CN101103110B - 诱变方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于引导突变进入分子的诱变方法，特别地涉及可以运用于分子群以产生或筛选涉及多个分子突变的文库的方法。
Description
本发明涉及产生诱变的核酸分子的方法。特别地，本发明涉及这样的方法中，在该方法中，诱变反应中使用的引物(诱变引物)本身是从模板核酸分子合成的。诱变反应的产物是诱变的环状核酸分子，其能例如在不需要其它修饰的情况下，被转化进入细菌。在优选的实施方式中，本方法被运用于分子群，例如用于分子群的产生和筛选中。本方法也以组合方式被使用，在其中，多种诱变引物用于突变多种亲代分子。
涉及分子生物学技术的其中一个步骤是引导核酸分子进入载体。例如，DNA片段或DNA片段群可以被消化，并通过连接反应被引入载体。例如，DNA片段(或片段群)可从第一个载体(例如，质粒)消化并除去，利用已知的亚克隆方法进入第二个载体。这样，第一载体使用和第二载体相同的限制性内切酶进行消化，以致生成用于连接的互补的突出端。然后，DNA片段和第二载体依靠其互补的突出端进行连接，结果得到包含所述DNA片段的完整的载体，其能在宿主细胞中(例如，在细菌中)复制。
因此，可以产生大量的DNA以用于多种分子生物学应用。或者，已引入DNA的载体可具有特定的目的(例如可以是表达载体)。一旦被引入这样的表达载体，限制性片段编码的蛋白质可从宿主细胞中的载体表达。一旦表达，所产生的蛋白能被纯化以用于其最终用途。或者具体地，当本方法用来将DNA片段群引入表达载体时，表达的蛋白可用于筛选(例如，通过对靶分子的结合亲和力)。
引导突变进入DNA的多种方法也是已知的。从Barik的研究中已知，用基于PCR的方法引导突变进入线性DNA(Barik，MethodsinMolecular Biology Vol.192：PCR Cloning Protocols，2nd edition p189-196，EdsB-YChen andH.WJanesHumana Press Inc，Totowa，NJ；Burke and Barik，Methods in Molecular Biology Vo.226：PCR Protocols，2nd Edition p 525-531，Eds JMS Bartless and D StirlingHumana Press Inc，Totowa，NJ)。依照这些方法，在PCR反应中所谓的大引物(megaprimer)已被用于引导突变进入线性模板。然而，这些方法导致线性双链DNA产物，为了产生用于例如放大(scale up)或者用于蛋白质表达的复制型，这些产物本身必需被亚克隆入适当的载体。
Miyazaki提出了一种涉及全质粒PCR的方法(Miyazaki，Methods inMolecular Biology：Directed Evolution Library Creation：Methods and Protocols.EdsArnold and Georgiou，Humana Press Inc.Totowa，NJ；BioTechniques 33：1033-1038)。在这种方法中，双链质粒在PCR反应中被用作模板，并将包含将被引入的突变的双链PCR产物加入到该PCR反应用于引发PCR反应。然而，引物和模板的双链性能引起引物链和模板链自退火而不是交叉退火，因此使用特定的引物与模板比率以使自退火现象最小化。
除了由双链模板导致的自退火的问题以外，当双链模板用于PCR反应时，还有进一步的问题。在指数反应中，当在一轮中引入的错配在指数基础上被携带入随后的每一轮中时，引入错配的容量是巨大的。而且，这里PCR模板是大模板例如载体，诸如质粒，这进一步增加了引入错配的可能性。
使用合成的寡核苷酸去突变DNA也是已知的(Kunkel et al.，(1985)PNAS USA，Vol 82，pp 488-492；Sidhu et al.，Phage Display for the Selection of NovelBinding Peptides)。但是，能被化学合成的寡核苷酸的长度是有限制的。另外，为了使合成仪程序化，序列必须是已知的并且预先输入到合成仪中以用于其产生。
因此需要可选的诱变方法。特别地，需要产生能直接被转化入细菌的产物的方法，准备用于下游，例如用于表达筛选中(避免需要另外的消化和连接步骤来将核酸引入恰当的载体)。也需要快速、有效的诱变方法以及可经改良用于扩增的方法，例如用于产生筛选或产生文库的群。
在一方面，本发明提供了引导一个或多个突变进入核酸分子的方法，所述方法包括：将单链形式的诱变引物与亲代分子退火，所述诱变引物从模板核酸分子合成并且包含相对于所述亲代分子的一个或多个的突变；从所述的诱变引物合成互补的链，以生成包含所述突变的环形核酸分子。
在一方面，本发明提供了引导一个或多个突变进入核酸分子的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)从模板核酸分子合成诱变引物，其中所述的诱变引物包括一个或多个相对于亲代分子的突变；
(b)分离所述诱变引物的单链形式；
(c)将所述单链诱变引物与所述亲代分子的单链形式退火；以及
(d)从所述的诱变引物合成互补的链，以产生包含所述突变的环形核酸分子。
因此，使用适当的酶和在本技术领域中已知的方法，从模板核酸分子合成诱变引物。优选地，使用基于聚合酶链式反应(PCR)的方法，合成所述诱变引物。
模板分子和亲代分子可以是相同的或者包含相同的序列，其形成诱变引物合成的基础。因此，在一些实施方式中，用于诱变引物合成的模板序列与在亲代分子中发现的序列是相同的。在这些实施方式中，在诱变引物从模板分子的合成过程中，突变依靠错配的引入而被引入，例如利用易错聚合酶进行。因此，在一些实施方式中，诱变引物通过这样的合成方法来合成，在该方法中，当由第一条链合成第二条链时，错配被引入，优选地，通过易错PCR进行(适当的方法对本领域的技术人员是已知的，例如Molecular Cloning：aLaboratory Manual：2ndedition，Sambrook et al.，1989 Cold Spring Harbour Laboratory Press)。在本领域，多种试剂盒可用于施行易错PCR，例如Diversify(BDBilsciences 63070)。在另一个方法中，模板分子可被转化进入大肠杆菌菌株(在本领域中恰当的菌株是可获得的，例如XL1-RED(Stratagene))，这样将错配引入DNA序列。当从模板产生诱变引物时，用于将错配引入诱变引物的其它方法对本领域的技术人员是熟知的。
模板和亲代分子可以是不同的分子，即可包含在亲代分子和模板分子各自序列之间具有差别的区域。因此，当诱变引物从模板合成时，其与亲代分子相比较包含突变(在这种情况下，引入错配的反应例如易错PCR，是不需要的)。
本领域的技术人员知道用于从模板合成诱变引物的适当的反应物和反应条件(见，例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2ndedition，Sambrook etal.，1989 Cold Spring Harbour Laboratory Press)。当使用聚合酶链反应合成诱变引物时，本领域的技术人员可依据使用的模板选择适当的引物。在本文中，用于产生诱变引物的引物被称为初始引物。这些初始引物包括正向和反向的引物，其通常基于将被扩增的序列的末端，即在将是诱变引物的序列的末端。初始引物通常是使用寡核苷酸合成仪通过标准的方法产生的合成的寡核苷酸。这些初始引物可以是任何适当的长度，例如大约15到100核苷酸长度、诸如大约15到75个核苷酸长度、大约15到50个核苷酸长度和通常地18到25个核苷酸长度。技术人员依靠例如模板分子的序列、所形成的诱变引物的大小和/或方法的运用，可选择或设计适当的初始引物。
