CN117517644A - 基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法 - Google Patents

基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117517644A
CN117517644A CN202410007951.5A CN202410007951A CN117517644A CN 117517644 A CN117517644 A CN 117517644A CN 202410007951 A CN202410007951 A CN 202410007951A CN 117517644 A CN117517644 A CN 117517644A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
kana
water
solution
magnetic beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410007951.5A
Other languages
English (en)
Inventor
朱国念
罗曼琳
罗萌
许淑霞
吴怡
冯慧
杨耀星
汤加文
罗浩天
白金鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SICHUAN ACADEMY OF ENVIRONMENTAL SCIENCES
Chengdu Univeristy of Technology
Original Assignee
SICHUAN ACADEMY OF ENVIRONMENTAL SCIENCES
Chengdu Univeristy of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SICHUAN ACADEMY OF ENVIRONMENTAL SCIENCES, Chengdu Univeristy of Technology filed Critical SICHUAN ACADEMY OF ENVIRONMENTAL SCIENCES
Priority to CN202410007951.5A priority Critical patent/CN117517644A/zh
Publication of CN117517644A publication Critical patent/CN117517644A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9446—Antibacterials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法，涉及电化学生物传感器技术领域，包括蔗糖和适配体纳米磁珠，所述适配体纳米磁珠由连接有Kana适配体的纳米磁珠与采用蔗糖转化酶标记的Kana适配体的互补链经双链杂交反应而制得。本发明通过氨基化纳米磁珠与适配体偶联，葡萄糖作为信号转换器，设计了一种血糖仪快速检测水中卡那霉素（Kana）的传感方法。实验中首先合成了带有氨基的纳米磁性微球，借助磁铁的磁分离作用使转化酶水解蔗糖，利用血糖仪进行检测，根据葡萄糖浓度与血糖仪示数之间的关系，间接实现了对Kana的检测，可以满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求。

Description

基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法。
背景技术
氨基糖苷类抗生素具有光谱的抗菌作用，卡那霉素（Kana）是从链霉菌或小单胞菌培养液中提取，或以天然品为原料合成的抗生素。卡那霉素选择性地与细菌核糖体30S亚基上的靶蛋白结合，错误诱导而合成异常功能的蛋白质，达到杀灭细菌目的。临床上可用于耐药性金黄色葡萄球菌和某些革兰氏阳性菌所致的败血症，肺部感染及其他多种严重感染疾病。目前国内临床上主要使用Kana抑制细菌的生长繁殖，如葡萄球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等。因其价格低廉，抗菌性强，Kana也是畜禽养殖普遍应用的兽药。然而滥用Kana可造成动物性食品残留量超标，人类长期食入会给身体带来肾毒性、造血系统的毒性及其他毒副作用。根据GB 31650-2019国家标准明确规定动物源性食品肌肉、皮脂中卡那霉素的最高残留量为100 μg/kg，牛、羊奶中的卡那霉素最高残留量为150 μg/kg，肝脏中卡那霉素的最高残留量为600 μg/kg。根据最新国家标准GB31650.1-2022食品中41种兽药最大残留限量规定，家禽的蛋类中的卡那霉素允许的最高残留量为10 μg/kg，为了落实最新国家标准的要求，就要求工作人员对卡那霉素的检测具有即时性，寻求高效的检测方法与装置对Kana残留量进行快速测定，已成为相关环保领域亟待解决的难题。
