JPH0584079A - 単一プライマー増幅に使用するポリヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
単一プライマー増幅に使用するポリヌクレオチドの製造方法Info
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- JPH0584079A JPH0584079A JP3269946A JP26994691A JPH0584079A JP H0584079 A JPH0584079 A JP H0584079A JP 3269946 A JP3269946 A JP 3269946A JP 26994691 A JP26994691 A JP 26994691A JP H0584079 A JPH0584079 A JP H0584079A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 互に連続しない、相補性の２個のフラグメン
トを含有する一本鎖ポリデオキシヌクレオチドの製造方
法。 【構成】 本方法は、（１）２個の連続しない、非相補
性のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合
Ｓ２はＳ１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長
であるポリヌクレオチド、および（２）２個のデオキシ
ヌクレオチド配列からなエクステンダープローブであ
り、このエクステンダープローブの３′末端における配
列はＳ１とハイブリダイゼーション可能であり、他方の
デオキシヌクレオチド配列はＳ２と相同であるエクステ
ンダープローブを混合し、ついでエクステンダープロー
ブをポリヌクレオチドに沿って延長させる工程からな
る。この方法はまた、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配列
とのハイブリダイゼーションが少なくとも３′末端にお
いて可能なポリデオキシヌクレオチドプライマーを混合
して行うこともできる。この方法は、ポリヌクレオチド
被検物質の検出にとくに応用できる。
トを含有する一本鎖ポリデオキシヌクレオチドの製造方
法。 【構成】 本方法は、（１）２個の連続しない、非相補
性のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合
Ｓ２はＳ１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長
であるポリヌクレオチド、および（２）２個のデオキシ
ヌクレオチド配列からなエクステンダープローブであ
り、このエクステンダープローブの３′末端における配
列はＳ１とハイブリダイゼーション可能であり、他方の
デオキシヌクレオチド配列はＳ２と相同であるエクステ
ンダープローブを混合し、ついでエクステンダープロー
ブをポリヌクレオチドに沿って延長させる工程からな
る。この方法はまた、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配列
とのハイブリダイゼーションが少なくとも３′末端にお
いて可能なポリデオキシヌクレオチドプライマーを混合
して行うこともできる。この方法は、ポリヌクレオチド
被検物質の検出にとくに応用できる。
Description
【０００１】発明の背景 １．発明の分野 核酸のハイブリダイゼーションはその同一性の検討およ
び核酸の存在の確立に使用されてきた。ハイブリダイゼ
ーションは、相補性の塩基の対合に基づくものである。
相補性の単一鎖核酸を一緒にインキュベートすると、相
補性の塩基配列が対合し、二本鎖のハイブリッド分子を
形成する。単一鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）また
はリボ核酸（ＲＮＡ）が相補性の核酸配列と水素結合し
た構造を形成する能力は、分子生物学の研究において、
分析的道具として使用されてきた。高い比活性の放射性
三リン酸ヌクレオシドの利用およびＴ４キナーゼによる
ＤＮＡの３２Ｐ標識は、生物学的に興味のある各種の核
酸配列の同定、単離および特性づけを可能にしてきた。
核酸のハイブリダイゼーションは、独特な核酸配列を伴
う疾病状態の診断に大きな威力を発揮する可能性があ
る。これらの独特な核酸配列は、挿入、欠失、点突然変
異、または細菌、カビ、菌類およびウイルスの感染によ
る異種ＤＮＡもしくはＲＮＡの獲得によって、遺伝的ま
たは環境的なＤＮＡの変化から生じる。核酸のハイブリ
ダイゼーションは、従来、学問的または工業的な分子生
物学の実験室で主として使用されてきた。核酸ハイブリ
ダイゼーションの診断用の道具としての臨床医学におけ
る応用は、患者の体液中に存在する疾病関連ＤＮＡまた
はＲＮＡの濃度が多くの場合著しく低いこと、および核
酸ハイブリダイゼーション分析に十分な感度をもつ方法
がなかったことにより、限られている。
び核酸の存在の確立に使用されてきた。ハイブリダイゼ
ーションは、相補性の塩基の対合に基づくものである。
相補性の単一鎖核酸を一緒にインキュベートすると、相
補性の塩基配列が対合し、二本鎖のハイブリッド分子を
形成する。単一鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）また
はリボ核酸（ＲＮＡ）が相補性の核酸配列と水素結合し
た構造を形成する能力は、分子生物学の研究において、
分析的道具として使用されてきた。高い比活性の放射性
三リン酸ヌクレオシドの利用およびＴ４キナーゼによる
ＤＮＡの３２Ｐ標識は、生物学的に興味のある各種の核
酸配列の同定、単離および特性づけを可能にしてきた。
核酸のハイブリダイゼーションは、独特な核酸配列を伴
う疾病状態の診断に大きな威力を発揮する可能性があ
る。これらの独特な核酸配列は、挿入、欠失、点突然変
異、または細菌、カビ、菌類およびウイルスの感染によ
る異種ＤＮＡもしくはＲＮＡの獲得によって、遺伝的ま
たは環境的なＤＮＡの変化から生じる。核酸のハイブリ
ダイゼーションは、従来、学問的または工業的な分子生
物学の実験室で主として使用されてきた。核酸ハイブリ
ダイゼーションの診断用の道具としての臨床医学におけ
る応用は、患者の体液中に存在する疾病関連ＤＮＡまた
はＲＮＡの濃度が多くの場合著しく低いこと、および核
酸ハイブリダイゼーション分析に十分な感度をもつ方法
がなかったことにより、限られている。
【０００２】特異的な核酸配列を検出する現行の方法は
一般的に、標的核酸を、固体支持体たとえばニトロセル
ロース濾紙、セルロース濾紙、ジアゾ化濾紙、またはナ
イロン膜に固定化するものである。標的核酸が支持体上
に固定されたのち、支持体を適当に標識したプローブ核
酸と約２〜４８時間接触させる。上記時間の経過後、固
体支持体を制御された温度で数回洗浄してハイブリダイ
ズしなかったプローブを除去する。ついで支持体を乾燥
し、ハイブリダイズされた物質をオートラジオグラフィ
ーまたは分光測定法によって検出する。
一般的に、標的核酸を、固体支持体たとえばニトロセル
ロース濾紙、セルロース濾紙、ジアゾ化濾紙、またはナ
イロン膜に固定化するものである。標的核酸が支持体上
に固定されたのち、支持体を適当に標識したプローブ核
酸と約２〜４８時間接触させる。上記時間の経過後、固
体支持体を制御された温度で数回洗浄してハイブリダイ
ズしなかったプローブを除去する。ついで支持体を乾燥
し、ハイブリダイズされた物質をオートラジオグラフィ
ーまたは分光測定法によって検出する。
【０００３】きわめて低濃度を検出しなければならない
場合には、現行の方法は、遅く、労働集約的で、放射標
識より検出が容易でない非同位元素標識は不適当なこと
が多い。したがって、核酸配列を検出に際し、簡単な、
迅速な、非同位元素による、均一または不均一系法の使
用を可能にする感度の増大方法が望まれている。
場合には、現行の方法は、遅く、労働集約的で、放射標
識より検出が容易でない非同位元素標識は不適当なこと
が多い。したがって、核酸配列を検出に際し、簡単な、
迅速な、非同位元素による、均一または不均一系法の使
用を可能にする感度の増大方法が望まれている。
【０００４】最近、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と
して知られているＤＮＡの特異的セグメントの酵素的増
幅方法が報告された。このｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅操作
は、変性、オリゴヌクレオチドプライマー・アニーリン
グおよび好熱性ポリメラーゼによるプライマー延長の反
復サイクルに基づくものであり、プライマーに隣接する
領域のコピーの指数関数的増大を生じる。そのＤＮＡの
対立鎖にアニーリングするＰＣＲプライマーは、一方の
プライマーのポリメラーゼ触媒延長生成物が他方の鋳型
鎖として働き、オリゴヌクレオチドプライマーの５′末
端間の距離によって定められる長さの区分されたフラグ
メントの蓄積を生じるように配置される。
して知られているＤＮＡの特異的セグメントの酵素的増
幅方法が報告された。このｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅操作
は、変性、オリゴヌクレオチドプライマー・アニーリン
グおよび好熱性ポリメラーゼによるプライマー延長の反
復サイクルに基づくものであり、プライマーに隣接する
領域のコピーの指数関数的増大を生じる。そのＤＮＡの
対立鎖にアニーリングするＰＣＲプライマーは、一方の
プライマーのポリメラーゼ触媒延長生成物が他方の鋳型
鎖として働き、オリゴヌクレオチドプライマーの５′末
端間の距離によって定められる長さの区分されたフラグ
メントの蓄積を生じるように配置される。
【０００５】２．従来技術の説明 核酸配列の増幅、検出および／またはクローニング方法
は、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８
３，２０２号に開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応
による配列重合は、Ｓａｉｋｉら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３０：１３５０〜１３５４（１９８６）によって報告さ
れている。オリゴヌクレオチドの作製方法は欧州特許出
願第０１９４５４５Ａ２号に記載されている。ベルギー
特許出願第ＢＥ９０４４０２号には、ＤＮＡ検出プロー
ブ作製用の鋳型が開示されている。真核細胞における遺
伝子増幅は米国特許第４，６５６，１３４号に開示され
ている。
は、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８
３，２０２号に開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応
による配列重合は、Ｓａｉｋｉら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３０：１３５０〜１３５４（１９８６）によって報告さ
れている。オリゴヌクレオチドの作製方法は欧州特許出
願第０１９４５４５Ａ２号に記載されている。ベルギー
特許出願第ＢＥ９０４４０２号には、ＤＮＡ検出プロー
ブ作製用の鋳型が開示されている。真核細胞における遺
伝子増幅は米国特許第４，６５６，１３４号に開示され
ている。
【０００６】Ｌａｎｇｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：６６３３〜６６３７
（１９８１）には、ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵
素的剛性、およびこれらの物質の新規な核酸アフィニテ
ィープローブとしての使用が開示されている。ビオチン
標識ハイブリダイゼーションプローブを用いた、培養細
胞およびパラフィン包埋組織切片中のウイルスゲノムの
検出は、Ｂｒｉｇａｔｉら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２
６：３２〜５０（１９８３）によって論じられている。
米国特許第４，４８６，５３９号には、一工程サンドイ
ッチ・ハイブリダイゼーション試験による微生物核酸の
検出が開示されている。ＤＮＡ検出に基づく悪性腫瘍の
感度のよい試験が米国特許第４，４９０，４７２号に記
載されている。米国特許第４，４８０，０４０号には、
植物ウイロイド病およびウイルスの感度のよい迅速な診
断が開示されている。これは、診断すべきウイロイドま
たはウイルスの核酸に相補性の放射標識ＤＮＡを使用す
るものである。欧州特許出願第８３１０６１１２．２号
（１９８２年６月２３日出願の米国特許出願による優先
権）は、改良された標識ヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチド、ならびにそれらの製造、利用および検出方法が
教示されている。細胞性ＤＮＡの検出および定量のため
の方法および組成物が米国特許第４，４２３，１５３号
に開示されている。診断微生物学的な特異的ＤＮＡプロ
ーブが米国特許第４，３５８，５３５号に論じられてい
る。多形制限部位および核酸配列の検出方法は欧州特許
出願第０１６４０５４Ａ１号に論じられている。米国特
許第４，６６３，２８３号には二本鎖ＤＮＡを変える方
法が記載されている。
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：６６３３〜６６３７
（１９８１）には、ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵
素的剛性、およびこれらの物質の新規な核酸アフィニテ
ィープローブとしての使用が開示されている。ビオチン
標識ハイブリダイゼーションプローブを用いた、培養細
胞およびパラフィン包埋組織切片中のウイルスゲノムの
検出は、Ｂｒｉｇａｔｉら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２
６：３２〜５０（１９８３）によって論じられている。
米国特許第４，４８６，５３９号には、一工程サンドイ
ッチ・ハイブリダイゼーション試験による微生物核酸の
検出が開示されている。ＤＮＡ検出に基づく悪性腫瘍の
感度のよい試験が米国特許第４，４９０，４７２号に記
載されている。米国特許第４，４８０，０４０号には、
植物ウイロイド病およびウイルスの感度のよい迅速な診
断が開示されている。これは、診断すべきウイロイドま
たはウイルスの核酸に相補性の放射標識ＤＮＡを使用す
るものである。欧州特許出願第８３１０６１１２．２号
（１９８２年６月２３日出願の米国特許出願による優先
権）は、改良された標識ヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチド、ならびにそれらの製造、利用および検出方法が
教示されている。細胞性ＤＮＡの検出および定量のため
の方法および組成物が米国特許第４，４２３，１５３号
に開示されている。診断微生物学的な特異的ＤＮＡプロ
ーブが米国特許第４，３５８，５３５号に論じられてい
る。多形制限部位および核酸配列の検出方法は欧州特許
出願第０１６４０５４Ａ１号に論じられている。米国特
許第４，６６３，２８３号には二本鎖ＤＮＡを変える方
法が記載されている。
【０００７】転写体シクエンシングでのゲノム増幅がＳ
ｔｏｆｌｅｔら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４９１（１
９８８）によって論じられる。熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼによるプライマー指図の酵素的ＤＮＡ増幅はＳａｉ
ｋｉら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７（１９８８）
によって記載されている。米国特許第４，７２４，２０
２号には、核酸ハイブリダイゼーションの検出に、ハイ
ブリダイズできない核酸の使用が開示されている。Ｂｕ
ｇａｗａｎらは、胎児期の診断と法医学的ＨＬＡ類型分
類のための、酵素的に増幅したＤＮＡの分析に、非放射
性オリゴヌクレオチドプローブの使用を報告している。
ｔｏｆｌｅｔら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４９１（１
９８８）によって論じられる。熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼによるプライマー指図の酵素的ＤＮＡ増幅はＳａｉ
ｋｉら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７（１９８８）
によって記載されている。米国特許第４，７２４，２０
２号には、核酸ハイブリダイゼーションの検出に、ハイ
ブリダイズできない核酸の使用が開示されている。Ｂｕ
ｇａｗａｎらは、胎児期の診断と法医学的ＨＬＡ類型分
類のための、酵素的に増幅したＤＮＡの分析に、非放射
性オリゴヌクレオチドプローブの使用を報告している。
【０００８】同種の、反復増幅された核酸配列の検出お
よび単離は、米国特許第４，６７５，２８３号に開示さ
れている。それ自体にまたは他の核酸に反復ハイブリダ
イゼーションが可能で増幅体を形成する、一本鎖の自己
ハイブリダイゼーション核酸は、１９８６年７月２２日
出願の米国特許出願第８８８，０５８号に記載されてい
る。米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８
３，２０２号には、試薬複合物からの置換されたＲＮＡ
一本鎖ポリヌクレオチドの消化、および２個のオリゴヌ
クレオチドプライマーでのその核酸の別個の相補性鎖の
処理による核酸の増幅が行われる均一ポリヌクレオチド
置換アッセイが開示されている。欧州特許出願第０，２
００，３６２号には、疾病の診断および形質転換ベクタ
ーの製造に有用な、核酸配列の増幅、検出またはクロー
ニング方法が記載されている。多数の小サンプル中の相
対的核酸レベルを細胞質ドットハイブリダイゼーション
によって簡単に分析する方法が、米国特許第４，６７
７，０５４号に記載されている。チオヌクレオチド含有
プローブで核酸配列を検出するハイブリダイゼーション
方法が、米国特許第４，６４７，５２９号に記載されて
いる。
よび単離は、米国特許第４，６７５，２８３号に開示さ
れている。それ自体にまたは他の核酸に反復ハイブリダ
イゼーションが可能で増幅体を形成する、一本鎖の自己
ハイブリダイゼーション核酸は、１９８６年７月２２日
出願の米国特許出願第８８８，０５８号に記載されてい
る。米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８
３，２０２号には、試薬複合物からの置換されたＲＮＡ
一本鎖ポリヌクレオチドの消化、および２個のオリゴヌ
クレオチドプライマーでのその核酸の別個の相補性鎖の
処理による核酸の増幅が行われる均一ポリヌクレオチド
置換アッセイが開示されている。欧州特許出願第０，２
００，３６２号には、疾病の診断および形質転換ベクタ
ーの製造に有用な、核酸配列の増幅、検出またはクロー
ニング方法が記載されている。多数の小サンプル中の相
対的核酸レベルを細胞質ドットハイブリダイゼーション
によって簡単に分析する方法が、米国特許第４，６７
７，０５４号に記載されている。チオヌクレオチド含有
プローブで核酸配列を検出するハイブリダイゼーション
方法が、米国特許第４，６４７，５２９号に記載されて
いる。
【０００９】ＤＮＡのセルロースへの共有結合的付着お
よびそのハイブリダイゼーション限定分析への応用、な
らびにＤＮＡプローブのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための
簡単な、効率的な酵素的方法がＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１４：９１７１〜９１９１（１９８６）に記
載されている。一本鎖オリゴヌクレオチドのＥｃｏＲＩ
制限エンドヌクレアーゼによる切断は、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：７０９〜７１６，１９８７に
記載されている。
よびそのハイブリダイゼーション限定分析への応用、な
らびにＤＮＡプローブのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための
簡単な、効率的な酵素的方法がＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１４：９１７１〜９１９１（１９８６）に記
載されている。一本鎖オリゴヌクレオチドのＥｃｏＲＩ
制限エンドヌクレアーゼによる切断は、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：７０９〜７１６，１９８７に
記載されている。
【００１０】組換えＲＮＡハイブリダイゼーションプロ
ーブの指数関数的増幅は、Ｌｉｚａｒｄｉら：Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７〜１２０２（１９
８８）に記載されている。ＦａｈｒｌａｎｄｅｒらはＢ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１６５〜１１６８
（１９８８）に、ＤＮＡプローブシグナルの増幅：クリ
スマスツリー・アプローチを論じている。
ーブの指数関数的増幅は、Ｌｉｚａｒｄｉら：Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７〜１２０２（１９
８８）に記載されている。ＦａｈｒｌａｎｄｅｒらはＢ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１６５〜１１６８
（１９８８）に、ＤＮＡプローブシグナルの増幅：クリ
スマスツリー・アプローチを論じている。
【００１１】標的配列に架橋できるプローブを使用する
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは米国特許第４，
５９９，３０３号に記載されている。この方法は、二官
能性の架橋分子が予め共有結合によって導入された特異
的一本鎖リボ核酸またはデオキシリボ核酸分子の製造を
包含する。導入は、架橋分子が、プローブの標的である
細菌、ウイルスまたは哺乳動物の染色体の核酸と共有結
合架橋を形成する第二の反応を行う能力を維持するよう
に行われる。架橋後、一本鎖プローブと二本鎖の共有結
合で架橋したプローブ−標的複合体を識別する数種の方
法のひとつを用いて、非架橋プローブを共有結合で架橋
したプローブ−標的複合体から分離する。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは米国特許第４，
５９９，３０３号に記載されている。この方法は、二官
能性の架橋分子が予め共有結合によって導入された特異
的一本鎖リボ核酸またはデオキシリボ核酸分子の製造を
包含する。導入は、架橋分子が、プローブの標的である
細菌、ウイルスまたは哺乳動物の染色体の核酸と共有結
合架橋を形成する第二の反応を行う能力を維持するよう
に行われる。架橋後、一本鎖プローブと二本鎖の共有結
合で架橋したプローブ−標的複合体を識別する数種の方
法のひとつを用いて、非架橋プローブを共有結合で架橋
したプローブ−標的複合体から分離する。
【００１２】ハイブリダイゼーション方法および核酸配
列を検出するためのプローブは、米国特許第４，９０
８，３０７号に記載されている。増幅ハイブリダイゼー
ションアッセイは米国特許第４，８８２，２６９号に記
載されている。これは、シグナル発生二次プローブのフ
ァミリーが、興味ある標的配列にハイブリダイズする一
時プローブに結合するものである。
列を検出するためのプローブは、米国特許第４，９０
８，３０７号に記載されている。増幅ハイブリダイゼー
ションアッセイは米国特許第４，８８２，２６９号に記
載されている。これは、シグナル発生二次プローブのフ
ァミリーが、興味ある標的配列にハイブリダイズする一
時プローブに結合するものである。
【００１３】遺伝子異常疾患の診断のために、診断およ
び隣接プローブを用いるハイブリダイゼーションによ
る、とくに自動化操作での、核酸中の標的配列の検出
が、欧州特許出願第０ １８５ ４９４Ａ２号に記載さ
れている。この方法では、サンプルを、標的配列の診断
部分に相補性のプローブ（診断プローブ）と、診断部分
に連続するヌクレオチド配列に相補性のプローブ（連続
プローブ）と、診断プローブが実質的に、標的配列を含
むサンプル核酸にのみ結合して維持される条件下にハイ
ブリダイズさせる。次に、診断プローブと連続プローブ
を共有結合で付着させて、標的配列に相補性の標的プロ
ーブを生成させ、結合しないプローブを除去する。好ま
しい様式においては、一方のプローブを標識し、標的配
列の存否は、サンプル核酸標的プローブ二本鎖を解き、
解離した標的プローブを溶出し、その標識を調べること
によって試験できる。
び隣接プローブを用いるハイブリダイゼーションによ
る、とくに自動化操作での、核酸中の標的配列の検出
が、欧州特許出願第０ １８５ ４９４Ａ２号に記載さ
れている。この方法では、サンプルを、標的配列の診断
部分に相補性のプローブ（診断プローブ）と、診断部分
に連続するヌクレオチド配列に相補性のプローブ（連続
プローブ）と、診断プローブが実質的に、標的配列を含
むサンプル核酸にのみ結合して維持される条件下にハイ
ブリダイズさせる。次に、診断プローブと連続プローブ
を共有結合で付着させて、標的配列に相補性の標的プロ
ーブを生成させ、結合しないプローブを除去する。好ま
しい様式においては、一方のプローブを標識し、標的配
列の存否は、サンプル核酸標的プローブ二本鎖を解き、
解離した標的プローブを溶出し、その標識を調べること
によって試験できる。
【００１４】上述の方法には、連続配列が要求されると
いう少なくとも一つの欠点がある。この方法を実施する
ためには、診断配列と連続配列を同定し、上記配列に相
補性の診断および連続プローブを作らなければならな
い。診断および連続配列が正確に同定されていないと、
診断および連続プローブは十分にハイブリダイズせず、
アッセイの特異性および感度は失われるかまた実質的に
低下する。
いう少なくとも一つの欠点がある。この方法を実施する
ためには、診断配列と連続配列を同定し、上記配列に相
補性の診断および連続プローブを作らなければならな
い。診断および連続配列が正確に同定されていないと、
診断および連続プローブは十分にハイブリダイズせず、
アッセイの特異性および感度は失われるかまた実質的に
低下する。
【００１５】ＤＮＡの増幅および減衰技術はＷＯ８９／
１２６９５に記載されている。この方法は、２フラグメ
ント混合物の一方に独特なゲノムまたはＲＮＡ−誘導二
本鎖の単離を包含する。正のソースおよび負のソース混
合物中のフラグメントは別個にエンドリンカーを装備
し、各混合物を、会合したリンカーに相同の単一プライ
マーを用い、連続的なプライマー鎖複製によって増幅さ
れる。第二のソースのリンカーはビオチン化し、この混
合物中のフラグメントを正のソースの混合物中のフラグ
メントのモル過剰でバイブリダイズする。ビオチン化
種、すなわち正のソース混合物に独特の種を、アフィニ
ティークロマトグラフイーでハイブリダイズされた種を
除去したのち単離する。リンカー／プライマー複製の反
復によってＤＮＡフラグメントの混合物の増幅方法も開
示されている。
１２６９５に記載されている。この方法は、２フラグメ
ント混合物の一方に独特なゲノムまたはＲＮＡ−誘導二
本鎖の単離を包含する。正のソースおよび負のソース混
合物中のフラグメントは別個にエンドリンカーを装備
し、各混合物を、会合したリンカーに相同の単一プライ
マーを用い、連続的なプライマー鎖複製によって増幅さ
れる。第二のソースのリンカーはビオチン化し、この混
合物中のフラグメントを正のソースの混合物中のフラグ
メントのモル過剰でバイブリダイズする。ビオチン化
種、すなわち正のソース混合物に独特の種を、アフィニ
ティークロマトグラフイーでハイブリダイズされた種を
除去したのち単離する。リンカー／プライマー複製の反
復によってＤＮＡフラグメントの混合物の増幅方法も開
示されている。
【００１６】１９８９年１月１９日および１９８９年８
月２９日にそれぞれ出願された米国特許出願第０７／２
９９，２８２号および第０７／３９９，７９５号（欧州
特許出願第９０３００５２８．８号、公告番号第０３７
９３６９号）に単一ポリヌクレオチドプライマーを使用
する核酸増幅が記載されている。これらの２出願の開示
は参考として本明細書に導入する。
月２９日にそれぞれ出願された米国特許出願第０７／２
９９，２８２号および第０７／３９９，７９５号（欧州
特許出願第９０３００５２８．８号、公告番号第０３７
９３６９号）に単一ポリヌクレオチドプライマーを使用
する核酸増幅が記載されている。これらの２出願の開示
は参考として本明細書に導入する。
【００１７】発明の要約 ここに開示される発明は、互いに連続しない、相補性の
２個のセグメントを有する一本鎖ポリデオキシヌクレオ
チドを形成するための方法および試薬を包含する。この
方法は、たとえば、単一プライマー増幅アッセイに特に
応用を見出すことができる。
２個のセグメントを有する一本鎖ポリデオキシヌクレオ
チドを形成するための方法および試薬を包含する。この
方法は、たとえば、単一プライマー増幅アッセイに特に
応用を見出すことができる。
【００１８】本発明の一実施態様においては、互いに連
続しない、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポ
リデオキシヌクレオチドを製造する。製造方法は、
（ａ）２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配列
Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′であ
り少なくとも１０ヌクレオチド長であるポリヌクレオチ
ドと、２個のデオキシヌクレオチド配列からなるエクス
テンダープローブであり、このエクステンダープローブ
の３′末端における配列はＳ１とハイブリダイゼーショ
ン可能で、他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２と相
同であるエクステンダープローブとを混合する工程、な
らびに（ｂ）そのエクステンダープローブをポリヌクレ
オチドに沿って延長させる工程からなる。
続しない、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポ
リデオキシヌクレオチドを製造する。製造方法は、
（ａ）２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配列
Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′であ
り少なくとも１０ヌクレオチド長であるポリヌクレオチ
ドと、２個のデオキシヌクレオチド配列からなるエクス
テンダープローブであり、このエクステンダープローブ
の３′末端における配列はＳ１とハイブリダイゼーショ
ン可能で、他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２と相
同であるエクステンダープローブとを混合する工程、な
らびに（ｂ）そのエクステンダープローブをポリヌクレ
オチドに沿って延長させる工程からなる。
【００１９】本発明の他の態様には、互いに連続しな
い、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチドの多重コピーを製造する方法が包含さ
れる。この方法は、（１）２個の連続しない、非相補性
のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ
２はＳ１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長で
あるポリヌクレオチド、（２）２個のデオキシヌクレオ
チド配列からなるエクステンダープローブであり、この
エクステンダープローブの３′末端における配列はＳ１
とハイブリダイゼーション可能で、他方のヌクレオチド
配列はＳ２と相同でありポリヌクレオチドと相補性では
ないエクステンダープローブ、（３）Ｓ２と相補性のヌ
クレオチド配列とのハイブリダイゼーションが少なくと
も３′末端において可能なポリデオキシヌクレオチドプ
ライマー、（４）ＤＮＡポリメラーゼ、および（５）三
リン酸デオキシヌクレオチドを、（ａ）エクステンダー
プローブがポリヌクレオチドに沿って延長して二本鎖を
形成し、（ｂ）この延長されたエクステンダープローブ
が二本鎖から解離し、（ｃ）ポリデオキシヌクレオチド
プライマーが延長されたエクステンダープローブとハイ
ブリダイズし、それに沿って延長され、延長されたプラ
イマーからなる第二の二本鎖を形成し、（ｄ）この延長
されたプライマーが第二の二本鎖から解離し、ついで
（ｅ）このプライマーが延長されたプライマーとハイブ
リダイズし、それに沿って延長され、延長されたプライ
マーからなる二本鎖を形成し、続いて工程（ｄ）と
（ｅ）が反復される条件下に、同時に、または全部もし
くは一部を継続的に混合する工程からなる。
い、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチドの多重コピーを製造する方法が包含さ
れる。この方法は、（１）２個の連続しない、非相補性
のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ
２はＳ１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長で
あるポリヌクレオチド、（２）２個のデオキシヌクレオ
チド配列からなるエクステンダープローブであり、この
エクステンダープローブの３′末端における配列はＳ１
とハイブリダイゼーション可能で、他方のヌクレオチド
配列はＳ２と相同でありポリヌクレオチドと相補性では
ないエクステンダープローブ、（３）Ｓ２と相補性のヌ
クレオチド配列とのハイブリダイゼーションが少なくと
も３′末端において可能なポリデオキシヌクレオチドプ
ライマー、（４）ＤＮＡポリメラーゼ、および（５）三
リン酸デオキシヌクレオチドを、（ａ）エクステンダー
プローブがポリヌクレオチドに沿って延長して二本鎖を
形成し、（ｂ）この延長されたエクステンダープローブ
が二本鎖から解離し、（ｃ）ポリデオキシヌクレオチド
プライマーが延長されたエクステンダープローブとハイ
ブリダイズし、それに沿って延長され、延長されたプラ
イマーからなる第二の二本鎖を形成し、（ｄ）この延長
されたプライマーが第二の二本鎖から解離し、ついで
（ｅ）このプライマーが延長されたプライマーとハイブ
リダイズし、それに沿って延長され、延長されたプライ
マーからなる二本鎖を形成し、続いて工程（ｄ）と
（ｅ）が反復される条件下に、同時に、または全部もし
くは一部を継続的に混合する工程からなる。
【００２０】他の実施態様においては、標的ヌクレオチ
ド配列の含有が疑われるメジウム中の標的ヌクレオチド
配列の存在が検出される。標的ヌクレオチド配列は、２
個の連続しない、ハイブリダイズできないヌクレオチド
配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′
であり少なくとも１０ヌクレオチド長である。この方法
は、（ａ）メジウム；２個のデオキシヌクレオチド配列
を有するエクステンダープローブであり、このエクステ
ンダープローブの３′末端における配列はＳ１とハイブ
リダイゼーション可能で、他方のデオキシヌクレオチド
配列はＳ２と相同であり標的ヌクレオチドと相補性では
ないエクステンダープローブ；Ｓ２と相補性のヌクレオ
チド配列とハイブリダイゼーション可能なポリデオキシ
ヌクレオチドプライマー；ＤＮＡポリメラーゼ；ならび
に三リン酸デオキシヌクレオチドを、（１）エクステン
ダープローブがポリヌクレオチドに沿って延長して二本
鎖を形成し、（２）この延長されたエクステンダープロ
ーブが二本鎖から解離し、（３）プライマーがこの延長
されたエクステンダープローブとハイブリダイズし、そ
れに沿って延長され、延長されたプライマーからなる第
二の二本鎖を形成し、（４）この延長されたプライマー
がその二本鎖から解離し、ついで（５）プライマーが延
長されたプライマーとハイブリダイズし、それに沿って
延長され、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成
し、続いて工程（４）および（５）が反復される条件下
に、同時に、または全部もしくは一部を継続的に混合す
る工程、ならびに（ｂ）延長されたプライマーの存在を
調べる工程からなる。
ド配列の含有が疑われるメジウム中の標的ヌクレオチド
配列の存在が検出される。標的ヌクレオチド配列は、２
個の連続しない、ハイブリダイズできないヌクレオチド
配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′
であり少なくとも１０ヌクレオチド長である。この方法
は、（ａ）メジウム；２個のデオキシヌクレオチド配列
を有するエクステンダープローブであり、このエクステ
ンダープローブの３′末端における配列はＳ１とハイブ
リダイゼーション可能で、他方のデオキシヌクレオチド
配列はＳ２と相同であり標的ヌクレオチドと相補性では
ないエクステンダープローブ；Ｓ２と相補性のヌクレオ
チド配列とハイブリダイゼーション可能なポリデオキシ
ヌクレオチドプライマー；ＤＮＡポリメラーゼ；ならび
に三リン酸デオキシヌクレオチドを、（１）エクステン
ダープローブがポリヌクレオチドに沿って延長して二本
鎖を形成し、（２）この延長されたエクステンダープロ
ーブが二本鎖から解離し、（３）プライマーがこの延長
されたエクステンダープローブとハイブリダイズし、そ
れに沿って延長され、延長されたプライマーからなる第
二の二本鎖を形成し、（４）この延長されたプライマー
がその二本鎖から解離し、ついで（５）プライマーが延
長されたプライマーとハイブリダイズし、それに沿って
延長され、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成
し、続いて工程（４）および（５）が反復される条件下
に、同時に、または全部もしくは一部を継続的に混合す
る工程、ならびに（ｂ）延長されたプライマーの存在を
調べる工程からなる。
【００２１】本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチ
ド被検物質の含有が疑われるサンプル中のポリヌクレオ
チド被検物質の存在を検出する方法に関する。この方法
は、（ａ）ポリヌクレオチド被検物質が存在すればそれ
から、２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配
列、Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′
であり少なくとも１０ヌクレオチド長である一本鎖ヌク
レオチド配列が形成されるようにサンプル含有メジウム
を処理し、（ｂ）このメジウムを、２個のポリデオキシ
ヌクレオチド配列を有するエクステンダープローブであ
り、このエクステンダープローブの３′末端における配
列はＳ１とハイブリダイゼーション可能で、他方のデオ
キシヌクレオチド配列はＳ２と相同であり標的配列とは
相補性ではないエクステンダープローブ；Ｓ２に相補性
のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーション可能なポ
リデオキシヌクレオチドプライマー；三リン酸デオキシ
ヌクレオシド；ならびにＤＮＡ鋳型依存性ポリデオキシ
ヌクレオチドポリメラーゼと、（１）エクステンダープ
ローブが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、そ
れに沿って延長して二本鎖を形成し、（２）この延長さ
れたエクステンダープローブが二本鎖から解離し、
（３）プライマーがこの延長されたエクステンダープロ
ーブとハイブリダイズし、それに沿って延長され、延長
されたプライマーからなる二本鎖を形成し、（４）この
延長されたプライマーが二本鎖から解離し、ついで
（５）プライマーがこの延長されたプライマーとハイブ
リダイズし、それに沿って延長され、延長されたプライ
マーからなる二本鎖を形成し、続いて工程（４）および
（５）が反復される条件下に混合し、この場合、工程
（ａ）と（ｂ）は同時に、または全部もしくは一部を継
続的に実施し、ついで（ｃ）延長されたプライマーの存
在を調べる工程からなる。
ド被検物質の含有が疑われるサンプル中のポリヌクレオ
チド被検物質の存在を検出する方法に関する。この方法
は、（ａ）ポリヌクレオチド被検物質が存在すればそれ
から、２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配
列、Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′
であり少なくとも１０ヌクレオチド長である一本鎖ヌク
レオチド配列が形成されるようにサンプル含有メジウム
を処理し、（ｂ）このメジウムを、２個のポリデオキシ
ヌクレオチド配列を有するエクステンダープローブであ
り、このエクステンダープローブの３′末端における配
列はＳ１とハイブリダイゼーション可能で、他方のデオ
キシヌクレオチド配列はＳ２と相同であり標的配列とは
相補性ではないエクステンダープローブ；Ｓ２に相補性
のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーション可能なポ
リデオキシヌクレオチドプライマー；三リン酸デオキシ
ヌクレオシド；ならびにＤＮＡ鋳型依存性ポリデオキシ
ヌクレオチドポリメラーゼと、（１）エクステンダープ
ローブが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、そ
れに沿って延長して二本鎖を形成し、（２）この延長さ
れたエクステンダープローブが二本鎖から解離し、
（３）プライマーがこの延長されたエクステンダープロ
ーブとハイブリダイズし、それに沿って延長され、延長
されたプライマーからなる二本鎖を形成し、（４）この
延長されたプライマーが二本鎖から解離し、ついで
（５）プライマーがこの延長されたプライマーとハイブ
リダイズし、それに沿って延長され、延長されたプライ
マーからなる二本鎖を形成し、続いて工程（４）および
（５）が反復される条件下に混合し、この場合、工程
（ａ）と（ｂ）は同時に、または全部もしくは一部を継
続的に実施し、ついで（ｃ）延長されたプライマーの存
在を調べる工程からなる。
【００２２】本発明は、（ａ）標的ヌクレオチド配列に
おける第一の配列にハイブリダイゼーション可能な配列
を３′末端に有し、標的ヌクレオチド配列の第二の配列
と相同である配列を有し、この場合、標的ヌクレオチド
配列中、第二の配列は第一の配列の５′であって両者は
連続しないエクステンダープローブ、および第二の配列
と相補性の配列とハイブリダイゼーション可能なポリデ
オキシヌクレオチドプライマーを、包装して組合せてな
るキットを包含する。
おける第一の配列にハイブリダイゼーション可能な配列
を３′末端に有し、標的ヌクレオチド配列の第二の配列
と相同である配列を有し、この場合、標的ヌクレオチド
配列中、第二の配列は第一の配列の５′であって両者は
連続しないエクステンダープローブ、および第二の配列
と相補性の配列とハイブリダイゼーション可能なポリデ
オキシヌクレオチドプライマーを、包装して組合せてな
るキットを包含する。
【００２３】特定の実施態様の説明 本発明は、分子内に塩基対合構造、すなわち互いに連続
しない、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポリ
ヌクレオチド配列の製造を可能にする。この方法は、サ
ンプル中の標的配列が分子内に塩基対合構造を有するか
またはそのような構造に変換できる場合、その標的配列
を増幅する、上述の単一プライマー増幅の分野に、とく
に応用される。本方法は、興味あるポリヌクレオチド配
列を、分子内塩基対合構造を有する標的配列に変換する
きわめて便利な方法を提供する。
しない、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポリ
ヌクレオチド配列の製造を可能にする。この方法は、サ
ンプル中の標的配列が分子内に塩基対合構造を有するか
またはそのような構造に変換できる場合、その標的配列
を増幅する、上述の単一プライマー増幅の分野に、とく
に応用される。本方法は、興味あるポリヌクレオチド配
列を、分子内塩基対合構造を有する標的配列に変換する
きわめて便利な方法を提供する。
【００２４】本発明の特定の実施態様についてさらに説
明を進める前に、多数の用語について定義する。
明を進める前に、多数の用語について定義する。
【００２５】ポリヌクレオチド被検物質−測定すべき化
合物または組成物で重合ヌクレオチドである。無傷の天
然状態では約２０〜５００，０００またはそれ以上のヌ
クレオチド、単離状態では約３０〜５０，０００または
それ以上のヌクレオチド、通常は約１００〜２０，００
０ヌクレオチド、さらに頻繁には５００〜１０，０００
のヌクレオチドを有する。すなわち、天然状態からの被
検物質の単離に際しては、しばしば断片化を生じること
が明らかである。ポリヌクレオチド被検物質には、任意
の起源からの精製または非精製型の核酸、すなわち、ｔ
−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、γ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤ
ＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ
−ＲＮＡハイブリッド、またはそれらの混合物、遺伝
子、染色体、プラスミド、生物学的材料たとえば微生
物、たとえば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ
類、菌類、植物、動物、ヒトのゲノム、およびそれらの
フラグメント等が包含される。ポリヌクレオチド被検物
質は、生物学的サンプルのような複合混合物の微量分画
であってもよい。被検物質は、様々な生物学的材料か
ら、本技術分野においてよく知られている操作によって
得ることができる。このような生物学的材料の一部を、
例示のために以下の表に掲げるが、これは本発明を限定
するものではない。
合物または組成物で重合ヌクレオチドである。無傷の天
然状態では約２０〜５００，０００またはそれ以上のヌ
クレオチド、単離状態では約３０〜５０，０００または
それ以上のヌクレオチド、通常は約１００〜２０，００
０ヌクレオチド、さらに頻繁には５００〜１０，０００
のヌクレオチドを有する。すなわち、天然状態からの被
検物質の単離に際しては、しばしば断片化を生じること
が明らかである。ポリヌクレオチド被検物質には、任意
の起源からの精製または非精製型の核酸、すなわち、ｔ
−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、γ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤ
ＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ
−ＲＮＡハイブリッド、またはそれらの混合物、遺伝
子、染色体、プラスミド、生物学的材料たとえば微生
物、たとえば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ
類、菌類、植物、動物、ヒトのゲノム、およびそれらの
フラグメント等が包含される。ポリヌクレオチド被検物
質は、生物学的サンプルのような複合混合物の微量分画
であってもよい。被検物質は、様々な生物学的材料か
ら、本技術分野においてよく知られている操作によって
得ることができる。このような生物学的材料の一部を、
例示のために以下の表に掲げるが、これは本発明を限定
するものではない。
【００２６】
【表１】 興味ある微生物 コリネバクテリウム Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ肺炎球菌 Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅストレプトコッカス Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｕｓブドウ球菌 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓナイセリア Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ腸内細菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ 大腸菌群 Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ Ｓａｃｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ サルモネラ属 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｓｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｃｈｍｉｔｚｉｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄａ シゲラ属 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ他の腸内菌 Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ プロテウス属 Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅヘモフィルス−ボルデテラ属群 Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｈ．ｄｕｃｒｙｌ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓパスツレラ属 Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓブルセラ属 Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ好気性胞子形成桿菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ嫌気性胞子形成桿菌 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓマイコバクテリウム Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ放射菌類（カビ様細菌） Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓａｅｌｉ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｂｏｖｉｓ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓスピロヘータ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｏｉｌｉｆｏｒｍｉｓ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａトリパノゾーマ マイコプラズマ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ他の病原体 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ Ｄｏｎｖａｎｉａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓリケッチア（細菌様寄生動物） Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ （ＨＩＶ） Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａクラミジア（分類不能寄生動物、細菌／ウイルス） Ｃｌａｍｉｄｉａ ａｇｅｎｔｓ（名称不確定）菌類 Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ Ｈｉｓｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ Ｍｕｃｏｒ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ） Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕａ Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｕｍ ｓｃｈｅｎｋｉｉ Ｆｌｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｃｏｍｐａｃｔ Ｆｒｏｓｅｃａｅａ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｍｙｃｅｔｏｍｉ Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓｅａ Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ Ｐｈｉｌｏｐｈｏｒａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｊｅｌｌｏｉ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｄｏｕｉｎｉウイルス Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓヘルペスウイルス Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ（水痘） Ｈｅｒｐｅｓ Ｚｏｓｔｅｒ（帯状庖疹） Ｖｉｒｕｓ Ｂ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓポックスウイルス Ｖａｒｉｏｌａ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｂｏｖｉｓ Ｐａｒａｖａｃｃｉｎｉａ Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍピコナルウイルス Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓミキソウイルス Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ａ，ＢおよびＣ） Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ（１〜４） Ｍｕｍｐｓ Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｒｉｎｄｅｒｐｅａｔ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｎｉｎｅ Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｈｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｒｕｂｅｌｌａ Ｖｉｒｕｓアルボウイルス Ｅａｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｕｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｕｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｃｈｉｋｕｇｕｎｙａ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｙｏｒａ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｔｉｃｋ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓレオウイルス Ｒｅｏｖｉｒｕｓ１〜３型レトロウイルス Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｉおよ びＩＩ（ＨＴＬＶ）肝炎 Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｎｏｎＡ−ｎｏｎＢ Ｖｉｒｕｓ腫瘍ウイルス Ｒａｕｓｃｈｅｒ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｒｏｓｓ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＶｉｒｕｓＨｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ
【００２７】ポリヌクレオチド被検物質は、適宜、たと
えば、剪断力によりまたは制限エンドヌクレアーゼもし
くは他の部位特異的な化学的切断方法により、標的ポリ
ヌクレオチド配列を含有するフラグメントを得るため被
検物質を切断するように処理することができる。しかし
ながら、ポリヌクレオチド被検物質をさらに切断するこ
となく、その単離状態で使用できることが本発明の利点
である。
えば、剪断力によりまたは制限エンドヌクレアーゼもし
くは他の部位特異的な化学的切断方法により、標的ポリ
ヌクレオチド配列を含有するフラグメントを得るため被
検物質を切断するように処理することができる。しかし
ながら、ポリヌクレオチド被検物質をさらに切断するこ
となく、その単離状態で使用できることが本発明の利点
である。
【００２８】本発明の目的のためには、ポリヌクレオチ
ド被検物質、またはポリヌクレオチド被検物質から得ら
れた切断フラグメントは、通常、少なくとも一部が変性
もしくは一本鎖化されるか、またはそれが変性もしくは
一本鎖化するように処理される。このような処理は本技
術分野においてよく知られていて、たとえば、熱または
アルカリ処理が包含される。たとえば、二本鎖ＤＮＡを
９０〜１００℃に約１〜１０分間加熱して、変性物質を
製造することができる。
ド被検物質、またはポリヌクレオチド被検物質から得ら
れた切断フラグメントは、通常、少なくとも一部が変性
もしくは一本鎖化されるか、またはそれが変性もしくは
一本鎖化するように処理される。このような処理は本技
術分野においてよく知られていて、たとえば、熱または
アルカリ処理が包含される。たとえば、二本鎖ＤＮＡを
９０〜１００℃に約１〜１０分間加熱して、変性物質を
製造することができる。
【００２９】標的ポリヌクレオチド配列−同定されるヌ
クレオチドの配列。その同定については、このような標
的配列の少なくとも部分、通常は少なくともその１０ヌ
クレオチドセグメント、好ましくはその少なくとも１
５、多くの場合その２０〜５０ヌクレオチドセグメント
とハイブリダイズするエクステンダープローブ、ポリデ
オキシヌクレオチドの製造が十分可能な程度まで知られ
ている。標的ポリヌクレオチド配列は、２個の連続しな
い、非相補性のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有
し、その一方（Ｓ１）はエクステンダープローホ、ポリ
デオキシヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能な
上述の部分であり、Ｓ２はＳ１の５′である。標的ポリ
ヌクレオチド配列は通常、約１０〜５，０００またはそ
れ以上のヌクレオチド、好ましくは２０〜１，０００ヌ
クレオチドを含有する。２個の連続しない、非相補性の
ヌクレオチド配列、Ｓ１およびＳ２は、好ましくはそれ
ぞれ１０〜１００ヌクレオチドを含有し、少なくとも１
０塩基、好ましくは少なくとも１００、通常は２００〜
５，０００塩基またはそれ以上離れている。標的ポリヌ
クレオチド配列は多くの場合、ポリヌクレオチド被検物
質の部分である。標的ポリヌクレオチド配列は一般には
大分子の分画であるか、また、実質的に全分子であって
もよい。標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの
最小数はサンプル中における標的ポリヌクレオチド配列
の存在がサンプル中におけるポリヌクレオチド被検物質
の存在の特異的インディケーターになることが確信でき
るように選択される。大ざっぱには、配列の長さは通常
約１．６ｌｏｇＬヌクレオチド以上であり、この場合、
Ｌはサンプルの生物学的起源のゲノムにおける塩基対の
数である。標的配列中のヌクレオチドの最大数は通常、
ポリヌクレオチド被検物質の長さ、ならびに剪断力また
は単離時の他の処理および検定用サンプルの調製に必要
な操作によるその切断されやすさによって支配される。
クレオチドの配列。その同定については、このような標
的配列の少なくとも部分、通常は少なくともその１０ヌ
クレオチドセグメント、好ましくはその少なくとも１
５、多くの場合その２０〜５０ヌクレオチドセグメント
とハイブリダイズするエクステンダープローブ、ポリデ
オキシヌクレオチドの製造が十分可能な程度まで知られ
ている。標的ポリヌクレオチド配列は、２個の連続しな
い、非相補性のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有
し、その一方（Ｓ１）はエクステンダープローホ、ポリ
デオキシヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能な
上述の部分であり、Ｓ２はＳ１の５′である。標的ポリ
ヌクレオチド配列は通常、約１０〜５，０００またはそ
れ以上のヌクレオチド、好ましくは２０〜１，０００ヌ
クレオチドを含有する。２個の連続しない、非相補性の
ヌクレオチド配列、Ｓ１およびＳ２は、好ましくはそれ
ぞれ１０〜１００ヌクレオチドを含有し、少なくとも１
０塩基、好ましくは少なくとも１００、通常は２００〜
５，０００塩基またはそれ以上離れている。標的ポリヌ
クレオチド配列は多くの場合、ポリヌクレオチド被検物
質の部分である。標的ポリヌクレオチド配列は一般には
大分子の分画であるか、また、実質的に全分子であって
もよい。標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの
最小数はサンプル中における標的ポリヌクレオチド配列
の存在がサンプル中におけるポリヌクレオチド被検物質
の存在の特異的インディケーターになることが確信でき
るように選択される。大ざっぱには、配列の長さは通常
約１．６ｌｏｇＬヌクレオチド以上であり、この場合、
Ｌはサンプルの生物学的起源のゲノムにおける塩基対の
数である。標的配列中のヌクレオチドの最大数は通常、
ポリヌクレオチド被検物質の長さ、ならびに剪断力また
は単離時の他の処理および検定用サンプルの調製に必要
な操作によるその切断されやすさによって支配される。
【００３０】一本鎖ポリデオキシヌクレオチド−本発明
の結果として形成されるデオキシヌクレオチドの配列。
通常、互いに連続しない、相補性の少なくとも２個のセ
グメントまたは側部配列からなる。それは、それらの相
補性配列に結合した場合、レセプターたとえばレプレッ
サー、制限酵素等の特異的結合部位である１個もしくは
２個以上の配列を含有していてもよい。第一および第二
のセグメントまたは側部配列は、それぞれ一本鎖ポリヌ
クレオチド中の３′末端および５′末端にあり、それぞ
れ少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５デオキシ
ヌクレオチドおよび／またはその誘導体からなる。
の結果として形成されるデオキシヌクレオチドの配列。
通常、互いに連続しない、相補性の少なくとも２個のセ
グメントまたは側部配列からなる。それは、それらの相
補性配列に結合した場合、レセプターたとえばレプレッ
サー、制限酵素等の特異的結合部位である１個もしくは
２個以上の配列を含有していてもよい。第一および第二
のセグメントまたは側部配列は、それぞれ一本鎖ポリヌ
クレオチド中の３′末端および５′末端にあり、それぞ
れ少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５デオキシ
ヌクレオチドおよび／またはその誘導体からなる。
【００３１】一本鎖ポリデオキシヌクレオチドは通常、
３０〜５０，０００デオキシヌクレオチド、好ましくは
１００〜２，０００デオキシヌクレオチド、さらに好ま
しくは５００〜１０，０００デオキシヌクレオチドを含
有する。一本鎖ポリデオキシヌクレオチドが相補性鎖と
ハイブリダイズすると、多くの場合、逆行のリピートを
形成する。
３０〜５０，０００デオキシヌクレオチド、好ましくは
１００〜２，０００デオキシヌクレオチド、さらに好ま
しくは５００〜１０，０００デオキシヌクレオチドを含
有する。一本鎖ポリデオキシヌクレオチドが相補性鎖と
ハイブリダイズすると、多くの場合、逆行のリピートを
形成する。
【００３２】ポリデオキシヌクレオチドプライマー−通
常は合成デオキシヌクレオチドであり、一本鎖で、ポリ
ヌクレオチド配列の配列Ｓ２と相補性のヌクレオチド配
列とハイブリダイゼーション可能な配列を３′末端に含
有し、エクステンダープローブの第二のヌクレオチド配
列と少なくとも９０％、好ましくは１００％同じ塩基配
列を有するポリデオキシヌクレオチド。したがって、一
本鎖ポリデオキシヌクレオチドの第二のセグメントまた
は側部配列と相補性のヌクレオチド配列ともハイブリダ
イズできる。ポリデオキシヌクレオチドプライマーのハ
イブリダイゼーション可能な配列におけるデオキシヌク
レオチドの数は、ポリデオキシヌクレオチドプライマー
のハイブリダイゼーションに使用される緊縮条件が過剰
のランダムな非特異的ハイブリダイゼーションを防止す
るものでなければならない。通常、ポリデオキシヌクレ
オチドプライマー中のデオキシヌクレオチドの数は、標
的ヌクレオチド配列のＳ２配列と少なくとも同じ、すな
わち、少なくとも１０デオキシヌクレオチド、好ましく
は少なくとも１５デオキシヌクレオチド、一般的には約
１０〜２００、好ましくは２０〜５０デオキシヌクレオ
チドである。
常は合成デオキシヌクレオチドであり、一本鎖で、ポリ
ヌクレオチド配列の配列Ｓ２と相補性のヌクレオチド配
列とハイブリダイゼーション可能な配列を３′末端に含
有し、エクステンダープローブの第二のヌクレオチド配
列と少なくとも９０％、好ましくは１００％同じ塩基配
列を有するポリデオキシヌクレオチド。したがって、一
本鎖ポリデオキシヌクレオチドの第二のセグメントまた
は側部配列と相補性のヌクレオチド配列ともハイブリダ
イズできる。ポリデオキシヌクレオチドプライマーのハ
イブリダイゼーション可能な配列におけるデオキシヌク
レオチドの数は、ポリデオキシヌクレオチドプライマー
のハイブリダイゼーションに使用される緊縮条件が過剰
のランダムな非特異的ハイブリダイゼーションを防止す
るものでなければならない。通常、ポリデオキシヌクレ
オチドプライマー中のデオキシヌクレオチドの数は、標
的ヌクレオチド配列のＳ２配列と少なくとも同じ、すな
わち、少なくとも１０デオキシヌクレオチド、好ましく
は少なくとも１５デオキシヌクレオチド、一般的には約
１０〜２００、好ましくは２０〜５０デオキシヌクレオ
チドである。
【００３３】特異的結合対のメンバー（ｓｂｐメンバ
ー）一他方の分子と特異的に結合し、したがってその特
定の空間的および極性的構成に相補性と定義される領域
を表面上または空洞内に有する２種の異なる分子の一
方。特異的結合対のメンバーはリカンドおよびレセプタ
ー（アンチリガンド）とも呼ばれる。これらのメンバー
は免疫学的対たとえば抗原−抗体でもよく、またオペレ
ーター−レプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、
ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、
核酸二重鎖、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、
ＤＮＡ−ＲＮＡ等であってもよい。
ー）一他方の分子と特異的に結合し、したがってその特
定の空間的および極性的構成に相補性と定義される領域
を表面上または空洞内に有する２種の異なる分子の一
方。特異的結合対のメンバーはリカンドおよびレセプタ
ー（アンチリガンド）とも呼ばれる。これらのメンバー
は免疫学的対たとえば抗原−抗体でもよく、またオペレ
ーター−レプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、
ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、
核酸二重鎖、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、
ＤＮＡ−ＲＮＡ等であってもよい。
【００３４】リガンド−それに対するレセプターが天然
に存在するか、または調製できる化合物。
に存在するか、または調製できる化合物。
【００３５】レセプター（アンチリガンド）−分子の特
定の空間的および極性的機構、たとえばエピトープまた
は決定部位を認識できる化合物または組成物。レセプタ
ーの例には、天然のレセプター、たとえばサイロキシン
結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レ
クチン、核酸、レプレッサー、防御酵素、プロテイン
Ａ、補体成分Ｃｌｑ、ＤＮＡ結合蛋白質またはリガン等
が包含される。
定の空間的および極性的機構、たとえばエピトープまた
は決定部位を認識できる化合物または組成物。レセプタ
ーの例には、天然のレセプター、たとえばサイロキシン
結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レ
クチン、核酸、レプレッサー、防御酵素、プロテイン
Ａ、補体成分Ｃｌｑ、ＤＮＡ結合蛋白質またはリガン等
が包含される。
【００３６】小有機分子−分子量１５００未満、好まし
くは１００〜１０００、さらに好ましくは３００〜６０
０の化合物、たとえばビオチン、フルオロレセイン、ロ
ーダミンおよび他の染料、テトラサイクリンおよび他の
蛋白質結合分子、ならびにハプテン等である。小有機分
子は、核酸配列が標識または支持体へ付着する手段を提
供する。
くは１００〜１０００、さらに好ましくは３００〜６０
０の化合物、たとえばビオチン、フルオロレセイン、ロ
ーダミンおよび他の染料、テトラサイクリンおよび他の
蛋白質結合分子、ならびにハプテン等である。小有機分
子は、核酸配列が標識または支持体へ付着する手段を提
供する。
【００３７】支持体または表面−多孔性または非多孔性
の水不溶性材料。支持体は親水性でも、また親水性にす
ることができるものでもよく、無機粉末たとえばシリ
カ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ；天然重合材
料、とくにセルロース性材料およびセルロースから誘導
される材料、たとえば濾紙、クロマトグラフィー用濾紙
等のような紙を含む繊維；合成または改良天然重合材
料、たとえばニトロセルロース、セルロースアセテー
ト、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デ
キストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポ
リスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレ
フタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）等；それ
ら単独でもまた他の材料と接合させて使用してもよく；
バイオガラスとして入手できるガラス、セラミックス、
金属等が包含される。天然または合成の集合体、たとえ
ばリポゾーム、リン脂質小胞、および細胞も使用でき
る。
の水不溶性材料。支持体は親水性でも、また親水性にす
ることができるものでもよく、無機粉末たとえばシリ
カ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ；天然重合材
料、とくにセルロース性材料およびセルロースから誘導
される材料、たとえば濾紙、クロマトグラフィー用濾紙
等のような紙を含む繊維；合成または改良天然重合材
料、たとえばニトロセルロース、セルロースアセテー
ト、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デ
キストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポ
リスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレ
フタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）等；それ
ら単独でもまた他の材料と接合させて使用してもよく；
バイオガラスとして入手できるガラス、セラミックス、
金属等が包含される。天然または合成の集合体、たとえ
ばリポゾーム、リン脂質小胞、および細胞も使用でき
る。
【００３８】ｓｂｐメンバーの支持体または表面への結
合は、一般に文献にみられる、よく知られた技術で達成
できる〔たとえば、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚ
ｙｍｅｓ”，Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓ
ｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７８）およ
びＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。表面は、任
意の形状、たとえばストリップ、ロッド、ビーズを含め
た粒子等とすることができる。
合は、一般に文献にみられる、よく知られた技術で達成
できる〔たとえば、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚ
ｙｍｅｓ”，Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓ
ｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７８）およ
びＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。表面は、任
意の形状、たとえばストリップ、ロッド、ビーズを含め
た粒子等とすることができる。
【００３９】表面は通常、多官能性であるかもしくは多
官能性化することが可能であるか、または特異的もしく
は非特異的共有結合もしくは非共有結合による相互作用
で、オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーを結合で
きる。広範囲の官能基が利用可能であり、また導入でき
る。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、
シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基
等が包含される。広範囲の化合物を粒子に連結させる方
法はよく知られていて、文献に詳細に例示されている
〔たとえば、Ｃａｕｔｒｅｃａｓａｓ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９（１９７０）参照〕。オリ
ゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーへの連結基の長さ
は、連結させる化合物の性質、配列のハイブリダイゼー
ションに対する連結させる化合物と粒子の間の距離の影
響等に応じて、広範囲に変動させることができる。オリ
ゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーは、実質的に、粒
子の外表面に結合される。
官能性化することが可能であるか、または特異的もしく
は非特異的共有結合もしくは非共有結合による相互作用
で、オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーを結合で
きる。広範囲の官能基が利用可能であり、また導入でき
る。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、
シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基
等が包含される。広範囲の化合物を粒子に連結させる方
法はよく知られていて、文献に詳細に例示されている
〔たとえば、Ｃａｕｔｒｅｃａｓａｓ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９（１９７０）参照〕。オリ
ゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーへの連結基の長さ
は、連結させる化合物の性質、配列のハイブリダイゼー
ションに対する連結させる化合物と粒子の間の距離の影
響等に応じて、広範囲に変動させることができる。オリ
ゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーは、実質的に、粒
子の外表面に結合される。
【００４０】表面として用いられる粒子は、それ自体
を、または蛍光性化合物もしくは蛍光体を慣用法で粒子
に結合させることによって、蛍光性とすることができ
る。蛍光体は通常、粒子中に溶解させるか、あるいは粒
子に共有結合もしくは非共有結合的に結合させ、多くの
場合、粒子全体に実質的に均一に結合させる。フルオレ
セイン標識化ラテックス粒子は米国特許第３，８５３，
９８７号に教示されている。
を、または蛍光性化合物もしくは蛍光体を慣用法で粒子
に結合させることによって、蛍光性とすることができ
る。蛍光体は通常、粒子中に溶解させるか、あるいは粒
子に共有結合もしくは非共有結合的に結合させ、多くの
場合、粒子全体に実質的に均一に結合させる。フルオレ
セイン標識化ラテックス粒子は米国特許第３，８５３，
９８７号に教示されている。
【００４１】標識またはレポーター基もしくはレポータ
ー分子−シグナル生成系のメンバー。通常、標識または
レポーター基もしくは分子はプローブまたはポリデオキ
シヌクレオチドプライマーに接合するかまたは結合し
て、直接検出できるか、または特異的な反応を介して検
出可能なシグナルを産生することができる。標識には、
増幅もしくはリゲーションに際して鋳型を提供するかま
たはレプレッサー蛋白質に対するようなリガンドとして
働くことができるポリヌクレオチドプライマーまたは特
異的ポリヌクレオチド配列が包含される。好ましくは、
ポリデオキシヌクレオチドプライマーは、標識を有する
か、または標識をもつことが可能である。標識は同位元
素でも非同位元素でもよく、通常は非同位元素であり、
触媒たとえば酵素、触媒をコードするポリヌクレオチ
ド、プロモーター、染料、蛍光性分子、化学発光体、補
酵素、酵素基質、放射性基、小有機分子、増幅可能なポ
リヌクレオチド配列、ラテックスまたは炭素粒子のよう
な粒子、金属ゾル、クリスタリット、リポゾーム、細胞
等であってよく、さらに染料、触媒または他の検出可能
な基等で標識されていても、またされていなくてもよ
い。標識はシグナル生成系のメンバーであり、単独でま
たは他のシグナル生成系のメンバーとともに、検出可能
なシグナルを発生させることができる。標識は直接ヌク
レオチド配列に結合させることもできるし、またそれ
に、ヌクレオチド配列に結合するｓｂｐメンバーと相補
性のｓｂｐメンバーに結合させることによって結合でき
る。
ー分子−シグナル生成系のメンバー。通常、標識または
レポーター基もしくは分子はプローブまたはポリデオキ
シヌクレオチドプライマーに接合するかまたは結合し
て、直接検出できるか、または特異的な反応を介して検
出可能なシグナルを産生することができる。標識には、
増幅もしくはリゲーションに際して鋳型を提供するかま
たはレプレッサー蛋白質に対するようなリガンドとして
働くことができるポリヌクレオチドプライマーまたは特
異的ポリヌクレオチド配列が包含される。好ましくは、
ポリデオキシヌクレオチドプライマーは、標識を有する
か、または標識をもつことが可能である。標識は同位元
素でも非同位元素でもよく、通常は非同位元素であり、
触媒たとえば酵素、触媒をコードするポリヌクレオチ
ド、プロモーター、染料、蛍光性分子、化学発光体、補
酵素、酵素基質、放射性基、小有機分子、増幅可能なポ
リヌクレオチド配列、ラテックスまたは炭素粒子のよう
な粒子、金属ゾル、クリスタリット、リポゾーム、細胞
等であってよく、さらに染料、触媒または他の検出可能
な基等で標識されていても、またされていなくてもよ
い。標識はシグナル生成系のメンバーであり、単独でま
たは他のシグナル生成系のメンバーとともに、検出可能
なシグナルを発生させることができる。標識は直接ヌク
レオチド配列に結合させることもできるし、またそれ
に、ヌクレオチド配列に結合するｓｂｐメンバーと相補
性のｓｂｐメンバーに結合させることによって結合でき
る。
【００４２】シグナル生成系−シグナル生成系は１種ま
たは２種以上の構成要素を有し、その構成要素の少なく
ともひとつは標識またはレポーター基である。シグナル
生成系は、サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列また
はポリヌクレオチド被検物質の存在または量に関連する
シグナルを発生する。シグナル生成系は、測定可能なシ
グナルの生成に必要なすべての試薬を包含する。標識が
ヌクレオチド配列に接合していない場合は、標識は通
常、ヌクレオチド配列に結合しているかまたはその部分
であるｓｂｐメンバーに相補性のｓｂｐメンバーに結合
している。シグナル生成系の他の構成要素にはデベロッ
パー溶液が包含されてもよく、これには、基質、エンハ
ンサー、アクティベーター、化学発光性化合物、補因
子、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、シグ
ナル発生物質の結合に必要な特異的結合物質等が包含さ
れる。シグナル生成系の他の構成要素は、補酵素、酵素
生成物と反応する物質、他の酵素および触媒等であって
もよい。シグナル生成系は、外部手段によって、電磁放
射線を用い、望ましくは肉眼検査によって検出可能なシ
グナルを供給する。
たは２種以上の構成要素を有し、その構成要素の少なく
ともひとつは標識またはレポーター基である。シグナル
生成系は、サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列また
はポリヌクレオチド被検物質の存在または量に関連する
シグナルを発生する。シグナル生成系は、測定可能なシ
グナルの生成に必要なすべての試薬を包含する。標識が
ヌクレオチド配列に接合していない場合は、標識は通
常、ヌクレオチド配列に結合しているかまたはその部分
であるｓｂｐメンバーに相補性のｓｂｐメンバーに結合
している。シグナル生成系の他の構成要素にはデベロッ
パー溶液が包含されてもよく、これには、基質、エンハ
ンサー、アクティベーター、化学発光性化合物、補因
子、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、シグ
ナル発生物質の結合に必要な特異的結合物質等が包含さ
れる。シグナル生成系の他の構成要素は、補酵素、酵素
生成物と反応する物質、他の酵素および触媒等であって
もよい。シグナル生成系は、外部手段によって、電磁放
射線を用い、望ましくは肉眼検査によって検出可能なシ
グナルを供給する。
【００４３】シグナル生成系には少なくとも１種の触
媒、通常は酵素と、少なくとも１種の基質を包含するこ
とができ、２種以上の触媒と複数個の基質を含んでいて
もよく、また、１つの酵素の基質が他の酵素の生成物で
ある酵素の組合せを包含していてもよい。シグナル生成
系の機能は、サンプル中のポリヌクレオチド被検物質の
量に関連する検出可能なシグナルを供給する生成物を生
成することである。
媒、通常は酵素と、少なくとも１種の基質を包含するこ
とができ、２種以上の触媒と複数個の基質を含んでいて
もよく、また、１つの酵素の基質が他の酵素の生成物で
ある酵素の組合せを包含していてもよい。シグナル生成
系の機能は、サンプル中のポリヌクレオチド被検物質の
量に関連する検出可能なシグナルを供給する生成物を生
成することである。
【００４４】シグナル生成系に有用な多数の酵素および
補酵素が、米国特許第４，２７５，１４９号１９〜２３
欄および米国特許第４，３１８，９８０号１０〜１４欄
に示されている。これらの開示は参考として本明細書に
導入する。多数の酵素の組み合わせが米国特許第４，２
７５，１４９号２３〜２８欄に記載されている。これら
の組み合わせは本発明に利用できる。この開示は参考と
して本明細書に導入する。
補酵素が、米国特許第４，２７５，１４９号１９〜２３
欄および米国特許第４，３１８，９８０号１０〜１４欄
に示されている。これらの開示は参考として本明細書に
導入する。多数の酵素の組み合わせが米国特許第４，２
７５，１４９号２３〜２８欄に記載されている。これら
の組み合わせは本発明に利用できる。この開示は参考と
して本明細書に導入する。
【００４５】とくに興味がある酵素は、過酸化水素を産
生する酵素で、過酸化水素は染料前駆体の染料への酸化
に使用される。特定の組み合わせとしては、糖オキシダ
ーゼたとえばグルコースおよびガラクトースオキシダー
ゼまたは異項環オキシダーゼたとえばウリカーゼおよび
キサンチンオキシダーゼを、染料前駆体の酸化に過酸化
水素を使用する酵素、すなわちペルオキシダーゼたとえ
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダー
ゼまたはミクロペルオキシダーゼとの組み合わせを挙げ
ることができる。その他の酵素の組み合わせは、参考と
して導入した文献中に見出すことができる。単一の酵素
を標識として使用する場合には、他の酵素たとえばヒド
ロラーゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクタ
ーゼ、好ましくはヒドロラーゼたとえばアルカリホスフ
ァターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが使用できる。ま
た、ルシフェラーゼ、たとえばホタルルシフェラーゼお
よび細菌ルシフェラーゼも使用できる。
生する酵素で、過酸化水素は染料前駆体の染料への酸化
に使用される。特定の組み合わせとしては、糖オキシダ
ーゼたとえばグルコースおよびガラクトースオキシダー
ゼまたは異項環オキシダーゼたとえばウリカーゼおよび
キサンチンオキシダーゼを、染料前駆体の酸化に過酸化
水素を使用する酵素、すなわちペルオキシダーゼたとえ
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダー
ゼまたはミクロペルオキシダーゼとの組み合わせを挙げ
ることができる。その他の酵素の組み合わせは、参考と
して導入した文献中に見出すことができる。単一の酵素
を標識として使用する場合には、他の酵素たとえばヒド
ロラーゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクタ
ーゼ、好ましくはヒドロラーゼたとえばアルカリホスフ
ァターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが使用できる。ま
た、ルシフェラーゼ、たとえばホタルルシフェラーゼお
よび細菌ルシフェラーゼも使用できる。
【００４６】使用できる補酵素の例としてはＮＡＤ
〔Ｈ〕；ＮＡＤＰ〔Ｈ〕、ピリドキサールホスフェー
ト；ＦＡＤ〔Ｈ〕；ＦＭＮ〔Ｈ〕等、通常、循環反応に
関与する補酵素を挙げることができる（とくに米国特許
第４，３１８，９８０号参照）。
〔Ｈ〕；ＮＡＤＰ〔Ｈ〕、ピリドキサールホスフェー
ト；ＦＡＤ〔Ｈ〕；ＦＭＮ〔Ｈ〕等、通常、循環反応に
関与する補酵素を挙げることができる（とくに米国特許
第４，３１８，９８０号参照）。
【００４７】酵素反応の生成物は通常、染料または蛍光
体である。多数の蛍光体の例が米国特許第４，２７５，
１４９号３０および３１欄に例示されている。この開示
を参考として本明細書に導入する。
体である。多数の蛍光体の例が米国特許第４，２７５，
１４９号３０および３１欄に例示されている。この開示
を参考として本明細書に導入する。
【００４８】シグナル生成系には、直径が少なくとも約
５０ｎｍで約５０ミクロン以上ではない、通常は少なく
とも約１００ｎｍで約２５ミクロン以上ではない、好ま
しくは約０．２〜５ミクロンの不溶性粒子である１種ま
たは２種以上の粒子を包含させることができる。粒子
は、有機または無機の、多孔性または非多孔性の、好ま
しくは水とほぼ等しい密度、一般的には約０．７〜約
１．５ｇ／ｍｌであり、透明、半透明または不透明の材
料から構成される。
５０ｎｍで約５０ミクロン以上ではない、通常は少なく
とも約１００ｎｍで約２５ミクロン以上ではない、好ま
しくは約０．２〜５ミクロンの不溶性粒子である１種ま
たは２種以上の粒子を包含させることができる。粒子
は、有機または無機の、多孔性または非多孔性の、好ま
しくは水とほぼ等しい密度、一般的には約０．７〜約
１．５ｇ／ｍｌであり、透明、半透明または不透明の材
料から構成される。
【００４９】有機粒子は通常、付加または縮合ポリマー
で、検定メジウム中に容易に分散可能なポリマーからな
る。粒子の表面は、吸着性であるか、または直接もしく
は間接にオリゴヌクレオチドもしくはｓｂｐメンバーを
結合できるように官能化できる。粒子の性質は上述の通
りである。
で、検定メジウム中に容易に分散可能なポリマーからな
る。粒子の表面は、吸着性であるか、または直接もしく
は間接にオリゴヌクレオチドもしくはｓｂｐメンバーを
結合できるように官能化できる。粒子の性質は上述の通
りである。
【００５０】興味ある蛍光体は一般に３５０ｎｍ以上、
通常は４００ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上の波
長で光を放射する。望ましくは、蛍光体は高い量子効
率、大きなストークスシフトを有し、それらの接合およ
び使用条件下に化学的に安定である。蛍光体の語は、電
磁放射線による活性化または化学的活性化によって光を
放射する物質を包含し、蛍光および燐光物質、シンチレ
ーター、および化学発光物質を含む。
通常は４００ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上の波
長で光を放射する。望ましくは、蛍光体は高い量子効
率、大きなストークスシフトを有し、それらの接合およ
び使用条件下に化学的に安定である。蛍光体の語は、電
磁放射線による活性化または化学的活性化によって光を
放射する物質を包含し、蛍光および燐光物質、シンチレ
ーター、および化学発光物質を含む。
【００５１】興味ある蛍光体はそれが有する主要官能性
によって様々の分類に属する。これらの主要官能性に
は、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ−ジアミ
ノスチルベン、ピレン、四級フェナンスリジン塩、９−
アミノアクリジン、ｐ，ｐ′−ジアミノスチルベンイミ
ン、アントラセン、オキサカルボキシアニン、メロシア
ニン、３−アミノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベン
ゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，
２−ベンゾフェナジン、レチナール、ビス−３−アミノ
ピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、
ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミ
ン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテ
ン、７−ヒドロキシクマリン、４，５−ベンズイミダゾ
ール、フェノキサジン、サリチレート、ストロファンチ
ジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラビンな
らびに希土類キレート酸化物および塩が包含される。蛍
光体の例は米国特許第４，３１８，７０７号７および８
欄に列挙されている。この開示は参考として本明細書に
導入する。
によって様々の分類に属する。これらの主要官能性に
は、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ−ジアミ
ノスチルベン、ピレン、四級フェナンスリジン塩、９−
アミノアクリジン、ｐ，ｐ′−ジアミノスチルベンイミ
ン、アントラセン、オキサカルボキシアニン、メロシア
ニン、３−アミノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベン
ゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，
２−ベンゾフェナジン、レチナール、ビス−３−アミノ
ピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、
ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミ
ン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテ
ン、７−ヒドロキシクマリン、４，５−ベンズイミダゾ
ール、フェノキサジン、サリチレート、ストロファンチ
ジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラビンな
らびに希土類キレート酸化物および塩が包含される。蛍
光体の例は米国特許第４，３１８，７０７号７および８
欄に列挙されている。この開示は参考として本明細書に
導入する。
【００５２】さらに、エネルギー吸収または消光粒子を
使用することもできる。これは直径が少なくとも約５０
ｎｍの固体、不溶性粒子で、プローブのポリヌクレオチ
ド被検物質とのハイブリダイゼーションまたは特異的結
合対のメンバー間の特異的結合によって生じる距離内で
は、蛍光粒子の蛍光を消光できる。消光粒子は蛍光粒子
と同種でも異種でもよいが、通常は異種である。通常、
消光粒子は、粒子の表面から距離を測定して、約５０Å
以上、好ましくは約５００Å以上、さらに好ましくは約
２０００Å以上の距離で実質的な消光を与える。
使用することもできる。これは直径が少なくとも約５０
ｎｍの固体、不溶性粒子で、プローブのポリヌクレオチ
ド被検物質とのハイブリダイゼーションまたは特異的結
合対のメンバー間の特異的結合によって生じる距離内で
は、蛍光粒子の蛍光を消光できる。消光粒子は蛍光粒子
と同種でも異種でもよいが、通常は異種である。通常、
消光粒子は、粒子の表面から距離を測定して、約５０Å
以上、好ましくは約５００Å以上、さらに好ましくは約
２０００Å以上の距離で実質的な消光を与える。
【００５３】光の放射を調節するためには、多くの異な
る型の粒子を使用できる。とくに興味ある粒子は、炭素
粒子たとえば木炭、油煙、グラファイト、コロイド状炭
素等である。炭素粒子のほかに、金属ゾル、とくに貴金
属、金、銀および白金も使用できる。他の金属誘導粒子
には金属硫化物たとえば鉛、銀もしくは銅の硫化物、ま
たは金属酸化物たとえば鉄もしくは銅の酸化物が包含さ
れる。
る型の粒子を使用できる。とくに興味ある粒子は、炭素
粒子たとえば木炭、油煙、グラファイト、コロイド状炭
素等である。炭素粒子のほかに、金属ゾル、とくに貴金
属、金、銀および白金も使用できる。他の金属誘導粒子
には金属硫化物たとえば鉛、銀もしくは銅の硫化物、ま
たは金属酸化物たとえば鉄もしくは銅の酸化物が包含さ
れる。
【００５４】検出可能なシグナルとしての他の光源には
化学発光源がある。化学発光源には、化学反応によって
電子的に励起され、ついで検出可能なシグナルとして働
くかまたは蛍光アクセプターにエネルギーを与える光を
放射する化合物が包含される。
化学発光源がある。化学発光源には、化学反応によって
電子的に励起され、ついで検出可能なシグナルとして働
くかまたは蛍光アクセプターにエネルギーを与える光を
放射する化合物が包含される。
【００５５】多様なファミリーの化合物が、様々な条件
下に化学発光を発することが見出されてきた。これらの
化合物の一群として、２，３−ジヒドロ−１，４−フタ
ラジンジオンがある。最もよく知られた化合物はルミノ
ールで、これは上記化合物の５−アミノ類縁体である。
この群の他の化合物には、５−アミノ−６，７，８−ト
リメトキシ−およびジメチルアミノ−〔ｃａ〕ベンズ類
縁体である。これらの化合物はアルカリ性過酸化水素ま
たは次亜鉛素酸カルシウムおよび塩基で発光させること
ができる。他の群の化合物には２，４，５−トリフェニ
ルイミダゾールがあり、母体生成物に対する共通の名称
でロフィンとして知られている。化学発光類縁体にはｐ
−ジメチルアミノおよびｐ−メトキシ置換体が包含され
る。化学発光はまた、オキシレート、通常はシュウ酸の
活性化エステルたとえばｐ−ニトロフェニルエステルと
ペルオキシダーゼたとえば過酸化水素と、塩基性条件下
でも得られる。また、ルシフェリンがルシフェラーゼま
たはルシゲニンと組合せて使用される。
下に化学発光を発することが見出されてきた。これらの
化合物の一群として、２，３−ジヒドロ−１，４−フタ
ラジンジオンがある。最もよく知られた化合物はルミノ
ールで、これは上記化合物の５−アミノ類縁体である。
この群の他の化合物には、５−アミノ−６，７，８−ト
リメトキシ−およびジメチルアミノ−〔ｃａ〕ベンズ類
縁体である。これらの化合物はアルカリ性過酸化水素ま
たは次亜鉛素酸カルシウムおよび塩基で発光させること
ができる。他の群の化合物には２，４，５−トリフェニ
ルイミダゾールがあり、母体生成物に対する共通の名称
でロフィンとして知られている。化学発光類縁体にはｐ
−ジメチルアミノおよびｐ−メトキシ置換体が包含され
る。化学発光はまた、オキシレート、通常はシュウ酸の
活性化エステルたとえばｐ−ニトロフェニルエステルと
ペルオキシダーゼたとえば過酸化水素と、塩基性条件下
でも得られる。また、ルシフェリンがルシフェラーゼま
たはルシゲニンと組合せて使用される。
【００５６】補助材料−本発明による検定にはしばしば
様々な補助材料が使用される。たとえば、検定メジウム
中には通常、緩衝剤が加えられ、また検定メジウムおよ
び検定成分に対する安定化剤が用いられる。これらの添
加物に加えて、多くの場合、蛋白質たとえばアルブミ
ン、有機溶媒たとえばホルムアミド、四級アンモニウム
塩、ポリカチオンたとえばデキストラン硫酸、界面活性
剤とくに非イオン界面活性剤、結合エンハンサーたとえ
ばポリアルキレングリコール等が包含される。
様々な補助材料が使用される。たとえば、検定メジウム
中には通常、緩衝剤が加えられ、また検定メジウムおよ
び検定成分に対する安定化剤が用いられる。これらの添
加物に加えて、多くの場合、蛋白質たとえばアルブミ
ン、有機溶媒たとえばホルムアミド、四級アンモニウム
塩、ポリカチオンたとえばデキストラン硫酸、界面活性
剤とくに非イオン界面活性剤、結合エンハンサーたとえ
ばポリアルキレングリコール等が包含される。
【００５７】三リン酸デオキシヌクレオシド−５′−三
リン酸置換基を有するデオキシヌクレオシド。デオキシ
ヌクレオシドは、プリンまたはピリミジン誘導体の窒素
塩基がペントース糖の１′−炭素に共有結合したペント
ース糖誘導体である。プリン塩基には、アデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、イノシンならびにそれらの誘
導体および類縁体が包含される。ピリミジン塩基には、
シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）ならび
にそれらの誘導体および類縁体が包含される。
リン酸置換基を有するデオキシヌクレオシド。デオキシ
ヌクレオシドは、プリンまたはピリミジン誘導体の窒素
塩基がペントース糖の１′−炭素に共有結合したペント
ース糖誘導体である。プリン塩基には、アデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、イノシンならびにそれらの誘
導体および類縁体が包含される。ピリミジン塩基には、
シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）ならび
にそれらの誘導体および類縁体が包含される。
【００５８】誘導体および類縁体は、非誘導化三リン酸
ヌクレオシドと同じ様式で認識され、重合される誘導体
および類縁体が実例として挙げられる。このような誘導
体および類縁体の例には、レポーター基で修飾されたも
の、ビオチン化、アミノ修飾、放射標識、アルキ化等が
行われたもの、またチオホスフェート、ホスファイト、
環原子改変誘導体があるが、これらは単に例示であっ
て、これらに限定されるものではない。レポーター基
は、蛍光性基たとえばフルオロセイン、化学発光基たと
えばルミノール、遅延蛍光によって検出できるテルビウ
ムキレーターたとえばＮ−（ヒドロキシエチル）エチレ
ンジアミン三酢酸等とすることができる。
ヌクレオシドと同じ様式で認識され、重合される誘導体
および類縁体が実例として挙げられる。このような誘導
体および類縁体の例には、レポーター基で修飾されたも
の、ビオチン化、アミノ修飾、放射標識、アルキ化等が
行われたもの、またチオホスフェート、ホスファイト、
環原子改変誘導体があるが、これらは単に例示であっ
て、これらに限定されるものではない。レポーター基
は、蛍光性基たとえばフルオロセイン、化学発光基たと
えばルミノール、遅延蛍光によって検出できるテルビウ
ムキレーターたとえばＮ−（ヒドロキシエチル）エチレ
ンジアミン三酢酸等とすることができる。
【００５９】ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼ−
一本鎖ポリデオキシヌクレオチドを包含するＤＮＡ鋳型
沿って、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの延長を
形成する触媒、通常は酵素で、この場合、延長はＤＮＡ
鋳型に相補性である。ポリデオキシヌクレオチドポリメ
ラーゼは鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチドポリメラ
ーゼであり、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの
３′末端を延長する一本鎖ポリデオキシヌクレオチドと
相補性の配列を供給するために、三リン酸デオキシヌク
レオシドを構築用ブロックとして利用する。通常、触媒
はＤＮＡポリメラーゼのような酵素であり、たとえば原
核ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩ）、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、クレノ
ウフラグメント等で、任意の起源たとえば細胞、細菌た
とえば大腸菌、植物、動物、ウイルス、好熱性細菌等か
ら誘導される。ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレ
オチド配列がＲＮＡである場合には、エクステンダープ
ローブがポリヌクレオチドまたは標的ヌクレオチド配列
に沿って延長するのを容易にするため、逆転写酵素を包
含させてもよい。
一本鎖ポリデオキシヌクレオチドを包含するＤＮＡ鋳型
沿って、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの延長を
形成する触媒、通常は酵素で、この場合、延長はＤＮＡ
鋳型に相補性である。ポリデオキシヌクレオチドポリメ
ラーゼは鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチドポリメラ
ーゼであり、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの
３′末端を延長する一本鎖ポリデオキシヌクレオチドと
相補性の配列を供給するために、三リン酸デオキシヌク
レオシドを構築用ブロックとして利用する。通常、触媒
はＤＮＡポリメラーゼのような酵素であり、たとえば原
核ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩ）、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、クレノ
ウフラグメント等で、任意の起源たとえば細胞、細菌た
とえば大腸菌、植物、動物、ウイルス、好熱性細菌等か
ら誘導される。ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレ
オチド配列がＲＮＡである場合には、エクステンダープ
ローブがポリヌクレオチドまたは標的ヌクレオチド配列
に沿って延長するのを容易にするため、逆転写酵素を包
含させてもよい。
【００６０】全部もしくは一部を継続的に−本発明に用
いられるサンプルおよび各種試剤を一緒に（同時に）混
合する以外の場合、１種または２種以上の試剤を残りの
試剤の１種または２種以上と混合して部分混合物を形成
させてもよい。ついで各部分混合物を本法の１または２
以上の工程に付すことができる。すなわち、部分混合物
はそれぞれ、１または２以上の所望の結果を達成するた
めの条件下にインキュベートすることができる。
いられるサンプルおよび各種試剤を一緒に（同時に）混
合する以外の場合、１種または２種以上の試剤を残りの
試剤の１種または２種以上と混合して部分混合物を形成
させてもよい。ついで各部分混合物を本法の１または２
以上の工程に付すことができる。すなわち、部分混合物
はそれぞれ、１または２以上の所望の結果を達成するた
めの条件下にインキュベートすることができる。
【００６１】ハイブリダイゼーションおよび結合−ヌク
レオチド配列の関係では、これらの語は本明細書におい
ては同義に使用される。２個のヌクレオチド配列が互い
にハイブリダイズする能力はこの２個のヌクレオチド配
列の相補性の程度に依存し、一方、その程度は合致した
相補性ヌクレオチド対の分画に基づくものである。与え
られた配列中に他の配列と相補性のヌクレオチドが多い
ほど、それが他とハイブリダイゼーションする程度は大
きくなる。ハイブリダイゼーションの程度はまた、粘度
条件または、温度、溶媒比、塩濃度等を包含する緊縮条
件に依存する。
レオチド配列の関係では、これらの語は本明細書におい
ては同義に使用される。２個のヌクレオチド配列が互い
にハイブリダイズする能力はこの２個のヌクレオチド配
列の相補性の程度に依存し、一方、その程度は合致した
相補性ヌクレオチド対の分画に基づくものである。与え
られた配列中に他の配列と相補性のヌクレオチドが多い
ほど、それが他とハイブリダイゼーションする程度は大
きくなる。ハイブリダイゼーションの程度はまた、粘度
条件または、温度、溶媒比、塩濃度等を包含する緊縮条
件に依存する。
【００６２】相同−２つの配列がそれぞれ、チミン
（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同一とみなして、少なくとも
９０％好ましくは１００％、同じまたは類縁の塩基配列
を有する場合、これらは相同である。すなわち、リボヌ
クレオチドＡ，Ｕ，ＣおよびＧはデオキシヌクレオチド
ｄＡ，ｄＵ，ｄＣおよびｄＧと類縁である。相同性の配
列は、両者がＤＮＡでも、一方がＤＮＡで他方がＲＮＡ
でもよい。
（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同一とみなして、少なくとも
９０％好ましくは１００％、同じまたは類縁の塩基配列
を有する場合、これらは相同である。すなわち、リボヌ
クレオチドＡ，Ｕ，ＣおよびＧはデオキシヌクレオチド
ｄＡ，ｄＵ，ｄＣおよびｄＧと類縁である。相同性の配
列は、両者がＤＮＡでも、一方がＤＮＡで他方がＲＮＡ
でもよい。
【００６３】エクステンダープローブ−これは、デオキ
シヌクレオチドの２個の配列の一本鎖からなり、その
３′末端に、その連続的デオキシヌクレオチドの好まし
くは少なくとも１０個からなる一方の配列（ＥＰ１）が
存在する。このＥＰ１は、２個の連続しない、非相補性
のヌクレオチド配列を有する標的配列を包含するポリヌ
クレオチドの第一のポリヌクレオチド（Ｓ１）で、第二
のポリヌクレオチド配列の３′である配列とハイブリダ
イゼーション可能である。ハイブリダイゼーションが可
能なことは、第一のポリヌクレオチド配列がＥＰ１に結
合するように、部分的にまたは完全に、通常は完全に第
一のポリヌクレオチド配列に相補性であることによって
起こる。通常、エクステンダープローブは合成オリゴヌ
クレオチドである。
シヌクレオチドの２個の配列の一本鎖からなり、その
３′末端に、その連続的デオキシヌクレオチドの好まし
くは少なくとも１０個からなる一方の配列（ＥＰ１）が
存在する。このＥＰ１は、２個の連続しない、非相補性
のヌクレオチド配列を有する標的配列を包含するポリヌ
クレオチドの第一のポリヌクレオチド（Ｓ１）で、第二
のポリヌクレオチド配列の３′である配列とハイブリダ
イゼーション可能である。ハイブリダイゼーションが可
能なことは、第一のポリヌクレオチド配列がＥＰ１に結
合するように、部分的にまたは完全に、通常は完全に第
一のポリヌクレオチド配列に相補性であることによって
起こる。通常、エクステンダープローブは合成オリゴヌ
クレオチドである。
【００６４】ＥＰ１の選択に際して主要な基準は、
（１）その配列は信頼できるものでなければならない。
すなわち、それは厳格または正確にＳ１と相補性で、安
定かつ特異的な結合を与えるのに十分な長さをもたなけ
ればならない。（２）３′末端は、遊離３′−ヒドロキ
シル基を形成するか、またはそれを形成できるものでな
ければならない。最小の結合配列は、少なくとも１０、
通常は少なくとも１５、好ましくは２０〜５０デオキシ
ヌクレオチド長である。一般的には、ＥＰ１は約１０〜
１００、たとえば３０〜１００デオキシヌクレオチドで
ある。エクステンダープローブの第一および第二のポリ
ヌクレオチド配列を合わせた長さは、少なくとも約２０
ヌクレオチド、好ましくは約４０〜２００ヌクレオチド
長である。
（１）その配列は信頼できるものでなければならない。
すなわち、それは厳格または正確にＳ１と相補性で、安
定かつ特異的な結合を与えるのに十分な長さをもたなけ
ればならない。（２）３′末端は、遊離３′−ヒドロキ
シル基を形成するか、またはそれを形成できるものでな
ければならない。最小の結合配列は、少なくとも１０、
通常は少なくとも１５、好ましくは２０〜５０デオキシ
ヌクレオチド長である。一般的には、ＥＰ１は約１０〜
１００、たとえば３０〜１００デオキシヌクレオチドで
ある。エクステンダープローブの第一および第二のポリ
ヌクレオチド配列を合わせた長さは、少なくとも約２０
ヌクレオチド、好ましくは約４０〜２００ヌクレオチド
長である。
【００６５】エクステンダープローブの第二のポリデオ
キシヌクレオチド配列（ＥＰ２）は、２個の連続しな
い、非相補性のヌクレオチド配列を有する標的ポリヌク
レオチドの第二のポリヌクレオチド配列（Ｓ２）で、Ｓ
１の５′である配列と相同のデオキシヌクレオチドの配
列である。ＥＰ２の長さは、少なくとも１０ヌクレオチ
ド、通常は少なくとも１５、好ましくは２０〜５０デオ
キシヌクレオチドである。一般的に、ＥＰ２は約１０〜
１００、たとえば３０〜１００デオキシヌクレオチドで
ある。
キシヌクレオチド配列（ＥＰ２）は、２個の連続しな
い、非相補性のヌクレオチド配列を有する標的ポリヌク
レオチドの第二のポリヌクレオチド配列（Ｓ２）で、Ｓ
１の５′である配列と相同のデオキシヌクレオチドの配
列である。ＥＰ２の長さは、少なくとも１０ヌクレオチ
ド、通常は少なくとも１５、好ましくは２０〜５０デオ
キシヌクレオチドである。一般的に、ＥＰ２は約１０〜
１００、たとえば３０〜１００デオキシヌクレオチドで
ある。
【００６６】エクステンダープローブは、さらにレセプ
ター結合配列もしくはスペーサー配列、またはＥＰ１と
ＥＰ２の間もしくはＥＰ２の末端に位置する他の配列を
含有していてもよい。
ター結合配列もしくはスペーサー配列、またはＥＰ１と
ＥＰ２の間もしくはＥＰ２の末端に位置する他の配列を
含有していてもよい。
【００６７】連続しない−配列が連続しないとは、標的
ポリデオキシヌクレオチド配列中２個のセグメントまた
はポリヌクレオチドの２個の配列Ｓ１とＳ２の間に、少
なくとも１通常は少なくとも１０デオキシヌクレオチド
が存在することである。
ポリデオキシヌクレオチド配列中２個のセグメントまた
はポリヌクレオチドの２個の配列Ｓ１とＳ２の間に、少
なくとも１通常は少なくとも１０デオキシヌクレオチド
が存在することである。
【００６８】連続する−ポリヌクレオチドの２個のセグ
メントまたは２個の配列の間にデオキシヌクレオチドが
存在しない場合、両配列は連続するとみなされる。
メントまたは２個の配列の間にデオキシヌクレオチドが
存在しない場合、両配列は連続するとみなされる。
【００６９】コピー−一本鎖ポリヌクレオチドの配列に
相補性な配列から分化される、この一本鎖ポリヌクレオ
チドの直接コピーである配列を意味する。本発明に関連
して実行される単一プライマー増幅においては、一本鎖
ポリデオキシヌクレオチドの相補性配列が最初にポリデ
オキシヌクレオチドプライマーの延長の結果として生成
され、ついでこの相補性配列から、一本鎖ポリデオキシ
ヌクレオチドの直接コピーである配列が得られる。
相補性な配列から分化される、この一本鎖ポリヌクレオ
チドの直接コピーである配列を意味する。本発明に関連
して実行される単一プライマー増幅においては、一本鎖
ポリデオキシヌクレオチドの相補性配列が最初にポリデ
オキシヌクレオチドプライマーの延長の結果として生成
され、ついでこの相補性配列から、一本鎖ポリデオキシ
ヌクレオチドの直接コピーである配列が得られる。
【００７０】エクステンダープローブの延長方法−延長
可能な３′末端を有するエクステンダープローブは、上
述のような２個のセグメントを有する、標的ポリヌクレ
オチド配列のような、ポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズしたエクステンダープローブを、ポリデオキシヌクレ
オチドポリメラーゼおよび三リン酸デオキシヌクレオシ
ドと、エクステンダープローブが延長する条件下に混合
することによって延長できる。この方法で、エクステン
ダープローブは、一本鎖ポリヌクレオチドに沿って延長
し、延長されたエクステンダープローブからなる二本鎖
を形成する。この様式での延長は２つの鎖の間に必須の
忠実度を提供し、その結果、延長されたエクステンダー
プローブのエクステンダーポリデオキシヌクレオチドプ
ライマーとしての以後の増幅が、興味ある標的の正確な
検出を可能にする。
可能な３′末端を有するエクステンダープローブは、上
述のような２個のセグメントを有する、標的ポリヌクレ
オチド配列のような、ポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズしたエクステンダープローブを、ポリデオキシヌクレ
オチドポリメラーゼおよび三リン酸デオキシヌクレオシ
ドと、エクステンダープローブが延長する条件下に混合
することによって延長できる。この方法で、エクステン
ダープローブは、一本鎖ポリヌクレオチドに沿って延長
し、延長されたエクステンダープローブからなる二本鎖
を形成する。この様式での延長は２つの鎖の間に必須の
忠実度を提供し、その結果、延長されたエクステンダー
プローブのエクステンダーポリデオキシヌクレオチドプ
ライマーとしての以後の増幅が、興味ある標的の正確な
検出を可能にする。
【００７１】プライマーの延長方法−延長可能な３′末
端を有するポリデオキシヌクレオチドプライマーは、延
長されたエクステンダープローブまたは延長されたプラ
イマーにハイブリダイズしたプライマーを、ポリデオキ
シヌクレオチドポリメラーゼおよび三リン酸デオキシヌ
クレオシドと、プライマーが延長する条件下に混合する
ことによって延長できる。この方法で、プライマーは、
延長されたエクステンダープライマーまたは延長された
プライマーに沿って延長され、延長されたプライマーか
らなる二本鎖を形成する。この様式での延長は延長され
たプライマーとポリヌクレオチドの間に必須の忠実度を
提供し、その結果、標的被検物質の正確な検出を達成で
きる。
端を有するポリデオキシヌクレオチドプライマーは、延
長されたエクステンダープローブまたは延長されたプラ
イマーにハイブリダイズしたプライマーを、ポリデオキ
シヌクレオチドポリメラーゼおよび三リン酸デオキシヌ
クレオシドと、プライマーが延長する条件下に混合する
ことによって延長できる。この方法で、プライマーは、
延長されたエクステンダープライマーまたは延長された
プライマーに沿って延長され、延長されたプライマーか
らなる二本鎖を形成する。この様式での延長は延長され
たプライマーとポリヌクレオチドの間に必須の忠実度を
提供し、その結果、標的被検物質の正確な検出を達成で
きる。
【００７２】この方法を、図１に示す。図１の説明は次
の通りである。
の通りである。
【００７３】エクステンダープローブのＥＰ１はポリヌ
クレオチドのＳ１とハイブリダイズする。ＥＰ２はＳ２
と相同である。エクステンダープローブはＡに沿って延
長し、Ｓ２と相補性の配列Ｓ′２を含む延長されたエク
ステンダープローブＢを生成する。ＢはＥＰ２とＳ′２
を含有し、これらは互いにハイブリダイゼーションが可
能である。
クレオチドのＳ１とハイブリダイズする。ＥＰ２はＳ２
と相同である。エクステンダープローブはＡに沿って延
長し、Ｓ２と相補性の配列Ｓ′２を含む延長されたエク
ステンダープローブＢを生成する。ＢはＥＰ２とＳ′２
を含有し、これらは互いにハイブリダイゼーションが可
能である。
【００７４】この方法は単一プライマー増幅に利用でき
る。この場合には、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配列と
少なくとも３′末端でハイブリダイゼーション可能なポ
リデオキシヌクレオチドプライマーからなる混合物を、
（１）延長されたエクステンダープローブが一本鎖にな
り、（２）ポリデオキシヌクレオチドプライマーが延長
されたエクステンダープローブとハイブリダイズし、そ
れに沿って延長されて、延長されたプライマーからなる
二本鎖を形成し、（３）延長されたプライマーが二本鎖
から解離し、ついで（４）プライマーが延長されたプラ
イマーとハイブリダイズし、それに沿って延長されて、
延長されたプライマーからなる二本鎖を形成する条件下
に提供する。工程（３）および（４）は反復される。エ
クステンダープローブの濃度は、ポリデオキシヌクレオ
チドプライマーの濃度よりも実質的に低いことが好まし
い。「実質的に低い」の語は、プライマーに対するエク
ステンダープローブの濃度が、ＰＣＲ増幅ではなく、本
明細書に述べる単一プライマー増幅が起こるようにする
ことを意味する。好ましくは、エクステンダープローブ
の濃度は、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの濃度
の１％未満とする。
る。この場合には、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配列と
少なくとも３′末端でハイブリダイゼーション可能なポ
リデオキシヌクレオチドプライマーからなる混合物を、
（１）延長されたエクステンダープローブが一本鎖にな
り、（２）ポリデオキシヌクレオチドプライマーが延長
されたエクステンダープローブとハイブリダイズし、そ
れに沿って延長されて、延長されたプライマーからなる
二本鎖を形成し、（３）延長されたプライマーが二本鎖
から解離し、ついで（４）プライマーが延長されたプラ
イマーとハイブリダイズし、それに沿って延長されて、
延長されたプライマーからなる二本鎖を形成する条件下
に提供する。工程（３）および（４）は反復される。エ
クステンダープローブの濃度は、ポリデオキシヌクレオ
チドプライマーの濃度よりも実質的に低いことが好まし
い。「実質的に低い」の語は、プライマーに対するエク
ステンダープローブの濃度が、ＰＣＲ増幅ではなく、本
明細書に述べる単一プライマー増幅が起こるようにする
ことを意味する。好ましくは、エクステンダープローブ
の濃度は、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの濃度
の１％未満とする。
【００７５】単一プライマー増幅への本発明の方法の使
用は、図２に示す。図２の説明は以下のとおりである。
用は、図２に示す。図２の説明は以下のとおりである。
【００７６】ポリデオキシヌクレオチドプライマーＰは
その３′末端に、Ｓ２と相補性のＳ′２とハイブリダイ
ズする配列（ＰＳ）を有する。Ｐはまた、標識Ｗをもつ
ことができる。Ｐは、延長されたエクステンダープロー
ブＢ（その二本鎖から解離した）とハイブリダイズし、
それに沿って延長され、配列Ｓ″２とＳ′２からなる延
長されたプライマーＣを形成する。ＢとＣは解離し、Ｐ
はＣのＳ′２およびＢのＳ′２とハイブリダイズし、Ｐ
はＢおよびＣに沿って延長され、それぞれＣおよびＣ′
を生成する。Ｃ′は配列Ｓ′２およびＳ″２を有する。
これらの二本鎖は解離し、ＰはＣ′およびＣとハイブリ
ダイズし、それに沿って延長されてＣ′およびＣを生成
する。さらに、反復によって、Ｃ′の多重コピーが生
じ、これは標識Ｗの存在によって検出できる。ポリデオ
キシヌクレオチドプライマーの濃度に対してエクステン
ダープローブの濃度は実質的に低いので、ＢおよびＣの
コピーは最小限に止まる。結果として、ＰＣＲ増幅より
もむしろ、単一プライマー増幅が起こる。ＰＣＲ増幅の
生成物ではなく、単一プライマー増幅の生成物が検出さ
れる。
その３′末端に、Ｓ２と相補性のＳ′２とハイブリダイ
ズする配列（ＰＳ）を有する。Ｐはまた、標識Ｗをもつ
ことができる。Ｐは、延長されたエクステンダープロー
ブＢ（その二本鎖から解離した）とハイブリダイズし、
それに沿って延長され、配列Ｓ″２とＳ′２からなる延
長されたプライマーＣを形成する。ＢとＣは解離し、Ｐ
はＣのＳ′２およびＢのＳ′２とハイブリダイズし、Ｐ
はＢおよびＣに沿って延長され、それぞれＣおよびＣ′
を生成する。Ｃ′は配列Ｓ′２およびＳ″２を有する。
これらの二本鎖は解離し、ＰはＣ′およびＣとハイブリ
ダイズし、それに沿って延長されてＣ′およびＣを生成
する。さらに、反復によって、Ｃ′の多重コピーが生
じ、これは標識Ｗの存在によって検出できる。ポリデオ
キシヌクレオチドプライマーの濃度に対してエクステン
ダープローブの濃度は実質的に低いので、ＢおよびＣの
コピーは最小限に止まる。結果として、ＰＣＲ増幅より
もむしろ、単一プライマー増幅が起こる。ＰＣＲ増幅の
生成物ではなく、単一プライマー増幅の生成物が検出さ
れる。
【００７７】エクステンダープローブとプライマーの両
者を高濃度で使用した場合には、標的のＰＣＲ増幅を起
こすことができるが、ＰＣＲ生成物は通常、単一プライ
マー増幅生成物とは異なり、その生成は単一プライマー
増幅生成物の量を減少させることになる。さらに、夾雑
するＤＮＡをランダムにプライムできるプライマー数の
減少により、単一プライマー増幅はＰＣＲよりも標的の
選択的な増幅を可能にする。これは、本発明による単一
プライマー増幅とＰＣＲの間の増幅ＤＮＡ生成物を、標
的ＤＮＡの同じ領域について直接比較することによって
明らかにされた。同一の反応条件下で、ＰＣＲは、増幅
標的ＤＮＡと無関係な増幅生成物を、本発明の単一プラ
イマー増幅で得られるよりも高率に生成した。実質的に
低い濃度のエクステンダープローブを使用することはま
た、減量の節約および経費の低減を可能にする。
者を高濃度で使用した場合には、標的のＰＣＲ増幅を起
こすことができるが、ＰＣＲ生成物は通常、単一プライ
マー増幅生成物とは異なり、その生成は単一プライマー
増幅生成物の量を減少させることになる。さらに、夾雑
するＤＮＡをランダムにプライムできるプライマー数の
減少により、単一プライマー増幅はＰＣＲよりも標的の
選択的な増幅を可能にする。これは、本発明による単一
プライマー増幅とＰＣＲの間の増幅ＤＮＡ生成物を、標
的ＤＮＡの同じ領域について直接比較することによって
明らかにされた。同一の反応条件下で、ＰＣＲは、増幅
標的ＤＮＡと無関係な増幅生成物を、本発明の単一プラ
イマー増幅で得られるよりも高率に生成した。実質的に
低い濃度のエクステンダープローブを使用することはま
た、減量の節約および経費の低減を可能にする。
【００７８】本発明の他の実施態様は、互いに連続しな
い、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチドの多重コピーを製造する方法である。
２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配列、Ｓ１
およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′であり少
なくとも１０ヌクレオチド長であるポリヌクレオチド、
２個のデオキシヌクレオチド配列からなるエクステンダ
ープローブであり、このエクステンダープローブの３′
末端における配列はＳ１とハイブリダイゼーション可能
で、他方のヌクレオチド配列はＳ２と相同であり、ポリ
ヌクレオチドと相補性ではないエクステンダープロー
ブ、Ｓ２と相補性のヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションが少なくとも３′末端において可能なポリデオキ
シヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、なら
びに三リン酸デオキシヌクレオシドを、同時に、または
全部もしくは一部を継続的に混合する。混合は、（ａ）
エクステンダープローブがポリヌクレオチドに沿って延
長して二本鎖を形成し、（ｂ）この延長されたエクステ
ンダープロブが二本鎖から解離し、（ｃ）ポリデオキシ
ヌクレオチドプライマーが延長されたエクステンダープ
ローブとハイブリダイズし、それに沿って延長され、延
長されたプライマーからなる第二の二本鎖を形成し、
（ｄ）この延長されたプライマーが第二の二本鎖から解
離し、ついで（ｅ）プライマーが延長されたプライマー
が延長されたプライマーとハイブリダイズし、それに沿
って延長され、延長されたプライマーからなる二本鎖を
形成し、この工程（ｄ）および（ｅ）が少なくとも３回
反復される条件下に行われる。エクステンダープローブ
の濃度は、ポリヌクレオチドプライマーの濃度の１％未
満とする。エクステンダープローブの好ましくは少なく
とも１５ヌクレオチド配列がＳ１とハイブリダイズす
る。また、ポリデオキシヌクレオチドプライマーは１０
〜１００ヌクレオチド配列を含有し、Ｓ２と相補性の配
列とハイブリダイゼーション可能な好ましくは少なくと
も１５デオキシヌクレオチド配列を含有するのが適当で
ある。
い、相補性の２個のセグメントを有する一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチドの多重コピーを製造する方法である。
２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配列、Ｓ１
およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１の５′であり少
なくとも１０ヌクレオチド長であるポリヌクレオチド、
２個のデオキシヌクレオチド配列からなるエクステンダ
ープローブであり、このエクステンダープローブの３′
末端における配列はＳ１とハイブリダイゼーション可能
で、他方のヌクレオチド配列はＳ２と相同であり、ポリ
ヌクレオチドと相補性ではないエクステンダープロー
ブ、Ｓ２と相補性のヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションが少なくとも３′末端において可能なポリデオキ
シヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、なら
びに三リン酸デオキシヌクレオシドを、同時に、または
全部もしくは一部を継続的に混合する。混合は、（ａ）
エクステンダープローブがポリヌクレオチドに沿って延
長して二本鎖を形成し、（ｂ）この延長されたエクステ
ンダープロブが二本鎖から解離し、（ｃ）ポリデオキシ
ヌクレオチドプライマーが延長されたエクステンダープ
ローブとハイブリダイズし、それに沿って延長され、延
長されたプライマーからなる第二の二本鎖を形成し、
（ｄ）この延長されたプライマーが第二の二本鎖から解
離し、ついで（ｅ）プライマーが延長されたプライマー
が延長されたプライマーとハイブリダイズし、それに沿
って延長され、延長されたプライマーからなる二本鎖を
形成し、この工程（ｄ）および（ｅ）が少なくとも３回
反復される条件下に行われる。エクステンダープローブ
の濃度は、ポリヌクレオチドプライマーの濃度の１％未
満とする。エクステンダープローブの好ましくは少なく
とも１５ヌクレオチド配列がＳ１とハイブリダイズす
る。また、ポリデオキシヌクレオチドプライマーは１０
〜１００ヌクレオチド配列を含有し、Ｓ２と相補性の配
列とハイブリダイゼーション可能な好ましくは少なくと
も１５デオキシヌクレオチド配列を含有するのが適当で
ある。
【００７９】本発明の他の実施態様は、標的ヌクレオチ
ド配列の含有が疑われるメジウム中のその標的ヌクレオ
チドの存在を検出する方法に関する。標的ヌクレオチド
の配列は、２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド
配列Ｓ１およびＳ２を有する。Ｓ２はＳ１の５′であ
り、少なくとも１０ヌクレオチド長である。メジウム、
２個のデオキシヌクレオチド配列を有するエクステンダ
ープローブであり、このエクステンダープローブの３′
末端における配列はＳ１とハイブリダイゼーション可能
で、他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２と相同で、
標的ヌクレオチド配列と相補性ではないエクステンダー
プローブ、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイゼーション可能なポリデオキシヌクレオチドプライ
マー、ＤＮＡポリメラーゼ、および三リン酸デオキシヌ
クレオシドを、同時に、または全部もしくは一部を継続
的に混合する。条件は、（１）エクステンダープローブ
がポリヌクレオチドに沿って延長して二本鎖を形成し、
（２）延長されたエクステンダープローブが二本鎖から
解離し、（３）上記プライマーがこの延長されたエクス
テンダープローブとハイブリダイズし、それに沿って延
長され、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成
し、（４）この延長されたプライマーがその二本鎖から
解離し、ついで（５）上記プライマーがこの延長された
プライマーとハイブリダイズし、それに沿って延長さ
れ、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成するよ
うに選択される。工程（４）と（５）が反復され、エク
ステンダープライマーの存在の検査が行われる。エクス
テンダープライマーの存在は標的ヌクレオチド配列の存
在を示すものである。
ド配列の含有が疑われるメジウム中のその標的ヌクレオ
チドの存在を検出する方法に関する。標的ヌクレオチド
の配列は、２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド
配列Ｓ１およびＳ２を有する。Ｓ２はＳ１の５′であ
り、少なくとも１０ヌクレオチド長である。メジウム、
２個のデオキシヌクレオチド配列を有するエクステンダ
ープローブであり、このエクステンダープローブの３′
末端における配列はＳ１とハイブリダイゼーション可能
で、他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２と相同で、
標的ヌクレオチド配列と相補性ではないエクステンダー
プローブ、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイゼーション可能なポリデオキシヌクレオチドプライ
マー、ＤＮＡポリメラーゼ、および三リン酸デオキシヌ
クレオシドを、同時に、または全部もしくは一部を継続
的に混合する。条件は、（１）エクステンダープローブ
がポリヌクレオチドに沿って延長して二本鎖を形成し、
（２）延長されたエクステンダープローブが二本鎖から
解離し、（３）上記プライマーがこの延長されたエクス
テンダープローブとハイブリダイズし、それに沿って延
長され、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成
し、（４）この延長されたプライマーがその二本鎖から
解離し、ついで（５）上記プライマーがこの延長された
プライマーとハイブリダイズし、それに沿って延長さ
れ、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成するよ
うに選択される。工程（４）と（５）が反復され、エク
ステンダープライマーの存在の検査が行われる。エクス
テンダープライマーの存在は標的ヌクレオチド配列の存
在を示すものである。
【００８０】好ましくは、Ｓ１およびＳ２はそれぞれ１
０〜１００のヌクレオチドを含有する。この方法は、標
的ヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡである場合に
応用できる。一態様においては、ポリデオキシヌクレオ
チドプライマーはレポーター分子で標識される。ポリデ
オキシヌクレオチドプライマーには、Ｓ２と相補性の配
列とハイブリダイズする配列以外のヌクレオチドを含有
させることができる。延長されたプライマーは、Ｓ１ま
たはＳ２以外の標的ヌクレオチド配列の部分に相補性の
ヌクレオチド配列に共有結合したレポーター分子を調べ
ることによって検出できる。
０〜１００のヌクレオチドを含有する。この方法は、標
的ヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡである場合に
応用できる。一態様においては、ポリデオキシヌクレオ
チドプライマーはレポーター分子で標識される。ポリデ
オキシヌクレオチドプライマーには、Ｓ２と相補性の配
列とハイブリダイズする配列以外のヌクレオチドを含有
させることができる。延長されたプライマーは、Ｓ１ま
たはＳ２以外の標的ヌクレオチド配列の部分に相補性の
ヌクレオチド配列に共有結合したレポーター分子を調べ
ることによって検出できる。
【００８１】本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチ
ド被検物質の含有が疑われるサンプル中のそのポリヌク
レオチド被検物質の存在を検出する方法に関する。サン
プルを含有するメジウムを上述のように処理して、ポリ
ヌクレオチド被検物質が存在すれば、それから一本鎖標
的ヌクレオチド配列を形成させる。標的ヌクレオチド配
列は２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配列Ｓ
１およびＳ２を有し、この場合、Ｓ２はＳ１の５′であ
り、少なくとも１０ヌクレオチド長である。メジウム
を、２個のデオキシヌクレオチド配列を有するエクステ
ンダープローブと混合する。エクステンダープローブの
３′末端における配列はＳ１とハイブリダイズできる。
他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２と相同で、標的
配列と相補性ではない。Ｓ２に相補性のヌクレオチド配
列とハイブリダイゼーション可能なポリデオキシヌクレ
オチドプライマー、ならびに三リン酸デオキシヌクレオ
シドおよびＤＮＡ鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチド
ポリメラーゼも混合する。条件は、（１）エクステンダ
ープローブが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズ
し、それに沿って延長されて二本鎖を形成し、（２）延
長されたエクステンダープローブが二本鎖から解離し、
（３）プライマーが延長された配列とハイブリダイズ
し、それに沿って延長され、延長されたプライマーから
なる第二の二本鎖を形成し、（４）延長されたプライマ
ーが二本鎖から解離し、（５）プライマーが上述の延長
されたプライマとハイブリダイズし、それに沿って延長
され、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成する
ように選択される。工程（４）および（５）は反復さ
れ、工程（ａ）および（ｂ）は同時に、または全部もし
くは一部を継続的に実施される。ついで、延長されたブ
ライマーの存在の検査が実施され、その存在はポリヌク
レオチド被検物質の存在を示すことになる。工程（４）
および（５）は少なくとも３回、好ましくは少なくとも
１０回反復される。通常は、反復数を３０未満とするこ
とが好ましい。一般的には、工程（４）および（５）
は、ポリヌクレオチド被検物質の正確な検出が可能にな
るのに十分な回数反復される。ポリヌクレオチド被検物
質がＲＮＡである場合には、メジウムに逆転写酵素も包
含させる。
ド被検物質の含有が疑われるサンプル中のそのポリヌク
レオチド被検物質の存在を検出する方法に関する。サン
プルを含有するメジウムを上述のように処理して、ポリ
ヌクレオチド被検物質が存在すれば、それから一本鎖標
的ヌクレオチド配列を形成させる。標的ヌクレオチド配
列は２個の連続しない、非相補性のヌクレオチド配列Ｓ
１およびＳ２を有し、この場合、Ｓ２はＳ１の５′であ
り、少なくとも１０ヌクレオチド長である。メジウム
を、２個のデオキシヌクレオチド配列を有するエクステ
ンダープローブと混合する。エクステンダープローブの
３′末端における配列はＳ１とハイブリダイズできる。
他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２と相同で、標的
配列と相補性ではない。Ｓ２に相補性のヌクレオチド配
列とハイブリダイゼーション可能なポリデオキシヌクレ
オチドプライマー、ならびに三リン酸デオキシヌクレオ
シドおよびＤＮＡ鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチド
ポリメラーゼも混合する。条件は、（１）エクステンダ
ープローブが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズ
し、それに沿って延長されて二本鎖を形成し、（２）延
長されたエクステンダープローブが二本鎖から解離し、
（３）プライマーが延長された配列とハイブリダイズ
し、それに沿って延長され、延長されたプライマーから
なる第二の二本鎖を形成し、（４）延長されたプライマ
ーが二本鎖から解離し、（５）プライマーが上述の延長
されたプライマとハイブリダイズし、それに沿って延長
され、延長されたプライマーからなる二本鎖を形成する
ように選択される。工程（４）および（５）は反復さ
れ、工程（ａ）および（ｂ）は同時に、または全部もし
くは一部を継続的に実施される。ついで、延長されたブ
ライマーの存在の検査が実施され、その存在はポリヌク
レオチド被検物質の存在を示すことになる。工程（４）
および（５）は少なくとも３回、好ましくは少なくとも
１０回反復される。通常は、反復数を３０未満とするこ
とが好ましい。一般的には、工程（４）および（５）
は、ポリヌクレオチド被検物質の正確な検出が可能にな
るのに十分な回数反復される。ポリヌクレオチド被検物
質がＲＮＡである場合には、メジウムに逆転写酵素も包
含させる。
【００８２】一本鎖ポリデオキシヌクレオチドの形成お
よび増幅方法の実施には、水性メジウムが使用される。
他の極性共溶媒、通常は１〜６個、さらに通常には１〜
４個の炭素原子を有する酸素化有機溶媒、たとえばアル
コール、エーテル等も使用できる。通常、これらの共溶
媒は約７０重量％未満、さらに通常には約３０重量％未
満含有させる
よび増幅方法の実施には、水性メジウムが使用される。
他の極性共溶媒、通常は１〜６個、さらに通常には１〜
４個の炭素原子を有する酸素化有機溶媒、たとえばアル
コール、エーテル等も使用できる。通常、これらの共溶
媒は約７０重量％未満、さらに通常には約３０重量％未
満含有させる
【００８３】メジウムのｐＨは、通常約４．５〜９．５
の範囲、さらに通常には約５．５〜８．５の範囲、好ま
しくは約６〜８の範囲とする。ｐＨおよび温度は、各場
合によって、内部ハイブリダイゼーション配列の解離、
エクステンダープローブとポリヌクレオチド、およびポ
リデオキシヌクレオチドプライマーの延長されたエクス
テンダープローブまたは延長されたプライマーとのハイ
ブリダイゼーション、エクステンダープローブおよびプ
ライマーの延長、延長されたプローブおよびプライマー
の解離、延長されたプライマーのプライマーとのハイブ
リダイゼーション、そのようにハイブリダイズしたプラ
イマーの延長、ならびに延長されたプライマーの解離お
よび後二者の工程の反復が同時にまたは継続的に行われ
るように選択され、また変動される。場合によっては、
上記工程を順次行うかまたは同時に行うかによって、こ
れらの考慮の間に妥協を要することもある。所望のｐＨ
を達成し、測定時にそのｐＨを維持するためには、様々
な緩衝剤が使用される。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リ
ン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含され
る。使用される特定の緩衝剤について本発明には制限は
ないが、各方法にはある種の緩衝剤が他より好ましいと
いう場合がある。
の範囲、さらに通常には約５．５〜８．５の範囲、好ま
しくは約６〜８の範囲とする。ｐＨおよび温度は、各場
合によって、内部ハイブリダイゼーション配列の解離、
エクステンダープローブとポリヌクレオチド、およびポ
リデオキシヌクレオチドプライマーの延長されたエクス
テンダープローブまたは延長されたプライマーとのハイ
ブリダイゼーション、エクステンダープローブおよびプ
ライマーの延長、延長されたプローブおよびプライマー
の解離、延長されたプライマーのプライマーとのハイブ
リダイゼーション、そのようにハイブリダイズしたプラ
イマーの延長、ならびに延長されたプライマーの解離お
よび後二者の工程の反復が同時にまたは継続的に行われ
るように選択され、また変動される。場合によっては、
上記工程を順次行うかまたは同時に行うかによって、こ
れらの考慮の間に妥協を要することもある。所望のｐＨ
を達成し、測定時にそのｐＨを維持するためには、様々
な緩衝剤が使用される。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リ
ン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含され
る。使用される特定の緩衝剤について本発明には制限は
ないが、各方法にはある種の緩衝剤が他より好ましいと
いう場合がある。
【００８４】この方法を実施するには通常、中等度の温
度が使用される。通常、本方法の実行にあたっては、２
種または３種の温度の間にメジウムを循環させることに
なる。この方法の温度は一般的に約１０〜１００℃の範
囲、さらに通常には約４０〜９８℃、好ましくは５０〜
９７℃の範囲である。正確な温度は、塩濃度、ｐＨ、使
用される溶媒 標的ポリヌクレオチドおよびプライマー
の鎖長および組成によって変動させることができる。延
長工程には約３０〜６５℃の比較的低い温度が使用でき
るが、変性およびハイブリダイゼーションは約５０〜１
００℃の温度で実施できる。
度が使用される。通常、本方法の実行にあたっては、２
種または３種の温度の間にメジウムを循環させることに
なる。この方法の温度は一般的に約１０〜１００℃の範
囲、さらに通常には約４０〜９８℃、好ましくは５０〜
９７℃の範囲である。正確な温度は、塩濃度、ｐＨ、使
用される溶媒 標的ポリヌクレオチドおよびプライマー
の鎖長および組成によって変動させることができる。延
長工程には約３０〜６５℃の比較的低い温度が使用でき
るが、変性およびハイブリダイゼーションは約５０〜１
００℃の温度で実施できる。
【００８５】本発明の方法を実施するための時間は、一
般的には、延長されたプライマーまたはそれと相補性の
配列のコピーの所望数が達成されるのに十分長くとす
る。これは一方、増幅が行われる目的、たとえばポリヌ
クレオチド被検物質の検定等に依存するものである。一
般的には、本方法を実施するための時間は、１サイクル
あたり１〜１０分、サイクル数は１か２００までまたは
それ以上、通常は１〜８０、多くの場合２０〜８０であ
る。便宜上、通常はサイクルの時間および数は最小限と
することが望ましい。一般的に、所定の増幅度を得るた
めの時間は、たとえば、ポリヌクレオチドポリメラーゼ
を飽和するのに十分な三リン酸ヌクレオシドの濃度を選
択することにより、またポリヌクレオチドポリメラーゼ
およびポリヌクレオチドプライマーの濃度を上昇させる
ことによって短縮することができる。一般には、本方法
の実行のための時間は約５〜２００分である。便宜上、
通常、この時間は最小限にすることが望ましい。
般的には、延長されたプライマーまたはそれと相補性の
配列のコピーの所望数が達成されるのに十分長くとす
る。これは一方、増幅が行われる目的、たとえばポリヌ
クレオチド被検物質の検定等に依存するものである。一
般的には、本方法を実施するための時間は、１サイクル
あたり１〜１０分、サイクル数は１か２００までまたは
それ以上、通常は１〜８０、多くの場合２０〜８０であ
る。便宜上、通常はサイクルの時間および数は最小限と
することが望ましい。一般的に、所定の増幅度を得るた
めの時間は、たとえば、ポリヌクレオチドポリメラーゼ
を飽和するのに十分な三リン酸ヌクレオシドの濃度を選
択することにより、またポリヌクレオチドポリメラーゼ
およびポリヌクレオチドプライマーの濃度を上昇させる
ことによって短縮することができる。一般には、本方法
の実行のための時間は約５〜２００分である。便宜上、
通常、この時間は最小限にすることが望ましい。
【００８６】上述の条件は、ポリヌクレオチド被検物質
から標的ポリヌクレオチド配列を形成させるためにも選
択される。
から標的ポリヌクレオチド配列を形成させるためにも選
択される。
【００８７】コピーされることになる一本鎖ポリデオキ
シヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列の量
は、サンプル中１または２分子という僅かでもよいが、
一般的には、サンプル中約１０２〜１０１０分子、さら
に通常には約１０３〜１０８分子である。ポリデオキシ
ヌクレオチドプライマーの量は、少なくとも所望のコピ
ーの数と同程度、通常はサンプルあたり１０−１３〜１
０−８モルで、この場合サンプルは１０〜１０００μｌ
である。通常、プライマーは少なくとも−１０−９Ｍ、
好ましくは１０−７、さらに好ましくは少なくとも約１
０−６Ｍ存在させる。ポリヌクレオチドプライマーの濃
度は、一本鎖ポリヌクレオチドに対して実質的に過剰
に、好ましくは少なくとも１００倍とすることが好まし
い。
シヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列の量
は、サンプル中１または２分子という僅かでもよいが、
一般的には、サンプル中約１０２〜１０１０分子、さら
に通常には約１０３〜１０８分子である。ポリデオキシ
ヌクレオチドプライマーの量は、少なくとも所望のコピ
ーの数と同程度、通常はサンプルあたり１０−１３〜１
０−８モルで、この場合サンプルは１０〜１０００μｌ
である。通常、プライマーは少なくとも−１０−９Ｍ、
好ましくは１０−７、さらに好ましくは少なくとも約１
０−６Ｍ存在させる。ポリヌクレオチドプライマーの濃
度は、一本鎖ポリヌクレオチドに対して実質的に過剰
に、好ましくは少なくとも１００倍とすることが好まし
い。
【００８８】エクステンダープローブの濃度は、上述の
ように、プライマーの濃度よりも実質的に低くなければ
ならない。好ましくは、エクステンダープローブの濃度
はプライマーの濃度の１％未満、さらに好ましくはプラ
イマーの濃度の０．１％未満である。通常、エクステン
ダープローブの濃度は１ナノモル、多くの場合０．１ナ
ノモル（ｎＭ）未満であるが、プライマーの濃度は通
常、１０ナノモル以上、通常少なくとも１００ナノモル
である。好ましくは、プライマーの濃度は１００ｎＭ以
上、一方、エクステンダープローブの濃度は１ｎＭ未満
である。
ように、プライマーの濃度よりも実質的に低くなければ
ならない。好ましくは、エクステンダープローブの濃度
はプライマーの濃度の１％未満、さらに好ましくはプラ
イマーの濃度の０．１％未満である。通常、エクステン
ダープローブの濃度は１ナノモル、多くの場合０．１ナ
ノモル（ｎＭ）未満であるが、プライマーの濃度は通
常、１０ナノモル以上、通常少なくとも１００ナノモル
である。好ましくは、プライマーの濃度は１００ｎＭ以
上、一方、エクステンダープローブの濃度は１ｎＭ未満
である。
【００８９】それぞれの試剤の最終濃度は通常、延長さ
れたプライマーのコピー数が至適になるように、経験的
に決定される。
れたプライマーのコピー数が至適になるように、経験的
に決定される。
【００９０】メジウム中の三リン酸デオキシヌクレオシ
ドの濃度は広範囲に変動させることができる。好ましく
は、これらの試剤は過剰量存在させる。三リン酸デオキ
シヌクレオシドは通常、１０−６〜１０−２Ｍ、好まし
くは１０−５〜１０−３Ｍ存在させる。
ドの濃度は広範囲に変動させることができる。好ましく
は、これらの試剤は過剰量存在させる。三リン酸デオキ
シヌクレオシドは通常、１０−６〜１０−２Ｍ、好まし
くは１０−５〜１０−３Ｍ存在させる。
【００９１】鋳型依存性ポリヌクレオチドプライマーの
濃度は通常、経験的に決定される。好ましくは、濃度を
さらに上昇させても、増幅のための時間を５倍以上、好
ましくは２倍以上低下させることがない濃度が使用され
る。この場合の主要な制限因子は一般的に、試剤の経費
である。
濃度は通常、経験的に決定される。好ましくは、濃度を
さらに上昇させても、増幅のための時間を５倍以上、好
ましくは２倍以上低下させることがない濃度が使用され
る。この場合の主要な制限因子は一般的に、試剤の経費
である。
【００９２】各種試剤の混合物を形成させるための混合
順序は適宜変動させることができる。一般的に、標的ヌ
クレオチド配列は、このような配列を含有するサンプル
またはこのような配列を得るために予め処理したポリヌ
クレオチド被検物質から得られる。一般的に、標的ポリ
ヌクレオチド配列およびエクステンダープローブを、予
め調製したポリヌクレオチドプライマー、三リン酸デオ
キシヌクレオシドおよび鋳型依存性ポリデオキシヌクレ
オチドポリメラーゼの混合物に混合する、しかしなが
ら、上述のすべての同時添加、ならびに段階的もしくは
特定の順序での添加を行うこともできる。
順序は適宜変動させることができる。一般的に、標的ヌ
クレオチド配列は、このような配列を含有するサンプル
またはこのような配列を得るために予め処理したポリヌ
クレオチド被検物質から得られる。一般的に、標的ポリ
ヌクレオチド配列およびエクステンダープローブを、予
め調製したポリヌクレオチドプライマー、三リン酸デオ
キシヌクレオシドおよび鋳型依存性ポリデオキシヌクレ
オチドポリメラーゼの混合物に混合する、しかしなが
ら、上述のすべての同時添加、ならびに段階的もしくは
特定の順序での添加を行うこともできる。
【００９３】試剤の濃度および添加順序、ならびにこの
方法の条件は、一般的に、エクステンダープライマーの
コピー数およびそのコピーの形成速度を最大にするとい
う要求によって支配される。一般的には、エクステンダ
ープライマーのコピー数は、少なくとも１０２のファク
ターで、好ましくは１０４、さらに好ましくは１０６ま
たはそれ以上のファクターで増大することが望まれる。
方法の条件は、一般的に、エクステンダープライマーの
コピー数およびそのコピーの形成速度を最大にするとい
う要求によって支配される。一般的には、エクステンダ
ープライマーのコピー数は、少なくとも１０２のファク
ターで、好ましくは１０４、さらに好ましくは１０６ま
たはそれ以上のファクターで増大することが望まれる。
【００９４】ポリヌクレオチド被検物質の定量にあたり
上述の混合物を形成させるための各種試剤の混合順序は
適宜変動させることができて、一緒にもしくは同時に、
または全部もしくは一部を継続的に行うことができる。
一般に、ポリヌクレオチド被検物質含有サンプルは、標
的ヌクレオチド配列が生じるように処理される。標的ポ
リデオキシヌクレオチド配列は、エクステンダープロー
ブと混合して、二者をハイブリダイズさせることができ
る。次に、エクステンダープローブは、三リン酸デオキ
シヌクレオシドおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下に、
標的ヌクレオチド配列に沿って延長させる。予め調製し
た三リン酸デオキシヌクレオシドとＤＮＡポリメラーゼ
の混合物を使用できる。この混合物にはポリデオキシヌ
クレオチドプライマーも包含させることができる。上記
試剤の同時添加も、また段階的もしくは特定の順序での
添加も使用できる。試剤の濃度および添加順序、ならび
にこの方法の条件は、一般的に上述の考慮によって支配
される。本発明の方法を、ポリヌクレオチド被検物質の
検出に応用して実施するにあたって、メジウム、ｐＨお
よび時間に関して考慮すべき点は上述の通りである。
上述の混合物を形成させるための各種試剤の混合順序は
適宜変動させることができて、一緒にもしくは同時に、
または全部もしくは一部を継続的に行うことができる。
一般に、ポリヌクレオチド被検物質含有サンプルは、標
的ヌクレオチド配列が生じるように処理される。標的ポ
リデオキシヌクレオチド配列は、エクステンダープロー
ブと混合して、二者をハイブリダイズさせることができ
る。次に、エクステンダープローブは、三リン酸デオキ
シヌクレオシドおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下に、
標的ヌクレオチド配列に沿って延長させる。予め調製し
た三リン酸デオキシヌクレオシドとＤＮＡポリメラーゼ
の混合物を使用できる。この混合物にはポリデオキシヌ
クレオチドプライマーも包含させることができる。上記
試剤の同時添加も、また段階的もしくは特定の順序での
添加も使用できる。試剤の濃度および添加順序、ならび
にこの方法の条件は、一般的に上述の考慮によって支配
される。本発明の方法を、ポリヌクレオチド被検物質の
検出に応用して実施するにあたって、メジウム、ｐＨお
よび時間に関して考慮すべき点は上述の通りである。
【００９５】標的ポリヌクレオチド被検物質の濃度は、
サンプル中１分子という低濃度でもよいが、好ましくは
少なくとも１０−２１Ｍ、一般的には約１０−１０Ｍ〜
１０−９Ｍ、さらに通常には約１０−１４〜１０−１９
Ｍである。
サンプル中１分子という低濃度でもよいが、好ましくは
少なくとも１０−２１Ｍ、一般的には約１０−１０Ｍ〜
１０−９Ｍ、さらに通常には約１０−１４〜１０−１９
Ｍである。
【００９６】各種試剤の濃度は一般的には、ポリヌクレ
オチド被検物質の興味ある濃度範囲によって決定される
が、それぞれの試剤の最終濃度は、興味ある範囲での検
定の感度を至適化できるように、通常、経験的に決定さ
れる。検定における他の試剤の濃度は、一般に、増幅方
法について上述したのと同じ原理に従って決定される。
第一に考慮すべき点は、延長されたプライマーのコピー
が容易に検出され、ポリヌクレオチド被検物質の正確な
定量値が与えられるように、延長されたプライマーのコ
ピーが十分な数、ポリヌクレオチド被検物質配列に関連
して生成することである。
オチド被検物質の興味ある濃度範囲によって決定される
が、それぞれの試剤の最終濃度は、興味ある範囲での検
定の感度を至適化できるように、通常、経験的に決定さ
れる。検定における他の試剤の濃度は、一般に、増幅方
法について上述したのと同じ原理に従って決定される。
第一に考慮すべき点は、延長されたプライマーのコピー
が容易に検出され、ポリヌクレオチド被検物質の正確な
定量値が与えられるように、延長されたプライマーのコ
ピーが十分な数、ポリヌクレオチド被検物質配列に関連
して生成することである。
【００９７】延長されたプライマーのコピーは、多くの
方法で検出できる。たとえば、本方法では、ポリデオキ
シヌクレオチドプライマーの分子はリガンドＷ′で標識
することが可能で、Ｗ′をついで検出することができ
る。
方法で検出できる。たとえば、本方法では、ポリデオキ
シヌクレオチドプライマーの分子はリガンドＷ′で標識
することが可能で、Ｗ′をついで検出することができ
る。
【００９８】他の例では、標識は、小有機分子、ポリヌ
クレオチド配列、蛋白質等とすることができる。増幅に
際し、末端に標識をもった二本鎖の混合が得られる。二
本鎖は、その分子を、リガンドに対するレセプターが結
合されている表面に結合させることによって検出でき
る。非結合物質を除去したのち、支持体を検出可能な標
識の存在について調べる。その存在はサンプル中におけ
るポリヌクレオチド被検物質の存在を指示する。
クレオチド配列、蛋白質等とすることができる。増幅に
際し、末端に標識をもった二本鎖の混合が得られる。二
本鎖は、その分子を、リガンドに対するレセプターが結
合されている表面に結合させることによって検出でき
る。非結合物質を除去したのち、支持体を検出可能な標
識の存在について調べる。その存在はサンプル中におけ
るポリヌクレオチド被検物質の存在を指示する。
【００９９】他のアプローチにおいては、ハイブリダイ
ズされた配列に結合できる合成または天然のレセプター
が存在するような配列を選択できる。この配列は、それ
が上述のエクステンダープローブのＥＰ１とＥＰ２の間
に包含されるように導入される。別法として、それら
は、ポリデオキシヌクレオチドプライマー分子の部分の
５′末端に標識として導入することもできる。テトラサ
イクリンレプレッサーはこのようなレセプターである。
この蛋白質はテトラサイクリンオペレーターに結合し、
ハイブリダイズされた配列はこのオペレーターの一部ま
たはすべてからなるように選択される。レプレッサーは
固体支持体に結合させ、増幅反応溶液から増幅生成物の
吸着および濃縮に使用することができる。プローブが検
出可能な標識に結合されている場合には、核酸プローブ
を増幅標的配列にハイブリダイズさせることによって、
結合生成物をついで検出できる。標識は吸着体の物理的
性質たとえば電気的性質、光学的性質、音波修飾等の変
化によって検出することができる。
ズされた配列に結合できる合成または天然のレセプター
が存在するような配列を選択できる。この配列は、それ
が上述のエクステンダープローブのＥＰ１とＥＰ２の間
に包含されるように導入される。別法として、それら
は、ポリデオキシヌクレオチドプライマー分子の部分の
５′末端に標識として導入することもできる。テトラサ
イクリンレプレッサーはこのようなレセプターである。
この蛋白質はテトラサイクリンオペレーターに結合し、
ハイブリダイズされた配列はこのオペレーターの一部ま
たはすべてからなるように選択される。レプレッサーは
固体支持体に結合させ、増幅反応溶液から増幅生成物の
吸着および濃縮に使用することができる。プローブが検
出可能な標識に結合されている場合には、核酸プローブ
を増幅標的配列にハイブリダイズさせることによって、
結合生成物をついで検出できる。標識は吸着体の物理的
性質たとえば電気的性質、光学的性質、音波修飾等の変
化によって検出することができる。
【０１００】他の使用できるオペレーター−レプレッサ
ーの組合わせには、たとえば、ＤＮＡ二本鎖の捕捉のた
めのリガンドおよびレセプターとして使用されているｌ
ａｃレプレッサーとオペレーター、またトリプトファン
レプレッサーとオペレーターがある。
ーの組合わせには、たとえば、ＤＮＡ二本鎖の捕捉のた
めのリガンドおよびレセプターとして使用されているｌ
ａｃレプレッサーとオペレーター、またトリプトファン
レプレッサーとオペレーターがある。
【０１０１】他のアプローチでは、ブロモデオキシウリ
ジンをポリデオキシヌクレオチドプライマー分子の部分
に導入し、ブロモデオキシウリジンに対する抗体を使用
することができる。結合した配列の検出は上述の任意の
方法で実施できる。
ジンをポリデオキシヌクレオチドプライマー分子の部分
に導入し、ブロモデオキシウリジンに対する抗体を使用
することができる。結合した配列の検出は上述の任意の
方法で実施できる。
【０１０２】延長されたコピーの検出のための好ましい
アプローチにおいては、コピーは、加熱または変性溶媒
と溶質の使用により同時にまたは継続的に変性させ、た
とえば上述の方法のひとつによって支持体に結合させ
る。ついで支持体を、核酸配列と標識またはレセプター
結合部位からなるプローブと接触させる。この核酸配列
は延長されたプライマーコピーの少なくとも一部分に相
補性である。延長されたプライマーコピーの存在はつい
で、支持体上における標識またはレセプター結合部位の
存在によって指示される。
アプローチにおいては、コピーは、加熱または変性溶媒
と溶質の使用により同時にまたは継続的に変性させ、た
とえば上述の方法のひとつによって支持体に結合させ
る。ついで支持体を、核酸配列と標識またはレセプター
結合部位からなるプローブと接触させる。この核酸配列
は延長されたプライマーコピーの少なくとも一部分に相
補性である。延長されたプライマーコピーの存在はつい
で、支持体上における標識またはレセプター結合部位の
存在によって指示される。
【０１０３】他の検定フォーマットおよび検出フォーマ
ットは、それぞれ１９８９年１月１９日および１９８９
年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／２２
９，２８２号および第０７／３３９，７９５号（ＥＰ０
３７９３６９）に開示されている。これらの記載は参考
として本明細書に導入する。
ットは、それぞれ１９８９年１月１９日および１９８９
年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／２２
９，２８２号および第０７／３３９，７９５号（ＥＰ０
３７９３６９）に開示されている。これらの記載は参考
として本明細書に導入する。
【０１０４】二本鎖核酸配列を特異的に検出するための
任意の標準方法が使用できる。
任意の標準方法が使用できる。
【０１０５】核酸を検出する一方法では核酸プローブが
使用される。この方法は一般的には、固体支持体たとえ
ばニトロセルロース濾紙、セルロース濾紙、ジアゾ化濾
紙、またはナイロン膜上に標的核酸を固定化するもので
ある。標的核酸が支持体上に固定されたならば、支持体
を、適当に標識されたプローブ核酸と、約１０分から４
８時間接触させる。この時間の経過後、固体支持体を数
回洗浄して、非結合プローブを除去し、ハイブリダイズ
した物質をオートラジオグラフィーまたは分光分析法に
よって検出する。
使用される。この方法は一般的には、固体支持体たとえ
ばニトロセルロース濾紙、セルロース濾紙、ジアゾ化濾
紙、またはナイロン膜上に標的核酸を固定化するもので
ある。標的核酸が支持体上に固定されたならば、支持体
を、適当に標識されたプローブ核酸と、約１０分から４
８時間接触させる。この時間の経過後、固体支持体を数
回洗浄して、非結合プローブを除去し、ハイブリダイズ
した物質をオートラジオグラフィーまたは分光分析法に
よって検出する。
【０１０６】プローブを使用する一方法は、１９８５年
９月６日出願の米国特許出願第７７３，３８６号（欧州
特許出願第８６３０６８６０．７号、公告第０２２４９
９５号）に記載されている。この記載は参考として本明
細書に導入する。この方法は、アッセイメジウム中に、
サンプル、および核酸フラグメントに相補性の第一およ
び第二のポリヌクレオチド試剤を混合することからな
る。第一および第二の試剤はそれぞれ、核酸フラグメン
トの別個の領域とハイブリダイズする。第一の試剤は、
それを非共有結合的に重合可能にする手段を含有する。
第二の試剤は、それを検出可能にする手段を含有する。
サンプルと第一および第二の試剤を、アッセイメジウム
中、第一の試剤は重合し、第二の試剤はサンプル中にＤ
ＮＡフラグメントが存在する場合にのみ重合した第一の
試剤に結合するような条件下に混合する。ついで測定
は、第二の試剤が重合した第一の試剤に結合したか否か
に関して行われる。
９月６日出願の米国特許出願第７７３，３８６号（欧州
特許出願第８６３０６８６０．７号、公告第０２２４９
９５号）に記載されている。この記載は参考として本明
細書に導入する。この方法は、アッセイメジウム中に、
サンプル、および核酸フラグメントに相補性の第一およ
び第二のポリヌクレオチド試剤を混合することからな
る。第一および第二の試剤はそれぞれ、核酸フラグメン
トの別個の領域とハイブリダイズする。第一の試剤は、
それを非共有結合的に重合可能にする手段を含有する。
第二の試剤は、それを検出可能にする手段を含有する。
サンプルと第一および第二の試剤を、アッセイメジウム
中、第一の試剤は重合し、第二の試剤はサンプル中にＤ
ＮＡフラグメントが存在する場合にのみ重合した第一の
試剤に結合するような条件下に混合する。ついで測定
は、第二の試剤が重合した第一の試剤に結合したか否か
に関して行われる。
【０１０７】サンプルを含有するアッセイ混合物中の他
の成分から延長されたプライマーのコピーを分離するた
めには、ポリヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオ
チドプライマーがその配列を固定化するための手段を有
することまたは有することが可能であることが望まし
く、また場合によっては実際に好ましいものである。一
般的には、この固定化の手段には支持体が使用される。
問題の配列は、この配列を本発明の方法に使用するのに
先立って、支持体に結合するように処理することができ
る。ヌクレオチド配列を固体支持体に結合させるために
は、多くの方法が知られている。たとえば、Ｔ．Ｇｏｌ
ｄｋｏｒｎら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：
９１７１〜９１９１（１９８６）およびここに引用され
た文献が参考になる。一般的に、ヌクレオチド配列を支
持体に付着させる操作には、その配列中の一部のヌクレ
オチドを化学的に修飾させ、ついで支持体にこの配列を
付着できるようにする操作がある。好ましくは、支持体
とヌクレオチド配列の間の結合は共有結合とし、さらに
好ましくは、ヌクレオチド配列と支持体の間には連結基
を配置する。たとえば、支持体はマレイミド基が導入さ
れるように処理し、ヌクレオチド配列はチオール基が導
入されるように処理することができる。チオール基はマ
レイミド基の活性化オレフィンと反応性を示し、この様
式でヌクレオチド配列は支持体に共有結合によって結合
させることができる。他のこのような連結基の例には、
Ｎｏｙｅｓ，Ｂ．Ｅ．＆ Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．Ｃｅｌ
ｌ ５：３０１（１９７５）およびＡｌｗｉｎｅ，Ｊ．
Ｃ．ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ７
４：５３５０（１９７７）に記載されているジアゾベン
ジルオキシメチル基で誘導体化したセルロース、ならび
にＳｅｅｄ，Ｂ．：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
０：１７９９（１９８２）に記載されているｏ−アミノ
フェニルチオエーテルで誘導体化されたセルロースがあ
る。
の成分から延長されたプライマーのコピーを分離するた
めには、ポリヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオ
チドプライマーがその配列を固定化するための手段を有
することまたは有することが可能であることが望まし
く、また場合によっては実際に好ましいものである。一
般的には、この固定化の手段には支持体が使用される。
問題の配列は、この配列を本発明の方法に使用するのに
先立って、支持体に結合するように処理することができ
る。ヌクレオチド配列を固体支持体に結合させるために
は、多くの方法が知られている。たとえば、Ｔ．Ｇｏｌ
ｄｋｏｒｎら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：
９１７１〜９１９１（１９８６）およびここに引用され
た文献が参考になる。一般的に、ヌクレオチド配列を支
持体に付着させる操作には、その配列中の一部のヌクレ
オチドを化学的に修飾させ、ついで支持体にこの配列を
付着できるようにする操作がある。好ましくは、支持体
とヌクレオチド配列の間の結合は共有結合とし、さらに
好ましくは、ヌクレオチド配列と支持体の間には連結基
を配置する。たとえば、支持体はマレイミド基が導入さ
れるように処理し、ヌクレオチド配列はチオール基が導
入されるように処理することができる。チオール基はマ
レイミド基の活性化オレフィンと反応性を示し、この様
式でヌクレオチド配列は支持体に共有結合によって結合
させることができる。他のこのような連結基の例には、
Ｎｏｙｅｓ，Ｂ．Ｅ．＆ Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．Ｃｅｌ
ｌ ５：３０１（１９７５）およびＡｌｗｉｎｅ，Ｊ．
Ｃ．ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ７
４：５３５０（１９７７）に記載されているジアゾベン
ジルオキシメチル基で誘導体化したセルロース、ならび
にＳｅｅｄ，Ｂ．：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
０：１７９９（１９８２）に記載されているｏ−アミノ
フェニルチオエーテルで誘導体化されたセルロースがあ
る。
【０１０８】ヌクレオチド配列が最初は支持体に結合さ
れていなくても、２個の配列の一方は、本発明の方法に
おけるある時期、好ましくは延長されたプライマーコピ
ーの検出前には、支持体に結合していることが望まし
い。したがって、支持体とヌクレオチド配列の一方は、
支持体とそのヌクレオチド配列の間の結合を可能にする
反応性の基を含んでいなければならない。反応性の基の
性質は、本発明の方法に適合性を有するものである。
れていなくても、２個の配列の一方は、本発明の方法に
おけるある時期、好ましくは延長されたプライマーコピ
ーの検出前には、支持体に結合していることが望まし
い。したがって、支持体とヌクレオチド配列の一方は、
支持体とそのヌクレオチド配列の間の結合を可能にする
反応性の基を含んでいなければならない。反応性の基の
性質は、本発明の方法に適合性を有するものである。
【０１０９】このようなシステムのひとつには、上述の
ような、支持体がマレイミド基を、ヌクレオチド配列が
チオール基を含むものがある。他の実施態様において
は、ヌクレオチド配列と支持体が、相補性の特異的結合
対メンバー、たとえばビオチン−アビジン等を含有す
る。すなわち、本発明の方法は、溶液中で進行させ、適
当な時期に支持体を導入し、相補性のｓｂｐメンバーを
結合させることができる。支持体を洗浄して非結合物質
を除去したのち、以後の反応または定量を行うことがで
きる。
ような、支持体がマレイミド基を、ヌクレオチド配列が
チオール基を含むものがある。他の実施態様において
は、ヌクレオチド配列と支持体が、相補性の特異的結合
対メンバー、たとえばビオチン−アビジン等を含有す
る。すなわち、本発明の方法は、溶液中で進行させ、適
当な時期に支持体を導入し、相補性のｓｂｐメンバーを
結合させることができる。支持体を洗浄して非結合物質
を除去したのち、以後の反応または定量を行うことがで
きる。
【０１１０】このようなシステムの他の例には、レプレ
ッサー−オペレーター相互作用がある。この場合、ヌク
レオチド配列の一方は固体表面に、固体表面上に固定化
された特異的レプレッサーまたは修飾蛋白質とのその配
列の特異的相互作用によって捕捉される。捕捉相のこの
実施態様の利点は、場合によっては、レプレッサーから
のオペレーターＤＮＡの放出が、複合体をインデューサ
ー分子での処理によって達成できることである。たとえ
ば、ヌクレオチド配列の一方または他方に存在するオペ
レーター配列が表面に捕捉され、溶液が表面に接触して
いる間表面に保持されるように、テトラサイクリンレプ
レッサーを固体表面上に固定化することができる。つい
で表面を洗浄して非特異的な結合を除去し、最後に、表
面に結合したレプレッサー−オペレーター複合体をイン
デューサー分子（この場合はテトラサイクリンまたはそ
の活性類縁体の１種）と接触させて、オペレーター含有
ヌクレオチドを表面から放出させる。
ッサー−オペレーター相互作用がある。この場合、ヌク
レオチド配列の一方は固体表面に、固体表面上に固定化
された特異的レプレッサーまたは修飾蛋白質とのその配
列の特異的相互作用によって捕捉される。捕捉相のこの
実施態様の利点は、場合によっては、レプレッサーから
のオペレーターＤＮＡの放出が、複合体をインデューサ
ー分子での処理によって達成できることである。たとえ
ば、ヌクレオチド配列の一方または他方に存在するオペ
レーター配列が表面に捕捉され、溶液が表面に接触して
いる間表面に保持されるように、テトラサイクリンレプ
レッサーを固体表面上に固定化することができる。つい
で表面を洗浄して非特異的な結合を除去し、最後に、表
面に結合したレプレッサー−オペレーター複合体をイン
デューサー分子（この場合はテトラサイクリンまたはそ
の活性類縁体の１種）と接触させて、オペレーター含有
ヌクレオチドを表面から放出させる。
【０１１１】インデューサー分子は、生物学的／調節レ
プレッサーオペレーター複合体の解離を生じる天然にお
ける分子と構造的に同一であるという意味において「天
然のインデューサー」であっても、また類似のもしくは
増強された結合および複合体解離活性を有する天然イン
デューサーの合成類縁体であってもよい。これらの例に
は、Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．らＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６
９：７０７〜７２１（１９８３）およびＫｌｏｃｋ，Ｇ
ら：Ｊ．Ｂａｃｔ．１６１：３２６〜３３２（１９８
５）に記載されているような、テトラサイクリンレプレ
ッサー−オペレーター相互作用およびそのテトラサイク
リンによる解離がある。
プレッサーオペレーター複合体の解離を生じる天然にお
ける分子と構造的に同一であるという意味において「天
然のインデューサー」であっても、また類似のもしくは
増強された結合および複合体解離活性を有する天然イン
デューサーの合成類縁体であってもよい。これらの例に
は、Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．らＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６
９：７０７〜７２１（１９８３）およびＫｌｏｃｋ，Ｇ
ら：Ｊ．Ｂａｃｔ．１６１：３２６〜３３２（１９８
５）に記載されているような、テトラサイクリンレプレ
ッサー−オペレーター相互作用およびそのテトラサイク
リンによる解離がある。
【０１１２】ヌクレオチド配列が支持体に共有結合で結
合している場合には、たとえばこの配列を増幅またはク
ローニングするために、付着した配列を支持体から除去
することが望ましい。この場合には、ヌクレオチド配列
と支持体の間に、切断可能な基を導入することが望まし
い。切断可能な基としてはピロリン酸結合、ジスルフィ
ド結合、および制限酵素切断部位がある。
合している場合には、たとえばこの配列を増幅またはク
ローニングするために、付着した配列を支持体から除去
することが望ましい。この場合には、ヌクレオチド配列
と支持体の間に、切断可能な基を導入することが望まし
い。切断可能な基としてはピロリン酸結合、ジスルフィ
ド結合、および制限酵素切断部位がある。
【０１１３】支持体はメジウムから除去し、非結合物質
を含まないように洗浄し、ついで、たとえば標識または
レポーター基の存在を検出することによって、延長され
たプライマーコピーの存在を調べる。一般的には、この
検査には、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の存在に
関連するシグナルを生成させるために、支持体を、残り
のシグナル生成系のメンバーと接触させる。
を含まないように洗浄し、ついで、たとえば標識または
レポーター基の存在を検出することによって、延長され
たプライマーコピーの存在を調べる。一般的には、この
検査には、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の存在に
関連するシグナルを生成させるために、支持体を、残り
のシグナル生成系のメンバーと接触させる。
【０１１４】シグナルの検出は、使用されるシグナル生
成系の性質に依存する。標識またはレポーター基が酵素
である場合には、シグナル生成系の付加的メンバーに酵
素基質等が包含される。酵素反応の生成物は、好ましく
は、発光生成物、または蛍光もしくは非蛍光染料であ
り、これらはいずれも分光測光法で検出できる。また、
他の分光法または電気的計測法で検出できる生成物であ
ってもよい。標識が蛍光分子である場合には、メジウム
を照射して、蛍光を定量する。標識が放射性の基である
場合には、メジウムをカウントして放射能カウントを定
量する。
成系の性質に依存する。標識またはレポーター基が酵素
である場合には、シグナル生成系の付加的メンバーに酵
素基質等が包含される。酵素反応の生成物は、好ましく
は、発光生成物、または蛍光もしくは非蛍光染料であ
り、これらはいずれも分光測光法で検出できる。また、
他の分光法または電気的計測法で検出できる生成物であ
ってもよい。標識が蛍光分子である場合には、メジウム
を照射して、蛍光を定量する。標識が放射性の基である
場合には、メジウムをカウントして放射能カウントを定
量する。
【０１１５】ポリデオキシヌクレオチドプライマー、エ
クステンダープローブ、または他のポリヌクレオチドの
製造には、様々な技術を使用できる。これらは生物学的
合成または化学的合成によって得られる。短い配列（約
１００ヌクレオチドまで）については、生物学的合成に
比べて、多くの場合、化学的合成の方が経済的である。
経済性に加えて、化学的合成は、低分子量化合物および
／または修飾塩基を、合成工程の間に導入するのに便利
な方法である。さらに、化学的合成は、標的ポリヌクレ
オチド結合配列の長さおよび領域の選択がきわめて柔軟
に実施である。ポリデオキシヌクレオチドプライマーお
よびエクステンダープローブは、市販の自動核酸シンセ
サイザーを用いる標準的な方法で合成できる。適当に修
飾されたガラスまたは樹脂上でのＤＮＡの化学的合成で
は、表面に共有結合で付着したＤＮＡが得られる。これ
は洗浄やサンプル処理に有利である。長い配列の場合
は、分子生物学で使用される複製法が、たとえばＪ．Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０
１：２０〜７８（１９８３）に記載されている一本鎖Ｄ
ＮＡのためのＭ１３に使用されているように、応用でき
る。
クステンダープローブ、または他のポリヌクレオチドの
製造には、様々な技術を使用できる。これらは生物学的
合成または化学的合成によって得られる。短い配列（約
１００ヌクレオチドまで）については、生物学的合成に
比べて、多くの場合、化学的合成の方が経済的である。
経済性に加えて、化学的合成は、低分子量化合物および
／または修飾塩基を、合成工程の間に導入するのに便利
な方法である。さらに、化学的合成は、標的ポリヌクレ
オチド結合配列の長さおよび領域の選択がきわめて柔軟
に実施である。ポリデオキシヌクレオチドプライマーお
よびエクステンダープローブは、市販の自動核酸シンセ
サイザーを用いる標準的な方法で合成できる。適当に修
飾されたガラスまたは樹脂上でのＤＮＡの化学的合成で
は、表面に共有結合で付着したＤＮＡが得られる。これ
は洗浄やサンプル処理に有利である。長い配列の場合
は、分子生物学で使用される複製法が、たとえばＪ．Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０
１：２０〜７８（１９８３）に記載されている一本鎖Ｄ
ＮＡのためのＭ１３に使用されているように、応用でき
る。
【０１１６】オリゴヌクレオチド合成の他の方法には、
ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法（Ｎａｒ
ａｎｇら：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９
０，１９７９）および支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａ
ｇｅら：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１
８５９〜１８６２，１９８１）、ならびにホスフォール
アミデート法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７〜３１
４，１９８８）および”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮ
Ａ”，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｙ偏、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとそれに引用された文献に
記載されている他の方法が包含される。
ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法（Ｎａｒ
ａｎｇら：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９
０，１９７９）および支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａ
ｇｅら：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１
８５９〜１８６２，１９８１）、ならびにホスフォール
アミデート法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７〜３１
４，１９８８）および”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮ
Ａ”，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｙ偏、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとそれに引用された文献に
記載されている他の方法が包含される。
【００１７】ある場合には、ポリヌクレオチドの３′末
端は、鋳型ＤＮＡポリメラーゼとの反応を防止するため
に、または結合配列を追加するために修飾される。３′
末端はたとえば、ジデオキシヌクレオチドまたはリボヌ
クレオチドのリゲーション、ついでリボースの過ヨウ素
酸酸化、ついで得られたアルデヒドの水素化ホウ素塩お
よび大きなアミンたとえばアミノデキストランとの還元
アミノ化によって修飾できる。
端は、鋳型ＤＮＡポリメラーゼとの反応を防止するため
に、または結合配列を追加するために修飾される。３′
末端はたとえば、ジデオキシヌクレオチドまたはリボヌ
クレオチドのリゲーション、ついでリボースの過ヨウ素
酸酸化、ついで得られたアルデヒドの水素化ホウ素塩お
よび大きなアミンたとえばアミノデキストランとの還元
アミノ化によって修飾できる。
【０１１８】ポリデオキシヌクレオチドプライマー、エ
クステンダープローブ、または他のポリヌクレオチド
は、標準的自動化法で製造できる。
クステンダープローブ、または他のポリヌクレオチド
は、標準的自動化法で製造できる。
【０１１９】便宜上、本発明に使用される試剤は、本方
法への使用のために既定量の試剤を包装して組合わせた
キットとして提供することもできる。サンプル中のポリ
ヌクレオチド被検物質のアッセイにおいては、本発明の
方法に有用なキットは、他の試剤、ポリヌクレオチド被
検物質から標的ヌクレオチド配列を形成させるための試
剤、標的ヌクレオチド配列中の第一の配列とハイブリダ
イゼーション可能な配列を３′末端に有し、標的ヌクレ
オチド配列の第二の配列と相同な配列を有し、この場
合、第二の配列は第一の配列の５′であり、第一の配列
と連続していないエクステンダープローブ、ならびにポ
リデオキシヌクレオチドプライマーを包装して組合わせ
ることができる。この場合、ポリデオキシヌクレオチド
プライマーは標識するか、またはこの配列の標識もしく
は支持体への結合を可能にするような基をもたせること
ができる。
法への使用のために既定量の試剤を包装して組合わせた
キットとして提供することもできる。サンプル中のポリ
ヌクレオチド被検物質のアッセイにおいては、本発明の
方法に有用なキットは、他の試剤、ポリヌクレオチド被
検物質から標的ヌクレオチド配列を形成させるための試
剤、標的ヌクレオチド配列中の第一の配列とハイブリダ
イゼーション可能な配列を３′末端に有し、標的ヌクレ
オチド配列の第二の配列と相同な配列を有し、この場
合、第二の配列は第一の配列の５′であり、第一の配列
と連続していないエクステンダープローブ、ならびにポ
リデオキシヌクレオチドプライマーを包装して組合わせ
ることができる。この場合、ポリデオキシヌクレオチド
プライマーは標識するか、またはこの配列の標識もしく
は支持体への結合を可能にするような基をもたせること
ができる。
【０１２０】多重コピーの製造方法に使用するために
は、キットには、ポリデオキシヌクレオチドプライマー
を含有させる。上述のキットにはさらに、三リン酸デオ
キシヌクレオシド、たとえば三リン酸デオキシアデノシ
ン（ｄＡＴＰ）、三リン酸デオキシグアノシン（ｄＧＴ
Ｐ）、三リン酸デオキシシチジン（ｄＣＴＰ）および三
リン酸デオキシチミジン（ｄＴＴＰ）を包含させること
ができる。キットにはさらに、ポリデオキシヌクレオチ
ドポリメラーゼおよびシグナル生成系のメンバー、また
様々な緩衝メジウムを包含させることができ、それらの
一部には１種もしくは２種以上の試剤を含有させてもよ
い。
は、キットには、ポリデオキシヌクレオチドプライマー
を含有させる。上述のキットにはさらに、三リン酸デオ
キシヌクレオシド、たとえば三リン酸デオキシアデノシ
ン（ｄＡＴＰ）、三リン酸デオキシグアノシン（ｄＧＴ
Ｐ）、三リン酸デオキシシチジン（ｄＣＴＰ）および三
リン酸デオキシチミジン（ｄＴＴＰ）を包含させること
ができる。キットにはさらに、ポリデオキシヌクレオチ
ドポリメラーゼおよびシグナル生成系のメンバー、また
様々な緩衝メジウムを包含させることができ、それらの
一部には１種もしくは２種以上の試剤を含有させてもよ
い。
【０１２１】キット中における各種試剤の相対量は、本
方法の実施時に起こることが必要な反応を実質的に至適
化する試剤濃度を与えるように、さらにアッセイの感度
を実質的に至適化するように、広範囲に変動させること
ができる。適当な環境下では、キット中の１種または２
種以上の試剤を、乾燥粉末、通常は凍結乾燥して、賦形
剤とともに提供し、溶解すると、本発明による方法また
はアッセイの実施に適当な濃度の試剤溶液が得られるよ
うにすることもできる。各試剤を別個の容器に包装する
こともできるし、また交叉反応性や貯蔵寿命の問題がな
ければ、１つの容器に数種の試剤を混合することもでき
る。
方法の実施時に起こることが必要な反応を実質的に至適
化する試剤濃度を与えるように、さらにアッセイの感度
を実質的に至適化するように、広範囲に変動させること
ができる。適当な環境下では、キット中の１種または２
種以上の試剤を、乾燥粉末、通常は凍結乾燥して、賦形
剤とともに提供し、溶解すると、本発明による方法また
はアッセイの実施に適当な濃度の試剤溶液が得られるよ
うにすることもできる。各試剤を別個の容器に包装する
こともできるし、また交叉反応性や貯蔵寿命の問題がな
ければ、１つの容器に数種の試剤を混合することもでき
る。
【０１２２】例 本発明をさらに、以下の例示的な実施例によって明確に
する。他の指示がない限り、温度は摂氏（℃）、部は重
量パーセントである。
する。他の指示がない限り、温度は摂氏（℃）、部は重
量パーセントである。
【０１２３】例１ ステム−ループ分子の形成および増幅は、０．１ピコモ
ルの一本鎖Ｍ１３ｍｐ１９〔標的ＤＮＡ，Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢＲ
Ｌ）〕を使用し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．
３，５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０
１％ゼラチンおよび２００マイクロモルの三リン酸デオ
キシヌクレオシド（ｄＮＴＰｓ）を含有する１００μｌ
反応液中で実施した。１マイクロモルの単一プライマー
増幅（ＳＰＡ）プライマー２（ポリデオキシヌクレオチ
ドプライマー）および様々の量のエクステンダープロー
ブ１（１，０．５，０．１，０．０１および０．００１
マイクロモル）の存在下に、上記混合物を９５℃に５分
間加熱し、室温に１５分間冷却した。これにより、エク
ステンダープローブの標的ＤＮＡへのアニーリングが可
能になる。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を加え（５単位）、温度を以下のように循環させ
た：９０℃−３０秒、５５℃−６０秒、７２℃−９０
秒。この温度プロフィルを３０回反復させた。標的分子
の同部分（１３５塩基未満）を１．０マイクロモル濃度
のプライマー４を用いて同一条件下にＰＣＲで増幅し
た。直接比較が可能なように、プライマー３の濃度はエ
クステンダープローブの濃度と同じにした。ＳＰＡおよ
びＲＣＲにおける増幅生成物の期待されるサイズは、そ
れぞれ１０１５および８８０塩基対であった。ＳＰＡお
よびＰＣＲ両者の反応混合物から、０，１０，２０およ
び３０サイクル後にサンプル（５μｌ）を採取し、１％
アガロースゲル上電気泳動に付し、エチジウムブロミド
で染色した。分子量標準の泳動性に基き約１０１５塩基
の単一バンドが、各濃度のエクステンダープローブにお
いて、ＳＰＡ１０，２０および３０サイクル後に出現し
た。ＰＣＲ生成物の検査により、約８８０塩基対のバン
ドが明らかにされ、さらにサイクルを続けると付加的な
高分子量フラグメントが認められた。プライマー３の最
低濃度では、１０または２０サイクル後に、ＰＣＲ生成
物は検出されなかった（表１参照）。
ルの一本鎖Ｍ１３ｍｐ１９〔標的ＤＮＡ，Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢＲ
Ｌ）〕を使用し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．
３，５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０
１％ゼラチンおよび２００マイクロモルの三リン酸デオ
キシヌクレオシド（ｄＮＴＰｓ）を含有する１００μｌ
反応液中で実施した。１マイクロモルの単一プライマー
増幅（ＳＰＡ）プライマー２（ポリデオキシヌクレオチ
ドプライマー）および様々の量のエクステンダープロー
ブ１（１，０．５，０．１，０．０１および０．００１
マイクロモル）の存在下に、上記混合物を９５℃に５分
間加熱し、室温に１５分間冷却した。これにより、エク
ステンダープローブの標的ＤＮＡへのアニーリングが可
能になる。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を加え（５単位）、温度を以下のように循環させ
た：９０℃−３０秒、５５℃−６０秒、７２℃−９０
秒。この温度プロフィルを３０回反復させた。標的分子
の同部分（１３５塩基未満）を１．０マイクロモル濃度
のプライマー４を用いて同一条件下にＰＣＲで増幅し
た。直接比較が可能なように、プライマー３の濃度はエ
クステンダープローブの濃度と同じにした。ＳＰＡおよ
びＲＣＲにおける増幅生成物の期待されるサイズは、そ
れぞれ１０１５および８８０塩基対であった。ＳＰＡお
よびＰＣＲ両者の反応混合物から、０，１０，２０およ
び３０サイクル後にサンプル（５μｌ）を採取し、１％
アガロースゲル上電気泳動に付し、エチジウムブロミド
で染色した。分子量標準の泳動性に基き約１０１５塩基
の単一バンドが、各濃度のエクステンダープローブにお
いて、ＳＰＡ１０，２０および３０サイクル後に出現し
た。ＰＣＲ生成物の検査により、約８８０塩基対のバン
ドが明らかにされ、さらにサイクルを続けると付加的な
高分子量フラグメントが認められた。プライマー３の最
低濃度では、１０または２０サイクル後に、ＰＣＲ生成
物は検出されなかった（表１参照）。
【０１２４】標的濃度を反応液１００μｌあたり１０ア
トモルに低下させ、ＳＰＡおよびＰＣＲを用いて増幅を
行った。個々の反応成分、ならびに時間および温度の循
環パラメーターは前述の通りとした。０．１，０．０１
または０．００１マイクロモルのエクステンダープロー
ブ１またはＰＣＲプライマー３の存在下に、ＳＰＡプラ
イマー２およびＰＣＲプライマー４は１．０マイクロモ
ルに維持した。反応液を９５℃に５分間加熱し、室温に
３０分間冷却した。０，１５および３０サイクル後にサ
ンプル（５μｌ）を採取し、０．８％アガロースゲル上
で電気泳動を行い、上述のように染色した。約１０１５
塩基対の単一バンドが、各濃度のエクステンダープロー
ブにおいて、ＳＰＡの３０サイクル後に出現した。ＰＣ
Ｒ反応では約８８０塩基対のバンドは、プライマー３の
最高濃度（０．１マイクロモル）で３０サイクル後に出
現したのみであった。それより低いプライマー３の濃度
では、３０温度サンクル後にもＰＣＲ生成物は検出され
なかった（表２参照）。
トモルに低下させ、ＳＰＡおよびＰＣＲを用いて増幅を
行った。個々の反応成分、ならびに時間および温度の循
環パラメーターは前述の通りとした。０．１，０．０１
または０．００１マイクロモルのエクステンダープロー
ブ１またはＰＣＲプライマー３の存在下に、ＳＰＡプラ
イマー２およびＰＣＲプライマー４は１．０マイクロモ
ルに維持した。反応液を９５℃に５分間加熱し、室温に
３０分間冷却した。０，１５および３０サイクル後にサ
ンプル（５μｌ）を採取し、０．８％アガロースゲル上
で電気泳動を行い、上述のように染色した。約１０１５
塩基対の単一バンドが、各濃度のエクステンダープロー
ブにおいて、ＳＰＡの３０サイクル後に出現した。ＰＣ
Ｒ反応では約８８０塩基対のバンドは、プライマー３の
最高濃度（０．１マイクロモル）で３０サイクル後に出
現したのみであった。それより低いプライマー３の濃度
では、３０温度サンクル後にもＰＣＲ生成物は検出され
なかった（表２参照）。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】
【表３】 用いたＭ１３ｍｐ１９の模式図を図３に示す。図３にお
ける数字の説明は以下のとおりである。 １：エクステンダープローブ（５６ｂ）：３′の３１塩
基が標的ＤＮＡのｐｏｓ．１７０２〜１７３２にハイブ
リダイズする。５′の２５塩基は標的にハイブリダイズ
しない。 ５′−ＴＧＴＴＧＴＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴ
ＡＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＴＡＡ
ＡＧＴＴＴＴＧＴＣ−３′ ２：ＳＰＡプライマー（２５ｂ）：この配列は標的のｐ
ｏｓ．７４４〜７６８と同一である。それはエクステン
ダープローブの５′の２５塩基とも同じである。 ５′−ＴＧＴＴＧＴＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴ
ＡＴＴ−３′ ３：ＰＣＲプライマー（３１ｂ）：このプライマーはエ
クステンダープローブの３′の３１塩基と同一である。 ５′−ＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＴＡＡ
ＡＧＴＴＴＴＧＴＣ−３′ ４：ＰＣＲプライマー（２５ｂ）：この配列は標的のｐ
ｏｓ．８５２〜８７６と同一である。 ５′−ＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＧ
ＣＣＣ−３′
ける数字の説明は以下のとおりである。 １：エクステンダープローブ（５６ｂ）：３′の３１塩
基が標的ＤＮＡのｐｏｓ．１７０２〜１７３２にハイブ
リダイズする。５′の２５塩基は標的にハイブリダイズ
しない。 ５′−ＴＧＴＴＧＴＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴ
ＡＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＴＡＡ
ＡＧＴＴＴＴＧＴＣ−３′ ２：ＳＰＡプライマー（２５ｂ）：この配列は標的のｐ
ｏｓ．７４４〜７６８と同一である。それはエクステン
ダープローブの５′の２５塩基とも同じである。 ５′−ＴＧＴＴＧＴＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴ
ＡＴＴ−３′ ３：ＰＣＲプライマー（３１ｂ）：このプライマーはエ
クステンダープローブの３′の３１塩基と同一である。 ５′−ＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＴＡＡ
ＡＧＴＴＴＴＧＴＣ−３′ ４：ＰＣＲプライマー（２５ｂ）：この配列は標的のｐ
ｏｓ．８５２〜８７６と同一である。 ５′−ＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＧ
ＣＣＣ−３′
【０１２７】上述の説明には、本発明に関係のあるメカ
ニズとしてある種の理論が包含されている。しかしなが
ら、本発明は記載された結果を達成することが明らかに
されたものであって、これらの理論はいかなる意味にお
いても、本発明を限定するものではない。
ニズとしてある種の理論が包含されている。しかしなが
ら、本発明は記載された結果を達成することが明らかに
されたものであって、これらの理論はいかなる意味にお
いても、本発明を限定するものではない。
【０１２８】以上の説明および例により、本発明は、そ
の好ましい実施態様を含めて完全に開示されている。分
子生物学および関連科学における通常の技術者には自明
の、上述の方法の改変は、特許請求の範囲内に包含され
るものである。
の好ましい実施態様を含めて完全に開示されている。分
子生物学および関連科学における通常の技術者には自明
の、上述の方法の改変は、特許請求の範囲内に包含され
るものである。
図１は標的被検物質の検出方法を示す模式図である。図
２は本発明の方法の使用を示す模式図である。図３はＭ
１３ｍｐ１９を示す模式図である。
２は本発明の方法の使用を示す模式図である。図３はＭ
１３ｍｐ１９を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リンダ エム．ウエスターン アメリカ合衆国カリフオルニア州サン マ テオ，ナンバー303，ベイシヨアー ブー ルバード 240 (72)発明者 マーチン ベツカー アメリア合衆国カリフオルニア州パロ ア ルト，グリアー ロード 3481 (72)発明者 エドウイン エフ．ウルマン アメリカ合衆国カリフオルニア州アサート ン，セルビイ レーン 135
Claims (30)
- 【請求項１】 互いに連続しない、相補性の２個のセグ
メントを有する一本鎖ポリデオキシヌクレオチドを製造
する方法において、２個の連続しない、非相補性のヌク
レオチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ
１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長であるポ
リヌクレオチドと、２個のデオキシヌクレオチド配列か
らなるエクステンダープローブであり、このエクステン
ダープローブの３′末端における配列はＳ１とハイブリ
ダイゼーション可能で、他方のデオキシヌクレオチド配
列はＳ２と相同であるエクステンダープローブとを混合
する工程、ならびに上記エクステンダープローブを上記
ポリヌクレオチドに沿って延長させる工程からなる方法 - 【請求項２】 さらに、Ｓ２と相補性のヌクレオチド配
列とのハイブリダイゼーションが少なくとも３′末端に
おいて可能なポリデオキシヌクレオチドプライマーを、
（１）上述の延長されたエクステンダープローブが一本
鎖となり、（２）上記ポリデオキシヌクレオチドプライ
マーが上述の延長されたエクステンダープローブとハイ
ブリダイズし、それに沿って延長されて、延長されたプ
ライマーからなる二本鎖を形成し、（３）上述の延長さ
れたプライマーがこの二本鎖から解離し、（４）上記プ
ライマーがこの延長されたプライマーとハイブリダイズ
し、それに沿って延長され、延長されたプライマーから
なる二本鎖を形成する条件下に、混合する請求項１に記
載の方法 - 【請求項３】 工程（３）および（４）は反復される請
求項１または２に記載の方法 - 【請求項４】 エクステンダープローブの濃度はポリデ
オキシヌクレオチドプライマーの濃度よりも実質的に低
くする請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法 - 【請求項５】 エクステンダープローブの濃度はポリデ
オキシヌクレオチドプライマーの濃度の１％未満とする
請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法 - 【請求項６】 互いに連続しない、相補性の２個のセグ
メントを有する一本鎖ポリデオキシヌクレオチドの多重
コピーを製造する方法において、２個の連続しない、非
相補性のヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この
場合Ｓ２はＳ１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチ
ド長であるポリヌクレオチド；２個のデオキシヌクレオ
チド配列からなるエクステンダープローブであり、この
エクステンダープローブの３′末端における配列はＳ１
とハイブリダイゼーション可能で、他方の上記ヌクレオ
チド配列はＳ２と相同であり上記ポリヌクレオチドと相
補性ではないエクステンダープローブ；Ｓ２と相補性の
ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが少なく
とも３′末端において可能なポリデオキシヌクレオチド
プライマー；ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに三リン酸デ
オキシヌクレオシドを、（ａ）上記エクステンダープロ
ーブが上記ポリヌクレオチドに沿って延長して二本鎖を
形成し、（ｂ）この延長されたエクステンダープローブ
が二本鎖から解離し、（ｃ）上記ポリデオキシヌクレオ
チドプライマーがこの延長されたエクステンダープロー
ブとハイブリダイズし、それに沿って延長され、延長さ
れたプライマーからなる第二の二本鎖を形成し、（ｄ）
この延長されたプライマーが第二の二本鎖から解離し、
ついで（ｅ）上記プライマーが上記の延長されたプライ
マーとハイブリダイズし、それに沿って延長され、延長
されたプライマーからなる二本鎖を形成し、この工程
（ｄ）および（ｅ）が反復される条件下に、同時に、ま
たは全部もしくは一部を継続的に混合する工程からなる
請求項１に記載の方法 - 【請求項７】 工程（ｄ）と（ｅ）は少なくとも３回反
復される請求項６に記載の方法 - 【請求項８】 エクステンダープローブの少なくとも１
５デオキシヌクレオチド配列がＳ１とハイブリダイズす
る請求項６または７に記載の方法 - 【請求項９】 ポリデオキシヌクレオチドプライマーは
Ｓ２に相補性の配列とハイブリダイゼーション可能な少
なくとも１５デオキシヌクレオチド配列を含有する、請
求項６〜８のいずれか一つに記載の方法 - 【請求項１０】 ポリヌクレオチドはＤＮＡである請求
項６〜９のいずれか一つに記載の方法 - 【請求項１１】 ２個の連続しない、非相補性のヌクレ
オチド配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ２はＳ１
の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長である標的
ヌクレオチド配列の含有が疑われるメジウム中のその標
的ヌクレオチドの存在を検出するにあたり、（ａ）上記
メジウム；２個のデオキシヌクレオチド配列を有するエ
クステンダープローブであり、このエクステンダープロ
ーブの３′末端における配列はＳ１とハイブリダイゼー
ション可能で、他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２
と相同で上記標的ヌクレオチド配列と相補性ではないエ
クステンダープローブ；Ｓ２と相補性のヌクレオチド配
列とハイブリダイゼーション可能なポリデオキシヌクレ
オチドプライマー；ＤＮＡポリメラーゼ；および三リン
酸デオキシヌクレオシドを、（１）上記エクステンダー
プローブが上記ポリヌクレオチドに沿って延長して二本
鎖を形成し、（２）この延長されたエクステンダープロ
ーブが二本鎖から解離し、（３）上記プライマーがこの
延長されたエクステンダープローブとハイブリダイズ
し、それに沿って延長され、延長されたプライマーから
なる二本鎖を形成し、（４）この延長されたプライマー
がその二本鎖から解離し、ついで（５）上記プライマー
がこの延長されたプライマーとハイブリダイズし、それ
に沿って延長され、延長されたプライマーからなる二本
鎖を形成し、続いて工程（４）および（５）が反復され
る条件下に、同時に、または全部もしくは一部を継続的
に混合する工程、ならびに（ｂ）上記の延長されたプラ
イマーの存在を調べる工程からなる方法 - 【請求項１２】 Ｓ１およびＳ２はそれぞれ１０〜１０
０ヌクレオチドを含有する請求項１１に記載の方法 - 【請求項１３】 エクステンダープローブの濃度は１ｎ
Ｍ未満、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの濃度は
１００ｎＭより大とする請求項１１または１２に記載の
方法 - 【請求項１４】 ポリデオキシヌクレオチドプライマー
はレポーター分子で標識される請求項１１〜１３のいず
れか一つに記載の方法 - 【請求項１５】 ポリデオキシヌクレオチドプライマー
はＳ２に相補性の配列とハイブリダイズする配列以外の
ヌクレオチド配列を含有する請求項１１〜１４のいずれ
か一つに記載の方法 - 【請求項１６】 延長されたプライマーの存在は、Ｓ１
またはＳ２以外の標的ヌクレオチド配列の部分に相補性
のヌクレオチド配列に共有結合したレポーター分子を調
べることによって検出する請求項１５に記載の方法 - 【請求項１７】 ポリヌクレオチド被検物質の含有が疑
われるサンプル中のそのポリヌクレオチド被検物質の存
在を検出するにあたり、（ａ）ポリヌクレオチド被検物
質が存在すればそれから、２個の連続しない、非相補性
のヌクレオチド配列Ｓ１およひＳ２を有し、この場合Ｓ
２はＳ１の５′であり少なくとも１０ヌクレオチド長で
ある一本鎖標的ヌクレオチド配列が形成されるように上
記サンプルを含有するメジウムを処理し、（ｂ）このメ
ジウムを、２個のデオキシヌクレオチド配列を有するエ
クステンダープローブであり、このエクステンダープロ
ーブの３′末端における配列はＳ１とハイブリダイゼー
ション可能で、他方のデオキシヌクレオチド配列はＳ２
と相同であり上記標的配列とは相補性ではないエクステ
ンダープローブ；Ｓ２に相補性のヌクレオチド配列とハ
イブリダイゼーション可能なポリデオキシヌクレオチド
プライマー；三リン酸デオキシヌクレオシド；ならびに
ＤＮＡ鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチドポリメラー
ゼと、（１）エクステンダープローブが標的ヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズし、それに沿って延長して二本
鎖を形成し、（２）この延長されたエクステンダープロ
ーブが上記二本鎖から解離し、（３）上記プライマーが
この延長されたエクステンダープローブとハイブリダイ
ズし、それに沿って延長され、延長されたプライマーか
らなる二本鎖を形成し、（４）この延長されたプライマ
ーがその二本鎖から解離し、ついで（５）上記プライマ
ーがこの延長されたプライマーとハイブリダイズし、そ
れに沿って延長され、延長されたプライマーからなる二
本鎖を形成し、続いて工程（４）および（５）が反復さ
れる条件下に、混合し、この場合、工程（ａ）と（ｂ）
は同時に、または全部もしくは一部を継続的に実施し、
ついで（ｃ）上記の延長されたプライマーの存在を調べ
る工程からなる方法 - 【請求項１８】 工程（４）および（５）は３０回未満
反復される請求項１７に記載の方法 - 【請求項１９】 ポリヌクレオチド被検物質はＲＮＡで
あり、メジウムは逆転写酵素を含有する請求項１７また
は１８に記載の方法 - 【請求項２０】 三リン酸デオキシヌクレオシドはｄＡ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，およびｄＴＴＰである請求
項１７〜１９のいずれか一つに記載の方法 - 【請求項２１】 工程（４）および（５）は形成される
二本鎖の数が少なくとも１０００のファクターで増加す
るように反復される請求項１７〜２０のいずれか一つに
記載の方法 - 【請求項２２】 レポーター分子は、蛍光体、化学発光
体、プロモーター、補酵素、放射性物質、増幅可能なポ
リヌクレオチド配列、小有機分子、触媒および触媒をコ
ードするヌクレオチド配列からなる群より選ばれる請求
項１４に記載の方法 - 【請求項２３】 ポリデオキシヌクレオチドプライマー
はリガンドで標識されている請求項１７〜２２のいずれ
か一つに記載の方法 - 【請求項２４】 ポリデオキシヌクレオチドプライマー
はＳ２に相補性の配列とハイブリダイズする配列以外の
ヌクレオチド配列を含有する請求項１７〜２３のいずれ
か一つに記載の方法 - 【請求項２５】 ポリデオキシヌクレオチドプライマー
の上記ヌクレオチド配列は、その相補性配列にハイブリ
ダイズする場合、レセプターによって特異的に結合され
うる配列を含有する請求項２４に記載の方法 - 【請求項２６】 レセプターは、レプレッサー、アクテ
ィベーターおよびヌクレアーゼからなる群より選ばれる
請求項２５に記載の方法 - 【請求項２７】 ポリデオキシヌクレオチドプライマー
の上記ヌクレオチド配列は、その相補性配列にハイブリ
ダイズする場合、レセプターによって特異的に結合され
うる配列を含有し、延長されたプライマーはその延長さ
れたプライマーへのレセプターの結合によって検出され
る請求項２４に記載の方法 - 【請求項２８】 標的ヌクレオチド配列における第一の
配列にハイブリダイゼーション可能な配列を３′未満に
有し、標的ヌクレオチド配列の第二の配列と相同である
配列を有し、この場合、標的ヌクレオチド配列中、第二
の配列は第一の配列の５′であって両者は連続しないエ
クステンダープローブ、および上記第二の配列と相補性
の配列とハイブリダイゼーション可能なポリデオキシヌ
クレオチドプライマーを、包装して組合せてなるキット - 【請求項２９】 鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼからな
る請求項２８に記載のキット - 【請求項３０】 三リン酸デオキシヌクレオシドからな
る請求項２８または２９に記載のキット
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US555323 | 1990-07-19 | ||
| US07/555,323 US5595891A (en) | 1990-07-19 | 1990-07-19 | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584079A true JPH0584079A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=24216831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3269946A Pending JPH0584079A (ja) | 1990-07-19 | 1991-07-18 | 単一プライマー増幅に使用するポリヌクレオチドの製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5595891A (ja) |
| EP (1) | EP0469755B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0584079A (ja) |
| AT (1) | ATE143697T1 (ja) |
| CA (1) | CA2047342A1 (ja) |
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