法は、ラテックス上へのジアゾニウム
基の導入、及びそれに統〈ポリヌクレオチドのグアニン
、チミン及びウラシル残基との反応を包含している［Ｎ
ｏｙｅｓ、　Ｂ、　Ｅ、及び５ｔａｒｋ、　Ｇ、　Ｒ，
、Ｃｅ１ｌ。

５　：　３０１〜３１０　（１９７５）　　；Ｒｅ１ｓ
ｅｒ、　Ｊ。

ら、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｏｓ
、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　８５　：１１０４〜１１１２　
（１９７８）］、リン酸エステル基をラテックス上に導
入し、カルボジイミドによって活性化してプローブと結
合させることもできる［Ｂａｕｔｚ、　Ｅ、　Ｋ、　Ｆ
、及びＨａｌｌ、　Ｂ、　Ｄ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ、４８　＋　４００〜４０８　（１９６２）　　；
Ａｄｌｅｒ、　Ａ、　Ｊ、及びＲｉｃｈ、Ａ、、　Ｊ、
　Ａｍ、　ＣｈｅＬＳｏｃ、、８４　：　３９７７〜３
９７９　（１９６２）］。水溶性力ルポジイミドによる
活性化によって［Ｒ４ｃｋｗｏｏｄ、　Ｄ、、　Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、２６９　：　４７〜５０
　　（１９７２）；Ｇｉｌｈａｍ、　　Ｐ、　　Ｔ、、
　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７　　：　　２　８　０　９〜
２８１３　（１９６８）］、又はポリヌクレオチド上の
親核性部位を臭化シアンによって活性化されたヒドロキ
シルと結合させることによって［Ａｒｎｄｔ−Ｊｏｒｉ
ｎ、　　Ｅ、　　Ｊ、ら、　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋ｉ、。

５４：　４１１〜４１８　（１９７５）　；Ｌｉｎｂｅ
ｒｇ。

Ｕ、及び計１ｋｓｓｏｎ、　Ｓ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１８〜４７４〜４７９　（１９７
１）］、ポリヌクレオチドの末端ホスフェートとヒドロ
キシルとの間に形成されたリン酸ジエステル結合を介し
た結合にラテックス上のヒドロキシル基を用いることが
できる。更に、ＲＮＡプローブの３′−ヒドロキシル末
端を過ヨウ素酸塩によって酸化し、Ｓｃｈ　ｉ　ｆ　ｆ
塩基形成法によってアミン又はヒドラジド基を有するラ
テックスと結合させることができるＪＧｉｌｈａ層。

Ｐ、　Ｔ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ７ｍｏ１．．２１　
：　１９１〜１９７（１９７１）　　；　Ｈａｎａｓｋ
ｅ、　Ｈ，Ｄ、ら、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　４９　：１７２〜１８１　（１９
７９）］。

親核性部位を有するラテックスをシアヌル酸塩化物と反
応させ、次にポリヌクレオチドと反応させることができ
る［Ｈｕｎｇｅｒ、　Ｈ，Ｄ、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　
Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ａｃｔａ、　６５３　：　３４４〜
３４９　（１９８１）］、更に、光活性化基をラテック
ス上に導入してＤＮＡ又はＲＮＡプローブを光による活
性化によって結合させることができる［Ｄａｔｔａｇｕ
ｐｔａ、　Ｎ、、米国特許第４．５４２，１０２号（１
９８５）］。

特に好ましいラテックス−プローブ複合体は、カルボキ
シレートで変性されたラテックス（ｃＭＬ）に共有結合
したＤＮＡ又はＲＮＡプローブである。結合剤であるＮ
−［１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオ
キサヘプタデシル］　−３−Ｎ−ＢＯＣ−アミノフェニ
ルアセトアミド（アミノ−ＰＥＧ−ＢＯＣ−アミノフェ
ニルアセトアミド）が水溶性カルボジイミドによってＣ
ＭＬと結合する０次にＢＯＣ保護基を酸で除去し、アリ
ールアミンをジアゾ化してプローブＤＮＡ又はＲＮＡに
結合させる。

一方、Ｎ−［１７−アミノ−３，６，９゜１２．１５−
ペンタオキサヘプタデシル］−３−二トロベンゾアミト
（アミノ−ＰＥＧ−ニトロフェニルアセトアミド）が水
溶性カルボジイミドによってＣＭＬのカルボキシル基に
結合する。ニトロ基が還元されプローブ核酸に結合する
ジアゾニウムイオンに転化せしめられる。

本発明によるラテックス−固定化プローブの使用を単独
で利用することができる主として２種のハイブリッド形
成法がある。第一のものが特に好ましく、それは、便宜
的に抗ハイブリッド法と呼ばれており、第二のものは試
料標識法として知られている。これら両方とも文献（前
述のヨーロッパ特許公報筒１６３，２２０号、及び１９
８６年３月１５日出願の米国特許出願第８３６，３７８
号）において実質的に記載されているが、ここで簡単に
述べる。

抗ハイブリッド法においては、対象となる試験配列と固
定化プローブとの間に形成されたハイブリッドを、かか
るハイブリッドに選択的に結合するが単鎖核酸に実質的
に結合しない試薬の結合によって測定する。向ハイブリ
ッド試薬が結合した固定化ハイブリッドを非結合試薬か
ら分離し試薬の存在を検出する。

向ハイブリッド試薬はハイブリッドに対して選択的な抗
体又はそのフラグメントであることが好都合であり、特
に、 （ａ）プローブ及び測定される配列の一方がＤＮＡであ
り他方がＲＮＡである場合、又は両方がＲＮＡである場
合は、それぞれ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はＲＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドに対する抗体（ヨーロッパ特許
公報筒１６３．２２０号参照）； （ｂ）プローブと検出される配列との間に生成するハイ
ブリッドが、居間複合体としてそれに結合される核酸挿
入剤からなるように形成される場合は挿入ハイブリッド
に対する抗体（米国特許第４．５６３，４１７号参照）
；及び （ｃ）プローブと試料配列の両方がＤＮＡである場合は
二重鎖ＤＮＡに対する抗体；から選択することができる
。好ましくは抗ハイブリッド試薬は迅速な測定を行なう
ために測定可能な化学基によって標識化される。実質的
にいかなる公知の標識体も用いることができるが、特に
有用な標識体は、酵素的に活性な群、例えば、酵素類、
基質類及び補酵素類、蛍光剤類、発色団類、発光剤類、
金属ゾル類、又は、任意の上記記載の特に好ましい標識
体によって標識された結合相手との結合によって測定す
ることのできるリガンド類、例えばビオチン又はハブテ
ン類である。かかる標識体は測定可能な信号、特に視覚
的信号を迅速かつ好適に生成することができ、これによ
ってハイブリッド形成から分離及び測定までの全試験工
程を約３０分未満で完了することができる。

試料の標識化法は、試験試料を処理してその中の核酸を
化学的に変性し、検出可能な標識体を導入する予備工程
を含む。固定化プローブにハイブリッド化するこれらの
標識化核酸は、対象となる配列を含有しており、ハイブ
リッド化されていない標識化核酸の除去後、直接に測定
することができる。好ましい標識体は上記に記載したも
のである。標識体は、適用できる、又は案出しうるいか
なる好都合な方法によっても導入することができるが、
標識化反応性核酸結合リガンド類、特に光反応性のもの
を用いることが特に好ましい。

