NO881203L - Hurtig hydridiseringsanalyse med bruk av lateximmobilisert probe. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører nukleinsyrehybridiseringsanalyse-fremgangsmåter og reagenssystemer for deteksjon av spesifikke polynukleotidsekvenser. Oppfinnelsen innbefatter spesielt hybridiseringsanalyser som kan bli utført på relativt kort tid, f.eks. på under 30 minutter fra begynnelsen av hybridiseringen til måling av signaler som blir dannet, ved å følge hensiktsmessig protokoller.

Nukleinsyrehybridiserings-analyser er basert på veldig spesifikk baseparring mellom den polynukleotidsekvens som er av interesse og en komplementær probepolynukleotidreagens. Slike analyser er nyttige som en analytisk fremgangsmåte innen human- og veterinærmedisin, Jordbruk matvitenskap og andre. Fremgangsmåten kan bli brukt til å detektere og identifisere etiologiske midler som bakterier og virus, for å screene mikrober for antibiotikaresistens, og for å detektere ondartede celler.

Det er gått flere år siden det er blitt oppdaget at nukleinsyrehybridisering gir en potensiell veldig nyttig basis for analyser som er av kommerisell interesse. I denne tiden er det blitt gjort mange fremskritt og fordelinger av de tradisjonelle fremgansmåter som er blitt brukt innenfor området, spesielt når det gjelder grunnforskning for å gjøre dem mindre komplekse, og tidkrevende. Til tross for disse forsøkene, er de fremgangsmåtene som nå er best kjente veldig vanskelige, og krever enda flere timer for å fullføres. For å ha et hovedkommersielt nedslagsfelt bør analysen ikke ta mer enn 30 minutter.

De viktigste hybridiseringsfremgangsmåtene som er kjent idag er basert enten på immobilisering av prøven eller probepoly-nukleotidet eller på hybridisering av begge tråder mens de er i oppløsning etterfulgt av en selektiv fremgangsmåte - for separering av hybridisert og ikke-hybridisert probe. Immobilisering av prøvenukleinsyrene er plaget med et antall problemer, spesielt signifikant er problemene når det gjelder de vanskelige og tidkrevende fremgangsmåtene som er invol-vert og vanskeligheten med å kontrollere ikke-spesifikk adsorpsjon av interferense substanser fra de normalt veldig heterogene prøver. Introdusering av analyseformater som tillater bruk av immobiliserte prober har i prinsippet løst disse spesielle problemene, men har ikke før foreliggende oppfinnelse tillatt at analysene utføres på mindre enn noen timer.

Faste bærere som vanligvis blir brukt for immobilisering av nukleinsyrer for hybridisering er mikroporøse membraner sammensatt av nitrocellulose eller nylon. Hybridiseringen blir vanligvis utført ved at membranen er omgitt av hybridi-seringsvæske som inneholder den komplementære nukleinsyre-sekvens. Selv om de mikroporøse membranene kan ha et høyt overflateareal, består mesteparten av overflaten av indre porer som ikke er i nær kontakt med hele hybridiserings-væsken; derfor er nukleinsyrenes diffusjonsveier lange og hybridiseringsgraden er sakte. Etter hybridiseringen blir probenukleinsyre som er i overskudd fjernet fra membranen ved neddypping i vannoppløsning. En betydelig tidsmengde kreves for å tillate diffusjon av nukleinsyren fra innsiden av porene. Hvis det i tillegg blir benyttet reagenser som enzymmerker for å detektere hybrider, må disse få tid til å diffundere inn i porene og deretter trengs det ennå mere tid for å fjerne merker som er i overskudd ved bruk av vas-ketrinn.

I-oppløsning-nukleinsyrehybridiseringen er blitt formulert fordi det ble oppdaget at slike hybridiseringer er raskere enn to-fasesystemer, siden den oppløste nukleinsyren ikke må diffundere til en fast overflate for at hybridisering skal oppstå. Etter hybridisering kan den hybridiserte ikke-hybridisert-merkede proben bli separert med hydroksylapatitt som selektivt binder hybridene. Hydroksylapatittfremgangsmå-ter er imidlertid blitt benyttet bare for radioaktivt å merke probene, fordi hydroksylapatitt også binder mange ikke- radioaktive merker. I tillegg er selektiviteten for enkelttrådet versushybridisert probe ikke absolutt; derfor fører økning i nivået av proben til økende bakgrunnssignal i fravær av hybriddannelse. Som et resultat av dette, kan den merkede proben ikke bli brukt i et stort overskudd for å akselerere hybridiseringsfastheten. Derfor kreves ennå flere timer for at analysen skal bli fullført.

Sandwich-hybridisering er også blitt studert fordi den ikke krever immobilisering av nukleinsyreprøven. Den benytter en immobilisert probe og en oppløselig, merket probe som hybridiserer til forskjellige segmenter av prøvetråden. Denne fremgangsmåte krever derimot lengere hybridisering fordi tre nukleinsyretråder må komme sammen for å danne detekterbare hybrider.

Bruk av immobi1 iserte eller immobiliserbare prober for å for-enkle hybridiseringsanalysene er blitt foreslått. I en fremstilling blir de resulterende immobiliserte hybridene detektert ved binding av merket anti-hybridantistoffreagens (se EP-publ. 163.220). Foreslåtte faste faser for proben innbefatter mikropartikler, kuler, membraner o.l. hvor de spesifikke eksemplifiserte fremgangsmåtene bruker store, vannuoppløselige partikler som medfører analysetider på noen timer. I en annen fremstilling blir selve prøvenukleinsyrene først merket, f.eks. ved kontakt med et merket fotokjemisk reaktivt DNA-intercalerende middel, etter separasjon, blir de resulterende, merkede hybridene detektert (se EP-PS 87 102 577.1 og henvist til Molecular Diagnostics, Inc., "West Haven CT, USA). Igjen har den spesielle seleksjon av bærere medført at analysetidene er blitt holdt på over noen timer.

Det er derfor nøvendig med et nukleinsyrehybridiseringsformat som vil medføre at utførelsen av analysene skjer på under en time, spesielt under det kommersielle målet på 30 minutter, uten at dette påvirker hensiktsmessigheten eller analyseut-førelsen. En annen fordel ville være at man kunne bruke en ikke-radioaktiv deteksjonsfremgangsmåte, spesielt en visuell eller spektrometrisk fremgangsmåte.

Bruk av mikropartikler, innbefattet lateks, er blitt foreslått i litteraturen som en fast fase for separering av detektering av hybrider. Noyes og Stark (1975) Cell 5:301 kovalent koblet SV40 DNA til diazotisert m-aminobenzyloksy-metylcellulose-partikler 0,5 til 1,0 pm i diameter. Hybridisering med<3>H-merket probe krevde omtrent 24 timer for full-førelse. EP-publ. 154.505 foreslår at faste faser Innbefat-tende latekspartikler kan bli brukt for immobilisering av DNA-prober for bruk ved sandwich-hybridisering. Fremgangsmåter for kovalent immobilisering av DNA til slike partikler og utførelse av produktet i aktuelle analyser er ikke diskutert. Bruk av latekspartikler, spesielt som merker, i sandwich-hybridisering er altså beskrevet i EP-publ. 159.719. PCT-søknad WO 86-03782 beskriver Immobilisering av DNA på kryssbundne makroporøse celluloseholdige harpikspartikler på 40 til 60 pm diametere. Inkuberingsperioder på 2 til 4 timer var nødvendig for å fullføre sandwich-hybridisering.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nå nukleinsyrehybri-diseringsanalyser som kan bli fullført i 30 minutter eller mindre fra begynnelsen av hybridisering til måling av dannet signal. Hybridiseringsanalyse basert på bruken av immobilisert probe er signifikant forbedret ved bruk av diskrete, vannsuspensible mikropartikler, dvs., latekspartikler, som den faste fase bærer proben. Vannsuspensibi1iteten av mikropartiklene og deres høye overflateareal tillater at kinetikken av hybridiseringsreaksjonen er vesentlig så rask som bindingen skjer når begge nukleinsyretråder er i oppløsning. Den bestemte naturen til den faste fasen muliggjør rask, hensiktsmessig og effektiv separasjon av merket materiale assosiert med dannede hybrider fra det ikke-reagerte merket.

Bruk av lateks-immobilisert probe er spesielt fordelaktig i de hybridiseringsformatene som inbefatter deteksjon av merket anti-hybrid-antIstoffreagens eller ved bruk av måter å merke prøvenukleinsyrene før hybridisering. I begge tilfeller kan måling av merket, spesielt når det gjelder den ikke-radioiso-topen, f.eks., enzym, utføres veldig raskt etter separasjon av lateks-hybrid-reaksjonsproduktet. Bare ett separa-sjonstrinn er nødvendig, selv når merket antihybrid blir benyttet, siden et slikt reagens kan bli tatt til hybridiseringsblandingen og de resulterende lateks-hybrid:merkede antistoffprodukter separert ved bruk av hensiktsmessig fremgangsmåte .

En spesielt foretrukket fremstilling av foreliggende fremgangsmåte bruker enzym-merket anti-hybrid for å detektere hybridiseringsprodukter og muliggjør separasjon av de ultimate lateks-hybrid:merkede antistoffprodukter ved filtrering. De filtrerte enzym-merkede latekspartiklene kan deretter lett bli målt visuelt eller spektrofotometrisk etter tilsetting av en oppløsning bestående av kromogene eller fluorgent substrat for enzymet.

Foreliggende oppfinnelse erkarakterisert vedet stort antall av signifikante fordeler. Siden DNA-lateks danner en uniform suspensjon, kan den tilsettes dråpevis eller ved pipettering på samme måte som i vannholdig væske. Kontakt av hele væsken med lateksoverflaten er optimal fordi partiklene er jevnt fordelt gjennom væsken og overflatearealet er veldig stort. Diffusjonsveier for den oppløste nukleinsyre til den immobiliserte nukleinsyre på partikkeloverflaten er kort og med-fører raske hybridiseringsresultater.

Etter at hybridiseringstrinnet er fullført og et merket bindingsreagens ble brukt for å detektere hybridene, tilveiebringer latekspartiklene igjen et system som fremmer rask reaksjon fordi de er spredt gjennom væsken og et stort overflateareal er eksponert for bindingsreagenset. Når bindingen er fullstendig, må bindingsreagens som er i overskudd, fjernes. Dette kan hensiktsmessig bli utført ved å samle partiklene på et filter. Valseoppløsning kan deretter bli sendt gjennom filteret, som dermed spyler bort overflødig merket bindingsreagens. Vaskingen kan bli fullført på mindre enn ett minutt.

Siden partiklene blir konsentrert i et lite volum på filteret, kan signalet fra merket på en effektiv måte bli målt. Hvis det bl.a. blir benyttet en koiorimetrisk gjennomlesning av enzymmerket, blir kromoforet dannet i et lite volum rundt de konsentrerte partiklene og kan dermed bli målt raskere enn hvis kromogenet var fortynnet i et væskevolum. Analyser som benytter latekspartikler kan bli fullført i 30 minutter eller mindre fordi hybridisering, vasking og deteksjonstrinnene er raske. Fig. 1 er en grafisk fremstilling av tidskurven til hybridiseringsreaksjonen mellom en prøve nukleinsyre i oppløsning og lateksmobilisert probe (åpne sirkler). Resultatene med en bufferkontroll (lukkede sirkler) er også vist. Resultatene demonstrerer at hybridiseringen var fullført etter bare 15 minutter. Fig. 2 er en tabell som sammenligner analysetidene for foreliggende oppfinnelse med de viktigste tidligere metodene. Når det gjelder foreliggende fremgangsmåte, er det bare nødvendig med 20 minutter fra Initiering av hybridiseringen opptil deteksjonstrinnet, mens den korteste tiden, når det gjelder tidligere metoder, er i området på 2-3 timer.

Hovedtrekkene ved foreliggende oppfinnelse er evnen til å utføre en hybridiseringsanalyse fra begynnelsen av hybridiseringen til minst separasjonssteget på mindre enn- 30 minutter, fortrinnsvis mindre enn 20 minutter, og optimalt innpå omtrent 15 minutter. Formatene til hybridiseringen som ble brukt i foreliggende oppfinnelse, tillater bruk av raske detekteringssystemer slik at hele analysen, til og med måling av dannet signal, kan bli fullført i mindre enn omtrent 30 minutter, og vanligvis på mindre enn 20 minutter. Disse tidsperiodene er fundamentalt uavhengig av konsentrasjonen av sekvensen som er av interesse i testprøven, innenfor begrens-ningene av deteksjonen av det signaldannende system som ble brukt, fordi store overskudd av probe kan bli brukt til å drive kinetikken, og hybrldiseringsreaksjonen foregår essensielt som om begge trådene var i oppløsning.

En bør merke seg at lateksmikropartikler, slik det blir betegnet heri, er generelt diskrete, vannblandbare partikler i slik størrelse og komposisjon at de danner en sakte, settende suspensjon i væskehybridiseringsmedium. Den spesielle kjemiske sammensetningen av slike partikler kan variere slik det blir diskutert nedenfor.

Prober kan generelt innbefatte hvilket som helst polynukleotid som er kjent innen fagområdet, eller som kan bli fremstilt ved bruk av tilgjengelige fremgangsmåter, hensiktsmessig spesifikk deteksjon av den ønskede polynukleotid-sekvensen ved hybridisering. Proben vil være DNA eller RNA og vil innbefatte minst en enkel trådbasesekvens som er vesentlig komplementær til sekvensen som skal detekteres. Dets lengde kan variere svært, varierende fra så få som omtrent ett dusin eller så mange som flere tusen baser, og inbefatte oligonukleotider som har mindre enn 50 baser.

Prober kan bli tilveiebragt på flere forskjellige fremgangsmåter. Når det gjelder RNA-prober, kan f.eks. RNA bli isolert i form av de naturlige produktene til cellene, så som 5s, 16s og 23s ribosomale RNA-er som bakteriell eller cellulær transfere RNA-er. Det er også praktisk å isolere spesifikke messenger RNA-er fra cellene som spesialiserer-seg i fremstilling av store mengder av et protein som messenger RNA koder for.

In vitro-syntese av RNA-prober kan utføres med en vektor som inneholder den veldig aktive Salmonella typhimurium bakteriofag SP6 transkripsjonspromoteren. Vektorer med multiple restriksjonsendonukleaseseter ved siden av promoteren er tilgjengelige. En DNA-probe blir klonet inn i vektoren som deretter blir propagert i en bakteriell vert. Multiple RNA-kopier av den klonede DNA-proben kan bli syntetisert in vitro ved bruk av DNA-avhengig RNA-polymerase fra bakteriofag SP6 .

DNA-prober kan bli fremstilt fra forskjellige kilder. Et helt bakterielt genom kan bli immobilisert for en hybridiseringsanalyse som skal detektere bakterier i en typisk steril prøve. Analysen vil ha evnen til å detektere bakterielle RNA-er som er tilstede i store mengder så som ribosomal RNA og transfer RNA. Alternativt, såkalt spesifikke DNA-sekvenser, ble klonet inn i velkjente plasmid- eller virale vektorer, og brukt som hybridiseringsprober.

Prøvene som skal analyseres kan innbefatte hvilke som helst stoffer som er av interesse, og vil vanligvis være av medisinsk, veterinær, miljømessig eller industriell betyd-ning. Menneske- og dyreeksperiment, kroppsvæske og eksudater, kan bli analysert ved foreliggende metode, innbefattet urin, blod, melk, ryggmargsyæske, spytt, avføring, lungeoppspytt, halsvattpinne, genitale vattpinner og eksudater, rektale vattpinner og nesesvelgoppspytt. En analyse som er av spesiell interesse er deteksjon av bakterier i urin og ryggmargsvæske. I tilfeller hvor testprøven fra en pasient eller annen kilde inneholder celler, vil prøven bli behandlet slik at nukleinsyrene frigjøres. Hvis de er enkelttrådet, kan de bli analysert ved bruk av foreliggende fremgangsmåte. Hvis nukleinsyrene er dobbelttrådet, vil en fremgangsmåte bli benyttet for å denaturere dem. Denaturering tilveiebringes fortrinnsvis ved oppvarming i kokende vann eller ved alkalibehandling (f.eks., 0,1 M natriumhydroksyd), som, i noen tilfelle, kan bli brukt for samtidig å analysere cellene. Hvis målmaterialet er en RNA, vil alkalidenature-ring ikke bli benyttet fordi dette degraderer RNA. Frigjøring av nukleinsyrer kan også bli tilveiebragt ved mekanisk ødeleggelse (fryse/tine, avslipes, sonitering), psysisk/kjemisk ødelegging (detergenter slik som Triton, Tween, natrium-dodecylsulfat, osmotisk sjokk eller varme), eller enzymatisk lysering (lysozym, proteinase K, pepsin). Disse fremgangsmåtene vil medføre et testmedium med nukleinsyrer som er i enkelttrådet form, som kan bli analysert i henhold til foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte.

Mikropartikler ifølge foreliggende oppfinnelse, vil være av en slik sammensetning at de er vannsuspensible og stabile under hybridiseringsbetingelser, og fortrinnsvis vil innbefatte overflatekjemiske grupper som muliggjør kovalent binding av nukleinsyreprober. De vil fortrinnsvis være i tilstrekkelig størrelse som tillater filtrering, hvis slike fremgangsmåter for separasjon blir brukt, eller vil være magnetiske eller magnetiserbare for magnetisk separasjon.

Når det gjelder filtrering, er polystyren-latekspartikler på omtrentlig 1 pm diamater, og som enten har karboksyl eller amidooverflategrupper, ideelle for dette bruk. Karboksylat-og amidmodif isert lateks blir fremstilt ved bruk av fremgangsmåten til Mani s (US-PS 4.094.841). Mer generelt kan latekser bli fremstilt ved emulsjonpolymerisering og suspensjonspolymeriseringsfremgangsmåter [Bangs, L.B. (1984) Uniform Latex Particles, Seragen Diagnostics Inc., In-dianapolis, IN, USA]. Svellet emulsjonspolymerisering kan også bli benyttet [Ugelstad, J. et al (1980) Adv. Colloid and Interface Sei., 13:101-140].

Latekspartikler består ofte av polystyren eller kryss-bundet polystyren svarende til en tetthet på rundt 1,05 g^ml. Partikler med en tetthet på så lav som 1,00 g/ml kan bli fremstilt med en kopolymer av vinyl-toluen/tertiær butylsty-ren. Partikler med veldig høy tetthet (opp til 1,19 g/ml) kan bli fremstilt ved polymetylmetaakrylat. Andre polymerer og kopolymerer kan bli benyttet for å lage partikler. Det beste valget vil avhenge av tettheten på hybridiseringsmediumet og kjemien som blir brukt for kobling av DNA- eller ENA-prober til partikkeloverflaten.

Det mest kritiske trekket til mikropartiklene som blir brukt til å immobilisere proben er vannsuspenslbiliteten siden dette karaktertrekket er hovedsakelig ansvarlig for den raske hybridiseringskinetikken som er observert. Slik det blir brukt heri, vil egenskapen når det gjelder vannsuspen-sibllitet forstås å bety at vesentlig all, eller i hvertfall en signifikant del av partiklene som opprinnelig blir puttet inn i suspensjonen, forblir generelt jevnt fordelt i væsken og ikke faller ut eller flyter til toppen av hybridiserings-oppløsningen i løpet av reaksjonstiden. De ytre grenser på graden hvorpå mikropartiklene kommer ut av suspensjon som kan tolereres, vil variere noe, avhengig av volumet til hybridi-seringsoppløsningen (mer til punktet, avstand fra overflaten av oppløsningen ned til beholderbunden) og hybridiseringstiden. Ved normale reaksjonsvolumer og en ønskelig hybridi-seringstid på under 30 minutter, Innbefatter en nyttig definisjon av vannsuspensibilitet at turbiditeten til suspensjonen i hybridiseringsblandingen ikke vil avta så mye som omtrent 70$, vanligvis 50$, og fortrinnsvis 25%, i mindre enn 30 minutter.

Lateks-mikropartikler kommer ut av suspensjon Ifølge en funksjon av flere parametere, som innbefatter partikkelstør-relser, overflateladning og tetthet, og viskositeten, tetthet og temperaturen til væsken hvori de er suspendert. Med hensyn til størrelse, vil partikler som er veldig små være vanskeligere å separere fra hybridiseringsmediumet i påfølgende analyse. På den andre side vil veldig siore partikler mangle tilstrekkelig overflateareal for den immobiliserte nukleinsyreproben og har mindre sannsynlighet for å forbli suspendert i løpet av hybridiseringen.

For å oppnå optimale hybridiseringsbetingelser, er det viktig at partiklene forblir så jevnlig blandet som mulig i løpet av hybridiseringsmediumet. Dette minimaliserer diffusjonsveien mellom den oppløselige nukleinsyren og den immobiliserte proben.

Med normale hybridiseringsbetingelser i væskeblandingen, vil partikler som kan benyttes generelt være mellom omtrent 0,1< og omtrent 20 pm, vanligvis omtrent mellom 0,5 og 5 pm i diamter, men kan være så små som 0,05 pm eller så store som 50 pm. Tettheten til partiklene vil generelt variere fra mellom 1,0 g/ml til omtrent 1,2 g/ml, med spesielt foretrukket densitet liggende mellom omtrent 1,03 g/ml og omtrent 1,08 g/ml. Porøsiteten er generelt et ikke-kritisk trekk ved pariklene. Porer i store størrelser som tillater makromoleky-ler så som nukleinsyrer, kan øke overflatearealet til partiklene og dermed tillate en større kvantitet av festede nukleinsyrer pr. vekt av partikkelen. Porene kan derimot også gjøre vaskeeffektiviteten av partiklene dårligere.

Komposisjonen av partiklene kan være slik at de inneholder overflategrupper som tillater immobilisering av nukleinsyre. Eksempler for slike grupper er karboksylat, amid, epoksyd og fosfat; disse funksjonelle grupper blir vanligvis introdusert på latekset i siste fasen av partikkeldannelse og de kan bli benyttet med én gang eller etter videre kjemisk modifikasjon.

Det er også mulig å tilføre et belegg på partiklene til paramagnetiske mineraler så som magnetitt (Fe304) med polymerene som er diskutert ovenfor. Disse partiklene vil bli tiltrukket til en magnet som dermed vil lette separa-sjonen av lateks fra væskeanalysemediumet. Paramagnetiske mineraler kan også bli belagt med organosilaner som kan reagere med mineraloverflaten og/eller polymerisere_ på overflaten for tilveiebringelse av vannsuspensible partikler med diametere på 0,1 til 1,5 pm diamtere [Whitehead, R.A. et al (1985) US-PS 4.554.088]. Organosilaner kan ha funksjonelle grupper som deretter kan bli brukt for kobling av DNA eller RNA-prober.

DNA eller RNA-prober kan bli bundet til latekspartikler ved adsorpsjon gjennom elektrostatisk og/eller hybrofoblske interaksjoner. Kovalent binding er derimot foretrukket fordi proben ikke vil dissosieres fra latekset i løpet av lagring. En stor mengde av kovalente koblingsteknikker kan bli benyttet. En foretrukket fremgangsmåte innbefatter innføring av diazoniumgrupper på lateks og påfølgende reaksjon med guanin, tymin og urasile rester av polynukleotid [Noyes, B.E. og Stark, G.R., (1975) Cell 5:301-310; Reiser, J., et al,

(1978) Biochem, Biophys. Res. Commun. 85:1104-1112]. Fos-fatestergrupper kan bli innført på lateks og koblet til proben ved aktivering med et karbodiimid [Bautz, E.K.F. og Hall, B.D. (1962) Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA 48:400-408; Adler, A.J, og Rich, A. (1962 ) J. Am. Chem. Soc, 84:3977-3979]. Hydroksylgrupper og lateks kan bli brukt ved kobling gjennom fosfodiesterbindinger som dannes mellom det terminale fosfatet til polynukleotidet og hydroksylene ved vannopp-løselig karbodiimidaktiviering [Rickwood, D. (1972) Biochem. Biophys. Acta 269:47-50; Gilham, P.T. (1968) Biochem. 7:2809-2813] eller ved kobling av nukleofile seter på polynukleotidet med cyanogenbromidaktiverte hydroksyler [Arndt-Jorin, E.J., et al , , (1975 ) Eur. J. Biochem. 54:411-418; Linberg, U. og Eriksson, S. (1971) Eur. J. Biochem. 18:474-479]. De 3' -hydroksylterminale endene til RNA-prober kan bli oksyder med periodat og koblet ved Schiff-basedannelse med lateksbærende amin eller hydrazid-grupper [Gilham, P.T.

(1971) Meth. Enzymol. 21:191-197; Hanoske, H.D., et al,

(1979) Meth. Enzymol. 49:172-181]. Latekser med nukleofile seter kan bli reagert med cyanurklorid og deretter med polynukleotidet [Hunger, H.D. et al (1981) Biochem. Biophys. Acta 653:344-349]. I tillegg, kan fotoaktiverbare grupper-bli introdusert på latekset av DNA eller RNA-prober kan ble koblet ved aktivering med lys [Dattagupta, N. (1985) US-PS 4.542.102]. Et spesielt foretrukket lateksprobekonjugat er DNA eller RNA kovalent koblet til karboksylatmodifisert lateks (CML). En vinkel, N-[17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecyl]-3-N-BOC-aminofenylacetamid (amino-PEG-BOC-aminofenylacetamid) ble koblet til CML med vannoppløselig karbodiimid. Deretter blir BOC-blokkeringsgruppen fjernet med syre og arylamindiazoti-sert og koblet til proben DNA eller RNA.

Alternativ, blir N-[17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksahepta-decyl] -3-nitrobenzoamid (amino-PEG-nitrofenylacetamid) koblet til karboksylgruppene til CML med et vannoppløselig karbodiimid. Nitrogruppen blir redusert og omdannet til det diazoniumionet som kobles til nukleinsyreproben.

Det er hovedsakelig to hybridiseringsformater som kan dra fordeler av bruken av lateks-immobilisert probe i henhold til foreliggende oppfinnelse. Den første er spesielt foretrukket og kan bli referert til som antihybridformatet, og det andre er kjent som prøvemerkingsformat. Begge disse er blitt beskrevet i litteraturen, EP-publ. 163.220 og EP-PS 87 102 577.1, men vil i korthet bli beskrevet her.

I antihybridformatet, blir hybridene som ble dannet mellom prøvesekvensen som var av interesse og den immobiliserte proben detektert ved. binding av et reagens som selektivt binder slike hybrider, men som ikke binder seg til enkelt-trådede nukleinsyrer. Immobiliserte hybrider som det hybrid-rettede reagenset er bundet til, ble separert fra ubundet reagens og tilstedeværelse av reagenset detektert.

Det hybrid-rettede reagens vil innbefatte et antistoff eller fragmenter derav selektive for hybridene, og kan hovedsakelig bli selektert fra (a) antistoff til DNA•RNA eller RNA-RNA-hybrider, hvor en av probene og sekvensen som skal bestemmes av DNA og den andre er RNA, eller hvor begge er RNA, respektivt [se EP-publ. 163.220]; (b) antistoff til interkalerte hybrider, hvor hybridene som resulterer mellom proben og sekvensen som skal bestemmes blir dannet slik at den inneholder en nukleinsyreinterkalator bundet dertil som et interfluerende kompleks [se US-PS 4.563.417]; og (c) antistoff til dobbelt-trådet DNA, hvor både proben og prøvesekvensene er DNA [se US-PS 4.623.627]. Antihybridrea-genset vil fortrinnsvis være merket med en detekterbar kjemisk gruppe som medfører rask deteksjon. Essensielt kan hvilket som helst av de kjente merkene bli benyttet, men spesielt nyttige merker er enzymatisk aktive grupper, f.eks. enzymer, substrater og koenzymer, fluoreskere, kromoforer, luminesker, metallsoler eller ligander, f.eks. biotin eller haptener, som kan bli detektert ved binding av en bindingspartner merket med hvilket som helst av de ovenfor nevnte spesielt egnede merker. Slike merker kan raskt og hensiktsmessig fenerere et detekterbart signal, spesielt et optisk signal, som tillater hele analysefremgangsmåten fra initiering av hybridiseringen til separasjon å bli fullført på mindre nn ca. 30 minutter.

Prøvemerkingsformatet innbefatter et preliminært steg med behandling av testprøven for kjemisk å modifisere nukleinsyrene deri til å innføre et detekterbart merke. De merkede nukleinsyrene som hybridiserer til den immobiliserete proben vil inneholde den sekvensen som er av interese og, etter separasjon av ikke-hybridisert merkede nukleinsyrer, bli detekter direkte. Foretrukne merker er de som er beskrevet ovenfor. Merket kan innføres ved bruk av en hvilken som helst hensiktsmessig fremgangsmåte som er tilgjengelig eller som kan bli fremsatt, men spesielt foretrukket er bruk av merket, reaktiv, nukleinsyre-bindende ligander, spesielt de som er fotoreaktive. Fotoreaktive interkaleringsforbindelser som er blitt konjugert til et merke er spesielt nyttig og er beskrevet i litteraturen (EP-publ. 131.830; EP-PS 87-102 577.1, supra; og Forster et al (1985) Nucl. Acids Res. 13:745).

Separasjon av latekspartiklene fra hybrid!seringsblandingen som er nødvendig for å fullføre analysen kan utføres i hvilken som helst hensiktsmessig måte, vanligvis ved filtrering, sentrifugering eller magnetisk tiltrekking. Et stort antall filteringsmedier er tilgjengelige og porøsiteten til et filter er det viktig å ta hensyn til. Hvis det benyttes latekser med små diamatere, vil det være nødvendig med en liten porediameter. Dybdefiltere, slik som glassfiber-filtere, er nyttige fordi de opprettholder lateksene effektivt selv når den nominelle porestørrelse er vesentlig større enn den gjennomsnittlige latekspartikkeldiameterenm. Slik filtere er attraktive fordi de sender væsker i aksep-table strømingshastigheter. Strømning kan tilveiebringes ved plassering av et vakuum under filteret. Det er ofte hensiktsmessig å plassere filteret på et adsorberende middel som trekker til seg avfallsvæskene. Disse systemtypene medfører vanligvis rasek strømingshastigheter uten bruk av vakuum (se for eksempel anordning beskrevet i US-PS 3.811.840; 4.246.339; 4.366.241 og 4.632.901). Gjennomlesning av analysesignalet kan bli kvantitert med et instrument eller kan visuelt observeres for farvedannelse spesielt hvis hvis et ja/nei-resultat er tilstrekkelig.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli illustrert, men er ikke ment å være begrensende.

EKSEMPLER

Probe-DNA kovalent immobilisert på latekse-partikler ble hybridisert med ribosomal RNA (rRNA) fra Escherichia coil og hybrider ble detektert kolorimetrisk med enzym-merket antistoff spesifikk for DNArRNA-hybrider. Karboksymetyl-lateks (CML) ble koblet til amino-PEG-BOC-aminofenylacetamid. Deretter ble ani1ingruppen deblokkert og diazotisert. Diazoniumionet reagerte effektivt med probe-DNA som ga opptil 7 pg DNA/mg lateks.

DNA-lateks ble hybridisert med rRNA og deretter ble 3-galaktosidase-merket antistoff til DNA:RNA latt bindes til hybridene. Overskudd av p<->galaktosidase anti-DNA:RNA-konjugat ble vasket bort ved å samle latekspartiklene på en spesiselt konstruert glassfiberfilter-strimmel. Mengden av p<->galaktosidase-anti-DNA:RNA-konjugat bundet til hybridene ble målt ved å plassere filterstrimmelen på et Seralyzer-reflektans-instrument (fremstilt av Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN, USA), ved tilsetting av et kromogent P-galaktosidasesubstrat, og måling av grad av farvedannelse.

1. Molekylær kloning av E. coli og

B. subtil is rRNA-gener

DNA-prober ble fremstilt ved kloning av restriksonsfragmenter inneholdende 23S rRNA-genet fra E. coli og B. subtilis inn i M13mpl8 og M13mpl9 [Messing et al, (1977) Proe. Nat'1. Acad. Sei., 75:3642] A 3.2 Kb DNA-fragment inneholdende E. coli 23S rRNA-genet ble tilveiebragt fra pN01301 [Jinks-Robertson et al (1983) Cell 33:865] ved putting med restriksjonsendonuklease Xbal og Xmml. Disse setene ble valgt etter dataanalyse av DNA-sekvensen til rrnB-operonet viste at de ville gi et fragment med det hele 2904-basepar 23S rRNA-genesekvens uten det ved sidenavliggende 5S rRNA-gen. Fragmentet ble klonet inn i M13-vektorer som tidligere var blitt kuttet med endonuklease Xbal og Smal.

Et 2,0 Kb DNA-fragment inneholdende to tredjedeler av B. subtilis 23S rRNA-gen fra rrnB-operonet ble tilveiebragt fra pl4Bl ved kutting med restriksjonsendonukleaser BamHI og Smal. Dette fragmentet inneholdt hele 23S rRNA-genet med unntagelse av 408 og 459 baseparene som koder for 5' og 3' terminalsekvensene, respektivt [Green, et al (1985) Gene, 37:261]. Denne ble klonet inn i Xbal og Smal-restriksjonsse-tene på en M13mpl8 vektor. Viralt DNA fra disse kloner, betegnet M13-23SE og M13-23SB, respektivt, ble brukt som probe i påfølgende hybridiseringseksperimenter.

Rekombinante DNA-molekyler ble konstruert ln vitro ved legering, med T4NNA-ligase, av restriksjonsendonuklease-lineærisert M13mpl8 og M13mpl9 replikativ form DNA-er til restriksjonsendonuklease-dannende DNA-fragmenter av plasmider inneholdende 23S rRNA-genet fra E. coli og B. subtilis ved 12°C i 16 til 18 timer med bufferen beskrevet av Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor, NY. Vellykket ligering ble bestemt ved å utsette reaksjonssprøvene for elektroforese på 1% agarosegeler sammen med DNA-molekyvektsmarkører. Kompetente E. coli ble transformert med legeringsreaksjonsproduktene og hensiktsmessig forsyninger ble sådd ut for å detektere rekombinante fag med soft agar overlagsmedium inneholdende isopropyl-g<->D-tiofalaktopyronosid og 5-brom-4-kloroindolyl-g<->D-galaktopyranosid [Messing, (1983) Meth. Enzymol., 110:20].

Rekombinante fag inneholdende det hensiktsmessige klonet 23S rRNA-genfragmentet ble identifisert ved screening av de rekombinante fagplatene for RF DNA med DNA-inskudd i riktig størrelse. Individuelle plank ble tatt ut fra soft agarlaget og suspendert i 1 mL 0,1 M NaCl , 8mM MgS04, 50 mM Trls-HCl, pH 7,5, 0,01$ gelatin i 1 time som deretter ble brukt for å infektere 5 ml kulturer av E. coli TG1 i tryptosegjær-ekstraktpeptonmedium. Etter 3-4 timer med vigorøs lufting ved 37' C, ble kulturene samlet ved sentrifugering ved 3000 x g i 10 minutter. Cellepelletene ble suspendert i 1.6 ml buffer bestående av 8$ (w/v) sukrose, 5$ Triton X-100, 50 mM EDTA,

50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Suspensjonene ble overført til Eppendorf sentrifugerør inneholdende 50 pl lysozym (10 mg/ml i vann) og inkubert ved 95°C i to minutter. De resulterende cellelysatene ble utsatt for sentrifugering ved 13.000 x g i fen minutter og 0,7 ml prøver ble overført til et nytt rør. Kold isopropanol (0,7 ml) ble tilsatt og rørene ble satt-ved

-18°C i ti minutter. Rørene ble sentrifugert kaldt ved 13.000 x g i fem minutter, supernatantene ble kastet og DNA-presipitatene ble såvidt tørket under vakuum. Presipitatene

ble løst opp I 50 pl vann og prøvene ble elektroforert på 0,7$ agarosegeler for å bekrefte tilstedeværelse av vektor RF DNA med økende størrelse. Hensiktsmessige prøver ble deretter utsatt for restriksjonsenzymputting og gelelektroforese for bekreftelse av tilstedeværelse av 23S rRNA-genfragmenter.

2. Fremstilling av amino- PEG- BOC- aminofenylacetamid

3- aminofenyleddiksyre. En oppløsning inneholdende 10 g 3-nitrofenyleddiksyre (55 mmol ) og 300 mg 10$ Pd/C katalysator i 125 mL etanol ble hydrogenert på et Paar-apparat ved 50 psi H2i tre timer. Blandingen ble filtrert gjennom et Celite-filter og massen ble vasket med etanol. Det sammensatte filtratet ble konsentrert i vakuum som ga 7,18 g av et hvitt pulver som ble brukt uten videre rensing (86$ utbytte). Sm.p. 131-132°.

En analytisk prøve ble fremstilt ved omkrystallisering fra vann. Sm.p. 145-8° (Lit 148-9°).

XE NMR (60 MHz, CDCI3) §: 3,6 (s. 2H); 7,0-7,6 (m, 4H).

IR (KBr) cm-<1>: 3000, 1592, 1377 cm-<1>.

3- N- BOC- aminofenyleddiksyre. En oppløsning inneholdende 3,02 g 3-aminofenyleddiksyre (20 mmol) og 6,97 ml diisopro-pyletylamin (5,17 g, 40 mmol) i 40 ml CH2C12ble satt til en oppløsning inneholdende 4,65 g di-tert-butylkarbonat (21,3 mmol) i 20 ml CH2C12. Etter tre timer ble 13,93 ml diisopro-pyletylamln (80 mmol) og 9,16 g di-tert-butylkarbonat (42 mmol) tilsatt, som resulterte i en fullstendig fjernelse av utgangsmaterialet (som ble observert ved TLC) etter tre _ timer. Oppløsningsmidlene ble beretter fordampet under vakuum

og reaksjonsblandingen ble flammekromatografert på 500 g SIO2-60 eluert med 19:1 CHCI3-CH3OH oppløsningsblanding. Fraksjoner på 25 ml ble tatt. Fraksjoner med rent produkt (54-85) ble slått sammen og konsentrert og ga 1,622 g av et hvitt faststoff som på følgende analytiske data ble oppnådd ( 325é utbytte). Sm.p. 102-104°.

Analyse: beregnet for C13H17NO4:

C, 62,14; H, 6,82; N, 5,56

Funnet; C, 62,19; H, 6,78; N, 5,5 0

IR (CHCI3) cm-<1>: 3400, 3010, 3000, 2940, 1725, 1620, 1600, 1529, 1240, 1159.

1NMR (60 mHz, CDCI3) S: 1,5 (s. 9H); 3,6 (s. 2H), 6,95 (m. 2H, ArH og NH); 7,3 (3H, Ar-H); 9,67 (m, C02H).

Massespektrum (EI) m/e: 251,2 (M<+>, 2,8$); 252,2 (M+l, 0,4$).

Fraksjoner 86-180 inneholdt urent produkt som deretter ble slått sammen, konsentrert og rekromatografert på en 200 g kolonne bestående av Si02-60 som ga et ti 1leggsprodukt på 891 mg. Sm.p. 103-105°.

Analyse: Funnet: C, 6L..35; H, 6,68; N, 5,50.

Sammensatt utbytte av produktet var dermed 2,513 g (50$ utbytte).

N-( 17- amlno- 3. 6. 9. 12. 1 5 - pent aoks aheptadecyl - 3- N- BOC- amlno-fenylacetamld. Til en oppløsning inneholdende 1,265 g N-hydroksysuksinimld (11 mmol) og 2,51 g 3-N-BOC-aminofenyleddiksyre (10 mmol) 1 10 ml CH2C12ved 0° dråpevis over en fem minutters periode tilsatt en oppløsning inneholdende 2,166 g dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i 20 ml CH2C12. Den resulterende uklare oppløsning ble rørt ved 0°C i 0,5 time og ble deretter varmet til romtemperatur over en fire timers periode. Blandingen ble filtrert og presipitatet ble vasket to ganger med 5 ml posjoner av CH2C12. De kombinerte filtratene ble deretter plassert i en addisjonstrakt og tilsatt dråpevis til en oppløsning inneholdende 7 g 2,17-diamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekan (25 mmol) [Kern, et al (1979) Makromal. Chem., 180:2539] i 50 ml CH2C12. Den resulterende blanding ble rørt overnatt ved romtemperatur. Den resulterende blandingen ble deretter konsentrert under vakuum og flammekromatografert på en 500 g Si02-60-kolonne eluert med en 90:10:1 CHCl3-CH20H-conk. NH40H oppløsnings-blanding. Fraksjoner på 25 ml ble samlet. Fraksjoner 66-81 ble slått sammen og konsentrert som ga 1,77 g av produktet som en lys gul olje (31$ utbytte).

Analyse: Beregnet for C^H^^Og • 1/2 H20:

C, 57,45; H, 8,29; N, 8,04

Funnet: C, 57,10; H, 8,15; N, 8,16

% NMR (60 MHz, CDC13) S: 1,5 (s. 9H); 2,1 (m, NH2); 3,4-3,7 (m. 26H); 6.6 (m. NH); (m. NH); 7,0 (m. NH); 7,3 (m, H, ArH).

IR (CHCI3) cm-<1>: 3009, 2900, 1729, 1660, 1527, 1235, 1215, 1158, 1099.

Massespektrum (FAB) m/e: 514 (M+l, 28,8$).

3 . Fremstilling av diazonium- lateks

Diazonium-lateks ble fremstilt ved avledning av karboksylatmodifisert lateks (CML, Seragen Diagnostics, Indiana-polis, IN, USA), med amino-PEG-BOC-aminofenylacetamld, deblokkering av anilingruppen og diazotering av aminet-med salpetersyre. (CML blir solgt som en 10$ (s/v) suspensjon av 1,250 ± 0,015 pm partikler inneholdende~50 nmol karbok-sylatgruppe pr. mg lateks.)

For et preparat med gjennomsnittlig størrelse, ble 1 ml 10$ CML filtrert på hydrofil Durapore (polyvinylidendifluorid) membranfiltre (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) med en porestørrelse på 0,45 pm og skylt med deionisert H2O. Etter lett tørking i vakuum over vannfri CaSC^, ble den resulterende lateksmassen lett skrapt fra membranfilteret, resuspendert i~1 ml deionisert H2O (sonikering/omrysting) og plassert i et reagensrør. Til dette ble det tilsatt~1 g fuktig AG 501-X8 blandet ion-bytteharpiks (20-50 mesh) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA USA) for å fjerne all elektrolytt, anioniske overflateaktive midler, og vann-oppløselig polymermateriale. Lateksen ble separert fra harpikset ved bruk av sintret glassfilter, skylling av harpikset med deionisert vann og samling ved filtrering som beskrevet ovenfor.

Latekset ble resuspendert i 0,1 m pyridin-HCl buffer, pH 4,5, inneholdende~25 mg (50 pmol ) amino-PEG-BOC-aminofenylaet-amid. Til denne ble det tilsatt~95 mg (0,5 mmol) l-etyl-3-(3-dimetylaminpropyl)karbodiimidhydroklorid i to like deler, og den andre del en time etter den første. Etter blanding av reaksjonssuspensjonen ved romtemperatur i minst fire timer, ble latekset igjen samlet ved filtrering og skylt med deionisert vann.

Latekset ble resuspendert i~1 ml vann og et likt volum konsentrert HC1 ble tilsatt. Blandingen ble svakt ristet i 15 minutter ved 80°C før avkjøling på is og deretter fortynnet med 3 ml 0,2 M NaNC^. Etter 5 minutter, ble diazonium-latekset samlet på filter og raskt skylt med kald 0,1 m natriumacetatbuffer, pH 4,2. Lateksmassen ble tørket under vakuum i 3 minutter, siden diazoniumgruppene er labile.

Latekset ble resuspendert i 0,1 M natriumacetatbuffer, pH 4,2, til et finalvolum på ca. 1 ml. En 2,0 pl prøve av diazonium-lateks ble fortynnet fem ganger med buffer og analysert for diazoniumgruppen ved bruk av analysemetoden beskrevet nedenfor. To 40 pl prøver av diazonium-latekset ble pipettert på tarert pretørket dekkslipp og øyeblikkelig veiet. Prøvene ble tørket for minst fire timer under vakuum (oljepumpe) og ved 55°C. De tørkede prøvene ble igjen veid. Vekten av det tørkede diazonium-latekset (tørket prøve minus dekkslipp tara minus buffersaltkonsentrasjon -~70 pg pr. prøve) delt med vekten til væsken (pre-tørket prøve minus dekkslipptara) ga faststoffInnholdet til suspensjon.

4. Analyse for diazoniumgrupper

Diazoniumgrupper ble kvantitativt bestemt ved bruk av 1-naftol-8-amino-5,7-disulfonsyre i en tilbaketitrerings analysefremgangsmåte. Etter resuspendering av diazotiserte partikler i 0,1 M natriumacetatbuf fer, pH 4,2, ble en 50 pL prøve (eller fortynning) blandet ved romtemperatur med 50 pL 2 mM l-naftol-8-amino-5,7-disulfonsyre i 10 mM 1-Tris-HCl, pH 8,0. Latekspartiklene ble raskt lavendel hvis diazoniumgruppene var tilstede. Etter fem minutter ble prøvene fortynnet med 0,9 ml deionisert vann og partiklene ble sedimentert ved sentrifugering ved 13.00 x g i 2 minutter. Absorbansen av blankprøven (ikke naftol tilført), standard (ikke noe lateks-diazonium tilsatt) og prøver på immobilisert diazoniumgrupper ble bestemt ved 340 nm. Forskjellen i signal mellom lateks-prøvene og standarden (minus bakgrunn) ble brukt til å beregne mengden av naftol fjernet fra oppløsningen av de immobiliserte diazoniumgrupper.

5. Fremstilling av DNA- lateks

DNAlatekset ble fremstilt ved tilsetting av en blanding av M13-23SE og M13-23SB probe DNA til nyfremstilt diazonium-lateks i et forhold på 10 pg DNA pr. 1 mg lateks. Det gjenværende diazonium-lateks, fra fremstillingen beskrevet i seksjon 3 over, ble blandet med 151 pl 1,6 mg/ml M13-23SE og 433 pl 0,52 mg/ml M13-23SB. Blandingen ble rørt overnatt ved~5°C, deretter varmet til romtemperatur 1 fire timer til. DNA-latekspreparatet ble fortynnet med~3 ml 1 x SSC (0.015M natriumsitratbuffer, pH 7,0, 0,15M NaCl), 0,1$ natrium-dodecylsulfat (SDS), filtrert, og skylt med samme oppløsning. Etter en siste skylling med 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM etylendiamintetraacetsyre (EDTA), ble lateksmassen tørket under vakuum over CaS04.

DNA-latekset ble resuspendert i 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA til et finalt volum på 0,9 ml for tilveiebringelse av en 100 mg/ml latekssuspensjon. To prøver på 2,5 og 5 pl ble fortynnet til 50 pl med buffer og 50 pl 2 x hybridiserings-oppløsning, minus laksesperm DNA (se nedenfor), ble tilsatt. Prøvene ble prehybridi sert ved 80°C i 30 minutter, fortynnet med deinoisert vann til~1,5 ml og sentrifugert for å pelletere latenkset. Etter dekantering av supernatanten, ble pelletene resuspendert i 100 pl buffer og DNA ble kvantitert ved bruk av fluoressensanalysen beskrevet nedenfor. DNA-latekspreparatene inneholdt 2,5 til 7,0 pg DNA pr. mg lateks.

Til det gjenværende DNA•latekspreparatet ble det tilsatt et volum 2 x hybridiseringsoppløsning [8 x SSPE, 4$ natrium-polyakrylat, 0,2$ SDS, 0,2 mg/ml denaturert alkalibehandlet laksesperm DNA (Boguslawski et al (1986) J. Immunol. Meth. 89:123)] (1 x SSPE er 10 mM natr iumf osf atbuf f er, pH 7,4, 0.15M NaCl og 1,0 mM EDTA) og blandingen ble prehybridisert ved SCC i 30 minutter. Blandingen ble fortynnet 10 ganger med vann, filtrert og skylt med 2 x SSPE. DNA-lateksmassen ble resuspendert i 2 x hybridiseringsoppløsning til konsentrasjon på 4 pg/ml DNA. Effektiv resuspensjon til fine partikler ble best oppnådd ved først sonikering av latekset i en porsjon vann. Etter resuspensjon i vann, ble de andre komponentene av hybridiseringsoppløsningen tilsatt som konsentrert oppløsninger (0,4 volum 20 x SSPE, 0,4 volum 10$ SPA, 0,01 volum 20$ SDS, 0,067 3 mg/ml denaturert alkalibehandlet laksesperm DNA).

6. Fluoressensanalyse for DNA på lateks

Kvantitering av probe-DNA immobilisert på latekspartikler ble utført ved bruk av en modifisert fremgangsmåte av Hinegardner

(1971) Anal. Biochem. 39:197. Fremgangsmåten innbefatter en reaksjon mellom 3,5-diaminobenzosyre og deoksyribose til DNA for dannelsen av et fluoressent produkt. Etter reaksjon, ble latekspartiklene fortynnet med 1 ml 1 M HC1 og pelletert ved sentrifugering (to minutter ved 13.000 x g). Fluoressens ble bestemt etter blanding 1 ml fra prøven med i tillegg 1 ml 1 M HC1. Analysen var sensitiv til 1 pg/ml (0,1 pg/analyse) med svært god presisjon.

7. Konjugering av p<->D-galaktosidase og Fab'fragment

fra DNA— RNA antistoff

Monoklonal muse IgG til DNA:RNA-hybrid ble fremstilt som nylig beskrevet [Boguslawski, et al, supra]. F(ab'^fragmen-tene ble tilveiebragt ved kutting med et 1:3 vekt-forhold mellom og IgG i 16 timer ved 37° C i 0,1 M natr iumacetat, pH 4,2. Puttingsproduktene ble kromatografert på en Sephacryl S-200 kolonnene (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) i 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl.

En del av F(ab')2ble merket med diklortriazinylaminofluor-eskein (DTAF) som brukes som anti stoffindikator i kon-jugatpreparering. Den merkede reaksjonen ble utført i 1 time i 0,1 M natr iumboratb.uf fer, pH 9,0, med 3:1 molart forhold mellom DTAF og F(ab')2[Blakeslee og Baines (1976) J. Immunol. Meth., 13:305].. Det merkede antistoff ble separert fra fritt DTAF på en bioGel P6-DG (Bio-Rad Laboratories) kolonne. Det molare DTAF/F(ab'-forholdet beregnet fra en empirisk avledet formel var 2,1 [The and Feltkamp (1970) Immunol., 18:865].

F(ab')2ble -landet med DTAF-F(ab')2i 20:1 forhold og redusert til Fab' i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl, ImM EDTA, 10 mM ditiotreitol. Reduksjonen ble utført i 3 timer ved romtemperatur. Fab'-fragmentene ble Isolert på en BioGel P6-DG-kolonne i 0,1 M natr iumf osf at, pH 7,0, 0,15 M NaCl, ImM EDTA og ble med en gang brukt for kobling til maleimido-3-D-galaktosidase fremstilt som beskrevet nedenfor. Sulfhydrylinnholdet av Fab' bestemt ved bruk av Ellman-fremgangsmåten [Habeeb (1972) Meth. Enzymol., 25:457] var 2,5-3,0 mol sulfhydryl pr. mol Fab'.

8. Fremstilling av 1,17-dimaleimido-3,6 , 9 ,12 ,15-pentaoksaheptadekan ( BMP)

En oppløsning inneholdende 2,80 g 1,17-diamino-3,6 ,12-15-pentaoksaheptadekan (10 mmol) i 20 ml tørr tetrahydrofuran (THF) ble dråpevis tilsatt i løpet av 1 time til en omrørt oppløsning inneholdende 4,50 g maleinanhydrid (45 mmol) i 20 ml THF. Etter 1 time ble reaksjonsblandingen filtrert og filtratet konsentrert til en olje i vakuum ved 50°C for tilveiebringelse av 6,34 g bis-maleinsyreintermediat som en rå, gul masse. Hydroksybenzotriazolhydrat (2,97 g, 22 mmol) ble deretter tilsatt og resten ble tre ganger axzotropt destillert under vakuum med 20 ml aliquoter av DMF. Den gjenværende olje ble deretter satt under argonatmosfære, oppløst i 20 ml DMF, avkjølt til 0°C, behandlet med 4,54 g (22 mmol) di cykloheksylkarbodiimid. Den resulterende blandingen ble latt stå til røring i 1 time ved 0°C og deretter overnatt ved romtemperatur. Den resulterende mørke brune blandingen ble filtrert og konsentrert ^or tilveiebringelse av 5,62 g jav en rå, mørkebrun olje. Prøven ble renset ved flammekromatografi på Si02-60 (230-400 mesh) ved bruk av 1$ CH3OH-CHCI3oppløsningsblanding. Fraksjoner inneholdende det rene produktet ble slått sammen og konsentrert for tilveiebringelse av 1,62 g av en olje (37$ utbytte).

Analyse: Beregnet for C2oH28<N>2°9<:>

C, 54,53; H, 6,41; N, 6,36

Funnet: C, 54,96; H, 6,28; N, 6,48

PMR (60 mHz) CDCI3A: 3,63 (s, 10H); 3,70 (s, 14H);

6,70 (s, 4H)

IR (CHCI3) cm-<1>: 2860, 1710, 1405, 1100 cm-<1>Massespektrum (FAB) m/e: 441 (M+l, 51$). 9. Fremstilling av malelmid- 3- D- galaktosidase 3-galaktosidase ble fremstilt ved bruk av fremgangsmåten til Fowler og Zabin (1983) J. Biol. Chem., 258:14354 og lagret som en 50$ ammoniumsulfatsuspensjon. En aliquot enzymssuspen-sjon ble sentrifugert og pelleten ble løst opp i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl. Ditiotreitol ble tilsatt til en final konsentrasjon på 2mM.blandingen ble inkubert i 4 timer ved 25°C, og deretter kromatografert på en BioGel P6-DG-kolonne i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA. Sulfhydrylinnholdet var 9,1 til 10,4 mol pr. mol enzym. Deretter, ble redusert3-galaktosidase reagert 1 time ved romtemperatur med et 200 ganger molart overskudd av BMP (seksjon 8 ovenfor), nylaget i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA. Blandingen ble kromatografert på BioGel P6-DG i samme bufferen og den aktiverte3-galak-todasen ble med en gang brukt for kobling med Fab'. Malein-innholdet til aktivert3-galaktosidase ble bestemt ved reaksjon av en del av det avledede enzymet med overskudd glutation og deretter måling av overskuddglutation med Ellman's reagens [Habeeb (1972), supra]. Maleimidinnholdet var 6,9 til 10,5 mol pr. mol enzym. 10 . Fremstilling av Fab- 3- galaktosidasekon. jugat Maleimido-3-galaktosidase ble blandet med Fab' i et 1,5 molart forhold. Finalekonsentrasjonen av maleimido-3-galaktosidase var 1,5 pM. KonjugerIngsreaksjonen ble utført i 22 timer ved 5°C med omrøring. Noe aggregert materiale ble dannet og ble fjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble kromatografert på en 1,5 x 46 cm BioGel A-l,5m (Bio-Rad Laboratories) kolonne i 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl. Fraksjonene ble undersøkt for enzymaktivitet, for absorbanse 280 nm, og for fluoressens av DTAF-Fab' ved bruk av 492 nm eksisjon og 512 nm emisjon. Fraksjonene som viste enzymaktivitet og fluoresensinnholdende konjugat ble slått sammen og lagret ved -15° C i o,l M natriumfosfat, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,1$ NaN3, lmg/mL bovin serumalbumin (BSA) inneholdende 50$ glyserol. Konjugatet inneholdt 4,1 mol Fab' pr. mol enzym basert på utbyttet av anzymaktivitet og fluoressens. 11. Fremstilling av Fab '- g- galaktosldaseoppløsninger Konjugatet ble fortynnet til en konsentrasjon på~40 jjg/mL i 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 0,15 M NaCl, 0,5$ BSA, 0,5$ Tween 20, 0,05$ NaN3og filtrert gjennom et GF/F glassfiberf ilter ("Whatman Ltd., Maidstone, England), deretter et 0,22 jjm filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) for å fjerne aggregert konjugat.

12. Fremstilling av filterstrimler

10 cm brede 31ET Whatman papir ble impregnert med 0,2$ etylcellulose i toluen, tørket og kuttet til 15 cm stykker. En 10 mm bred strimmel av porøst klebende limbånd (Fasson, Painesville, OH, USA) ble festet til de impregnerte 31 ET stykkene (5 mm fra en kant) og 12 mm brede GF/F glassfiber-bånd ble laminert på toppen av limbåndet. Stykkene ble kuttet til strimler.

13. Vakuum f11teranordning

En våkum filtreringsanordning ble konstruert på en slik måte at man kan sette inn GF/F-filterenden av strimlen opp til et stopp. Når strimlen ble satt inn, ble GF/F-filteret plassert over en vakuumport; og når anordningshåndtaket ble senket i nedovergående posisjon, ble en skrått reagensbelastningsport senket for stram plassering over kantene til GF/F-filterstyk-ket (12 mm x 5 mm) og en vakuumlinje ble samtidig engasjert. Analyreagenset ble pipettert inn i reagensporten (vakuum på) og filtrert gjennom GF/F stykket og til bærende bakstykke. Væske ble samlet i en felle for tilveiebringelse av enkel oppstilling. Da alle reagensene var filtrert, ble strimmelen fjernet fra vakuumanordningen og plassert på bordet til et Seralyzer-instrument for tilsetting av substrat.

14. E. coll- lysatfremstilling

E. coil lysat ble fremstilt fra kulturer av E. coli i logarytmisk vekstfase [4-7 x 10^ kolonidannende enheter (CFU)/ml]. Cellene som sedimenterte fra kulturmediumet, ble resuspendert i lysismedium (50 mM Tris buffer (pH 7,3), 10 mM EDTA, 200 ug/ ml lysozym) og inkubert ved 37°C i 10 minutter. Cellulære debrider ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten ble gjort 0,1$ SDS og volumet ble justert til det opprinnelige kulturvolumet med 50 mM Tris buffer, pH 7,3, 10 mM EDTA. Aliquoter av lysatene i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1$ SDS ble også inkubert ved 60°C i 10 minutter og oppbevart ved -20"C til fortynning til ønsket arbeidsnivå.

15. Fremstilling av rRNA

rRNA ble fremstilt fra E. coli-celler og 23S komponenten ble isolert ved sukrosetetthetsgradientsentrifugering [McConkey

(1967) Meth. Enzymol., 12a:620 og Takanami (1967) Meth. Enzymol., 12a:491]. 16 . Hybridisering av DNA- lateks med rRNA Fremgangsmåten bestod av følgende steg: a) 50 pl rRNA (1,0 ug/ ml) eller E. coli lysat ble pipettert inn i 1,5 ml konisk sentrifugerør. b) 50 pl 2x hybridiseringsoppløsning (supra) inneholdende probe DNA-lateks ble tilsatt og godt blandet. c) Rørene ble inkubert ved 80°C i 10 minutter (eller ved annen indikert tid). d) 100 pl 2 pg/ml Fab'-e-galaktosidasekonjugat ble tilsatt, blandet godt og latt stå ved romtemperatur i

30 minutter (eller annen indikert tid).

e) Deretter, ble 500 pl vasket buffer [50 mM natriumfosfat, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 10 mM MgCl2, 0,5$ (v/v)

Tween 20 og 0,05$ (w/v) natriumazid] tilsatt og innholdet dekantert på fi 1 terstykket til en strimmel plassert i vakuum anordningen med vakuumet på. Røret ble vasket med 500 pl vaskebuffer som ble dekantert på filteret. Filteret ble vasket med 2,0 ml vaskebuffer. f) Filterstrimmelen ble fjernet fra filtreringsanordnin-gen og plassert på Seralyzer-reflektens meterbordet. 30 pl 5mM substratreagens [50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4, 5mM MgCl20,05$ natriumazid og 5,0 mM klorfenol rød-e-D-galaktopyranosid, Kuhr (1985) German Offen. DE 3345748] ble pipettert på filteret. Eeflektans ved 570 nm ble målt med 5 sekunders intervaller fra 30 til 60 sekunder. Reflektansever-diene ble omdannet til K/S-verdiene [Greyson (1981) J. Automat. Chem., 3:65] og graden ble kalkulert.

17. Hybridlseringstidsforløp

En serie hybridiseringsblandinger ble fremstilt med 50 pl buffer eller 50 pl E. coli lysat i et nivå på 10.000 CFU/ml i hvert reagensrør. Rørene ble inkubert i et 80°C vannbad for gitte tidsperioder og deretter analysert for hybrider som beskrevet ovenfor ved bruk av 30 minutter for binding av Fab'-g-galaktosidase ved 37°C. Analyseresponsene er plottet i fig. 1 versus hybridiseringstiden. Resultatene til blan-dingene med lysat og bufferkontroller er indikert ved åpne og lukkede sirkler, respektivt. Resulatene bekrefter at hybridiseringen var fullstendig innen 15 minutter.

18. Total analvsetid

I en studie rettet mot forkorting av den totale analysetiden, ble binding av Fab'-p-galaktosidasekonjugat til DNA:RNA i hybridiseringsblandinger undersøkt mer detaljert. En serie hybridiseringsblandinger ble fremstilt med E. coli lysat ekvivalent til 2500 celler/analyse. Følgende hybridisering, 0,4 ml 2,5 pg Fab'-p<->galaktosidase ble tilsatt, blandet og latt stå i forskjellige perioder. Konjugatbinding ble avsluttet ved å ta lateks på glassfiberfiltene og vaske-dem med vaskebuffer justert til pH 7,9 i steden for 7,4. Vaskebufferen inneholdt også 1,0 mM 7.p<->D-galaktopyranosyl-oksy-9,9-dimetyl-akridin-2-on (fremstilt som beskrevet I US- PS 939.855). Hastighetene av farvedannelse målt i reflektans ved 634 nm viste at konjugatbindingen forløp raskt i de to første minuttene og deretter forløp i en mye saktere hastighet. En bindingstid på 3 minutter ble valgt for konjugatet.

I de andre analysene ble det benyttet 10 minutter for hybridisering, 3 minutter for konjugatbinding og 3 minutter for måling av enzymaktivitet. Blå farvedannelse ved enzymatisk hydrolyse av substratet kunne lett bli observert visuelt når de ekvivalente 2500 E. coli cellene ble satt til hybridiseringsblandingen. Dette antall celler kunne dermed bli detektert ved en fremgangsmåte som krevde mindre enn 20 minutter.

19. Sammenligning med tidligere hybridiserings

f remgangsmåte

Et studie ble utført ifølge litteraturen og tidligere fremgangsmåter som ble brukt i laboratoriet for å bestemme tidsbegrensningene til kjente hybridiseringsfremgangsmåter. Resultatene av studiet ble brukt til å konstruere tabellen vist i fig. 2 på tegningene. Referansene er som følger: 1. Yehle et al. Accepted for publication (Molecular and Cellular Probes, (se henvisning 4 nedenfor) 2. McGarrity, G. J. and Kotami , H. (1986 ) Exp. Cell. Res; 163:273-278 3. Langdale, J. A. and Malcolm, A.D.B. (1985) Gene 36:201-210; Malcolm, A.D.B, and Langdale, J.A.

(1984 ) PCTWO 86/03782

4. Carrico, R.J., European Pat. Publ. 163, 220.

5. Boguslawski, S.J. (1986) J. Immunol. Meth. 89:123. 6. Amasino, R.M. (1986) Anal. Biochem. 152: 304.

Det er innlysende at bruk av diskrete, vannsuspensible mikropartikler som den faste bærer for proben i de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene muliggjør utføring av en hybridise ringsanalyse på betraktelig kortere tid enn tidligere kjente fremgangsmåter.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av en bestemt polynukleotidsekvens i et testmedium Inneholdende enkelttrådet nukleinsyrer, hvori enten (i) testmediumet blir kombinert under hybridiserende betingelser med en immobilisert form av en polynukleotidprobe, den resulterende immobiliserte fasen blir separert, og hybridisert probe detektert ved binding av et reagens som selektivt binder hybrider av proben og sekvensen som skal bestemmes men i vesentlig grad ikke enkelttrådet nukleinsyre, eller (ii) testmediumet blir behandlet for å merke enkelttrådet nukleinsyre deri, en immobilisert form av en polynukleotidprobe blir tilsatt under hybridiserende betingelser, den resulterende immobiliserte fase blir separert, og hybridisert probe detektert ved måling av merket,karakterisert vedat den immobiliserte formen av polynukleotidproben innbefatter nevnte probe festet til diskrete, vannsuspensive mikropartikler hvorpå hybridiseringen og separasjonsstegene kan bli fullført innenfor omtrent 30 minutter.

2 . Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den innbefatter at en dispersjon av nevnte mikropartikler i hybridiseringsmediumet gir en 50% reduksjon i turbiditet på ikke mindre enn omtrent 30 minutter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den innbefatter at nevnte mikropartikler har en spesifikk tetthet på fra omtrent 1,03 til omtrent 1,08 g/ml og har en gjennomsnittlig diameter på fra omtrent 0,1 til omtrent 20 pm.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den innbefatter at den mikropartikkelimmobiliserte fase blir separert ved filtrering eller at mikropartiklene er magnetiske eller magnetiserbare og at den mikropartikkelimmobiliserte fasen blir separert ved bruk av et magnetisk felt.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den innbefatter at det hybridselektive bindingsreagens er merket med en enzymatisk aktiv gruppe, et fluoriserende middel, et kromofor, et luminiserende middel, eller en metallsol eller at merket introdusert til prøvenuk-leinsyrene er en ligand og er detekterbar ved binding av en bindingspartner merket med en enzymatisk aktiv gruppe, et fluoriserende middel, et kromofor, et luminiserende middel, eller en metallsol, hvorpå hybridiseringen, separeringen, og deteksjonsstegene alle kan bli fullført innenfor 30 minutter.

6 . Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den innbefatter at nevnte anti-hybrid-antistoffreagens er selektiv for binding av DNA"RNA hybrider, en av proben og sekvensen spm skal bestemmes er DNA og den andre RNA.

7. Reagenssystem for bestemmelse av en bestemt polynukleotidsekvens i et testmedium ved nukleinsyrehybridisering,karakterisert vedat det innbefatter: 1) en immobilisert form av en polynukleotidprobe med en enkelttrådet basesekvens som skal bestemmes, og nevnte probe er bundet til diskrete, vannsuspensible mikropartikler og 2) et anti-hybrid-antistoffreagens selektivt for binding av hybrider dannet mellom nevnte probe og sekvensen som skal bestemmes.

8. Reagenssystem ifølge krav 7,karakterisertved at nevnte mikropartikler har en spesifikk tetthet på fra omtrent 1,03 til omtrent 1,08 g/ml og har en gjennomsnittlig diameter på fra omtrent o,l til omtrent 20 mp.

9. Reagenssystemet for krav 7,karakterisertved at nevnte anti-hybrid-antistoffreagens er selektiv for binding av DNA'RNA hybrider, en av proben og sekvensen som skal bli bestemt er DNA og den andre er en RNA.

10 . Bruk av reagenssystemet ifølge kravene 7 til 9 for bestemmelse av en bestemt polynukleotidsekvens i et testmedium.