基于核酸适配体的即时检测技术近些年已成为检测抗生素的主流，这类传感器在检测Kana上常表现出特异性强、灵敏度高、重现性好等优点，然而目前的Kana检测设备均是较为笨重的实验室仪器，已不能满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法，实现对Kana的现场定量便携式检测，以解决现有Kana检测设备不能满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂，包括蔗糖和适配体纳米磁珠，所述适配体纳米磁珠由连接有Kana适配体的纳米磁珠与采用蔗糖转化酶标记的Kana适配体的互补链经双链杂交反应而制得。
作为优选地，所述Kana适配体的序列如SEQ ID NO:1所示；所述Kana适配体的互补链的序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1 5’- COOH-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’
SEQ ID NO:2 5’- TCGGCTTAGCCTCAA -SH-(CH2)6-3’
基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，适配体纳米磁珠的制备过程如下：
（1）制备氨基化纳米磁珠：将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中，加入无水乙酸钠和1,6-己二胺，将溶液密封并在高压、180~210℃环境中反应6~12h，之后用水和乙醇反复洗涤，除去过量溶剂，最后真空干燥后得到氨基化磁珠备用；
（2）在纳米磁珠上连接Kana适配体：采用羧基修饰Kana适配体，并将羧基修饰Kana适配体加入到磷酸盐缓冲液中并进行孵育以激活羧基，在适配体溶液中加入步骤（1）所得的氨基化磁珠并进行孵育，使活化的羧基修饰的适配体通过酰胺化反应固定在氨基化磁珠表面，并在磷酸盐缓冲液洗涤后进行磁选，得到Apt-MBs备用；
（3）采用蔗糖转化酶标记Kana适配体的互补链：将胺-巯基交联剂（sulfo-SMCC）溶于DMSO中，再将蔗糖转化酶溶于Buffer A中，并将两种溶液混合后摇匀在室温下充分反应；反应结束后转移到超滤管中进行离心，其离心产物SMCC-invertase截留在膜表面，离心完成后弃去超滤管下层液体，再加入Buffer A搅拌均匀进行离心，对产物进行洗涤，将洗涤并超滤好的SMCC-invertase转移至新的离心管，并加入Kana适配体的互补链cDNA，在室温条件下反应，反应完成后将溶液转移到超滤管内，再进行离心，使标记成功的cDNA-invertase截留于膜上方，离心结束后，弃去下层液体，并加入Buffer A混匀离心进行洗涤，得到蔗糖酶-cDNA备用；
（4）将步骤（2）所得的Apt-MBs和步骤（3）所得的蔗糖酶-cDNA，室温混合，以完成双链的杂交反应。
进一步地，步骤（2）中，激活羧基的激活反应温度为80~100℃，激活反应时间为5min，激活后在室温环境下冷却。
进一步地，步骤（2）中，适配体连接氨基化磁珠的反应温度为37℃，反应时间为30min。
进一步地，步骤（2）中，氨基化磁珠加入前需要进行如下处理：将氨基化磁珠分散在含1%戊二醛、pH为 7.4的磷酸盐缓冲溶液中在室温进行搅拌，然后用清水充分冲洗掉过量的戊二醛。
进一步地，步骤（2）中，激活羧基的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为10 mM，1,2-二氯乙烷的浓度为10 mM，N-羟基丁二酰亚胺的浓度为 30 mM，pH为 6.8。
进一步地，步骤（2）中，洗涤Apt-MBs的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为10 mM，pH为 6.8。
进一步地，步骤（3）中，所述Kana适配体的互补链cDNA在与SMCC-invertase反应前还要进行纯化操作：加入制备好的互补链、磷酸钠缓冲溶液、TCEP，混合以还原巯基标记的DNA并减少二硫键形成，将混合物在25℃下孵育1小时，然后将溶液转移到超滤管中进行离心，最后用Buffer A纯化得到纯化cDNA备用。
采用Kana检测试剂进行水中Kana含量检测的方法，采用如下步骤进行检测：
（1）使用前先用0.22 µm的针头式过滤器过滤，以除去水样中的不溶物等杂质，随后将样品配置成pH 7.4的缓冲溶液；
（2）将适配体纳米磁珠充分分散于样品缓冲溶液中；
（3）将适配体纳米磁珠通过磁分离后从溶液中除去；
（4）向除去适配体纳米磁珠的溶液中加入过量蔗糖，并采用血糖仪测量溶液的葡萄糖含量，根据血糖仪的数值与标准溶液数值进行对比，将血糖仪的数值换算成Kana含量。
综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