本发明的进一步的优点源于下述事实，即诱变引物是从模板核酸分子合成的，以致诱变引物的序列可不为使用者所知。例如，当使用针对模板的已知部分的初始引物通过PCR产生诱变引物时，被这些初始引物扩增的区域可能是未知的。因此，在一些实施方式中，诱变引物的序列在所述退火之前是未知的。当本发明的方法运用到文库(下面进一步讨论)时，其有特定的应用，但是并不仅限于应用到文库。当在亚克隆中的具体序列是未知的，但是包含它的载体的边界是已知的时，还有很多其它的应用(一个实例是“鸟枪法”克隆)。技术人员能基于他的亲代分子的知识选择适当的初始引物。
因此，在步骤(b)中限定的分子是单链诱变引物，其已与它的互补链分开，对于单链诱变引物，术语分开的(separated)和分离的(isolated)可互换使用。优选地，单链诱变引物与它的互补链的这种分开或分离使用下面描述的分离介质(例如珠子或分离柱)进行分离。用这种方式，当被合成时，结合部分可被引入诱变引物的其中一条链，因此允许诱变引物中的一条链与另一条分离，例如，在下面描述的捕获步骤中。
优选地，在步骤(b)中限定的单链引物通过使用分离介质进行分离。例如，合成诱变引物的步骤可将结合部分(bonding moiety)引入诱变引物的正链或负链，随后，引入其正链和负链的诱变引物的分离，可通过所述结合部分与分离介质上的其配偶体的结合而施行。分离介质可是任何适当的固体相介质，例如珠子或柱子(例如连接有结合配偶体的珠子或柱子)。
更具体而言，结合部分可被引导进入诱变引物的正链(例如，通过在整合结合部分的诱变反应中使用初始的正向引物)，然后在正链形式结合到分离介质后，诱变引物的负链被洗脱。优选地，结合部分是生物素，所述的结合配偶体是链霉亲和素。其它适当的结合部分和结合配偶体对本领域技术人员是熟知的，其包括荧光素和地高辛，以及抗体(包括片段和衍生物)和抗原。
技术人员完全知道能被使用的其它结合部分和结合配偶体。例如，除链亲和素以外，与生物素结合的其它结合配偶体是可获得的，例如抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。技术人员能选择适当的结合部分和结合配偶体，以用于涉及链分离的捕获步骤。另外，生物素和/或链亲和素的类似物也可被使用(参见，例如J Mol Biol(1994)Sep 30：242(4)：559-65)。生物素和链亲和素是最优选的。
例如，用与在上述生物素实例中描述的方式相似的方式，特定的抗原部分在合成过程中可以被引入诱变引物的其中一条链中。然后，使用包含针对抗原的抗体的柱子，一条链可与另一条链分离。
另一种方法是使用包含结合到特定DNA序列的蛋白质的分离系统。例如，在本领域中已知，HaeIII甲基化酶与特定的5’DNA序列结合，与特定的DNA序列结合的另一个蛋白质例子是P2A。对于这种方法的论述，可见Bertschinger andNeri“Protein，Engineering，Design and Selection(2004)，Volume17，page699。
结合配偶体和结合部分之间应该有足够的亲和力去抵挡用于DNA链分离的处理。对于链分离，可以使用高或低的pH。当使用低pH时，优选地≤3，更优选地≤2，甚至更优选地≤1。盐酸和柠檬酸是优选的酸。高pH是更优选地。当使用高pH时，优选地≥11，更优选地≥12，甚至更优选的≥13。优选地碱试剂包括氢氧化钠以及组I的其他氢氧化物例如LiOH或KOH。除了Be(OH)2和Ba(OH)2外，也能使用组II的氢氧化物。最优选地，使用氢氧化钠来分离链(例如，0.1NNaOH，其pH为13)。恰当的试剂和条件能被本领域的普通技术人员所选择。最优选的是使用生物素和链亲和素和/或它们的类似物以及前面描述的高pH链分离处理。
化学基团也可以被用于将其中一条链在化学上连接到支持物。例如，合成寡核苷酸以引入特定的化学基团例如胺或硫醇基团是可行的。实际上，这些寡核苷酸能从供应商处购买。当在本发明的反应中这些寡核苷酸被用作初始引物中的一条时，那么相关的化学基团将被引入所形成的诱变引物的相关的链。然后，作为示例，通过将这些化学试剂(其现在被整合入DNA链)偶联到胺连接试剂或硫醇连接试剂，链的分离能得以实现，并且适当的试剂对本领域的技术人员是可获得的。
在诱变引物的单链形式按前面描述产生以后，其被引导到亲代分子以施行退火步骤(c)。这样，诱变引物的单链形式被加到亲代分子中用于退火反应。
在步骤(c)中，依赖于例如诱变引物的大小，诱变引物与亲代分子的退火可使用任意适当的条件和试剂。适当条件的选择被本领域的技术人员所理解。作为实例，诱变引物与模板的摩尔比3：1可被使用。适当的反应条件是在90℃下温育2分钟、在50℃下温育3分钟以及在20℃下温育5分钟。如果需要，本领域的技术人员可以改变条件。
在本文，从步骤(d)产生的环形核酸分子也称为“诱变引物的产物”(或者，以简单形式，称为“产物”)。优选地，反应产物是可复制的，这意味着一旦转化进入宿主细胞，其能复制以产生本身的拷贝。其优点是诱变反应的产物可不需要进一步的操作而直接转化进入宿主细胞(例如，以从核酸表达蛋白为目的的宿主细胞)，例如不需要用限制性内切酶切除相关的核酸部分，也不需要连接入进一步的质粒。
可选地，或另外地，优选的诱变反应的产物是双链的，以允许用限制性内切酶进行消化。
最优选地，环形分子(诱变反应的产物)是共价闭合的环状DNA，优选地为双链。
如前面谈到的，步骤(d)从亲代分子产生环状反应产物。这种反应涉及从退火的诱变引物起始互补链的合成，这样所形成互补链包含了来自诱变引物的突变。通常，反应混合物将包含适当数量的核苷酸碱基、DNA聚合酶、DNA连接酶和适当的缓冲液(实例给出适当的数量)。其在适当的条件下温育以完成第二条链的合成。这样的方法对本领域的技术人员是熟知的。优选地，这种反应是非扩增类型的(即非PCR类型的反应)，这样它不涉及连续循环的扩增，因此其被描述为线性反应(即，每亲代分子的单链产生一条互补链)。例如，在本发明的方法中，对于单链亲代分子的诱变反应产生了与亲代分子的单链反义的第二条链。因此，当单链亲代分子是正链时，在诱变反应中合成的第二条链将是负链。
通过在诱变反应中使用单链模板和单链引物，和自退火相关的问题被消除了。而且，诱变反应的产物为双链，同样地转化细菌比单链分子更有效。因此，当转化入细菌宿主时，突变的双链形式将优先于单链模板转化细菌(有效地，突变形式的选择优先非突变模板的选择)。
本发明的方法包含前面列出的步骤(在本文中，术语“包含(comprise)”被用作“包括(include)”的意思，即允许一个或多个进一步特征的存在，例如，反应步骤)。因此本发明的方法可包括进一步的步骤，包括但不限定于本文其它地方提到的那些步骤。可选地，本发明的方法可以由前面列出的步骤或者本文提到的步骤组成。反应的各个步骤可被组合到单一反应容器中，不需要每一步在分离的容器中施行。例如，将诱变引物与亲代分子退火的步骤和合成互补链的步骤可以在一个容器中施行。
优选地，单链亲代分子是单链环状DNA。例如，单链亲代分子可以是从噬菌体颗粒提取的单链环状DNA。
优选地，在本发明的方法中，在所述退火步骤(c)之前，具有将单链亲代分子加到单链引物的分开的步骤。更优选地，在步骤(c)之前，所述方法进一步包括分离所述单链亲代分子的步骤。
分别涉及诱变引物和亲代分子的步骤的顺序是不需要连续的。因此，在亲代分子的单链形式被分离之前，诱变引物的单链形式可进行分离。或者，在诱变引物的单链形式行分离之前，亲代分子的单链形式可被分离。或者，单链诱变引物的分离和单链亲代分子的分离各自并排进行或同时进行。