標識体に結合した光反応性層間化合物が特に有用であり
、文献において記載されている［上述のヨーロッパ特許
公報部１３１，８３０号及び米国特許出願第８３６，３
７８号、並びにＦｏｒｓｔｅｒらのＮｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３　：　７４５（１９８５）］。

試験を完了するために必要な、ハイブリッド形成混合物
からのラテックス粒子の分離は、いかなる好都合な方法
によっても行なうことができ、通常は濾過、遠心分離又
は磁力吸引によって行なうことができる。広範囲にわた
る濾過媒体を適用することができ、濾紙の孔径は重要な
考慮すべき点である。直径の小さなラテックスを用いる
場合は孔径の小さなものが必要となる。ガラス繊維フィ
ルターのような深度のあるフィルターは、みがけの孔径
がラテックス粒子の平均粒径よりも実質的に大きな場合
においてもラテックスを有効に保持するので有用である
。かかるフィルターは満足できる流速で液を通すので好
ましいものである。

フィルターの下部に減圧をかけることによって流れを容
易にすることができる。排液を浸透させる吸着剤上にフ
ィルターを配置することがしばしば好都合である。この
種の系は通常、減圧をかけることなしに速い流速を得る
（例えば、米国特許第３．８１１，８４０号、４，２４
６，３３９号、４．３６６．２４１号及び４，６３２，
９０１号に記載の装置を参照のこと）、試験信号の読取
りは、装置によって定量することもでき、又は、特にイ
エス／ノーの結果で充分な場合は色を視認することがで
きる。

ここで、本発明を以下の実施例によって具体的に示すが
、これは本発明を制限するものではない。

実）１倒 ラテックス粒子上に固定化されたプローブＤＮＡを、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からのリポ
ソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）を用いてハイブリッド化し
、ハイブリッドを、ＤＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドに
対して特定の酵素標識化抗体を用いた示色測定によって
測定した。カルボキシメチルラテックス（ｃＭＬ）をア
ミノ−ＰＥＧ−ＢＯＣ−アミノフェニルアセトアミドに
結合させた。次に、アニリン基を脱保護しジアゾ化した
。

ジアゾニウムイオンをプローブＤＮＡと有効に反応させ
、ラテックス１ｍｇあたりＤＮＡ　　７ｇｇ以下を与え
た。

ＤＮＡ−ラテックスをｒＲＮＡでハイブリッド化し、次
にＤＮＡ　：　ＲＮＡに対するβ−ガラクトシダーゼで
標識化された抗体をハイブリッドと結合せしめた。ラテ
ックス粒子を特別に設計されたガラス繊維フィルター片
上に捕集することによって過剰のβ−ガラクトシダーゼ
抗ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体を洗浄除去した。フィルター片
を５ｅｒａ！ｙｚｅｒ　＠反射率計（米国インディアナ
州エルクハートのＭｉｌｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ａｗｅｓ　
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製）上に配置し、色原体β−ガラクト
シダーゼ基質を加え発色速度を測定することによって、
ハイブリッドに結合したβ−ガラクトシダーゼ抗ＤＮＡ
　：ＲＮＡ複合体の量を測定した。

Ｅ、　Ｃｏ１１及びＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓからの２３
ｓｒＲＮＡ遺伝子を含む制限フラグメントをＭ　１３　
ｍ　ｐ　１８及びＭ　１３　ｍ　ｐ　１９　［Ｍｅｓｓ
ｉｎｇら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、７５　：　３６４２（１９７７）］中にクロー
ニングすることによってＤＮＡプローブを調製した。　
Ｅ、　Ｃｏ１１２３ｓｒＲＮＡ遺伝子を含む３．２Ｋｂ
　　ＤＮＡ７ラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＸ
ｂａＩ及びＸ　ｍ　ｍ　Ｉによって消化することにより
ｐ　Ｎ　ｏ　１３０１　　［Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔ
ｓｏｎら、Ｃｅ１ｌ。

３３　：　８６５　（１９８３）］から生成した。これ
らの部位は、ｒｒｎＢオペらンのＤＮＡ配列のコンピュ
ーター分析によってそれらが隣接する５ｓｒＲＮＡ遺伝
子を有さない完全な２９０４塩・基対２３ｓ　　ｒＲＮ
Ａ遺伝子配列を有するフラグメントを与えることが示さ
れた後に選択された。このフラグメントを、エンドヌク
レアーゼＸｂａＩ及びＳｍａ　Ｉによってあらかじめ消
化されたＭ１３ベクター中にクローン化した。

ｒｒｎＢオペロンからのＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　２３
５ｒＲＮＡ遺伝子の３分の２を含む２．０ＫｂＤＮＡフ
ラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及び
Ｓｍａ　Ｉによって消化することによりｐ１４Ｂ１から
生成した。このフラグメントは、それぞれ５′及び３′
末端配列をコード化する４０８及び４５９塩基対を除く
全ての２３ｓｒＲＮＡを含んでいた［Ｇｒｅｅｎら、Ｇ
ｅｎｅ、　３７　：２６１　　（１９８５）］、これを
Ｍ１３ｍｐ１８ベクター上のＸｂａＩ及びＳｍａＩ制限
部位中にクローン化した。それぞれ、Ｍｌ３−２３ＳＥ
及びＭｌ　３−２３ＳＢと示されるこれらのクローンか
らのピリオンＤＮＡを引き続くハイブリッド形成実験に
おけるプローブとして用いた。Ｔａ　Ｄ　Ｎ　Ａリガー
ゼを用いて、制限エンドヌクレアーゼによって線状化さ
れたＭ　１３　ｍ　ｐ　１８及びＭ１３ｍｐ１９複製型
ＤＮＡを、Ｅ、　Ｃａｄｉ及びＢ。

５ｕｂｔｉｌｉｓからの２３ｓ　　ｒＲＮＡ遺伝子を含
むプラスミドの制限エンドヌクレアーゼによって生成し
たＤＮＡフラグメントに対して、Ｍａｎｉａｔｉｓら、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
、　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）に記載された
緩衝剤を用いて１２℃で１６〜１８時間連結反応させる
ことにより組み換えＤＮＡ分子をｉｎ　ｖｉｔｒｏで構
築した。反応試料を、ＤＮＡ分子サイズマーカーに沿っ
た１％アガロースゲル上の電気泳動にかけることによっ
て連結反応の成功を監視した。

コンビテン）　Ｅ、　Ｃｏ１１を連結反応生成物によっ
て形質転換し、適当な希釈物をブレーティングしてイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトビ口ノシド及び５−ブ
ロモ−４−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シドを含む軟寒天媒体によって組み換えファージを検出
した［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　ｌ　１０　：　２０　（１９８３
）　］　、適当なサイズのＤＮＡ挿入剤を用いてＲＦ　
　ＤＮＡに関する組み換えファージプラークをスクリー
ニングすることによって、適当なりローン化２３ｓｒＲ
ＮＡ遺伝子フラグメントを含む組み換えファージを同定
した０個々のプラークを軟寒天媒体から採取し、０．Ｉ
ＭＮａＣ文、８ｍＭＭｇ５Ｏａ　、５０ｍＭ、ｐＨ７，
５，０，０１％ゼラチン１−中に１時間懸濁し、次にこ
れを用いてトリプトースイースト抽出ペプトン媒体中の
Ｅ、　Ｃｏ１１　ＴＧＩの培養物を感染させた。３７℃
において３〜４時間激しく通気した後３０００Ｘｇで１
０分間遠心分離することによって培養物を採取した。セ
ルペレットを、８％（Ｗ／マ）スクロース、５％Ｔｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ　−１００、５０ｍＭＥＤＴＡ、５０　ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ１からなる緩衝液（ｐＨ８，０）
１．６＋ｎｌ中に懸濁した。懸濁液を、リゾチーム（水
１−中１０ｍｇ）５０−を入れたＥｐｐｅｎｄｏ　ｒ　
ｆ遠心管に移し、９５℃で２分間インキュベートした。