1、本发明通过氨基化纳米磁珠与适配体偶联，葡萄糖作为信号转换器，设计了一种血糖仪快速检测水中卡那霉素（Kana）的传感方法。实验中首先合成了带有氨基的纳米磁性微球，借助磁铁的磁分离作用使转化酶水解蔗糖，利用血糖仪进行检测，根据葡萄糖浓度与血糖仪示数之间的关系，间接实现了对Kana的检测，可以满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求。
2、本发明提供的检测方法，在优化完相关实验条件后，可以在1-200 nM的范围内实现Kana的检测，检出限为0.28 nM。同时表现出优异的选择性，该传感器成功应用于环境水样中的Kana检测，表明该方法具有极大的应用前景。
附图说明
图1是本发明利用便携式血糖仪检测卡那霉素原理图示意图。
图2是本发明中不同组分存在下的卡那霉素分析方法的血糖仪示数图，图中字母分别表示：（a）MB-apt；（b）MB-apt+卡那；（c） cDNA-转化酶；（d）MB-apt+cDNA-转化酶+卡那；（e）MB-apt+cDNA-转化酶+卡那。
图3是本发明中cDNA与蔗糖转化酶离心纯化过程的表征图。(A) cDNA与蔗糖转化酶通过sulfo- SMCC偶联的原理图；(B) sulfo-SMCC与蔗糖转化酶偶联经超滤管(50 KD)过滤后滤液的紫外-可见吸收光谱图；(C) cDNA与蔗糖转化酶偶联经超滤管(50 KD)过滤后滤液的紫外-可见吸收光谱图；(D) cDNA与蔗糖转化酶聚合物的紫外-可见吸收光谱表征图，其中，（B）和（C）中的1~6表示纯化离心次数。
图4是本发明中MBs-NH2的表征图。（A）和（B）扫描电镜图；（C）磁滞回线图；（D）和（E）透射电镜图；（F）红外光谱图；（G）不同时间纳米磁珠在外加磁场作用下的磁响应图；（H）为图（C）的中间部分放大图。
图5是本发明中使用合成的MBs-NH2和Apt进行紫外-可见吸收光谱图（A）和PAGE以验证纳米磁珠的连接性能板图（B）。
图6是本发明为了获得更高的检测效率，优化适配体链和MBs-NH2的共孵育时间得到的荧光强度图（A）和荧光强度与时间之间的分析折线图（B）。
图7是本发明中对cDNA-invetase的浓度（A）和反应温度（B）进行优化实验结果图。
图8是本发明中考察pH在5.0~8.0内对卡那霉素测定的影响实验结果图。
图9是本发明为了评估所建立的传感器的选择性，选择了五种不同的氨基糖苷类抗生素测试时血糖仪的读数柱状图。
图10是本发明基于血糖仪读数的传感方法分析了不同浓度的卡那霉素标准品来建立的校准曲线分析图。
图11是本发明结合3D打印技术所设计的集成式试剂盒的三维模型图（A），俯视图（B），侧视图(C)和主视图（D）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及各实施例和验证例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和验证例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本法实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明中的其它未特别注明的原材料、试剂、试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常使用的原材料和试剂，以及通常采用的实验方法和技术手段。
实施例1：
本实施例提供了一种基于适配体纳米磁珠的电化学检测试剂用于对卡那霉素的高灵敏定量检测，其中，适配体纳米磁珠的制备过程如下：
S1、加入制备好的SH-cDNA，磷酸钠缓冲溶液，TCEP混合以还原巯基标记的DNA并减少二硫键形成，再将混合物孵育后转移到超滤管中进行离心，最后用Buffer A纯化，最终完成SH-cDNA的纯化，具体为：
向离心管中加入30 μL 1 mM SH-cDNA，2 μL 1 M磷酸钠缓冲液（pH 5.5）和2 μL30 mM TCEP并混合，以为了还原巯基标记的DNA并减少二硫键的形成，该混合物在25℃下孵育1 h，然后将溶液转移到超滤管中（10 KD，内管 500 μL），4 ℃、10000 rpm 条件下进行离心，最后用Buffer A纯化8次。
S2、对蔗糖转化酶进行标记；具体为：
首先准确称量 1 mg sulfo-SMCC溶于50 μL的DMSO中，2 mg蔗糖转化酶溶于450 μL buffer A当中，将上述溶液混合后轻轻摇匀，室温条件充分反应 1 h。反应结束后，将溶液转移到超滤管中（100 KD），在4 ℃、10000 rpm 条件下进行离心15 min，离心过程中反应产物SMCC-invertase 会截留在膜的上表面，此时反应体系中 sulfo-SMCC 分子量较小，未经反应的sulfo-SMCC 分子通透过滤膜被去除，从而实现纯化产物的目的。离心完成后，弃去超滤管下层液体，向超滤管内管中加入500μL buffer A，搅拌均匀，离心分离，如此重复三次，进行产物的洗涤。将超滤好的SMCC-invertase转移至新的离心管中，加入30 μL 100μmol的cDNA，在室温条件下反应 48 h。反应完成后，将溶液转移到超滤管内（50 KD），在使用条件为 4 ℃、10000 rpm 的离心机进行离心15 min，使体系中标记成功的cDNA-invertase截留于膜上方，则未标记成功的 cDNA会透过滤膜去除。离心结束后，弃去超滤管下层液体，在超滤内管中加入500 μL buffer A，混匀，离心，进行产物的洗涤，如此反复3次，超滤完成后收集滤液，将超滤好的cDNA-invertase 转移至新的离心管中，定容至150 μL保存于4℃待用。