优选地，在步骤(c)之前，本发明的方法进一步包括对所述单链亲代分子施行的尺寸排阻步骤。例如，使单链亲代分子通过多孔树脂，任何小片段被捕获在树脂中，而较大的亲代分子则通过。这步骤除去了短的线性DNA片段(被认为是与模板共净化的降解产物)。通过消除由并不导致诱变的短片段所致的引发事件，这些片段的除去提高了诱变效率。
亲代分子将含有用于本方法产物的下游使用所必需的序列元件。用作亲代分子的适当的载体，在本领域是可获得的或者可被技术人员使用传统的技术所构建。这些载体包括适当的调控序列，其包括启动子序列、终止子序列、增强子序列和标记基因等。载体可以是任何适当的类型，例如质粒、噬菌体和噬菌粒等。例如，当本方法的产物被用于蛋白表达(例如，用于表达产物的筛选)时，亲代分子将包括用于在宿主细胞中蛋白质表达的必要的序列。
适当的表达系统在本领域是充分熟知的，并且许多宿主细胞可被使用。这些宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞(例如HeLa、CHO或BHK细胞)。细菌细胞是优选地，最优选地为大肠杆菌。用于这些宿主每一个的适当的载体在本领域是可获得的，或者可以用常规方法所构建。病毒表达系统也可使用，例如杆状病毒系统或植物病毒表达系统。用于操作DNA的技术在本领域是充分熟知的(例如克隆、测序、表达和分析等)。已知的方法的进一步细节可在例如Molecular Cloning：a laboratory manual：2nd edition，Sambrook et al.，1989.ColdSpring Harbor Laboratory Press；orCurrent ProtocolsinMolecular Biology，secondedition，Ausubel etaleds.John Wiley & Sons，1992中找到。
优选地，本发明的方法进一步包括转化诱变处理的核酸分子进入宿主细胞的步骤。可使用任何适当的方法进行转化，这些方法对技术人员是熟知的。实例包括热激法。优选地，所述转化用电穿孔施行。转化诱变处理的产物的步骤可在步骤(d)后直接施行，或者在步骤(d)和转化进入宿主细胞之间也可有中间步骤。下面讨论的优选的实施方式中，转化入宿主细胞被用于优先选择突变的互补链，优于未突变的亲代分子。
本发明的方法可包括在包含突变的互补链被优先选择的条件下施行的步骤。在宿主细胞中，这样的互补链的优先选择可由亲代分子的优先消化产生，或由互补链的优先存活产生。
亲代分子可包含修饰，这样互补链被优先选择。本发明的方法可进一步包括引入所述修饰的步骤。在优选的实施方式中，在亲代分子中的修饰包括引入dU代替dT。当所述方法进一步包括引入如此的突变的步骤时，可理解的是，这包括这样的实施方式：在其中亲代分子最初包含如此的修饰，并且进一步的修饰在该步骤中被引入；以及也包括这样的实施方式：其中最初没有修饰，并由该步骤引入任何如此的修饰。
dU代替dT的情况可以按下述进行解释。亲代分子在支持尿嘧啶引入的大肠杆菌菌株中生长，例如dut-ung-菌株如CJ236(Kunkel et al.，(1985)PNASUSA，Vol82，pp488-492；Sidhu et al.，Phage Display for the Selection of Novel BindingPeptides，Methods in Enzymology 2000，Volume 238，page333-363)。依照这些方案，亲代分子在大肠杆菌中以噬菌粒的形式增殖。单链含尿嘧啶的DNA经标准的方法进行提取(例如Qiagen M13 Spin Prep Kit)。在诱变引物与单链含尿嘧啶的DNA退火之后，互补链被合成(在合成反应中使用dT而不是dU)。这导致异源双链DNA分子，在其中，一条链(亲代链)包含dU且不包含需要的突变，第二条链(在步骤(d)合成的互补的链)包含dT且包含突变。然后所形成的分子被转化进入不支持尿嘧啶存在的大肠杆菌宿主，例如dut+ung+宿主如JM101。因此包含突变的互补链优先于不包含突变的亲代分子进行复制(在dut+ung+宿主中含dU链亲代被尿嘧啶糖基化酶水解)。
其它选择方法包括甲基化的使用。亲代分子将在几乎所有的大肠杆菌菌株中被甲基化。在步骤(d)，互补链能在体外合成，其没有被甲基化，导致包含甲基化亲代链和非甲基化互补链的异源双链体，该甲基化的亲代链不包含突变，非甲基化的互补链包含突变。然后使用Dpn1限制性内切酶消化异源双链体，该内切酶在位点5’-Gm6ATC-3’切割双链DNA且该内切酶对甲基化和半甲基化的DNA具有特异性。因此亲代链被消化，而包含突变的互补链没有被消化。可以使用例如Dpn1之外的可选择的酶。
作为进一步可选择的方法，可使用条件致死基因。一个实例是ccdB，也被称为“细胞死亡控制”基因。该基因能插入到亲代分子中，插入在诱变反应之后将被取代的区域。亲代分子将从不易受该基因影响的大肠杆菌菌株制备。然后诱变反应将用目的基因取代ccdB基因。那些未突变的亲代分子仍表达ccdB，其将引起它们的大肠杆菌宿主死亡。因此，由诱变反应产生的突变分子被选择。
其它适合的系统和选择的酶可被使用，只要它们涉及异源双链体亲代链的降解。实例包括核酸内切酶和内切糖苷酶。
因此，在优选的实施方式中，方法涉及包括对核苷酸修饰(例如dU代替dT)的单链亲代分子的使用。由诱变引物引发的互补链合成产生了新合成的突变链，其不包括这种修饰(例如，在合成反应中，使用dTTP而不是dUTP)。未修饰、新合成的突变链被优选(例如，通过将异源双链体分子转化入宿主细胞，该宿主细胞仅仅支持未修饰的、新合成的突变链的复制，或通过使用选择性酶消化亲代链)。
在优选的实施方式中，本发明提供了如此方法，其中所述优先选择通过将来自步骤(d)的所述环形分子转化入宿主细胞来施行，所述宿主细胞对互补的、未修饰的链(新合成的、未修饰的突变链)具有选择性。
因此，在优选的实施方式中，本发明提供了将一种或多种突变引入核酸分子的方法，其包括下述步骤：
(a)从模板核酸分子合成(优选通过PCR合成)诱变引物，其中所述的诱变引物包括一种或多种相对于亲代分子的突变；
(b)分离所述诱变引物的单链形式；
(c)将所述单链诱变引物与所述亲代分子的单链形式退火，其中所述亲代分子包含一种或多种可选择的修饰；
(d)合成所述诱变引物的互补链，以制造不包含所述修饰的环形核酸分子；
(e)采取选择步骤，这样互补链优先于亲代分子而被选择。
在优选的实施方式中，本发明的方法可被运用到分子群。因此，分子群可使用上述的方法进行突变，或者序列群可被插入到适当载体进行筛选(例如表达筛选)。
例如，本方法可用来生成分子文库。这样，多种诱变引物可被用来突变适当的载体以产生产品文库。使用多种诱变引物和多种亲代分子的组合诱变也可被用于产生含有大量变换(permutation)的文库。例如在那个分子的第一位置上具有变异的多种亲代分子，可以和在第二个位置引入突变的多种诱变引物一起被使用在诱变反应中，因此作为在第一和第二位置的变异的组合和变换的结果，产生了大量的文库。这被实施例1所例证，并且被示意性地阐述在图6中。
本方法也可被用于帮助筛选分子群。例如诱变引物群可衍生自模板分子群。然后该群可被引入例如普通载体，诸如表达载体进行筛选。这在实施例2中被例证。
因此，在优选的实施方式中，本方法被运用于分子群，例如用于筛选分子群或分子群的亚克隆，以产生文库。因此，可有多种诱变引物、模板和/或亲代分子。该群在大小上可至少是1000个分子，更优选地至少104个分子，更优选地至少105个分子，更优选地至少106个分子，更优选地至少107个分子，更优选地至少108个分子，更优选地至少109个分子，更优选地至少1010个分子，更优选地至少1011个分子，更优选地至少1012个分子以及更优选地至少1013个分子。
与本发明的方法应用到群特别是文库相关联的优点，部分基于如此的事实，即诱变引物的序列在试验方案开始的时候不需要知道。对模板分子中的短区域或共同区或的知识(例如毗邻可变区的已知序列或者包含模板分子的载体中的已知序列)使得能够设计出初始引物。因此，这些初始引物可被用于扩增整个分子群，其具有可变区以及初始引物所针对的共同区。同样地，分子群可被插入到共同的亲代分子(例如载体)用于筛选，例如表达筛选，只要在诱变引物和亲代分子之间有一个互补区。该互补区可以与模板分子中初始引物所针对的区相同或部分相同。
因此，在本发明的方法中，可有多种模板或模板的多种形式。例如，模板可以是被包括在载体例如质粒内的不同分子的文库。因此，然后从这种文库产生的多种诱变引物被用来产生大量的环形诱变处理的产物，原因是当互补链在步骤(d)中被合成时，多种诱变引物中的每一个将不同突变引入亲代分子。当这些多种产物被转化进入适当的载体，例如细菌载体诸如大肠杆菌时，每一个所形成的菌群包含由多种诱变引物中的每一个产生的产物。
当多种不同诱变引物将从文库例如质粒文库产生时，那么选择用来合成诱变引物的初始引物，以至于该初始引物与同文库共有的载体的区域互补。因此，多种模板可包含可变区以及多种模板之间的共同区。例如，可变区可以是核酸的随机区域，其与非随机区域相邻。在另一个实例中，可变区可以经过多种插入物所产生，这些插入物已被引入相同基础载体的多种分子。因此，选择初始引物使之与模板上位于可变区外部的区域互补，例如与模板的全部或部分非随机区互补，或者与基础载体的部分互补。这样，多种诱变引物可以使用相同的初始引物在一个合成反应中产生。
可选地或另外地，有多种亲代分子。因此，在步骤(c)中诱变引物可以与多种不同的亲代分子退火。当有多种如先前描述的诱变引物的情况下，其也可以与多种亲代分子退火。因此能产生组合效应，在其中，多种诱变引物与多种亲代分子退火，产生诱变引物和亲代分子的组合。
因此，本发明的方法可包括多种亲代分子和/或多种诱变引物分子。
这样的优点是其能被用于获得宏大的所有的亲代分子和/或模板，例如组合宏大的所有的亲代分子和/或模板。优选所有组分的大小为至少100种亲代分子和/或模板，更优选地至少1000种，甚至更优选地至少2500种。
使用组合的方法，可产生宏大的所有的亲代分子和/或模板，例如在多种亲代分子和多种诱变引物组合之后，可以至少有1000种所形成的产物，更优选地至少104种，更优选地至少105种，更优选地至少106种，更优选地至少107种，更优选地至少108种，更优选地至少109种，更优选地至少1010种，更优选地至少1011种，更优选地至少1012种，更优选地至少1013种。
可用这种方法引入的突变包括取代、缺失和添加。突变可以是多个核苷酸(但是也可仅是单个核苷酸)。例如，在亲代分子中可以由诱变引物产生多个取代，或者大量核苷酸可以被缺失或加入。不同突变类型的组合也是可能的。因此，可有取代和缺失的组合、取代和添加的组合、添加和缺失的组合，或者添加、缺失和取代的组合。
也可有多个突变区，例如两个区域中，一个或多个核苷酸被取代，并且被诱变引物没有产生变化的区域所分开(因为在这个中间区(脉间区，interstitialregion)，在诱变引物和亲代分子之间具有互补性)。
进一步的可能性包括：在其中一个或多个核苷酸被取代的多个区域被互补区分开；在其中一个或多个核苷酸被添加的多个区域被互补区分开；在其中一个或多个核苷酸被缺失的多个区域被互补区分开。组合也是可能的。因此可以有：核苷酸被取代的一个或多个区域和核苷酸被添加的一个或多个区域被互补区隔开；核苷酸被取代的一个或多个区域和核苷酸被缺失的一个或多个区域被互补区隔开；核苷酸被缺失的一个或多个区域和核苷酸被添加的一个或多个区域被互补区隔开；核苷酸被取代的一个或多个区域、核苷酸被添加的一个或多个区域和核苷酸被缺失的一个或多个区域被互补区隔开。
突变的性质和数量被亲代分子和诱变引物之间错配的数目和性质所决定。因此，当与亲代分子相比在诱变引物上有单核苷酸的添加时，那么单核苷酸将经由诱变反应而被添加。当与亲代分子相比在诱变引物上有分散的错配区(例如，前述的分散的添加区、缺失区和取代区)时，作为诱变反应的结果将产生分散的相应突变区。诱变引物可以替代亲代分子上的一段核苷酸。例如，诱变引物可包含与亲代分子具有例如70％互补性的区域，这样在诱变反应之后，该亲代分子上的区域被来自诱变引物的70％互补区所替代。
为了诱变引物退火，在诱变引物和亲代分子之间必须有一定程度的互补性。典型地在诱变引物的末端具有最小的互补区域。当诱变引物已经通过PCR产生，初始引物(前面定义的)与亲代分子互补时，那么在诱变引物的末端提供具有18到25个碱基对互补性的最小区域。
相对于整个诱变引物的互补程度优选地为至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少97％，更优选地至少98％和更优选地至少99％。作为实例，至少97％互补性与在830个核苷酸长的诱变引物中有20个错配相对应(810个互补)。至少60％互补性与在730个核苷酸长的诱变引物中的错配区域相对应，且在830个核苷酸长的诱变引物中与亲代分子具有70％的同一性(“70％区域”的两个末端之一与亲代分子完全互补)。诱变引物的非限制性的实例在图中显示。
诱变引物可以为100到4000个核苷酸长度，优选地200到3000个核苷酸，更优选地300到2000个核苷酸，更优选地400到1500个核苷酸，更优选地400到1000个核苷酸，甚至更优选地400到850个核苷酸长度或800到1500个核苷酸长度。
诱变引物的大小可取决于亲代分子的大小。例如，当亲代分子为5.5kb，诱变引物优选地最长为1kb。因此，诱变引物优选地为亲代分子大小的大约1/50到1/5，更优选地1/25，更优选地为亲代分子大小的3/10，最优选地在核苷酸长度上为亲代分子大小的大约1/5。
优选地，在步骤(c)中，诱变引物与亲代分子的摩尔比为大约2:1到5:1，最优选地大约3:1。
本发明方法的优选运用包括文库的筛选和产生，特别是抗体文库。例如，亲代分子可以是用于抗体或抗体结构域表达的载体。在引导突变进入亲代分子之后(例如通过从包含抗体结构域文库的模板产生诱变引物)，所形成的突变亲代分子能在适当的宿主中进行表达，并可针对适当的抗原进行筛选(关于进一步的信息，见Vaughan et al.，(1996)Nature Biotechnology，Volume 14，pp 309 to 314；和Edwards et al.，(2003).J.Mol.Biol，334，pp103-118)。其它抗体相关的实例包括抗体结构域亚克隆进入免疫球蛋白受体质粒，例如IgG受体质粒(例如pEU IgG表达载体，见Persic et al(1997)Gene187：9-18)。术语抗体描述了免疫球蛋白并且包括天然和合成的类型。该术语包括具有抗体结合结构域的多肽，该多肽是抗体结合结构域或基本上与抗体结合结构域同源。实例包括Fab(VL，VH、CL和CH1结构域)；scFv(被连接体例如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3连接的VH结构域和VL结构域，例如Bird et al(1988)，Science，242，423-426，Huston et al.(1988)，PNAS USA，85pp5879-5883；Fv(单个抗体的VL和VH结构域)；Fd(VH和CH1结构域)；dAb(Holtet al(2003)，Trends in Biotech.21 pp484-490)和双抗体(WO94/13804)。
因此，在优选的实施方式中，亲代分子、模板或诱变引物包含编码抗体可变结构域的序列。抗体可变结构域可以是VH或VL结构域。优选地，亲代分子包含scFv。
当在核酸例如载体的背景中，本文涉及抗体或抗体结构域时，可以理解涉及编码所述抗体或结构域的核酸序列。
本方法也可用来改组抗体结构域以产生所有抗体类型。因此，亲代分子可包含抗体VH结构域，诱变引物可包含抗体VL结构域，或者亲代分子可包含抗体VL结构域，诱变引物可包含抗体VH结构域。抗体VH结构域的文库可以与抗体VL结构域的文库组合(改组)，反之亦然。因此两个文库之一可被用作模板以形成多种诱变引物，另一个文库可作为在多种亲代分子中的文库而存在。
因此，本发明提供了方法，在其中亲代分子包含抗体VH结构域和抗体VL结构域，诱变引物分子包含抗体VL结构域以突变亲代分子的VL结构域。本发明也提供了方法，在其中，亲代分子包含抗体VL结构域和抗体VH结构域，诱变引物分子包含抗体VH结构域以突变亲代分子上的抗体VH结构域。这样，抗体VH结构域的文库可与抗体VL结构域的文库相组合(被改组)，反之亦然。
可期望的是，亲代分子的VL和VH结构域中的仅仅一个被突变，或者可期望的是，亲代分子的VL和VH结构域都被突变。也可以设想单结构域系统，例如其中构建物包含VL结构域(但是没有VH结构域)，且该VL结构域被VL诱变引物所突变，或者例如，其中构建物包含VH结构域(但是没有VL结构域)，且该VH结构域被VH诱变引物所突变。本发明提供了所有这些可能性。
因此，本发明包括亲代分子上的VH和VL结构域将被包含每一个这些结构域的诱变引物所突变的情况。因此，VH诱变引物将诱变亲代分子上的VH结构域，VL诱变引物将诱变亲代分子上的VL结构域。包含这两种结构域的单一诱变引物也能被使用。
因此，本发明提供了方法，其中第一和第二诱变引物被用于突变亲代分子，包含抗体VH结构域的第一诱变引物突变亲代分子上的VH结构域，包含抗体VL结构域的第二诱变引物突变亲代分子上的VL结构域。第一和第二诱变引物可被用在独立的诱变反应步骤中，在这些情形中，第一和第二诱变引物可以以任何顺序参加独立的诱变反应(即，第一诱变引物能在涉及第二诱变引物的诱变反应之前或之后被用于诱变反应中)。另一个可能性是所述的第一和第二诱变引物被用在相同的诱变反应步骤中。
在前面描述的方面中，在抗体上下文中，本发明的方法被用来组合(或改组)VH结构域的文库与VL结构域的文库，该方面能被运用到结构域的组合改组被需要的其他系统中，例如通常涉及免疫球蛋白和多结构域蛋白的其它分子。因此，本发明提供结合第一结构域的文库和第二结构域的文库的方法，如前面对抗体方面所描述的(在其中，第一结构域是VH结构域，第二结构域是VL结构域，反之亦然)。
在一些优选的实施方式中，亲代分子包含编码scFv的核酸。
本发明也提供了实施上述方法的试剂盒。例如，这样的试剂盒可包括适合从模板分子合成单链引物分子的初始引物、单链亲代分子和使用说明书。亲代分子可按本文描述地进行修饰。也可以包括适当的试剂和缓冲液，例如本文涉及的那些试剂和缓冲液。也可包括在本发明方法的任何实施方式中所限定的进一步的试剂盒成分。
如前面谈到的，本发明的方法和试剂盒具有大量的应用，包括下列应用。本方法能被用于亚克隆，例如核酸区能通过步骤(a)产生，并通过诱变反应被引入适当的载体，这样消除了核酸消化和连接的需要。例如靶抗原能被克隆到表达载体。本方法可被运用于前述文库的产生和筛选。更具体的使用在下面进行了概述。
本文描述的方法能被用于将单链Fv(scFv)片段(通过连接体，VH和VL结构域作为单肽而被连接)转变为IgG分子。因此VH和VL结构域可被引入IgG_VH和IgG_VL受体质粒。对所谓的通用寡核苷酸的初始引物的使用，涉及包含scFv的载体的不可变部分，或者涉及两个结构域之间的连接体(例如一个初始引物涉及每个结构域上游或下游的序列，第二个初始引物涉及两个结构域之间的连接体)。例如，如果使用Vaughan等描述的scFvs，其中一个初始引物能涉及pCantab6中VH结构域上游的序列，另一个涉及连接体(即涉及编码(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3的序列的部分)。
本发明的方法也能被用以产生天然文库(即来自非免疫的人类供体的文库)。目前这些文库通过对来自非免疫人类供体的天然抗体VH和VL结构域进行PCR来产生，然后被限制性消化并连接入受体质粒。使用本发明的方法，诱变引物可从这些衍生自非免疫供体的PCR产物中分离出来。而且，上述方法的使用去除了对限制性消化和连接的需要。适当的引物可基于重链的每一端和轻链的每一端的序列(见，例如Vaughan et al.，supra)。
本发明的方面和实施方式将通过实施例并参考下列的图进行说明，在其中：
附图简述
图1表示在本发明的方法中使用的诱变引物。在每一情况下中，数字是近似的碱基数目，错配区用灰色表示。图1a表示在实施例1中(VH/VL重组)使用的诱变引物1。图1b表示在用于VHCDR3变体的实施例2中(核糖体展示亚克隆)中使用的诱变引物2a。图1c表示在用于VLCDR3变体的实施例2中使用的诱变引物2b。图1d表示用于产生VH或VL变体的诱变引物。灰色区域与实施例2的模板有大约70％同一性。图1e表示用于克隆入IgG受体质粒的诱变引物。图1f表示用于克隆入VH和VL受体质粒以创建天然文库的诱变引物。
图2表示用于诱变引物合成的初始引物的位置，该诱变引物用于VH/VL重组实施方式(例如实施例1)。A和B分别表示正向和反向引物。
图3表示用于诱变引物合成的初始引物的位置，该诱变引物用于核糖体展示方面(例如实施例2)。A和B分别表示正向和反向引物。
图4表示实施例1的诱变过程的结果。
图5是表示本发明的诱变过程的示意图。在该示意图中，来自在VHCDR3中包含特定突变的含scFv质粒的VHCDR3(用星号表示)通过PCR扩增，并且依靠在PCR反应中利用引物而引入的生物素被分离入单链形式。单链DNA被从包含scFv的质粒纯化，其在VLCDR3中包含特定的突变(也用星号表示)。在包含该VHCDR3突变的单链PCR产物和包含该VHCDR3突变的单链质粒之间的诱变反应中，两个突变组合以产生包含scFv的质粒，该质粒包含这两个突变。
图6表示本发明的组合实施方式。在图的顶部显示了包括突变a、b和c的多种模板分子。包含突变的这些分子区域通过PCR进行扩增并且使用生物素被分离进多种单链诱变引物。在图的底部显示了包含突变x、y和z的多种亲代分子。单链DNA被从这些分子产生，以产生多种亲代分子，每一种亲代分子包含突变x、y或z。在诱变反应中，包含突变a、b和c的诱变引物被用以突变多种亲代分子。这产生了表示在图的右部的产物组合。
实施例
实施例1：重组最优化的VH和VL区域的诱变方法
1.方法综述
已经表明，在体外抗体亲和成熟期间，最优化的VH和VL区的重组，能导致效价(potency)增加(Osbourn et al.，(1996)，Immunotechnology，Vol2，pp181-196)。在本实施例中，本发明的诱变方法被用于将VHCDR3已被随机化的一个变体文库和VLCDR3已被随机化的另一个变体文库重组。这两个变体文库含有同源的抗体序列，除了在VHCDR3和VLCDR3中的短随机化区域之外。在随机化以后，VH和VL文库各自经历了两轮噬菌体展示选择，以提高亲合力。两轮选择的VH和VL产物——其中每一种包含估计的105到106不同的变体序列——形成了本实施例描述的重组方法的起始点。
在该实施例的方法中，通过在5’端使用生物素化的PAMA-IN寡核苷酸，3’端使用H-LINK寡核苷酸，经PCR扩增VH文库(见图2)。在捕获在链亲和素珠子上之后，非生物素化的链被洗脱，这样形成了诱变引物。
在从dut-ung-大肠杆菌菌株CJ236获得噬菌体颗粒之后，VL文库作为单链质粒被制备。通过将编码诱变引物的VH和代表VL文库的单链质粒放置在一起，VH和VL区的重组发生了。
2寡核苷酸的设计
从M13分离的dU-ss DNA模板是正链，所以诱变引物与正链互补(即，诱变引物是负链)。通过生物素化正向引物，在捕获在链亲和素上之后，负链能被洗脱。使用如下的寡核苷酸(5’到3’)：
Bio-PAMA-IN：生物素-GCGGCCCAGCCGGCCATGG
H-LINK：ACCGCCAGAGCCACCTCCGCC
3作为dsPlasmid DNA的VL产物的制备
1.在小锥形瓶中，将100μl在pCantab6(Vaughan et al.)中的所有VL的甘油原液接种到50ml2×TYA中。
2.培养物在37℃、300rpm下生长2小时。
3.细胞在50ml Falcon管中3200rpm下离心10分钟沉淀下来。
4.在1ml水中，施行Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit试验方案以分离双链质粒DNA(ds Plasmid DNA)。
5.DNA浓度用UV光谱或琼脂糖凝胶进行检查。
4dU-ss DNA模板的制备
然后，得自第三部分的dsPlasmid DNA被用在下列的流程中：
试剂：
在pCantab6(Vaughan et al.)中所有VL的质粒Midiprep
于乙醇中的10mg/ml的氯霉素(CAM)，储存在-20℃
在水中的0.25mg/ml的尿苷(Sigma U-6381)，储存在4℃
2×TYAG(+10μg/ml CAM)平板：(TY如Sambrook et al，supra所描述的，加入100μg/ml的氨苄青霉素(A)和2％葡萄糖(G)，氯霉素(CAM)以20μl原液加入到80μl乙醇中，并且在平板上铺开)。
CaCl2感受态CJ236的制备
1.用大肠杆菌CJ236细胞(例如，由Biorad供应)的单菌落接种5ml2×TY培养基(加10μg/ml CAM)。细胞在37℃、300rpm下生长过夜。在CJ236中CAM选择F’游离体。
2.用5ml过夜的培养物接种500ml2×TY，并且在37℃下摇动培养。
3.当在600nm的OD达到0.9时，通过在4℃下离心(5分钟、5,000rpm)收获培养物。上清液被到出，细胞沉淀被排干。细胞被轻轻地重新悬浮于100ml100mM的冰冷MgCl2中。
4.通过离心(在x4℃下离心)，再一次收获细胞，并且沉淀被排干。细胞被轻轻地重新悬浮于20ml100mM的冷CaCl2中，直到获得平稳的悬浮液。加入200ml100mM的冷CaCl2并混合。细胞被置于冰上30-90分钟。
5.在低温离心机中通过离心收获细胞，并排干沉淀。细胞被重新悬浮在20ml85mM的冷CaCl2和15％甘油中。
6.立刻等分细胞悬浮液(如果需要，将整分试样冷藏于干冰/乙醇中)。
转化模板进入CJ236
1.来自前面的CJ236CaCl2感受态细胞在冰上解冻(整个试验方案中都保持在冰上)。
2.在PCR管中，将5μl包含得自第三部分的所有VL的pCantab6质粒加入到100μl感受态细胞中。
3.在PCR仪模块上运行下列程序：
0.1℃下30分钟
42℃下45秒
0.1℃下2分钟
4.在0.5ml的2×TY中，将细胞转移到15ml的Falcon管。
5.在37℃、200rpm的摇动下细胞被培养45-60分钟。
6.将0.5ml细胞铺于2×TYAG(+10μg/ml CAM)的平板上，并在37℃温育该平板。
从CJ236获得噬菌体以及DNA制备
1.从前面步骤6的CJ236转化子获得的菌苔被刮入1ml的2×TY中。500μl被接种入50ml的2×TYCAG中(即2％葡萄糖、100μg/ml AMP和10μg/ml CAM)并且在37℃，300rpm下温育，直到OD600＝0.5到1。
2.通过OD读数(OD600为1对应于5×108个细胞/ml)计算细胞密度，加入野生型KO7辅助噬菌体(Amersham Biosciences M13KO7辅助噬菌体)以确保10噬菌体：1细胞的感染复数(MOI)(野生型KO7原液通常在0.33μl中包含1010噬菌体)。然后细胞在37℃下温育10分钟(不摇动)以便能够进行感染。
3.将1ml培养物转移到30ml补充了25μg/ml KAN(用来选择KO7)和0.25μg/ml尿苷(允许包含尿苷的模板合成)的2×TYAC中。其在37℃、300rpm下温育过夜。
4.在SS-34转子中，细胞在15000rpm、2℃下离心10分钟。将上清液转移到新的管中，并且加入1/5体积的PEG-NaCl(20％PEG8000，2.5M NaCl)。其在室温下温育5分钟，然后在SS-34中在10000rpm、2℃下离心10分钟。
5.成生小的白色噬菌体沉淀。上清液被轻轻倒出，并在薄纱(tissue)上倒转管以排干。噬菌体沉淀被重新悬浮在0.5ml的PBS中(冲洗管壁以获得尽可能多的噬菌体)。转移噬菌体到离心管(eppendorf)，在15,000rpm下于微型离心机中离心5分钟以沉淀剩余的不溶物。上清液被转移到新的离心管中。
6.使用Qiagen Qiaprep Spin M13试剂盒纯化dU-ss DNA模板，以加入Qiagen MP缓冲液(Sidhu et al，supra)为开始。在100μl10mM pH8.0的Tris-HCl中洗脱DNA，并在1％琼脂糖凝胶上检查。ss DNA制备物在2.5kb的位置上跑出一条清晰的带，并被用在第6部分的诱变反应中。
5.来自所有VH(VHrepertoire)的ssDNA诱变引物的制备
使用寡核苷酸bio-PAMA-IN和H-LINK通过PCR从pCantab6扩增代表所有不同VH序列的区域。标准的PCR条件可被用于在第3部分制备的中量制备(midiprep)模板的连续稀释物。
Abgene(2×)Mastermix 25μl
中量制备模板 1μl[纯的、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、无]
Bio-PAMA-IN 1μl
H-LINK 1μl
水 22μl
在1％琼脂糖凝胶上运行每个PCR5μl的产物(这样确定了产物的大小，显示了产量等)。
1.将microMACS柱(Miltenyi Biotec：130-042-701)放置在磁性支架中。
2.使250μl1×结合缓冲液(2×结合缓冲液：10mMTris pH7.5、2MNaCl、1mM EDTA和0.1％Tween20)流过柱子。
3.将45μl PCR反应物与105μl microMACS链亲和素珠子(Miltenyi Biotec：130-074-101)和150μl2×结合缓冲液混合，并温育两分钟。
4.DNA+珠子被施用到microMACS柱，并流过柱子。
5.用2×1ml1×结合缓冲液洗涤柱子。
6.用200μl0.1NNaOH(新制的)将DNA洗脱到离心管中。
7.向洗脱的DNA，加入20μl pH5.2的醋酸钠、550μl乙醇和1μl糖原。
8.在-70℃下温育30分钟。
9.在13,000rpm下离心10分钟以沉淀DNA。除去上清液，并替换以500μl70％乙醇。
10.在13,000rpm下进一步离心5分钟，除去上清液，在37℃热模块下风干2分钟。DNA被重新悬浮于50μl水中。
6诱变反应
试剂：
TM缓冲液(10×)：500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH7.5
10mM ATP：(通过将0.6052g ATP溶解于1ml水中并且用0.1M NaOH调节pH为7.0，制成1M原液。原液按1：100的比例稀释以制成10mM ATP——能被储存于-70℃)
100mM DTT：(通过将0.1542g DTT溶解于1ml0.01M醋酸钠(pH5.2)制成1M原液。原液按1：10的比例稀释以制成100mM DTT——能被储存于-20℃)
酶：得自New England Biolabs(NEB)的T4多核苷酸激酶、T4DNA连接酶和T7DNA聚合酶。
25mM dNTPs
Qiagen Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)
诱变引物的磷酸化
下列物质被加入到离心管：
ssDNA诱变引物1.0μg(1.0μg/132000道尔顿＝7.6皮摩尔)
TM缓冲液(10×) 5.5μl
10mM ATP 5μl
100mM DTT 2.5μl
加水至总体积为53μl。加入2μl(20U)T4多核苷酸激酶(10U/μl)，并且在37℃下温育1小时。
以3：1的比率，诱变引物与模板退火
下列物质被加入到离心管：
dU-ssDNA模板(得自第4部分)4.4μg(4.4μg/1,750,000道尔顿＝2.5皮摩尔)
磷酸化的诱变引物1.0μg(1.0μg/132,000道尔顿＝7.6皮摩尔)
TM缓冲液(10×)25μl
加水至总体积250μl。
该250μl在90℃下温育2分钟、50℃下3分钟以及20℃下5分钟，以使诱变引物与模板退火。
诱变反应
为了混合退火的寡核苷酸/模板，被加入下列物质：
10mM ATP 10μl
25mM dNTP’s 10μl
100mM DTT 15μl
30韦氏(Weiss)单位的T4DNA连接酶(6U/μl)* 5μl
30单位的T7DNA聚合酶(10U/ul) 3μl
*标记在酶管上的单位不是韦氏单位——6U/μl是酶活性的正确浓度。
反应物在20℃下温育3小时。
使用Qiagen Qiaquick PCR Purification试剂盒，将每一个反应物亲和纯化到35μl水中。1μl的每个反应物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并且与用和不用诱变引物的反应产物相比较。在“没有引物”的电泳泳道上，观察到强的ssDNA带(2.5kb为pCantab6)。在“具有引物”的电泳泳道中，该ssDNA带在强度上降低，并且被一条或多条对应于cccDNA的较大的带所代替(共价闭合环形DNA)(对于pCantab6大于3kb)。
7电穿孔入大肠杆菌TG1’s
根据下列流程，制备新的电穿孔感受态TG1细胞(Stratagene)：
1.使用来自TG1基础培养基平板的菌落接种适当体积的2TY培养基。细胞在25℃、300rpm下培养过夜。
2.使用10ml(每瓶)过夜培养物接种5个每个包含500ml2TY的瓶。其在25℃、300-350rpm下生长，直到OD600为约0.5-0.6[通常进行大约2-3小时]。
3.6×500ml离心瓶和Sorval SLA3000转子被预冷到2℃。
4.一旦达到最适宜的OD，细胞在冰上于离心瓶中冷却30分钟并且在2℃、4,000rpm下离心30分钟。
5.上清液被倒出，沉淀被重新悬浮在小体积冰冷的高压蒸汽处理过的MilliQ水中。用水增大至～300ml，并且在2℃、4,000rpm下离心15分钟。
6.倒出上清液并且重新悬浮在小体积的剩余水中，然后加入300ml水并按照前述离心。
7.在-20℃预冷8×50ml Falcon管。Sorvall台式离心机(bench top centrifuge)被预冷到2℃。
8.倒出上清液，且沉淀被重新悬浮在剩余水中。
9.一旦重新悬浮，悬浮液被倒入Falcon管，并且加水到50ml。然后在3200rpm下离心10分钟。
10.除去上清液，每一个沉淀被重新悬浮在少量的水中，细胞被组合入一个50ml的Falcon管，加水至50ml，然后按上面所述离心。
11.除去上清液，并且在剩余体积的水中重新悬浮细胞。
为了进行电穿孔，使用连续稀释的细胞(仅细胞)以确定适当的浓度(例如细胞以100％、80％、60％和50％稀释)。仅仅用细胞作为对照，被铺在2TYAG上，用于证实在感受态细胞制备中没有氨苄青霉素抗性细胞。
使用下列设施，在单个小池(cuvette)(Bio-Rad大肠杆菌Pulser小池0.2cm电极间隙(electrode gap)；目录编号165-2086)中，全部35ml完整的诱变反应物被直接电穿孔进入400μl电穿孔感受态TG1细胞：
2.5kV场强
200Ω电阻
25μF电容
时间常数～4.2ms
在电穿孔之后，1ml2TYG立刻被加到小池中，并且将细胞转移到50ml Falcon管中。小池用另外的1ml2TYG冲洗，以将细胞从小池的底部(用伸长的P200移液管尖端)转移到Falcon管。然后转移到37℃、大约150-250rpm的培养器中，使细胞恢复1小时。
每一个文库的连续稀释物(每个Falcon管)被铺在小的2×TYAG平板上用来估计文库大小，和在大的2×TYAG平板上的剩余细胞。在铺于大的平板之前，剩余的细胞被离心(3200rpm，10分钟)并重新悬浮于1ml2TYG。该平板在30℃下温育过夜。
然后，将文库从大的平板上刮入到5ml2×TY中，然后补充2.5ml50％甘油。通过检测1：100稀释液的OD600(OD600为1等于5×108细胞/ml)，可计算细胞密度。对于储存，每个文库的多个整分试样被储存于-70℃，每个整分试样包含超过文库大小10倍的细胞。然后，解冻一个整分试样并且加入到500ml培养物中用于获得作为噬菌体的文库，例如，用于通过亲和结合选择噬菌体(Hawkinsetal(1992)J.Mol.Biol，226，pp889-896)。
该方法的结果如下，并且也显示在图4中：
| 全部转化子 | 被分析的序列的编号 | 诱变效率％ | 突变文库大小 | |
| 重组文库1 | 1×1010 | 47 | 83％(39/47) | 8.3×109 |
| 重组文库2 | 3.9×109 | 43 | 91％(39/43) | 3.5×109 |
实施例2：核糖体展示产物的亚克隆
本实施例涉及源自核糖体展示的产物的亚克隆。在本亚克隆方法中，模板是scFv，描述为亲代scFv。使用的方法如实施例1。
初始的PCR步骤，其通过使用初始引物产生诱变引物，施行在核糖展示文库的产物上(即，RT-PCR产物)，见Jermutusetal(2001)PNAS，vol 98，no 1，75-80。在图3里，展示了用作初始PCR引物的寡核苷酸。
因此，使用生物素化的正向引物和反向引物mycRestore，从核糖体展示产物，经PCR扩增不同的scFv序列的全部组分(Jermutus et al P.N.A.S 2001，Volume 98 pp75 to 80)，其中正向引物在VH开始端退火，反向引物mycRestore在myc标记处引发，myc标记就在VL末端的下游(见图3)。
根据在重链开始端的氨基酸序列，使用Bio-EVQ或者Bio-QVQ。使用标准的PCR条件(见实施例1以获得详细内容)。
将所得到的PCR产物分离成单链形式，以形成如在实施例1中描述的诱变引物，并且在诱变反应中使用。
用于诱变反应的亲代分子是于pCantab6中的单链scFv(Vaughanetal.，(1996)Nature Biotechnology，Volume 14 pp 309 to 314)。在这个实施例中，仅使用单一序列的scFv亲代pCantab6。因此，单一的亲代分子被多种诱变引物所诱变，并因此将来自核糖体展示的多种产物亚克隆入亲代质粒。
单链亲代分子的制备，用以诱变反应和细胞转化的试验方案如实施例1。
在电穿孔后，诱变反应的产物产生大于10,000转化子。相反，没有诱变引物和酶的对照产生大约10个转化子。
上述实施例的结果如下：
| 引物 | 诱变引物的大小 | 5’端互补性 | 错配 | 3’端互补性 | 效率 | n |
| 2a | 830碱基 | 320碱基 | 20碱基 | 490碱基 | 75％ | 20 |
| 2b | 830碱基 | 700碱基 | 20碱基 | 110碱基 | 90％ | 21 |
上面涉及的诱变引物展示在图中。通过对比，当合成的寡核苷酸被用于诱变(典型地，18个碱基错配的任意一边，有18个互补的碱基)时，平均的诱变效率为64％(n＝350序列)。
实施例3：尺寸排阻程序
通过在诱变反应之前，对在实施例2中的单链亲代分子施行尺寸排阻步骤，进一步提高了诱变效率。这导致诱变效率提高1.5倍(通过序列分析测量，计算成功突变序列的数目)。
Claims (44)
1.一种将一个或多个突变引入核酸分子的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)通过基于PCR的方法从模板核酸分子合成诱变引物，其中所述诱变引物包含相对于亲代分子的一个或多个突变；
(b)分离所述诱变引物的一条链的单链形式；
(c)将所述单链诱变引物与所述亲代分子的一条链的单链形式退火；以及
(d)通过非PCR类型的反应从所述诱变引物合成互补链，以产生包含所述突变的环形核酸分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述退火步骤(c)之前，所述单链引物被与所述单链亲代分子混合。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述单链引物利用分离介质进行分离。
4.根据权利要求2所述的方法，在步骤(c)之前，进一步包括分离所述单链亲代分子的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，在步骤(c)之前，进一步包括对所述单链亲代分子施行的尺寸排阻步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链亲代分子是单链环状DNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲代分子是表达载体或噬菌体展示载体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述环形分子是共价闭合的环状DNA。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将所述诱变的核酸分子转化入宿主细胞的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述转化使用电穿孔施行。
11.根据权利要求1所述的方法，其包括在包含突变的所述互补链被优先选择的条件下施行的步骤。
12.权利要求11所述的方法，其中所述互补链的优先选择由所述亲代分子的优先消化所致。
13.权利要求11所述的方法，其中所述亲代分子包含修饰，这样所述互补链被优先选择。
14.权利要求13所述的方法，进一步包含引入所述修饰的步骤。
15.权利要求13所述的方法，其中所述修饰是引入dU代替dT。
16.权利要求13所述的方法，其中修饰是甲基化作用或者引入条件致死基因。
17.权利要求11所述的方法，其中所述优先选择通过将来自步骤(d)的所述环形分子转化入宿主细胞来施行，所述宿主细胞对互补的未修饰链具有选择性。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱变引物通过基于PCR的方法所合成。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱变引物通过这样的合成方法所合成，在该合成方法中，当从所述模板合成所述诱变引物时，错配被引入。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法是易错PCR。
21.根据权利要求19所述的方法，其中用于所述诱变引物合成的模板的序列与在所述亲代分子中找到的序列相同。
22.根据权利要求3所述的方法，其中合成所述诱变引物的步骤将结合部分引入所述诱变引物的正链或负链，并且所述分离是通过将所述结合部分结合至所述分离介质上的其结合配偶体而进行的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述结合部分被引入所述诱变引物的正链，并且所述诱变引物的负链被从所述分离介质中洗脱。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述结合部分是生物素，并且所述结合配偶体是链霉亲和素。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变包括取代。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变包括缺失。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变包括添加。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变是多个核苷酸的突变。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱变引物与所述亲代分子具有至少80％的互补性。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述诱变引物与所述亲代分子具有至少90％的互补性。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述诱变引物与所述亲代分子具有至少95％的互补性。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱变引物的大小为从100个核苷酸到4000个核苷酸。
33.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，诱变引物与亲代分子的摩尔比是3∶1。
34.根据权利要求1所述的方法，其中有多种亲代分子和/或多种诱变引物分子。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲代分子、模板或诱变引物编码抗体可变结构域。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体可变结构域是抗体VL结构域。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体可变结构域是抗体VH结构域。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述亲代分子包含抗体VH结构域和抗体VL结构域，并且所述诱变引物分子包含抗体VL结构域以突变所述亲代分子的VL结构域。
39.权利要求35所述的方法，其中所述亲代分子包含抗体VL结构域和抗体VH结构域，并且所述诱变引物分子包含抗体VH结构域以突变所述亲代分子上的抗体VH结构域。
40.权利要求38所述的方法，其中第一和第二诱变引物用来突变所述亲代分子，所述第一诱变引物包含抗体VH结构域以突变所述亲代分子上的VH结构域，并且所述第二诱变引物包含抗体VL结构域以突变所述亲代分子上的VL结构域。
41.权利要求40所述的方法，其中所述第一和第二诱变引物被用在分开的诱变反应步骤中。
42.权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二诱变引物被用在同一个诱变反应步骤中。
43.权利要求38所述的方法，其中同时包含所述VH和所述VL结构域的单个诱变引物，被用于突变所述亲代分子上的所述VH和所述VL结构域。
44.根据权利要求34所述的方法，其中所述亲代分子包含编码scFv的核酸。
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