得られた細胞溶解産物（ライセード）を１３，０００Ｘ
ｇで５分間遠心分１２＆にかけ、試料０．７４を清潔な
管に取り出した。冷インプロパツール０．７−を加え、
管を一１８℃に１０分間配置した。管を、冷却状態で、
１３．０００Ｘｇで５分間遠心分離にかけ、上澄み液を
排除しＤＮＡ沈殿物を減圧下で短時間乾燥した。沈殿物
を木５０　Ｉｂｌ中に溶解し試料を０．７％アガロース
ゲル上で電気泳動して増大したサイズのベクターＲＦ　
　ＤＮＡの存在を確認した。次に適当な試料を制限酵素
消化及びゲル電気泳動にかけて２３ｓ　　ｒＲＮＡ遺伝
子フラグメントの存在を確認した。

エタノール１２５ｗＪ中に、３−ニトロフェニル酢酸１
０ｇ（５５ミリモル〕及び１０％Ｐｄ／Ｃ触媒３００ｍ
ｇを含む溶液を、Ｈ２５０ｐｓｉのＰａａｒ装置で３時
間水素化した０次に、混合物をセライトフィルターで濾
過し、残渣をエタノールで洗浄した。これを７戸液と合
わせて、減圧下で濃縮して白色粉末７．１８ｇを得、こ
れを更に精製することなく用いた。収率８６％。融点１
３１〜１３２℃。

分析試料を水から再結晶することによって得た。融点１
４５〜１４８℃（文献値１４８〜１４９℃）。

’ＨＮＭＲ（８０ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ５）δ：　３．８
（ｓ、　２Ｈ）；　７．０−７．６（ｍ、　４Ｈ） ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−’　：　３０００．１５９２．１
３７７ｃｍ−’質量スペクトル（Ｅｌ）ｍ／ｅ：１５１
．１　（Ｍ”　、　５４．５％）；１５２　　（Ｍ”！
、、５．３％）： １０６　　（Ｍ”−４５，１００％） ３−Ｎ−ＢＯＣ−アミノフ　ニル酢 ＣＨ２Ｃ立、　　４０−中に、３−７ミノフエニル酢酸
３．０２ｇ（２０ミリモル）及びジイソプロピルエチル
アミン６．９７ｄ（５，１７ｇ。

４０ミリモル）を含有する溶液を、ＣＨ２０文２２〇−
中に炭酸ジーｔｅｒｔ−ブチル４．６５ｇ（２１，３ミ
リモル）を含有する溶液に加えた。３時間後、ジイソプ
ロピルエチルアミンＬ３．９４．ｔＪ（８０ミリモル）
及び炭酸ジーｔｅｒｔ−ブチル９．１６ｇ（４２ミリモ
ル）を加え、３時間後、出発物質が完全に消滅したこと
がＴＬＣによって示された。次に溶媒を減圧下で蒸発さ
せ、１９：Ｉ　　ＣＨＣ文３−ＣＭ、ＯＨ溶媒混合物で
溶出する５ｉｎ２−６０　５００ｇ上のフラッシュクロ
マトグラフィーにかけた。２５μｍのフラクションを採
取した。純粋な生成物のフラクション（５４〜８５）を
プールし濃縮して白色固体１．６２２ｇを得、これから
以下の分析データを得た。収率３２％。融点１０２〜１
０４℃。

分析値：　Ｃ１３）１１７Ｎｃ１４としての計算値：Ｇ
、　６２．１４；　Ｈ，８，８２：　Ｎ、　５．５Ｅ！
測定値：　Ｃ，６２，１９，Ｈ，６，７８；　Ｎ、　５
．５０ＩＲ（ｃＨＧ１３）ｃｍ−’　：　３４００．３
０１０．３０００．２９４０．１？２５゜１６２０、１
８００．　＋５２９．１２４０．１１５９１８　ＮＭＲ
（ｆ（ＯＭＨｚ、　ＣＤＣ１３）δ：　１．５（ｓ、　
９８）；　３．８（ｓ。

２Ｈ）、　６．９５（Ｉｌｌ、　２Ｈ，ＡｒＨ及びＮＨ
）；　７．３（３Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；９．６？（ｍ、ｃＯ
２Ｈ） 質量スペクトル（Ｅｌ）ｍ／ｅ：２５１．２　（Ｍ”　
、　２．８％）；２５２．２　　（Ｍ＋１．　０．４　
　％）次に純粋でない生成物を含有するフラクション８
６〜１８０をプールｌ、１ｔｔｉｆＬテｓ　ｉ　０２−
６０カラム　２００ｇ上で再度クロマトグラフィーを行
ない更に生成物８９１ｍｇを得た。融点１０３〜１０５
゜ 分析値；測定値：　Ｃ，８１，３５；　Ｈ，８，６８；
　Ｎ、　５．５０したがって生成物を合わせた収量は２
．５１３ｇであった（収率５０％）。

ＣＨ２０文２２〇−中にＮ−ヒドロキシスクシンイミド
１．２６５ｇ　（ｉｉミリモル）及び３−Ｎ−ＢＯＣ−
アミノフェニル酢酸２．５１ｇ（１０ミリモル）を含有
する溶液に、ＣＨ２Ｃ１ｘ２〇−中にジシクロへキシル
カルボジイミド（ＤＣＣ）２．１６６ｇを含有する溶液
を、０℃で５分間かけて滴加した。得られた濁った溶液
を０℃で０．５時間攪拌し１次に、４時間かけて雰囲気
温度に加温した０次に混合物を濾過し、沈殿物をＣＨ２
Ｃ１２５−ずつで２回洗浄した。

炉液を合わせて滴加漏斗に入れ、ＣＨ２Ｃｌ２５〇−中
に２，１７−ジアミツー３，６，９゜１２．１５−ペン
タオキサヘプタデカン７ｇ（２５ミリモル）　　［Ｋｅ
ｒｎら、　Ｍａｋｒｏｍａｌ、　Ｃｈｅｗ、。

１８０　：　２５３９　（１９７９）］を含有する溶液
に滴加した。得られた混合物を雰囲気温度で１晩攪拌し
た０次に得られた混合物を減圧下で濃縮し、９０　：　
ｌ　Ｏ：　Ｉ　　ＣＨＣｆＬ３　　ＣＨ２０Ｈ−儂ＮＨ
４ｏ）１溶媒混合物で溶出する５ｉ０２−６０力ラム５
００ｇ上のフラッシュクロマトグラフィーにかけた。２
５１ｍ１のフラクションを採取した。フラクション６６
〜８１をプールし濃縮して生成物１．７７ｇを明黄色の
油状物として得た（収率３１％）。