S3、采用一锅法合成氨基功能化Fe3O4纳米粒子，具体为：
将1.0g FeCl3·6H2O溶解在30mL乙二醇中，然后加入4.0g无水乙酸钠和3.6g 1,6-己二胺，强力搅拌混合物以保证反应充分，得到透明的亮黄色溶液。随后，将溶液密封在聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，置于200°C下反应6h。用水和乙醇反复洗涤，去除过量溶剂。最后在50°C真空干燥后得到黑色粉末。
S4、制备Apt-MBs，具体为：
首先，羧基修饰的适配体溶液加热到90℃并保持5 min，后在室温下冷却30min（Muet al.，2013）。在固定之前，取20 μL 10 μM羧基修饰的适配体加入到60 μL 10 mM磷酸盐缓冲液（含10 mM DCE“1,2-二氯乙烷”, 30 mM NHS, pH 6.8）中，在37℃下孵育30 min，激活羧基。然后将100 μg氨基功能化纳米颗粒分散在70 mL 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液中（pH7.4含1%戊二醛）（Lin et al.，2016）。在室温下搅拌24 h，然后用清水充分冲洗掉过量的戊二醛，真空干燥。最后在适配体溶液中加入20 μL 1mg/mL MBs, 37℃孵育12 h，活化的羧基修饰的apt通过酰胺化反应固定在氨基功能化磁珠表面。最后用10 mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）洗涤3次，然后进行磁选。将得到的apt-MBs（1 μM）分散于200 μL磷酸盐缓冲液中，并保存于4℃备用。
S5、双联杂交反应，具体为：
取20 μL 10 mg/mL的apt-MBs与40 μL的蔗糖酶- cDNA室温混合1 h，用PBS洗涤3次，然后分散在200 μL的PBS中备用。
S6、测量实际水样前先对实际水样进行预处理以出去水样中的不溶物等杂质，具体为：
使用前先用0.22 µm的针头式过滤器过滤，以除去水样中的不溶物等杂质，随后将样品配置成pH 7.4的缓冲溶液。
如图1所示，实验中首先合成了带有氨基的纳米磁性微球，表面连接羧基修饰的互补探针，Kana适配体与其杂交形成双链DNA。加入Kana，能特异性识别Kana的适配体使cDNA从双链解旋并连同蔗糖转化酶游离于上清液中，磁珠表面富集了大量的Kana，加入30分钟后进行磁分离后从溶液中除去未反应的适配体纳米磁珠得到待检测液。此时，取5uL待检测液，加 20uL 0.5M的蔗糖溶液，室温反应20分钟后，经蔗糖转换酶将蔗糖水解为单糖，利用血糖仪进行检测。
在添加不同浓度的卡那霉素时，会释放不同量的蔗糖转化酶，从而导致水解产生的葡萄糖含量不同，采用血糖仪测定转化酶对蔗糖催化作用生成葡萄糖含量，最后对Kana的浓度与血糖仪示数之间的关系进行分析，间接的实现了对Kana的检测。
如图2所示，通过血糖仪检测不同组分的信号值包括（a）MB-apt; （b） MB-apt+Kana; （c） cDNA-invetase; （d） MB-apt+cDNA-invetase+Kana（10 nM）; （e） MB-apt+cDNA-invetase+Kana（100 nM）五种溶液，验证血糖仪信号变化情况，结果显示在图2 中。除了d，e组分情况下，其他三种组分溶液血糖仪信号值没有发生明显的变化。这归因于只有当MB-apt+cDNA-invetase+Kana同时存在时，适配体的特异性识别才会发生，从而解离双链并游离出大量的转化酶水解蔗糖生成葡萄糖，引起血糖仪信号的显著升高。该现象证明本实验所建立的检测卡那霉素的方案可行。
如图3所示，利用sulfo-SMCC异双官能团连接子与抗体偶联，作为交联剂分别连接巯基标记的cDNA和蔗糖转化酶。对其纯化过程进行了紫外-可见吸收光谱表征。从图3（B）和（C）可以看出，对sulfo-SMCC与蔗糖转化酶偶联进行6次纯化，滤液中转化酶的含量在逐渐减小，聚合物被截留在超滤管的内管中，达到离心纯化的目的。同样地使用buffer A重复6次进行纯化，随着离心次数的增加，滤液中cDNA的含量越来越少，表面cDNA-invertase纯化完成。如图3（D）所示，通过对比cDNA、蔗糖转化酶和cDNA-invetase的紫外-可见吸收光谱图可知，cDNA和蔗糖转化酶聚合物溶液在260 nm处的特征吸收峰明显增强，这表明cDNA成功地与转化酶结合。
