JP2007513642A - 人工テンプレートおよび単一プライマー増幅におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本国際出願は、2003年12月15日に出願された米国出願第10/737,252号(これは、2001年9月19日に出願された米国仮出願第60/323,455号に対する優先権を主張する、2002年9月19日に出願された米国出願第10/251,085号の一部継続出願である)に対する優先権を主張する。上述の米国出願および米国仮出願の開示全体は、本明細書中に参考として援用される。
本開示は、標的核酸配列の増幅のために有用な人工テンプレート(engineered template)に関連する。さらに具体的には、その反対端に相補的な配列を含むように操作されたテンプレートが、ネステッド(nested)オリゴヌクレオチド伸長反応(NOER)によって提供される。上記人工テンプレートは、この人工テンプレート内の標的配列を増幅するための単一プライマー増幅(SPA)を可能にする。特に有用な実施形態において、上記人工テンプレート由来の標的配列は、発現ビヒクル中にクローニングされて、例えば、抗体ライブラリーのような、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーを提供する。
核酸増幅および増幅生成物の検出のための方法は、核酸配列の検出、同定、定量および配列分析を支援する。核酸増幅は、例えば、抗体のような、関連する遺伝子ライブラリーの構築において重要な工程である。これらのライブラリーは、特異的であり所望する活性を有する抗体に関して、スクリーニングされ得る。核酸分析は、病原体の検出および同定、規定の表現型を引き起こす遺伝子変化の検出、遺伝病(genetic disease)または疾患に対する感受性の診断、発達、疾患および規定の刺激の応答における遺伝子発現の評価、ならびに種々のゲノム計画のために重要である。核酸増幅方法の他の適用としては、稀な細胞の検出、病原体の検出、および悪性疾患における改変された遺伝子発現の検出などが挙げられる。核酸増幅はまた、(例えば、規定の核酸配列の存在の検出のような)定性分析、および(例えば、病原性配列の量の評価、ならびに遺伝子増殖または遺伝子欠失の判定、および正常細胞型から悪性細胞型への細胞形質転換の判定などにおいて有用な)規定の遺伝子配列の定量化のために有用である。核酸配列中の配列変化の検出は、変異遺伝子型の検出、遺伝子分析に関連することとして、薬物耐性を引き起こす変異の検出、薬理ゲノム科学などのために重要である。
核酸増幅の新しい方法が、ここ発明され、この方法は、以下の工程:
a)テンプレート核酸配列にプライマーをアニーリングする工程であって、このプライマーは、テンプレートにアニーリングする第1の部分および所定の配列の第2の部分を有する、工程;
b)上記プライマーの第1の部分が上記テンプレートにアニーリングする位置と上記テンプレートの末端との間のテンプレートの部分にアニーリングし、かつ相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは第1の末端および第2の末端を有し、ここで、その第1の末端は上記プライマーを組み込む、工程;
c)上記テンプレートから、工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程;
d)工程(b)において合成されたポリヌクレオチドの第2の末端に、ネステッドオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このネステッドオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの第2の末端にアニーリングする第1の部分およびプライマーの第2の部分と同一の所定の配列を有する第2の部分を有する工程;
e)工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、上記所定の配列に相補的なこのポリヌクレオチドの末端部分を提供する、工程;ならびに
f)所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する。
a)テンプレート核酸配列に、プライマーおよび境界(boundary)オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このプライマーは、上記テンプレートにアニーリングする第1の部分および所定の配列の第2の部分を有する、工程;
b)上記プライマーの第1の部分がテンプレートにアニーリングする位置と上記境界オリゴヌクレオチドがアニーリングするテンプレートの部分との間のテンプレートの部分にアニーリングし、そしてそれに相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは第1の末端および第2の末端を有し、ここで、この第1の末端はプライマーを組み込む、工程;
c)上記テンプレートから、工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程;
d)工程(b)において合成されたポリヌクレオチドの第2の末端に、ネステッドオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このネステッドオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの第2の末端にアニーリングする第1の部分および上記プライマーの第2の部分と同一の所定の配列を有する第2の部分を有する、工程;
e)工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、上記所定の配列に相補的であるポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程;ならびに
f)上記所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する。
本開示は、標的核酸配列を増幅する方法を提供する。特に有用な実施形態において、上記標的核酸配列は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子である。本開示はまた、どのように増幅生成物をクローニングし、かつ適切な発現系において発現させ得るかを記載する。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、例えば、抗体ライブラリーのような複雑なライブラリーを構築するための、関連する配列のファミリーを増幅するために使用される。
1)増幅されるべき配列を含む、天然核酸または合成核酸(例えば、DNAまたはcDNA)である出発物質
2)ネステッドオリゴヌクレオチド