分析値：　Ｃ２５Ｈ４３Ｎ３０８・繕１（２０としての
計算値：Ｃ，５７，４５；　Ｈ，８，２９；　Ｎ、　８
．０４測定値：　Ｃ，５７，１０；　Ｈ，８，１５；　
Ｎ、　８．１８ＩＨＮＭＲ（８０ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ５
）δ：　１．５（ｓ、　９Ｈ）；　２．１（ｍ。

ＮＨ２）；　３．４−３．７（ｍ、　２６Ｈ）；　６．
８（ｍ、　ＮＨ）；７．０（ｍ、　　ＮＨ）；　７．３
（ｍ、　Ｈ，ＡｒＨ）ＩＲ（ｃＨＣＩ３）ｃｍ−１：　
３００９．２９００．１７２９．１６６０．１５２７゜
１２３５．１２１５，１１５８，１０９９質量スペクト
ル（ＦＡＢ）ｍ／ｅ　：　５１４　（Ｍ＋１．２８．８
％）３、ジアゾニウムラテックスの　゛ カルボキシレートで変性されたラテックス（ｃＭＬ　、
米国インディアナ州インディアナポリスｃ７）Ｓｅｒａ
ｇｅｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を、アミノ−Ｐ
ＥＧ−ＢＯＣ−アミノフェニルアセトアミドで訪導体化
し、アニリン基を脱保護し、亜硝酸でジアゾ化すること
によってジアゾニウム−ラテックスを製造した（ｃＭＬ
は、ラテックス１ｍｇあたりカルボキシレート基５０ナ
ノモル以下を含有する１、２５０±０．０１５戸粒子の
１０％（ｓ／マ）懸濁液として市販されている）。

中程度のサイズの製造においては、１０％ＣＭＬ　　１
−を、０．４５ｐ１の孔径を有する親木性Ｄｕｒａｐｏ
ｒｅ　（ポリビニリデンジフルオリド）膜フイルタ−（
米国マサチューセッツ州ベッド７オードｃｙ）Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ製）で濾過し、脱イオン水ですす
いだ、無水Ｃａ　Ｓ　０４上でわずかに減圧下で乾燥し
た後、得られたラテックスケーキを速やかに膜フィルタ
ーから剥離させ１ｒＩＪ以下の脱イオン水（音波処理／
渦動）中に再懸濁し、試験管に入れた。これに、湿性Ａ
Ｇ　　５０１−Ｘ８混合床イオン交換樹脂（２０〜５０
メツシユ）（米国カリフォルニア州すッチモンドのＢｉ
ｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１ｇ以下を
加え、全ての電解質、非イオン界面活性剤及び水溶性重
合性物質を除去した。焼結ガラスフィルターを用いて樹
脂を脱イオン水ですすぎ上記記載のような濾過によって
捕集することによってラテックスを樹脂から分離した。

ラテックスを、アミノ−ＰＥＧ−ＢＯＣ−アミノフェニ
ルアセトアミド２５ｍｇ（５０マイクロモル）以下を含
有する０、１Ｍピリジン・ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ４，５）
中に再懸濁した。これに、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド９
５ｍｇ（０，５ミリモル）以下を２等分にし、２回目は
１同口の１時間後に２回に分けて加えた。反応懸濁液を
室温で合計で少なくとも４時間混合した後、ラテックス
を濾過によって再び採取し脱イオン水ですすいだ。

ラテックスを水ｌ−以下に再懸濁し、同量の濃塩酸を加
えた。混合物をｇｏ’ｃで１５分間静かに振盪し、その
後、氷上で冷却して０．２ＭＮａＮＯ２３−で希釈した
。５分後、ジアゾニウムラテックスを濾紙上に回収し、
速やかに、冷却した０、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４，２）ですすいだ。ラテックスケーキが活性状態に
あるので３分間だけ減圧下で乾燥した。

ラテックスをＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，
２）に再懸濁し、最終容量を約１４とじた。ジアゾニウ
ム−ラテックスの試料２．ＯＷ文を緩衝液で５倍量に希
釈し、以下に記載の試験方法を用いてジアゾニウム基に
関する試験を行なった。２つのジアゾニウム−ラテック
ス試料４０用文を予め乾燥した秤量済カバースリップ上
に滴加し速やかに秤量した。試料を減圧下（油ポンプ）
、５５℃で少なくとも４時間乾燥させた。

乾燥ジアゾニウム−ラテックスの重量（乾燥試料−カバ
ースリップ秤量値−緩衝塩配合量：試料あたり７０ｇｇ
以下）を、液体の重量（予め乾燥した試料−カバースリ
ップ秤量値）で割ると懸濁液中の固体含有率を与える。

４、ジアゾニウム　に　　る １−ナフトール−８−アミノ−５，７−ジスルホン酸を
用い、逆滴定試験法でジアゾニウム基を定量分析した。

ジアゾ化粒子を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４
，２）に再懸濁した後、試料（又は希釈液）５０ル見を
、室温で、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ中２ｍＭ１−ナフ
トール−８−７ミノー５，７−ジスルホン酸（ｐＨ８、
０）　５０弘立に混合した。ジアゾニウム基が存在して
いるとラテックス粒子は速やかに薄紫色に変化した。５
分後、試料を脱イオン水０．９−で希釈し、１３．ＯＯ
ＯＸｇで２分間遠心分離することによって粒子を沈降さ
せた。ブランク試料（ナフトールを加えない）、標準試
料（ラテックスジアゾニウムを加えない）及び固定化ジ
アゾニウム基の試料の吸光度を３４０ｎ層で測定した。

ラテックス試料と標準試料との信号（バックグラウンド
値を引いた値）の差を用いて、固定化ジアゾニウム基に
よって溶液から除去されたナフトールの量を計算した。

５、ＤＮＡ−ラテークスの Ｍ２Ｓ−２３ＳＥ及びＭ２Ｓ−２３ＳＢプローブＤＮＡ
の混合物を新しく調製されたジアゾニウム−ラテックス
に、ラテックス１履ｇあたりＤＮＡｌｏｐｇの割合で加
えることによってＤＮＡ−ラテックスを調製した。上記
第３節において記載された調製物からの残りのジアゾニ
ウム−ラテックスを、１．６ｍｇ／μｍのＭ２Ｓ−２３
ＳＥ　　１５１牌文及び０．５２ｍｇ／μｍのＭ２Ｓ−
２３ＳＢ４３３ル文に加えた。混合物を５℃以下で１晩
攪拌した後更に４時間かけて室温に加温した。

ＤＮＡ−ラテックス調製物を、３４以下の１×５ＳＣ（
０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，
０，１５Ｍ　　ＮａＣｕ）、０．１％ドデシル硫醜ナト
リウム（ＳＯ５）で希釈し、濾過し、同様の溶液ですす
いだ、最後に１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ＠ＨＣ１（ｐＨ７、
４）、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）
でｔｔいだ後、ラテックスケーキをＣａ５Ｏ，上、減圧
下で乾燥した。

ＤＮＡ−ラテックスを１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ
１（ｐＨ７，４）、ＬｍＭ　　ＥＤＴＡに再懸濁して最
終容量を０．９４とじて１００ｍｇ／μｍのラテックス
懸濁液を調製した。２．５ｇ文及び５Ｗ文の２つの試料
を緩衝液で５０１Ｌｉに希釈し、２つのハイブリッド形
成溶液［劣性サケ精子ＤＮＡ　（下記参照）］　５０＃
１．交を加えた。試料を、８０℃で３０分間、予備ハイ
ブリッド形成を行ない脱イオン水で１．５−以下に希釈
し遠心分離してラテックスをペレット化した。上澄み液
を排除した後、ベレットを緩衝液１００　ＪＬｌに再懸
濁し、以下に記載の蛍光試験を用いてＤＮＡを定量した
。