如图4所示，从图中可以看出，所合成的MBs-NH2呈现出类球状结构，平均直径大约在180 nm。因为MBs-NH2有着超顺磁性结构微域，会造成MBs-NH2发生一定的团聚。为了验证磁珠表面的官能团化，对MBs-NH2进行红外光谱（FT-IR）表征，结果如图4（F）所示，567cm-1出现峰形，是由 Fe-O-Fe 的伸缩振动产生的；3400cm-1附近显示的谱带是-OH的伸缩振动峰与N-H伸缩振动峰发生了一定程度的重叠所产生的，1634cm-1附近的谱带则对应 N-H 的弯曲振动峰，以上FT-IR的实验结果表明，成功合成了表面分别具有氨基修饰的纳米磁珠。
通过VSM测定产品的磁性能。商品化的Fe3O4纳米颗粒和MBs-NH2粒子在室温下测得的磁滞回线如图4（C）、（F）、（H）所示，当外加磁场由最大值逐渐减弱到零时，从图中可以看出两者的矫顽力和剩余磁化强度接近零，具有良好的超顺磁性。Fe3O4纳米颗粒和MBs-NH2粒子的饱和磁化强度依次为61.48emu/g 和66.58 emu/g。 MBs-NH2纳米颗粒在经过氨基修饰后仍具有较高的饱和磁化强度。进一步考察了不同时间纳米磁珠在外加磁场作用下的磁响应效果，如图4（G）所示，MBs-NH2在水中具有良好的分散性，在外加磁场作用下，30 s内就能够快速分离。
如图5所示，使用合成的MBs-NH2和apt进行PAGE和紫外-可见吸收光谱分析以验证纳米磁珠的连接性能。众所周知，DNA由于碱基暴露，在260 nm处具有最大吸收。如图4（A）所示，只有MBs的存在时，在260 nm处无明显峰值；与单独存在apt的溶液相比，MBs和apt共同孵育后，在260 nm处降低apt的紫外可见吸收，这证明了有部分apt连接在MBs-NH2上。聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果也验证了这一原理。如图4（B）所示，相对于未加apt（泳道3）和未加入MBs-NH2（泳道1），MBs-NH2和apt的共孵育（泳道2）出现一明显条带，表明MBs-apt的形成。
如图6所示，适配体链的3'端用荧光基团FAM修饰，以确定支持链与磁珠连接的最佳反应浓度和反应时间。该荧光基团在波长为494 nm的蓝光激发下发出波长为522 nm的绿色荧光，用荧光分光光度计检测其荧光强度。高浓度的适配体链导致更大的空间阻力以及珠子上的结合位点过饱和。此外，高浓度的适配体链合成成本高、利用率低。低浓度的适配体链可能导致荧光强度低，荧光不稳定性明显。此外，当反应时间为50 min时，适配体链与磁珠之间的连接效率较高，此时的连接效率会随着时间逐渐稳定，因此我们选择适配体浓度为10 μM，孵育时间为30 min进行后续实验。
如图7所示，可从图7(A)看出随着cDNA-invetase的浓度从1 μL增加到8 μL，血糖仪的信号响应也在不断增加。说明随着cDNA-invetase含量的增大，被卡那霉素释放的转化酶也在不断增加，从而使得磁珠表面更多的转化酶被释放，造成示数的增加。当cDNA-invetase含量继续增加到10 μL时，血糖仪的信号开始保持平稳趋势，再加入等量卡那霉素释放的转化酶量基本相同，可能是因为连接到材料表面的cDNA-invetase过多，造成磁珠表面空间位点达到饱和。图7（B）描述了水解温度在4℃到57℃范围内对血糖仪示数的影响。随着水解温度的升高，血糖仪的响应值在逐渐升高。当温度超过37 ℃时，PGM信号开始减弱。这是因为转化酶和DNA的生物活性取决于温度，并随着温度的升高而增加。然而，如果温度过高，转化酶和DNA就会发生变性。因此，水解温度设定为37℃。根据实验结果，最终选取8 μL和37℃作为cDNA-invetase的最佳条件进行后续实验。
如图8所示，样品的血糖值随着 pH 的增大先上升然后逐渐减小，pH 为 7.4 时，蔗糖转化酶的活性最高，并且卡那霉素在中性条件下不易水解。当 pH 超过 7.4时，酶的活性随之减弱。因此，选择 pH 等于 7.4 时为卡那霉素定量检测的合适条件。
如图9所示，与Kana相比，五种抗生素均无明显的干扰作用。这得益于Kana对apt的特异性识别作用，而其他氨基糖苷类抗生素无法在无相应适配体的条件下进行结合，这使得所建立的传感器拥有良好的选择性。
如图10所示，血糖仪信号的响应值随着缓冲液中卡那霉素浓度的增加而增加，与卡那霉素浓度在1至 200 nM 范围内呈良好的线性关系，根据3σ/斜率的定义计算出检测限（LOD）为0.280 nM（相当于0.163 μg/kg），能满足国家最新标准规定的卡那霉素监测的要求。
如图11所示，该试剂盒具有小型化、低制造成本和便携式。无需昂贵复杂的设备，即可实现样品的快速现场检测。它比传统的实验室方法更快更方便。此外，通过在后续设备中增加相应的检测模块，甚至可以为环境污染物的现场检测和监测提供强有力的工具。
本实施例所设计的电化学传感器不需要昂贵的实验仪器，并利用适配体高选择性、易修饰、低成本等特点构建了用于检测卡那霉素的电化学生物传感器，并成功应用于水中卡那霉素的检测，为现场实时检测Kana提供了一种简单可靠的方法。