から調製される。上記出発物質は、原テンプレート(original template)と見なされ得る。上記ネステッドオリゴヌクレオチドは、操作された核酸の鎖の作製の間に、原テンプレートのヌクレオチド配列を伸長するためのテンプレートとして使用される。この操作された核酸の鎖は、一連の操作によって原テンプレートから作製され、その結果その反対端に相補的な配列が存在する。これは、単一のプライマーのみを使用する増幅を可能にする相補的な配列である。
(IgM重鎖可変遺伝子のレパートリーの増幅)
(第1鎖cDNA合成および修飾)
SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、基本的にキットの指示書に従って、オリゴdTプライマーを用いて慣習的な第1鎖cDNAを生成するために、ヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを使用した。この第1鎖cDNA生成物を、QIAGENスピンカラム(QIAGEN、Valencia、CA提供のPCR Purification Kit)を通じて浄化した。制限エンドヌクレアーゼEcoRIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドを上記第1鎖cDNAに添加した。制限オリゴヌクレオチド(CMEcoRI)の配列は、5’TCC TGT GAG AAT TCC CCG TCG3’(配列番号1)であった。この反応を、第1鎖cDNAおよび0.1μMオリゴヌクレオチドを用いてセットアップした。試料を2分間95℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保った。適切な量の10×制限緩衝液H(Roche Diagnostics)を上記試料に添加し、そしてさらに37℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼEcoRI(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。この制限酵素を65℃で20分間加熱不活性化し、次いで試料を4℃まで冷却した。
プライマー「TMX24VH3a」(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)に加えて、EcoRIで消化された第1鎖cDNAを、第2鎖cDNA反応における原テンプレートとして使用した。上記プライマーは、所定のTMX24配列、XhoI制限酵素認識部位およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。「TMX24VH3a」の配列は、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG CTC GAG GAR GTG CAG CTG GTG GAG3’(配列番号2)であり、Rは、塩基Aおよび塩基Gの等モル混合物を意味する。上記試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間、56℃で10秒間、および68℃で1分間を介する反応を20回サイクルさせた。これは、第2鎖cDNAの線形増幅を可能にする。「TMX24CM0」と命名されたネステッドオリゴを、次いで0.08μMの最終濃度となるように氷上で添加した。「TMX24CM0」の配列は、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG ACT AGT AAT TCT CAC AGG AGA CGA GGG GGA3’(配列番号3)であった。これはその後のクローニング工程において使用されるSpeI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このネステッドオリゴの3’末端は、逆結合(3’−5’よりもむしろ3’−3’)アデノシンの取り込みにより伸長を防ぐように設計される。上記第2鎖cDNAを、94℃5秒間で加熱変性し、次いで68℃で10秒間および95℃で5秒間の4サイクルアニーリングおよび伸長させることによってネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて68℃で30秒間処理し、そして4℃にした。結果生じた第2鎖cDNA、すなわち人工テンプレートを、次いでQIAGENスピンカラム(QIAGEN、Valencia、CA提供のPCR Purification Kit)を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
Advantage2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびに5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG3’(配列番号4)の配列を有する単一のプライマー(TMX24)を使用して、上記人工テンプレートを増幅した。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を35回サイクルさせた。これ続いて、さらに68℃で3分間反応させ、そして4℃で保持した。
約450bpの増幅生成物をゲル精製し、次いでXhoIおよびSpeIで消化し、そしてpBluescript KS+(Stratagene)中にクローニングした。個々のクローンを取り出し、そしてそれらのDNA配列を決定した。分析した16クローンの全てがIgM重鎖であり、各々が種々の長さの異なるCDR3配列を有していた。この結果は、この方法によって抗体鎖の多様な集団が増幅されたことを示す(表1を参照のこと)。
VH生成物をベクター中にクローニングするために、ネイティブIgM CH1定常領域が再構成され得、CH1中のEcoRI以外の部位を、上記第1鎖cDNAエンドヌクレアーゼ消化のために利用した。当業者が理解するように、Taqポリメラーゼがこのプロトコールのために使用された場合、新規に合成されたDNA鎖の多くに末端のAが付加される。多様性を最大化させるために、その末端のAの存在をネステッドオリゴヌクレオチドの設計において考慮した。しかしながら、余剰なAの存在は、EcoRI認識部位の減少を招く。IgM定常領域の分析は、他のネイティブ制限酵素認識部位が、この方法のために潜在的に使用され得ることを明らかにした(例えば、DraIII)。CH1ドメイン中のDraIIIネイティブ制限酵素認識部位の使用の結果、上流EcoRI部位が未修飾のまま残存し、そして重鎖レパートリーのクローニングのために使用され得る。重鎖インサートは、XhoIおよびEcoRIによって、EcoRIからCH2ドメインに残存IgM CH1ドメインを有する適切なベクター中にクローニングされる。