ＤＮＡ−ラテックス調製物は通常、ラテックスｌｆｆ１
ｇあたりＤＮＡ２．５〜７．０用ｇを含んでいた。

残りのＤＮＡ−ラテックス調製物に、２つのハイブリッ
ド形成溶液［８ＸＳＳＰＥ、４％ポリアクリル酸ナトリ
ウム、０．２％ＳＤＳ。

０．２ｍｇ／ｌｓ！変性アルカリ処理サケ精子ＤＮＡ（
Ｂｏｇｕｓｌａｗｓｋｉ　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　Ｍｅｔｈ、、８９　：１２３　（１９８６））］　　
（ＩＸＳＳＰＥは、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　　ＮａＣ１及び１．０ｍＭ　
　ＥＤＴＡである）の一定量を加え、混合物を８０″Ｃ
で３０分間予備ハイブリッド形成した。混合物を水で１
０倍量に希釈し２つの５ＳＰＥですすいだ。

ＤＮＡ−ラテックスケーキを２つのハイブリッド形成溶
液に再懸濁し、４ルｇ／、ＺＤＮＡの濃度とした０粒子
を純良にする有効な再懸濁は、ラテックスを水の１部中
でまず音波処理することによって最良の結果が得られた
。水へ再懸濁した後、ハイブリッド形成溶液の他の成分
をＢ縮溶液（２０ＸＳＳＰＥ　　Ｏ，４容量部、１０％
ＳＰＡ０．４容量部、２０％ＳＤＳ　　Ｏ，０１容量部
、３ｍｇ／−変性アルカリ処理サケ精子ＤＮＡ０．０６
７容量部）として加えた。

６、ラテークス　　ＤＮＡに ラテックス粒子上に固定化されたプローブＤＮＡの定量
を、Ｈｉｎｅｇａｒｄｎｅｒ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、。

３９　：１９７　（１９７１）による方法を修正した方
法を用いて行なった。この方法は３．５−ジアミノ安息
香酸をＤＮＡのデオキシリポースと反応させて蛍光生成
物を生成する反応を含んでいる。

反応後、ラテックス粒子をＩＭ　　ＨＣ文　ｌ−で希釈
し遠心分離（１３，０００Ｘｇで２分間）によってペレ
ット化した。試料からの１−を更にＬＭ　　ＨＣ交　１
−と混合した後に蛍光を測定した。試験は極めて正確に
、１　ｇｇ／ｄ　（０、ｉ　ｐ−ｇ／試料）に対しても
感受性を有していた。

ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドに対するマウスのモノクロ
ーナルＩｇＧを前述のように調製した（前述のＢｏｇｕ
ｓｌａｗｓｋｉら）。対ＩｇＧ重量比１：３３のペプシ
ンによって、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ＰＨ４，２）中
、３７℃で１６時間消化することによってＦ（ａｂ’）
２フラグメントを得た。消化生成物を、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、０．１５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１中で、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００カラム（
米国ニューシャーシー州ビス力タウェイのＰｈａｒ＋ａ
ａｃｔａ、　Ｉｎｃ。

製）上でクロマトグラフィーにかけた。

Ｆ（ａｂ’）２の一部をジクロロトリアジニルアミノフ
ルオレセイン（ＤＴＡＦ）でｅ４識化して複合調製物中
の抗体トレーサーとして用いた。標識化反応は、０．１
ＭＦＢ酸ナト酸中トリウム緩衝液９．０）中、ＤＴＡＦ
対Ｆ　（ａ　ｂ’）　２　ノモル比を３：１にして１時
間行なった［　Ｂ　１ａｋｅｓ　Ｉ　ｅｅ及びＢａ１ｎ
ｅｓ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、１３　
：　３０５（１９７６）］、標識化抗体をＢｉｏＧｅｌ
　Ｐ　６−Ｄ　Ｇ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製）カラム上で遊離Ｄ’ＴＡＦから分離し
た。経験的に誘導された式から計算されたＤＴＡＦ／Ｆ
　（ａｌ；）２のモル比は２．１であった［　Ｔｈｅ及
びＦｅ１ｔｋａ＋＊ｐ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１８：８６５　（１９７０）］。

Ｆ（ａｂ’）２をＤＴＡＦ−Ｆ　（ａｂ’）　２と２０
：１の比で混合し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、ｌｏｍＭジチオトレイット中でＦ　ａ　ｂ’に還
元した０反応は室温で３時間行なった。Ｆ　ａ　ｂ’フ
ラグメントを、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０
，０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ中、　
　ＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　６−ＤＧカラム上で単離し、下記
に記載のようにして調製されたマレイミド−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼとの結合に速やかに用いた。　Ｅｌ１ｍ
ａｎ法［Ｈａｂｅｅｂ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　２５　：　４５７　（１９７２）
　］によって測定されたＦａｔ；のスルフヒドリル含有
量は、Ｆａｂ’　　１モルあたりスルフヒドリル２．５
〜３．０モルであった。

Δ立滅 乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２０−中に１．１７
−ジアミツー３．６，９，１２．１５−ペンタオキサヘ
プタデカン２．８０ｇ（１０ミリモル）を含有する溶液
を、ＴＨＦ２０−中に無水マレイン酸４．５０ｇ（４５
ミリモル）を含有する溶液を攪拌しながら１時間かけて
これに滴加した。１時間後、反応混合物を濾過し、炉液
を減圧下、５０°Ｃで油状物に連綿し、ビスマレイン酸
中間体６．３４ｇを黄色の粗ペーストとして得た。次に
ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２，９７ｇ、２
２ミリモル）を加え、残渣をＤＭＦの２０−アリコート
と共に減圧下で３回共沸蒸留した０次に残留油状物をア
ルゴン雰囲気下に配置し、ＤＭＦ　　２０−中に溶解し
、０℃に冷却してジシクロへキシルカルボジイミド４．
５４ｇ（２２ミリモル）で処理した。得られた混合物を
０℃で１時間、次に雰囲気温度で１晩攪拌した。得られ
た暗褐色の混合物を濾過し、１縮して暗褐色の粗油状物
５．６２ｇを得た。試料を、１％ＣＨｓ　ＯＨ−ＣＨＣ
ｌ　ｓ溶媒混合物を用いてＳ　ｉ０２　６０　（２３０
〜４００メ−ｚシュ）　上でフラッシュクロマトグラフ
ィーを行なうことによって精製した。純粋な生成物を含
むフラクションをプールし濃縮して油状物１．６２ｇを
得た（収率３７％）。

分析値：　Ｃ２０Ｈ２ＢＮ２０９としテノ計算値：Ｃ，
５４，５３；　Ｈ，ｆｉ、４１；　Ｎ、　１３．３８測
定値：　Ｃ，５４，９１３，Ｈ，８，２８；　Ｎ、　８
．４８ＰＭＲ（ＨＭＨｚ）　ＣＤＣｌ３Δ：　３．８３
（ｓ、　１０Ｍ）；　３．７０（ｓ。

１４Ｈ）；　６．７０（ｓ、　４Ｈ） ＩＲ（ｃ：ＨＣｌ３）ｃ＋ｓ−’　：　２８８０．１？
１０．１４０５．　！１００ｃｍ−’質量スペクト脂質
量ＡＢ）＋＊／ｅ　：　４４１　（Ｍ−１，５１％）９
、マレイミド−−Ｄ−ガラクトシ　−ゼ■ Ｆｏｗｌｅｒ及びＺａｂｉｎ、　Ｊ、日ｉｏ１．　Ｃｈ
ｅｉ、、２５８　：１４３５４　（１９８３）の方法に
よってβ−ガラクトシダーゼを調製し、５０％硫酸アン
モニウム懸濁液として保存した。酵素懸濁液の７リコー
トを遠心分離し、ペレットを０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　　ＮａＣｕに溶解し
た。ジチオトレイットを加えて最終濃度を２ｍＭとし、
混合物を２５℃で４時間インキュベートし、次に０．１
Ｍリン酸ナトリウム、　　ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　　
ＮａＣ１中、ＢｉｏＧｅｌＰ６−ＤＧカラム上でクロマ
トグラフィーにかけた。スルフヒドリル含有量は酵素１
モルあたり９．１〜１０．４モルであった０次に、還元
されたβ−ガラクトシダーゼを、０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ７，０，０，１５ＭＮａＣ文、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ中で新しく調製された２００モル倍過剰量
のＢＭＰ　（８セクション以上）と、室温で１時間反応
させた。混合物を同様の緩衝液中、ＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　
６−　Ｄ　Ｇ上でクロマトグラフィーにかけ、活性化β
−ガラクトシダーゼを用いて速やかにＦａｌ；と結合さ
せた。活性化β−ガラクトシダーゼのマレイミド含有量
は、誘導化酵素の１部を過剰のグルタチオンと反応させ
、過剰グルタチオンをＥｌ１ｍａｎ’ｓ試薬［上述のＨ
ａｂｅｅｂら（１９７２）］によって測定することによ
って測定した。マレイミド含有量は酵素１モルあたり６
．９〜１０．５モルであった。

１０、Ｆａｂ’−−ガラクトシ　−ゼ　　　の週１ マレイミド−β−ガラクトシダーゼを１：５のモル比で
Ｆ　ａ　ｂ’と結合させた。最終的なマレイミド−β−
ガラクトシダーゼの濃度は１．５ｇＭであった。複合反
応は攪拌下、５℃で２２時間行なった。凝集物が若干生
成し、遠心分離によって除去した。上澄み液を、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　
　Ｎａ０Ｍ中、１，５Ｘ４６ｃｍＢｉｏＧｅｌ　Ａ−１
，５ｍ（Ｂｉａ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
製）カラム上でクロマトグラフィーにかけた。フラクシ
ョンを、酵素活性、２８０ｎｍにおける吸光度、及び、
４９２ｎｍの励起及び５１２ｎｍの発光を用いてＤＴＡ
Ｆ−Ｆ　ａ　ｂ’の蛍光に関して試験した。酵素活性及
び蛍光を示すフラクションが複合体を含んでおり、これ
をプールし、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，
０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，１％ＮａＮ３．５０％グ
リセリンを含有するＩＢ／Ｊウシ血清アルブミン（Ｂ　
Ｓ　Ａ）中に−１５℃で保存した。酵素活性及び蛍光の
結果によれば複合体は酵素１モルあたりＦａｂ’４．１
モルを含んでいた。

１１、Ｆａｂ’−−ガラクトシダーゼ　　の・製 複合体を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，
４，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，０．１５ＭＮａＣ１，０
，５％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．０５％　
ＮａＮ３中、４ｏｈｇ／μｍの使用濃度に希釈し、ＧＦ
／Ｆガラス繊維フィルター（英国メイドストーンの−ｈ
ａｔｍａｎ　Ｌｔｄ、製）、次に０．２２ｕｌｆＦ紙（
米国マサチューセッツ州ベッド７７？−ドの旧１１ｉｐ
ｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、製）テ濾過し、凝集した複合体を除
去した。

１２．２戸紙　の− １０ｃｍ幅の３１　Ｅ　Ｔ　Ｗｈａｔｍａｎ紙にトルエ
ン中０．２％エチルセルロースを含浸せしめ、乾燥して
１５ｃｍ片に切断した。多孔性粘着テープ（米国オハイ
オ州、パイネスビルのＦａｓｓｏｎ社製）の１０ｍｍ幅
の片を含浸された３１ＥＴ片に貼付しく一端から５■は
なす）、１２ｍ＋ｓ幅のＧＦ／Ｆガラス繊維リボンを粘
着テープの上に積層した。この片を小片に切断した。

１３、゛圧コー゛・８１Ｆｌｌ 減圧濾過装置は、ＧＦ／Ｆフィルターが片の端から端ま
で挿入されるように構成した０片を挿入すると、ＧＦ／
Ｆフィルターが減圧口の上部に配置され、装置のハンド
ルが下の位置に下げられると、傾斜した試薬供給口が下
がってＧＦ／Ｆフィルターパッド（１２■厘×５■）の
端部上にしっかりと設置され、減圧ラインが同時に開か
れた。

試験試薬を試薬供給口に滴加しく減圧開始）、ＧＦ／Ｆ
パッド及び支持ケーシングを通して濾過した。液体は処
理を簡単に行なうためにトラップ中に回収した。全ての
試薬が濾過されると片を減圧装置から取り外して基質を
添加するための５ｅｒａｌｙｓｅｒ　＠装置の台上に配
置した。

１４　、　Ｅ、　ｃａｌｉ　　　　　の・Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ溶解産物を対数増殖期［４〜７×１０６コロニ一形成
単位（ｃｐｕ）／、ｚｌのＥ。

ｃｏｌｉの培養物から調製した。培地から沈降した細胞
を、溶解媒体（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ！ａ衝液、ＰＨ７
，３，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２００ｘｇ／−リゾチー
ム）中に再懸濁し、３７℃で１０分間イノキュベートし
た。細胞性廃棄物を遠心分離によって除去し、上澄み液
を０．１％ＳＤＳにして、容量を５０ｍＭ　　丁ｒｉｓ
緩衝液、ｐＨ７，３，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡによって元
の培養容量に調節した。　５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
文、ｐＨ８，０，１゜ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤ
Ｓ中の溶解産物のアリコートもまた６０℃で１０分間イ
ンキュベートし、−２０℃で保存して使用の際には所望
の使用濃度に希釈して用いた。

１５　、ｒＲＮＡの・ Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞からｒＲＮＡを調製し、２３ｓ成分
をスクロース密度勾配遠心［ＭｃＣｏｎｋｅｙ、　Ｍｅ
ｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　　１２ａ　：　６２０　（１９６
７）及び↑ａｋａｎａｍｉ、　　Ｍｅｔｈ、　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、、　　１　２　　ａ　　：　　４９　１（１
９６７）］によって単離した。