以上施例和验证例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂，其特征在于，包括蔗糖和适配体纳米磁珠，所述适配体纳米磁珠由连接有Kana适配体的纳米磁珠与采用蔗糖转化酶标记的Kana适配体的互补链经双链杂交反应而制得。
2.如权利要求1所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂，其特征在于，所述Kana适配体的序列如SEQ ID NO:1所示；所述Kana适配体的互补链的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1或2所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，适配体纳米磁珠的制备过程如下：
（1）制备氨基化纳米磁珠：将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中，加入无水乙酸钠和1,6-己二胺，将溶液密封并在高压、180~210℃环境中反应6~12h，之后用水和乙醇反复洗涤，除去过量溶剂，最后真空干燥后得到氨基化磁珠备用；
（2）在纳米磁珠上连接Kana适配体：采用羧基修饰Kana适配体，并将羧基修饰Kana适配体加入到磷酸盐缓冲液中并进行孵育以激活羧基，在适配体溶液中加入步骤（1）所得的氨基化磁珠并进行孵育，使活化的羧基修饰的适配体通过酰胺化反应固定在氨基化磁珠表面，并在磷酸盐缓冲液洗涤后进行磁选，得到Apt-MBs备用；
（3）采用蔗糖转化酶标记Kana适配体的互补链：将胺-巯基交联剂溶于DMSO中，再将蔗糖转化酶溶于Buffer A中，并将两种溶液混合后摇匀在室温下充分反应；反应结束后转移到超滤管中进行离心，其离心产物SMCC-invertase截留在膜表面，离心完成后弃去超滤管下层液体，再加入Buffer A搅拌均匀进行离心，对产物进行洗涤，将洗涤并超滤好的SMCC-invertase转移至新的离心管，并加入Kana适配体的互补链cDNA，在室温条件下反应，反应完成后将溶液转移到超滤管内，再进行离心，使标记成功的cDNA-invertase截留于膜上方，离心结束后，弃去下层液体，并加入Buffer A混匀离心进行洗涤，得到蔗糖酶-cDNA备用；
（4）将步骤（2）所得的Apt-MBs和步骤（3）所得的蔗糖酶-cDNA，室温混合，以完成双链的杂交反应。
4.如权利要求3所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，激活羧基的激活反应温度为80~100℃，激活反应时间为5min，激活后在室温环境下冷却。
5.如权利要求3所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，适配体连接氨基化磁珠的反应温度为37℃，反应时间为30min。
6.如权利要求3所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，氨基化磁珠加入前需要进行如下处理：将氨基化磁珠分散在含1%戊二醛、pH为 7.4的磷酸盐缓冲溶液中在室温进行搅拌，然后用清水充分冲洗掉过量的戊二醛。
7.如权利要求3所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，激活羧基的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为10 mM，1,2-二氯乙烷的浓度为10 mM，N-羟基丁二酰亚胺的浓度为 30 mM，pH为 6.8。
8.如权利要求3所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，洗涤Apt-MBs的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为10 mM，pH为 6.8。
9.如权利要求3所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述Kana适配体的互补链cDNA在与SMCC-invertase反应前还要进行纯化操作：加入制备好的互补链、磷酸钠缓冲溶液、TCEP，混合以还原巯基标记的DNA并减少二硫键形成，将混合物在25℃下孵育1小时，然后将溶液转移到超滤管中进行离心，最后用Buffer A纯化得到纯化cDNA备用。
10.采用如权利要求1或2所述的基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂进行水中Kana含量检测的方法，其特征在于，采用如下步骤进行检测：
（1）使用前先用0.22 µm的针头式过滤器过滤，以除去水样中的不溶物等杂质，随后将样品配置成pH 7.4的缓冲溶液；
（2）将适配体纳米磁珠充分分散于样品缓冲溶液中；
（3）将适配体纳米磁珠通过磁分离后从溶液中除去；
（4）向除去适配体纳米磁珠的溶液中加入过量蔗糖，并采用血糖仪测量溶液的葡萄糖含量，根据血糖仪的数值与标准溶液数值进行对比，将血糖仪的数值换算成Kana含量。