オリゴdTプライマーを用いた慣習的な第1鎖cDNAを生成するために、ヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを使用した。これを、基本的にキットの指示書に従って、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用して行った。制限エンドヌクレアーゼDraIIIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドを第1鎖cDNAに添加した。この制限オリゴヌクレオチド(CMDraIII)の配列は、5’GAC GAA CAC GTG GTG TGC AAA G3’(配列番号21)であった。この反応を、第1鎖cDNAおよび1μMオリゴヌクレオチドを用いてセットアップした。試料を2分間95℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持した。適切な量の10×制限緩衝液H(Roche Diagnostics)を、上記試料中に添加し、そしてさらに37℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼDraIII(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。上記制限酵素を65℃で20分間加熱不活性化し、次いでこの試料を4℃まで冷却した。
第2鎖cDNA反応において、プライマー「TMX24VH1a」(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)に加えて、DraIIIで消化された第1鎖cDNAを原テンプレートとして使用した。上記プライマーは、所定のTMX24配列、XhoI制限酵素認識部位およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。「TMX24VH1a」の配列は、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG CTC GAG CAG GTK CAG CTG GTG CAG3’(配列番号22)であり、Kは、塩基Gおよび塩基Tの等モル混合物を意味する。上記試料を94℃で1分間加熱変性し、次いで94℃で5秒間、56℃で10秒間、および68℃で2分間を介する反応を20回サイクルさせた。これは、第2鎖cDNAの線形増幅を可能にする。「TMX24CMnpt」と命名されたネステッドオリゴを、次いで0.2μMの最終濃度となるように氷上で添加した。図7において示されるように、「TMX24CMnpt」(配列番号23)の配列は、オリゴヌクレオチドの伸長を防ぐように設計された、修飾された構造を有する3つの3’末端ヌクレオチドを含む。具体的には、上記ネステッドオリゴは、ホスホチオ酸塩(phosphorthioate)および伸長を防ぎかつエキソヌクレアーゼ活性ならびにエンドヌクレアーゼ活性に対して保護するために設計された2’OMeで修飾された、3つの末端ヌクレオチドを有する。このオリゴの3’末端オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしない(cの代わりにg)。上記第2鎖cDNAを、94℃1分間で加熱変性し、次いで68℃で2分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて4℃にした。結果生じた第2鎖cDNA、または人工テンプレートを、次いでQIAGENスピンカラム(QIAGEN、Valencia、CA提供のPCR Purification Kit)を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。この手順を繰り返し、そして、適切なベクターにクローニングされ得る免疫グロブリン生成物のライブラリーを生成するために、VHプライマーパネル(primer panel)(プライマーリストを参照のこと)の残りの部分を伸長した。
上記人工テンプレートを、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTPならびに5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG3’(配列番号4)の配列を有する単一のプライマー(TMX24)を使用して増幅した。その試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30回サイクルさせた。これに続いてさらに68℃で3分間処理し、そして4℃で保持した。
約450bpの増幅生成物をゲル精製し、そしてXhoIおよびEcoRIによって消化する。ネイティブEcoRI由来のIgM CH1ドメインの残余部分を含み、CH2ドメインまでかまたはを含んで増幅されたフラグメントをクローニングするために適性のある制限酵素認識部位を含む任意の適切な発現ベクター中に、このインサートをクローニングする。
(B型肝炎陽性ドナー由来のファージミドディスプレイライブラリー(phagmid display library)の構築)
(IgG重鎖およびκ軽鎖についての第1鎖cDNAの合成および修飾)
オリゴdTプライマーを用いた慣習的な第1鎖cDNAを生成するために、B型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを使用した。これは、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。IgGについては制限エンドヌクレアーゼApaLIによって、またはκ軽鎖についてはSacIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、IgGについては制限オリゴヌクレオチド「CGApaLI」を、またはκ軽鎖については制限オリゴヌクレオチド「CKSacI」を第1鎖cDNAに添加した。「CGApaLI」配列は、5’CCA GCG GCG TGC ACA CCT TCC3’(配列番号39)である。「CKSacI」配列は、5’AGG GCC TGA GCT CGC CCG TC3’(配列番号40)である。この反応を、第1鎖cDNA、1μMオリゴヌクレオチド、および適切な量の10×反応緩衝液A(Roche Diagnostics)を用いてセットアップした。この試料を95℃まで2分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持し、そして37℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼApaLIまたはSacI(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。この制限酵素を、SacIに関して65℃で20分間加熱不活性化し、次いで試料を4℃まで冷却した。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用した複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、SacI消化された第1鎖cDNAを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、κについて所定のTMX24K配列5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG3’(配列番号47)、XbaI制限酵素認識部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク1領域中の第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、VBaseデータベースプライマー(www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html)由来であり、これらは、公知のヒト抗体の配列に基づいて設計され、そしてκ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにκ鎖についてのプライマー「TMX24K」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「TMX24K」についての配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG3’(配列番号62)である。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30サイクルさせた。これに続いてさらに68℃で3分間処理し、そして4℃で保持した。
κ増幅生成物をゲル精製し、次いでXbaIおよびSacIによって消化した。そのインサートを、κ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーDNAを回収するためにDNAマキシプレップ(QIAGEN、Valencia、CA)を実施した。次いで、ライブラリーの構築を完了させるために、XhoI/AgeIによる重鎖Fdフラグメントのクローニングのための続く工程において、この軽鎖ライブラリーDNAを使用した。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、ApaLI消化された第1鎖cDNAを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、所定のTMX24配列、XhoI制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、VBaseデータベースプライマー由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして重鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、およびプライマー「TMX24」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30サイクルさせた。これに続いて68℃でさらに3分間処理し、そして4℃で保持した。
この増幅された生成物をプールし、次いでゲル精製した。QIAquick PCR purification kit(QIAGEN、Valencia、CA)を用いて、DNAを回収した。このDNAを、XhoI制限酵素およびAgeI制限酵素で順次消化し、次いでゲル精製した。AgeI部位は、ApaLI部位の上流のIgG定常領域のCH1中に、天然に存在する。DNAを、QIAquick Gel extraction Kit(QIAGEN、Valencia、CA)で回収した。
基本的に、Barbas III,CF、Burton,DR、Scott,JK、およびSilverman,GJ(2001)Phage Display:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yorkに記載されるように、上記ライブラリーを、固定化HBs Agについて4ラウンドパンニングした。パンニングの第2ラウンド、第3ラウンド、および第4ラウンド由来である個々のクローンを、HBs AgについてのELISAによってスクリーニングした。
オリゴdTプライマーを用いた慣習的な第1鎖cDNAを生成するために、B型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒトPBL mRNAを使用した。これを、SuperScript First−Strand Synthesis for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。制限エンドヌクレアーゼSmaIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、上記第1鎖cDNAに制限オリゴヌクレオチド「CLSmaI」を添加した。「CLSmaI」配列は、5’GAC TTC TAC CCG GGA GCY GTG3’(配列番号78)であって、ここで、YはCおよびTの混合物である。この反応を、第1鎖cDNA、1μMオリゴヌクレオチド、および適切な量の10×反応緩衝液A(Roche Diagnostics)を用いてセットアップした。この試料を95℃まで2分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持し、そして37℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼSmaI(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。この制限酵素を65℃で加熱不活性化し、次いでその試料を4℃まで冷却した。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、SmaI消化された第1鎖cDNAを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、所定のTMX24L配列、XbaI部位、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク領域中の第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、VBaseデータベースプライマー(www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html)由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そしてλ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。λ軽鎖フレームワーク1特異的プライマーは、実施例4におけるものを使用する。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにプライマー「TMX24L」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「TMX24L」についての所定の配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG3’(配列番号82)である。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30サイクルさせた。これに続いてさらに68℃で3分間処理し、そして4℃で保持した。
λ軽鎖増幅生成物を、PCR purification kit(QIAGEN、Valencia、CA)によって浄化し、そしてXbaIおよびSacIによって消化した。そのインサートを、gel extraction kit(QIAGEN、Valencia、CA)を使用してゲル精製し、そしてλ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩成長させた。翌朝、λ軽鎖ライブラリーDNAを回収するためにDNAマキシプレップ(QIAGEN、Valencia、CA)を実施した。
上記で調製したλ軽鎖ライブラリーDNAを、前述されるように、IgGκライブラリーに対して調製した重鎖Fdフラグメントの挿入のために、XhoIおよびAgeIで順次消化した。次いで、ライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩成長させた。翌朝、完全なIgGλライブラリーDNAを回収するために、DNAマキシプレップ(QIAGEN、Valencia、CA)を実施した。
IgGκライブラリーについて前述されたように、パンニングおよびスクリーニングを実施した。
ELISAスクリーニングによって、HBsAgに対して特異的結合を示し、かつ非特異的タンパク質(オボアルブミン)に対して最低限の結合を示したクローンを、DNA配列決定によって分析した。図8a〜図8eを参照のこと。HBsAgに対して、全部で38の異なるIgGκFab(25重鎖および37軽鎖)および17の異なるIgGλFab(13重鎖および16軽鎖)を、B型肝炎ワクチン接種を受けたドナー由来のPBL mRNAから作製したライブラリーから単離した。
(ヒトPBL mRNAからのファージディスプレイライブラリーの構築)
(軽鎖についての第1鎖cDNA合成および修飾)
ドナーからのヒトPBL mRNAを、オリゴdTプライマーを用いて、基本的にキットの指示書に従って、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、慣習的な第1鎖cDNAを生成するために使用した。κ軽鎖反応およびλ軽鎖反応を、別々にセットアップする。κ軽鎖については制限ヌクレアーゼSacIによって、またはλ軽鎖についてはSmaIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、第1鎖cDNAに制限オリゴヌクレオチド「CKSacI」または「CLSmaI」を添加する。複数のλ定常領域(C1、C2、C3、およびC6)がある場合、全ての機能的λ定常ドメイン(C1、C2、C3、およびC6)の中で、SmaI部位が保存されていることに注意することが重要である。「CKSacI」配列は、5’AGG GCC TGA GCT CGC CCG TC3’(配列番号179)であり、「CLSmaI」配列は5’GAC TTC TAC CCG GGA GCY GTG3’(配列番号180)であって、ここで、YはCおよびTの混合物である。この反応を、第1鎖cDNAおよび1μMオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。この試料を95℃まで2分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持する。適切な量の10×制限緩衝液A(Roche Diagnostics)を上記試料に添加し、そして37℃までさらに冷却する。制限エンドヌクレアーゼSacIまたはSmaI(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。この制限酵素を、65℃で20分間加熱不活性化し、次いでこの試料を4℃まで冷却する。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、SacI消化されたκ第1鎖cDNAまたはSmaI消化されたλ第1鎖cDNAを、原テンプレートとして使用する。上記プライマーを、TMX24K(κについて)配列またはTMX24L(λについて)配列、XbaI制限酵素認識部位、およびヒト抗体κ鎖遺伝子またはヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク1領域中の第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列は、VBaseデータベースプライマー(www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html)由来であり、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。κ軽鎖フレームワーク1特異的プライマーは、実施例3におけるものを使用する。λ増幅における使用のためのプライマーのリストは、以下を参照のこと。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにκ鎖についてプライマー「TMX24K」を、またはλ鎖について「TMX24L」を使用し、上記人工テンプレートを増幅する。「TMX24K」の配列は5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG 3’(配列番号198)であり、そして「TMX24L」の配列は5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG3’(配列番号199)である。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30サイクル行う。これに続いてさらに68℃で3分間処理し、そして4℃で保持する。
κ増幅生成物およびλ増幅生成物を、PCR purification kit(QUIAGEN)を使用して浄化し、そして別々にゲル精製した。これらの生成物を、XbaIおよびSacIによって消化した。そのインサートを、それぞれの軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーDNAを回収するために、DNAマキシプレップを実施した。ライブラリーの構築を完了させるために、この軽鎖ライブラリーDNA調製物を、XhoI/EcoRIによる重鎖Fdフラグメントの挿入のためのクローニングベクターとして使用した。
オリゴdTプライマーを用いた慣習的な第1鎖cDNAを生成するために、ヒトPBL mRNAを使用する。これを、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、基本的にキットの指示書に従って行う。制限エンドヌクレアーゼDraIIIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドCMDraIIIを、第1鎖cDNAに添加する。この反応を、第1鎖cDNAおよび1μMオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。試料を2分間95℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持する。適切な量の10×制限緩衝液H(Roche Diagnostics)を上記試料中に添加し、そしてさらに37℃まで冷却する。制限エンドヌクレアーゼDraIII(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートし、次いで4℃まで冷却する。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、DraIII消化された第1鎖cDNAを、原テンプレートとして使用する。上記プライマーを、TMX24配列、XbaI制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列は、VBaseデータベースプライマー由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして実施例3において上述されるように、重鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。重鎖フレームワーク1特異的プライマーは、実施例3において列挙されたものを使用する。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにプライマー「TMX24」を使用し、上記人工テンプレートを増幅する。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30サイクル行う。これに続いてさらに68℃で3分間処理し、そして4℃で保持する。
約500bpの増幅生成物をゲル精製し、次いでXhoIおよびEcoRIによって消化する。IgM CH1ドメインの残余部分を含む適切な発現ベクター中に、インサートをクローニングする。ライゲーションされたFabライブラリーを含む生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入する。
(IgEまたは組み換えIgE Fc CH2〜4で免疫されたマウスmRNA由来のファージミドディスプレイライブラリーの構築)
(IgG重鎖およびκ軽鎖についての第1鎖cDNA合成および修飾)
オリゴdTプライマーを用いた慣習的第1鎖cDNAを生成するために、ヒトIgEまたは組み換えヒトIgEで免疫されたマウス由来であるマウス脾臓mRNAを使用した。これを、SuperScript First−Strand Synthesis for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。IgG1については制限エンドヌクレアーゼXcmI、IgG2aについては制限エンドヌクレアーゼBsaJI、またはκ軽鎖についてはHpaIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、IgG1については制限オリゴヌクレオチド「mCG1XcmI」、IgG2aについては制限オリゴヌクレオチド「mCG2aBsaJI」、またはκ軽鎖については制限オリゴヌクレオチド「mCKHpaI」を、第1鎖cDNAに添加した。「mCG1XcmI」配列は、5’CTAACTCCATGGTGACCCTGGGATG3’(配列番号200)である。「mCG2aBsaJI」配列は、5’CAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAG3’(配列番号201)であり、「mCKHpaI」配列は、5’CAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGG3’(配列番号202)である。この反応を、第1鎖cDNA、1μMオリゴヌクレオチド、および適切な量の10×NE緩衝液(New England Biolabs、Beverly MA)または10×反応緩衝液A(Roche Diagnostics)を用いてセットアップした。この試料を95℃まで2分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持し、そしてXcmIおよびHpaIについては37℃まで冷却し、またBsaJIについては60℃まで冷却した。上記制限エンドヌクレアーゼXcmI、制限エンドヌクレアーゼBsaJI、または制限エンドヌクレアーゼHpaI(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、それぞれ、37℃で30分間、60℃で30分間、および37℃で10分間インキュベートした。上記制限酵素を、XcmIについては65℃で20分間、およびBsaJIについては80℃で20分間加熱不活性化し、次いで試料を4℃まで冷却した。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、HpaI消化された第1鎖cDNAを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、TMX24mK配列(κについて)、およびXbaI制限酵素認識部位、ならびにマウス抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。そしてκ軽鎖遺伝子の全マウス抗体レパートリーを網羅するために、Kabatデータベース(http://immuno.bme.nwu.edu/)由来の公知のマウス抗体の配列に基づいて、これらのアニーリング配列を設計した。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにκ鎖についてのプライマー「TMX24mK」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「TMX24mK」についての配列は、5’GACGACCGGCTACCAAGAGGAGTG3’(配列番号221)である。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を25サイクルさせた。これに続いてさらに68℃で3分間処理し、そして4℃で保持した。
κ増幅生成物をゲル精製し、次いでXbaIおよびBspEIによって消化した。そのインサートを、κ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーDNAを回収するためにDNAマキシプレップを実施した。次いで、以下の「(重鎖クローニング)」において記載されるようにライブラリーの構築を完了させるため、XhoI/BlnIによる重鎖Fdフラグメントをクローニングするための後の工程において、この軽鎖ライブラリーDNAを使用した。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、XcmIおよびBsaJIで消化された第1鎖cDNAを使用した。上記プライマーを、TMX24mH配列、XhoI制限酵素認識部位、およびマウス抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。そして重鎖遺伝子の全マウス抗体レパートリーを網羅するために、Kabatデータベース(http://immuno.bme.nwu.edu/)由来の公知のマウス抗体の配列に基づいて、これらのアニーリング配列を設計した。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびに重鎖についてのプライマー「TMX24mH」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「TMX24mH」についての配列は、5’GACGTGGCCGTTGGAAGAGGAGTG3’(配列番号232)である。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を、IgG1については28サイクル、IgG2aについては30サイクルさせた。これに続いて68℃でさらに3分間処理し、そして4℃で保持した。
重鎖増幅生成物をゲル精製し、次いでXhoIおよびBlnIによって消化した。そのインサートを、IgG1およびIgG2aについての重鎖定常領域の残余部分を含むκ鎖ライブラリーDNA中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩成長させた。翌朝、IgG1κライブラリーDNAまたはIgG2aκライブラリーDNAを回収するために、DNAマキシプレップを実施した。
基本的に、Barbas III,CF、Burton,DR、Scott,JK、およびSilverman,GJ(2001)Phage Display:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yorkに記載されるように、上記ライブラリーを、組み換えIgE Fc CH2〜4について4ラウンドパンニングした。選別の第2ラウンド、第3ラウンド、および第4ラウンド由来の個々のクローンを、組み換えIgE Fc CH2〜4についてのELISAによってスクリーニングした。
(IgA抗体ライブラリーの構築)
(第1鎖cDNA合成および修飾)
ヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを、オリゴdTプライマーを用いた慣習的な第1鎖cDNAを生成するために使用する。これを、SuperScript II RTcDNA Synthesis Kit(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用し、基本的にその指示書に従って行う。制限エンドヌクレアーゼBsrGIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、第1鎖cDNAに制限オリゴヌクレオチド「CABsrGI」を添加する。「CABsrGI」の配列は、5’TCC GGG GAC CTG TAC ACC ACG AGC AG3’(配列番号279)である。この反応を、第1鎖cDNAおよび0.1μMオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。試料を95℃まで2分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように64℃で2分間保持する。適切な量の10×制限緩衝液2(New England Biolabs、Beverly MA)を上記試料中に添加し、そしてさらに37℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼBsrGI(New England Biolabs、Beverly MA)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。この制限酵素を80℃で20分間加熱不活性化し、次いで試料を4℃まで冷却する。
フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して複数の第2鎖cDNA反応をセットアップするために、BsrGI消化された第1鎖cDNAを使用する。以下の表A中に列挙されるプライマーは、TMX24配列、XhoI制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域における第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計された。これらのアニーリング配列は、公知のヒト抗体の配列に基づいて設計され、そして重鎖鎖遺伝子の全長ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されているVbaseデータベースプライマー由来である。
Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech、Palo Alto、CA)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにプライマー「TMX24」を使用し、上記第2鎖cDNAの増幅を実施する。「TMX24」の配列は、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG3’(配列番号295)である。この試料を95℃で1分間加熱変性し、次いで95℃で5秒間および68℃で1分間を介する反応を30サイクルさせる。これに続いて68℃でさらに3分間処理し、そして4℃で保持する。
約560bpのPCR生成物を、PCR purification kit (QIAGEN、Valencia、CA)を使用して精製し、XhoIおよびBsrGIによって消化し、ゲル精製し、そしてIgA CH1定常領域の残余部を有する適切なFab発現ベクター中にクローニングする。
Claims (11)
- 抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法であって、以下の工程:
a)抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートにプライマーをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第1の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第2の部分を有する、工程;
b)該プライマーの該第1の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第1の末端において該プライマーを有し、かつ第2の末端を有する、工程;
c)該テンプレートから、工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程;
d)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドの該第2の末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第2の末端にアニーリングする第1の部分および該プライマーの該第2の部分と同一の所定の配列を有する第2の部分を有する、工程;
e)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程;および
f)該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする前記工程が、IgA抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする工程を包含する、方法。
- 抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法であって、以下の工程:
a)抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートに、プライマーおよび境界オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第1の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第2の部分を有する、工程;
b)該プライマーの該第1の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該境界オリゴヌクレオチドがアニーリングする該テンプレートの部分との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第1の末端において該プライマーを有し、かつ第2の末端を有する、工程;
c)該テンプレートから、工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程;
d)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドの該第2の末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第2の末端にアニーリングする第1の部分および該プライマーの該第2の部分と同一の所定の配列を有する第2の部分を有する工程;
e)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的である該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する、工程;
f)該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程
を包含する、方法。 - 請求項4に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする前記工程が、IgA抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする工程を包含する、方法。
- 抗体ライブラリーを作製する方法であって、以下の工程:
a)IgA抗体の少なくとも一部分をコードする、多種多様なテンプレートの集団を提供する工程;
b)該多種多様なテンプレートの集団と少なくとも1つのプライマーとを接触させる工程であって、該少なくとも1つのプライマーは、該テンプレートにアニーリングする第1の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第2の部分を有する、工程;
c)該プライマーの該第1の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的である、ポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第1の末端において該プライマーを有し、かつ第2の末端を有する、工程;
d)該テンプレートから、工程(c)において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程;
e)工程(c)において合成された該ポリヌクレオチドの該第2の末端に、少なくとも1つのテンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該少なくとも1つのテンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第2の末端にアニーリングする第1の部分および該プライマー該第2の部分と同一の所定の配列を有する第2の部分を有する、工程;
f)工程(c)において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的である該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程;および
g)該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する、方法。 - 請求項7に記載の方法に従って調製された、IgA抗体のライブラリー。
- 所望の結合特異性を有する抗体を同定する方法であって、以下の工程:
請求項7に記載の方法に従ってIgA抗体のライブラリーを調製する工程;および
該ライブラリーをスクリーニングして、所望の結合特異性を有する1つ以上のIgA抗体を同定する工程
を包含する、方法。 - 請求項10に記載の方法に従って同定した、IgA抗体。
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