１６、ｒＲＮＡに　　ＤＮＡ−ラー−ス　ハ木方法は次
の工程からなる。

（ａ）　ｒ　ＲＮＡ　（１、Ｏｎｇ／ａ／）又はＥ、　
ｃｏｌｉ溶解産物５０ル文を円錐形遠心管にピペットで
加えた。

（ｂ）プローブＤＮＡ−ラテックスを含有する２つのハ
イブリッド形成溶液（前述）５０川文を全て加えた。

（ｃ）管を８０℃で１０分間（又は他の指定時間）イン
キュベートした。

（ｄ）２ｇｇ／＋＋ＪのＦａｂ’−β−ガラクトシダー
ゼ複合体１００　ｇｌを加え、良く混合し、室温で３０
分間（又は他の指定時間）放置した。

（ｅ）次に、洗浄緩衝液［５０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ７，４，０，５ＭＮａＣ文。

１０ｍＭ　　Ｍｇ０文２．０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０及び０．０５％（ｗハ）アジ化ナトリウム］　５
００用文を加え、減圧を開始している減圧装置に取り付
けられたか紙パッド片上に内容物を注いだ、管を洗浄緩
衝液５００ＩＬ１で洗浄し洗浄液を濾紙上に注いだ、濾
紙を洗浄緩衝液２．０−で洗浄した。

（ｆ）Ｆ紙片を濾過装置から取り外し５ｅｒａｌｙｚｅ
ｒ＠反射率測定計の台上に配置した。５ｍＭ基質試薬［
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４，５ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２，０．０５％アジ化ナトリウム及び５．
０ｍＭクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Ｋｕｈｒの西独間特許公報　ＤＥ３３４５７４
８号、１９８５年）］３０ル文をフィルター上に滴加し
た。５７０ｎ層における反射率を３０秒から６０秒まで
５秒間隔で測定した０反射率をに／Ｓ値［Ｇｒｅｙｓｏ
ｎ、　Ｊ。

Ａｕｔｏｍａｔ、　　Ｃｈｅｗ、、　　３　　：　　６
　５　　（１９８１）　　］　　に変換し、速度を計算
した。

１７、ハイブリード／　　　Ｈ′ 一連のハイブリッド形成混合物を、緩衝液５０座文又は
ｔｏ、０ＯＯＣＦＵ／μｍのレベルのＥ、　ｃｏｌｉ溶
解産物５０牌文を用いてそれぞれの試験管中に調製した
。管を８０℃の水浴中で与えられた時間インキュベート
シ、上記記載のようにして、３７℃においてＦ　ａ　ｂ
’−β−ガラクトシダーゼの結合を３０分間行なうこと
によってハイブリッドを試験した。この試験結果を、図
１においてハイブリッド形成時間に対してプロットした
。

溶解産物との混合物及び緩衝剤対象物との混合物に対す
る結果を、それぞれ白丸及び黒丸で示した。この結果よ
りハイブリッド形成が１５分で完了したことが確認され
た。

１８−至ヌ上芳Ｊ 全試験時間を短縮することに関する研究においては、ハ
イブリッド形成混合物中のＦ　ａ　ｂ’−β−ガラクト
シダーゼ複合体のＤＮＡ　：　ＲＮＡに対する結合をよ
り詳細に実験した。一連のハイブリッド形成混合物を、
−試験あたり細胞数２５００に相当するＥ、　ｃｏｌｉ
溶解産物によって調製した。

統〈ハイブリッド形成において、２．５ｐ、ｇのＦａｂ
゛−β−ガラクトシダーゼ０．４−を加え、混合して種
々の時間放置した。ラテックスをガラス繊維フィルター
上に回収し、ｐＨ７，４のかわりにｐＨ７，９に調節し
た洗浄緩衝液で洗浄することによって複合体結合を終結
させた。洗浄液には、１．０ｍＭの７−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシ−９，９−ジメチル−アクリジン−
２−オン（１９８６年１２月９日に出願され、通常のよ
うに譲渡された米国特許出願第９３９，８５５号におい
て記載されたようにして合成した）も含有せしめた。５
３４ｎ■における反射率によって測定された発色速度に
よって、複合体の結合は最初の２分間に速やかに進行し
、続いて、非常に遅い速度で進行することが示された。

複合体に関しては３分間の結合時間が選択された。

更なる実験において、１０分間のハイブリッド形成、３
分間の複合体結合及び３分間の酵素活性測定を用いた。

細胞数２５００に相当するＥ、　ｃｏｌｉ　をハイブリ
ッド形成混合物に加えた際に、基質の酵素加水分解によ
って生成する青色がはっきりと視認された。したがって
、この数の細胞は２０分未満しか必要としない工程によ
って検出できた。

１９．７　　ハ　ブリー１／ 周知のハイブリッド形成法の時間の限界を測定するため
に、文献方法及び本実験室において従来用いていた方法
に関する実験を行なった。実験結果を次表１に示した。

参考文献は以下のものである。

１、Ｙｅｈｌｅ　ら、Ａｃｃｅｐｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｕ
ｂｌｉｃａ目ｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、（及び下記参照文献４） ２　、　ＭｃＧａｒｒｉｔｙ、　Ｇ、　Ｊ、及びＫｏｔ
ａｍｉ、　Ｈ，（１９８６）Ｅ！Ｔ１．　Ｃｅ１１．　
Ｒｅｓ、　　１６３　：　２７３−２７８３　、　Ｌａ
ｎｇｄａｌｅ、　Ｊ、　Ａ、及びＭａｌｃｏｌ＋＊、　
Ａ、　Ｄ、　Ｂ。

（１９８５）Ｇｅｎｅ　　３６：２０１−２１０；Ｍａ
ｌｃｏｌｍ、　Ａ、　Ｄ、　Ｂ、及びＬａｎｇｄａｌｅ
、　Ｊ、　Ａ。

（１９８４）ＰＣＴＷＯ８６１０３７８２４、Ｃａｒｒ
ｉｃｏ、　Ｒ，Ｊ、、ヨーロッパ特許公報第１６３．２
２０号 ５　、Ｂｏｇｕｓｌａｗｓｋｉ、　Ｓ、　Ｊ、　（１９
８６）　Ｊ、　ｔｌｌｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　　８９　　：１２３　　。

６　　、　Ａｍａｓｉｎｏ、　　Ｒ，Ｍ、　（１９８６
）　Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｌｌ。

１５２：３０４゜ 子　　（！！′″′　　燭８　　や８　　口　　　も　
　　謳上記記載の方法において、プローブ用固体担持体
としてそれぞれ独立した水懸濁性微粒子を用いることに
より従来の公知方法よりも著しく短い時間でハイブリッ
ド形成試験を行なうことができることは明白である。

以上、本発明を特に例示することによって記載した０本
発明の多くの他の変更及び修正を本発明の精神及び範囲
から逸脱することなしに行なうことができることは明ら
かである。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のハイブリッド形成反応における反射率の
時間経過及び緩衝液を用いた参照を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ｉ）試験媒体を、ハイブリッド形成条件下で、固
   定化形態のポリヌクレオチドプローブと結合せしめ、得
   られた固定化相を分離し、ハイブリッド化プローブを、
   プローブ及び測定すべき配列のハイブリッドと選択的に
   結合するが単鎖核酸とは実質的に結合しない試薬と結合
   せしめることによって検出するか、あるいは、 （ｉｉ）試験媒体を処理してその中の単鎖核酸を標識化
   せしめ、固定化形態のポリヌクレオチドプローブをハイ
   ブリッド形成条件下で加え、得られた固定化相を分離し
   標識体を測定することによってハイブリッド化プローブ
   を検出する、単鎖核酸を含有する試験媒体中の特定のポ
   リヌクレオチド配列を測定する方法であって、 固定化形態の、ポリヌクレオチドプローブとして、それ
   ぞれ独立した水懸濁性微粒子に付着させた該プローブを
   用い、それによってハイブリッド形成及び分離工程を約
   ３０分以内で完了せしめうることを特徴とする方法。 ２、ハイブリッド形成媒体中の該微粒子の懸濁液の濁り
   度が７０％減少するのに少なくとも約３０分かかる請求
   項１記載の方法。 ３、ハイブリッド形成媒体中の該微粒子の懸濁液の濁り
   度が５０％減少するのに少なくとも約３０分かかる請求
   項２記載の方法。 ４、ハイブリッド形成媒体中の該微粒子の懸濁液の濁り
   度が２５％減少するのに少なくとも約３０分かかる請求
   項３記載の方法。 ５、該微粒子が約１．０３〜約１．０８ｇ／ｍｌの比重
   を有する請求項１記載の方法。 ６、該微粒子が非孔質ポリスチレンラテックス粒子であ
   る請求項１記載の方法。 ７、該粒子が約０．１〜約２０μｍの平均径を有する請
   求項１記載の方法。 ８、該ポリヌクレオチドプローブが該微粒子に共有結合
   している請求項１記載の方法。 ９、該微粒子固定化相を濾過によって分離する請求項１
   記載の方法。 １０、該微粒子が磁性を有するか、磁化可能であり、該
   微粒子−固定化相を、磁場を施すことによって分離する
   請求項１記載の方法。 １１、ハイブリッド選択性結合試薬が酵素的に活性な基
   、蛍光剤、発色団、発光剤、金属ゾルで標識されるか、
   又は、試料核酸に導入される標識体がリガンドであって
   、酵素的に活性な基、蛍光剤、発色団、発光剤又は金属
   ゾルで標識化された結合相手との結合によって検出可能
   であり、それによってハイブリッド形成、分離及び検出
   工程の全てを約３０分以内に完了することができる請求
   項１記載の方法。 １２、（ａ）試験媒体を、ハイブリッド形成に適した条
   件下で、検出される配列と実質的に相補的な単鎖塩基配
   列を有する固定化形態のポリヌクレオチドプローブと結
   合させ、それによってハイブリッド形成混合物を生成し
   、 （ｂ）該ハイブリッド形成混合物に抗ハイ ブリッド抗体試薬を加え、 （ｃ）固定化相と結合した抗ハイブリッド 試薬を残りのハイブリッド形成混合物から分離する、単
   鎖核酸を含有する試験媒体中の特定のポリヌクレオチド
   配列を検出する方法であって、 固定化形態のポリヌクレオチドプローブとして、それぞ
   れ独立した水懸濁性微粒子に付着した該プローブを用い
   、それによってハイブリッド形成及び分離工程を約３０
   分以内で完了せしめうることを特徴とする方法。 １３、ハイブリッド形成媒体中の該微粒子の懸濁液の濁
   り度が５０％減少するのに少なくとも約３０分かかる請
   求項１２記載の方法。 １４、該微粒子が約０．５〜約５μｍの平均径を有する
   非孔質ポリスチレンラテックス粒子であり、ポリヌクレ
   オチドプローブが該粒子に共有結合している請求項１２
   記載の方法。 １５、該抗ハイブリッド抗体試薬が、ＤＮＡ・ＲＮＡハ
   イブリッドに対して結合選択性を有するものであり、プ
   ローブ及び検出される配列の一方がＤＮＡであり他方が
   ＲＮＡである請求項１２記載の方法。 １６、該抗ハイブリッド抗体試薬が二重鎖ＲＮＡに対し
   て結合選択性を有するものであり、プローブ及び検出さ
   れる配列の両方がＲＮＡである請求項１２記載の方法。 １７、該抗ハイブリッド抗体試薬が二重鎖ＤＮＡに対し
   て結合選択性を有するものであり、プローブ及び検出さ
   れる配列の両方がＤＮＡである請求項１２記載の方法。 １８、該抗ハイブリッド抗体試薬が層間鎖体に対して結
   合選択性を有するものであり、プローブと検出される配
   列との間で生成するハイブリッドが、層間錯体としてそ
   れに結合した核酸挿入剤からなるように形成されている
   請求項１２記載の方法。 １９、該抗ハイブリッド抗体試薬が検出可能な化学基に
   よって標識化されている請求項１２記載の方法。 ２０、検出可能な化学基が酵素的に活性な基、蛍光剤、
   発色団、発光剤又は金属ゾルであり、それによってハイ
   ブリッド形成、分離及び検出工程の全てが約３０分以内
   で完了せしめうる請求項１９記載の方法。 ２１、試験媒体中の特定のポリヌクレオチド配列を核酸
   のハイブリッド形成によって測定する試薬系であって、 （ｉ）測定される配列に実質的に相補的な単鎖塩基配列
   を有する固定化形態のポリヌクレオチドプローブであっ
   て、該プローブがそれぞれ独立した水懸濁性微粒子に付
   着しているもの、及び （ｉｉ）該プローブと検出される配列との間に形成され
   たハイブリッドに対して結合選択性を有する抗ハイブリ
   ッド抗体試薬からなることを特徴とする試薬系。 ２２、用いられるハイブリッド形成媒体中の該微粒子の
   懸濁液の濁り度が７０％減少するのに少なくとも約３０
   分を要する請求項２２記載の方法。 ２３、用いられるハイブリッド形成媒体中の該微粒子の
   懸濁液の濁り度が５０％減少するのに少なくとも約３０
   分を要する請求項２２記載の方法。 ２４、用いられるハイブリッド形成媒体中の該微粒子の
   懸濁液の濁り度が２５％減少するのに少なくとも約３０
   分を要する請求項２３記載の方法。 ２５、該微粒子が約１．０３〜約１．０８ｇ／ｍｌの比
   重を有する請求項２１記載の試薬系。 ２６、該微粒子が非孔質ポリスチレンラテックス粒子で
   ある請求項２１記載の試薬系。 ２７、該粒子が約０．１〜約２０μｍの平均径を有して
   いる請求項２１記載の試薬系。 ２８、該ポリヌクレオチドプローブが該微粒子に共有結
   合している請求項２１記載の試薬系。 ２９、該微粒子が磁性を有するか磁化可能である請求項
   ２１記載の試薬系。 ３０、該抗ハイブリッド抗体試薬が、ＤＮＡ・ＲＮＡハ
   イブリッドに対して結合選択性を有するものであり、プ
   ローブ及び検出される配列の一方がＤＮＡであり他方が
   ＲＮＡである請求項２１記載の試薬系。 ３１、該抗ハイブリッド抗体試薬が二重鎖ＲＮＡに対し
   て結合選択性を有するものであり、プローブ及び検出さ
   れる配列の両方がＲＮＡである請求項２１記載の試薬系
   。 ３２、該抗ハイブリッド抗体試薬が二重鎖ＤＮＡに対し
   て結合選択性を有するものであり、プローブ及び検出さ
   れる配列の両方がＤＮＡである請求項１２記載の試薬系
   。 ３３、該抗ハイブリッド抗体試薬が層間鎖体に対して結
   合選択性を有するものであり、プローブと検出される配
   列との間で生成するハイブリッドが、層間錯体としてそ
   れに結合した核酸挿入剤からなるように形成されている
   請求項２１記載の試薬系。 ３４、該抗ハイブリッド抗体試薬が検出可能な化学基に
   よって標識化されている請求項２１記載の試薬系。 ３５、検出可能な化学基が酵素的に活性な基、蛍光剤、
   発色団、発光剤又は金属ゾルである請求項３４記載の試
   薬系。