CN202410007951.5A 2024-01-03 2024-01-03 基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法 Pending CN117517644A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410007951.5A CN117517644A (zh) 2024-01-03 2024-01-03 基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410007951.5A CN117517644A (zh) 2024-01-03 2024-01-03 基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117517644A true CN117517644A (zh) 2024-02-06

Family

ID=89751620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410007951.5A Pending CN117517644A (zh) 2024-01-03 2024-01-03 基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117517644A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0288737A1 (en) * 1987-04-01 1988-11-02 Miles Inc. Rapid hybridization assay using latex-immobilized probe
CN103399005A (zh) * 2013-07-12 2013-11-20 青岛科技大学 基于羧基化碳纳米粒子和dna相互作用测定溶菌酶的方法
CN107238699A (zh) * 2017-05-10 2017-10-10 江南大学 一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法
CN108008128A (zh) * 2017-12-21 2018-05-08 江南大学 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用
CN110161099A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 河南大学 以二氧化钛纳米棒复合材料为电化学示踪剂的电化学适配体传感器的构建方法
CN110589846A (zh) * 2019-10-23 2019-12-20 成都理工大学 一种六硼化镱纳米棒晶体的制备方法
CN110745838A (zh) * 2019-10-25 2020-02-04 成都理工大学 一种CuB23纳米花的制备方法
CN113933500A (zh) * 2021-09-30 2022-01-14 山东省农业科学院原子能农业应用研究所(山东省辐照中心、山东省农业科学院农产品研究所) 一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0288737A1 (en) * 1987-04-01 1988-11-02 Miles Inc. Rapid hybridization assay using latex-immobilized probe
CN103399005A (zh) * 2013-07-12 2013-11-20 青岛科技大学 基于羧基化碳纳米粒子和dna相互作用测定溶菌酶的方法
CN107238699A (zh) * 2017-05-10 2017-10-10 江南大学 一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法
CN108008128A (zh) * 2017-12-21 2018-05-08 江南大学 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用
CN110161099A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 河南大学 以二氧化钛纳米棒复合材料为电化学示踪剂的电化学适配体传感器的构建方法
CN110589846A (zh) * 2019-10-23 2019-12-20 成都理工大学 一种六硼化镱纳米棒晶体的制备方法
CN110745838A (zh) * 2019-10-25 2020-02-04 成都理工大学 一种CuB23纳米花的制备方法
CN113933500A (zh) * 2021-09-30 2022-01-14 山东省农业科学院原子能农业应用研究所(山东省辐照中心、山东省农业科学院农产品研究所) 一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAI-YAN SONG ET AL.,: "Highly sensitive voltammetric determination of kanamycin based on aptamer sensor for signal Amplification", 《ANAL. METHODS》, no. 8, 31 March 2016 (2016-03-31), pages 3366 *
YU XIANG ET AL.: "Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets", 《NATURE CHEMISTRY》, vol. 3, 14 July 2011 (2011-07-14), pages 697 - 703, XP055235002, DOI: 10.1038/nchem.1092 *
严伟;陈冬冬;陈嵘;: "便携式血糖仪联合血管内皮生长因子适配体传感系统的构建及其在骨肉瘤诊断中的应用", 福建医药杂志, no. 02, 15 April 2020 (2020-04-15) *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10895536B1 (en) Method for preparing a ratiometric fluorescent sensor for phycoerythrin based on a magnetic molecularly imprinted core-shell polymer
US7169618B2 (en) Magnetic particles and methods of producing coated magnetic particles
CN102928590A (zh) 一种快速检测沙门氏菌的荧光量子点筛选分离检测试剂盒
CN106770172B (zh) 一种牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法
CN113406329B (zh) 一种检测小分子物质的通用型适配体胶体金侧向层析试纸
Li et al. A novel low-field NMR biosensor based on dendritic superparamagnetic iron oxide nanoparticles for the rapid detection of Salmonella in milk
CN103320503B (zh) 检测结核杆菌的纳米材料探针系统及检测方法
CN113933500A (zh) 一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用
CN106366195B (zh) 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法
CN109444240A (zh) 一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用
CN107607722B (zh) 一种定量检测奶粉中β-乳球蛋白的方法
CN106770173B (zh) 一种用于抗生素检测的磁控适配体传感器制备方法
CN107860934A (zh) 一种微流控芯片及改性方法和在检测食品细菌数量上应用
CN112899231B (zh) 一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用
CN117517644A (zh) 基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法
CN106596957A (zh) 一种三唑磷定性定量分析的方法及该方法所用的试剂盒
CN113804665B (zh) 一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器及其制备方法和应用
CN114354573B (zh) 一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备方法和应用
CN114426971B (zh) 一种基于DNAzyme辅助信号放大的荧光免疫分析方法
CN116148239A (zh) 一种多重sers信号增强的纳米“三明治”细菌检测系统及其制备方法
CN109283347A (zh) 基于免疫磁珠和荧光量子点的纳米生物传感器快速检测肉鸡中恩诺沙星的方法
CN106279420B (zh) 一种cd20抗体免疫磁珠及其制备方法
CN114384240B (zh) 基于乳胶微球紫外吸收光谱峰面积积分的多目标物同时检测方法
CN219935866U (zh) 一种可同时快速检测三种食源性致病菌的纸基传感器
CN111592875B (zh) 一种荧光纤维素酶铂纳米簇及制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination