CN116323673A - 用于制备抗体文库和从其分离的抗体的方法和组合物 - Google Patents

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CN116323673A CN202180054747.3A CN202180054747A CN116323673A CN 116323673 A CN116323673 A CN 116323673A CN 202180054747 A CN202180054747 A CN 202180054747A CN 116323673 A CN116323673 A CN 116323673A
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J·B·拉克
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Abstract

本文提供的实施方式涉及抗体的产生和鉴定、抗体文库和在鸡中产生的抗体文库及其使用方法。

Description

用于制备抗体文库和从其分离的抗体的方法和组合物
技术领域
本申请涉及用于制备抗体文库和从其分离的抗体的方法和组合物。
发明内容
在一些实施方式中，提供了产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，所述方法包括：a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：所述第一引物退火至所述鸡抗体CDR的上游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且所述第二引物退火至所述鸡抗体CDR下游一定距离处的区域。在一些实施方式中，限制性位点可以在CDR的上游以产生第一核酸群。在一些实施方式中，限制性位点可以在CDR的下游以产生第一核酸群。
在一些实施方式中，提供了产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子文库的方法。在一些实施方式中，所述方法包括组合：i)编码鸡互补决定区1(CDR1)结构域的第一核酸分子文库，侧翼为编码人框架区1(FR1)和人框架区2(FR2)的核酸序列；ii)编码鸡互补决定区2(CDR2)结构域的第二核酸序列文库，侧翼为编码人框架区2(FR2)和人框架区3(FR3)的核酸序列；iii)编码鸡互补决定区3(CDR3)结构域的第三核酸序列文库，侧翼为编码人框架区3(FR3)和人框架区4(FR4)的核酸序列，其中所述编码抗体的人源化可变区的核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
在一些实施方式中，提供了核酸分子文库，其中所述文库是根据本文提供的方法制备的。
在一些实施方式中，提供了退火至鸡CDR紧上游的区域的寡核苷酸。在一些实施方式中，提供了退火至鸡抗体CDR紧上游的区域的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点由在识别位点下游一定距离处切割的限制酶识别。
在一些实施方式中，提供了由具有下式的核酸分子编码的多肽：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4，
其中所述核酸分子根据本文提供的方法制备。
在一些实施方式中，提供了鉴定靶标的结合配偶体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使靶标与由根据本文提供的方法制备的文库编码的蛋白质文库接触。
附图说明
图1例示了引物设计的非限制性实例。带下划线的序列代表IIS型限制酶AcuI的识别位点。
图2例示了用于从鸡抗体中提取CDR并将CDR嵌入侧翼人框架区的非限制性过程。
图3例示了来自根据本文提供的实施方式产生的抗体的单克隆scFv结合。例示了91个亲和力成熟的scFv克隆的靶标结合。将这些scFv提取物针对它们的靶抗原和作为对照的第二不相关膜蛋白进行了测试。条形图描绘了scFv提取物与靶抗原的结合。虚线表示20倍信号:背景比(靶标结合)。>50％的克隆显示比与不相关蛋白质的结合高20倍的靶标结合。
具体实施方式
如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个或一种(a)”、“一个或一种(an)”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“有”和“包括”及其变体，如本文所用，是指“包括但不限于”。虽然各种组合物和方法被描述为“包含”各种组分或步骤(解释为意指“包括但不限于”)，但组合物、方法和装置也可以“基本上由各种组分或步骤组成”或“由各种组分或步骤组成”，并且此类术语应解释为定义基本上封闭成员组。
本文提供的实施方式部分地涉及产生编码CDR的核酸分子文库的方法。这些CDR可以源自，例如，在鸡中产生的抗体。在一些实施方式中，文库包含编码包含三个CDR的多肽的核酸分子，每个CDR源自鸡抗体。
例如，在一些实施方式中，提供了产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)。
在一些实施方式中，所述方法包括：a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：所述第一引物退火至所述鸡抗体CDR的上游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且所述第二引物退火至所述鸡抗体CDR下游一定距离处的区域。在一些实施方式中，紧上游的切割是CDR边界的约1、2、3、4或5个核苷酸。在优选的实施方式中，紧上游的切割是CDR边界的约1、2或3个核苷酸。在一些实施方式中，第二引物退火至距离鸡抗体CDR下游不大于mRNA转录物长度处的区域。
在一些实施方式中，该方法进一步包括用所述限制酶消化扩增的核酸分子群以在编码CDR的序列的紧上游(例如，1、2、3或4个核苷酸碱基)产生5'突出端以产生消化产物。在优选的实施方式中，编码CDR的序列紧下游的5'突出端是CDR边界的1、2或3个核苷酸。在一些实施方式中，连接位点/突出端也可以是CDR中的残基。例如，CDR-L3和CDR-H3的5’连接位点是CDR上游的半胱氨酸。在一些实施方式中，这被认为是CDR的一部分，取决于CDR命名约定。因此，在一些实施方式中，突出端是CDR边界外的1(-1)或2(-2)个核苷酸。
在一些实施方式中，该方法包括通过将所述消化产物连接至编码人抗体的第一FR的核酸序列来制备第一连接产物，其中所述人抗体的第一FR在其3'端包含与所述消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得第一FR连接至第一消化产物的上游。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在足以产生编码鸡CDR的第二扩增的核酸分子群的条件下，用第三引物和第四引物制备第二扩增的核酸分子群，其中：所述第三引物退火至所述第一连接产物中存在的编码CDR的核酸序列紧下游的区域，其中所述第三引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且所述第四引物在所述连接产物中CDR上游一定距离处退火至所述第一连接产物中存在的编码第一FR的核酸分子的一部分。在一些实施方式中，紧下游的限制酶切割位点是CDR边界的约1、2、3、4或5个核苷酸。在优选的实施方式中，紧下游的限制酶切割位点是CDR边界的约1、2或3个核苷酸。在一些实施方式中，第四引物在连接产物中CDR上游一定距离处退火至第一连接产物中存在的编码第一FR的核酸分子的一部分，其中所述距离由第一FR的长度决定。在一些实施方式中，第一FR是FR1、FR2或FR3。
在一些实施方式中，该方法包括用所述限制酶消化第二扩增的核酸分子群以在编码CDR的序列的紧下游产生5'突出端以产生第二消化产物。在一些实施方式中，编码CDR的序列紧下游的5'突出端是CDR边界的约1、2、3、4或5个核苷酸。在优选的实施方式中，编码CDR的序列紧下游的5'突出端是CDR边界的1、2或3个核苷酸。
在一些实施方式中，该方法包括将第二消化产物连接至编码人抗体的第二FR的核酸序列以产生第二连接产物，其中所述第二FR在其5'端包含与所述第二消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得第二FR连接至第二消化产物的下游。
在一些实施方式中，该方法包括在足以产生编码侧翼为人抗体的两个FR的CDR的核酸分子群的条件下，用退火至人抗体的第一FR的第一FW引物和退火至人抗体的第二FR的第二引物扩增第二连接产物。
在一些实施方式中，CDR是鸡CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方式中，框架区(FR)是人FR1、FR2、FR3或FR4。在一些实施方式中，第一FR是人FR1并且第二FR是人FR2。在一些实施方式中，第一FR是人FR2并且第二FR是人FR3。在一些实施方式中，第一FR是人FR3并且第二FR是人FR4。
限制酶可以是任何合适的限制酶。在一些实施方式中，限制酶是IIS型酶。在一些实施方式中，IIS型酶是AcuI、BpmI、BpuEI、BsgI、MmeI或NmeAllI。在一些实施方式中，IIS型酶是AcuI、AlwI、Alw26I、BaeI、BbsI、BbsI-HF、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BmsI、BpiI、BpmI、BpuEI、BsaI、
Figure BDA0004108523820000051
v2(在BsaI位点酶切的IIS型限制酶)、BsaXI、BseRI、BseGI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmBI-v2、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI-v2、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Eco31I、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、LguI、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、Mva1269I、NmeAIII、PleI、SapI或SfaNI。
在一些实施方式中，该方法进一步包括产生编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸。在一些实施方式中，产生编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸的步骤包括对根据本文提供的方法产生的第一、第二和第三连接产物进行重叠PCR，其中：第一连接产物包含编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；第二连接产物包含编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且第三连接产物包含编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。
在一些实施方式中，产生编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸的步骤包括连接根据本文提供的方法产生的第一、第二和第三连接产物，其中：第一连接产物包含编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；第二连接产物包含编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且第三连接产物包含编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。
在一些实施方式中，编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
在一些实施方式中，编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的核酸分子编码抗体可变区。
在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有下式的核酸序列：
5’-(N)xR(N)n-3’，
其中，
R是识别序列；
N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基；
x为0-11；并且
n为1-21。
在一些实施方式中，R是CTGAAG、CGATC、ACNNNNGTAYC、GAAGAC、GCAGC、CCATC、ACGGC、CGANNNNNNTGC、GTATCC、GTCTC、ACCTGC、ACTGGG、CTGGAG、CTTGAG、GGTCTC、ACNNNNNCTCC、GAGGAG、GTGCAG、GTCTC、CGTCTC、GGGAC、GAATGC、CTCAG、ACCTGC、GCTCTTC、GCAATG、ACTGG、GCGATG、GGATG、GCAGTG、CAGTG、CAANNNNNGTGG、CTCTTC、GGCGGA、CGTCTC、CCCGC、GGATG、GACGC、GGTGA、CCTTC、GAAGA、GAGTC、TCCRAC、CCTC、GCCGAG、GAGTC、GCTCTTC或GCATC。式5’-R(N)n-3’，其中R是识别序列，N是任何核酸碱基，并且n＝1-21。在一些实施方式中，N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。在一些实施方式中，N是天然存在的核酸碱基，诸如C、G、A、T或U。在一些实施方式中，非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。在一些实施方式中，非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。在一些实施方式中，简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。在一些实施方式中，K是G或T/U。在一些实施方式中，M是A或C。在一些实施方式中，R是A或G。在一些实施方式中，Y是C或T/U。在一些实施方式中，S是C或G。在一些实施方式中，W是A或T/U。在一些实施方式中，B是C或G或T/U。在一些实施方式中，D是A或G或T/U。在一些实施方式中，H是A或C或T/U。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:45)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CGATCNNNN-3’(SEQ ID NO:46)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-NNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:47)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GAAGACNN-3’(SEQ ID NO:48)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCAGCNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:49)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CCATCNNNN-3’(SEQ ID NO:50)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-ACGGCNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:51)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-NNNNNNNNNNCGANNNNNNTGCNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:52)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GTATCCNNNNNN-3’(SEQ ID NO:53)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GTCTCN-3’(SEQ ID NO:49)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-ACCTGCNNNN-3’(SEQ ID NO:55)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-ACTGGGNNNNN-3’(SEQ ID NO:56)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:57)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CTTGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:58)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GGTCTCN-3’(SEQ ID NO:59)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-NNNNNNNNNACNNNNNCTCCNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:60)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GAGGAGNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:61)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GTGCAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:62)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GTCTCN-3’(SEQ ID NO:49)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CGTCTCN-3’(SEQ ID NO:63)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GGGACNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:64)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GAATGCN-3’(SEQ ID NO:65)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CTCAGNNNNNNNNN-3’(SEQ IDNO:66)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-ACCTGCNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCTCTTCN-3’(SEQ ID NO:67)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCAATGNN-3’(SEQ ID NO:68)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-ACTGGN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCGATGNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GGATGNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCAGTGNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CAGTGNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-NNNNNNNNNNNCAANNNNNGTGGNNNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CTCTTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GGCGGANNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CGTCTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CCCGCNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GGATGNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GACGCNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GGTGANNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CCTTCNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GAAGANNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GAGTCNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-CCTCNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GAGTCNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCTCTTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，第一引物和第三引物包含含有5’-GCATCNNNNN-3’的序列的核酸序列。
本文还提供了产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子文库的方法。在一些实施方式中，所述方法包括组合：i)编码鸡互补决定区1(CDR1)结构域的第一核酸分子文库，侧翼为编码人框架区1(FR1)和人框架区2(FR2)的核酸序列；ii)编码鸡互补决定区2(CDR2)结构域的第二核酸序列文库，侧翼为编码人框架区2(FR2)和人框架区3(FR3)的核酸序列；iii)编码鸡互补决定区3(CDR3)结构域的第三核酸序列文库，侧翼为编码人框架区3(FR3)和人框架区4(FR4)的核酸序列，其中所述编码抗体的人源化可变区的核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
在一些实施方式中，组合包括连接第一、第二和第三核酸分子文库以产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子。在一些实施方式中，组合包括用第一、第二和第三核酸分子文库进行重叠PCR以产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子。在一些实施方式中，这是连续进行的。
本文还提供了根据本文提供的任一种方法制备的核酸分子文库。在一些实施方式中，文库包含核酸分子群，所述群的多个核酸分子编码具有下式的多肽：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
在一些实施方式中，文库包含存在于文库中的至少两种编码不同多肽的核酸分子。
在一些实施方式中，提供了退火至鸡抗体CDR紧上游的区域的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点由在识别位点下游一定距离处切割的限制酶识别。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有下式的核酸序列的序列：
5’-(N)xR(N)n-3’，
其中，
R是识别序列；
N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基；
x为0-11；并且
n为1-21。
在一些实施方式中，R是CTGAAG、CGATC、ACNNNNGTAYC、GAAGAC、GCAGC、CCATC、ACGGC、CGANNNNNNTGC、GTATCC、GTCTC、ACCTGC、ACTGGG、CTGGAG、CTTGAG、GGTCTC、ACNNNNNCTCC、GAGGAG、GTGCAG、GTCTC、CGTCTC、GGGAC、GAATGC、CTCAG、ACCTGC、GCTCTTC、GCAATG、ACTGG、GCGATG、GGATG、GCAGTG、CAGTG、CAANNNNNGTGG、CTCTTC、GGCGGA、CGTCTC、CCCGC、GGATG、GACGC、GGTGA、CCTTC、GAAGA、GAGTC、TCCRAC、CCTC、GCCGAG、GAGTC、GCTCTTC或GCATC。在一些实施方式中，N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。在一些实施方式中，N是天然存在的核酸碱基，诸如C、G、A、T或U。在一些实施方式中，非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。在一些实施方式中，非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。在一些实施方式中，简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。在一些实施方式中，K是G或T/U。在一些实施方式中，M是A或C。在一些实施方式中，R是A或G。在一些实施方式中，Y是C或T/U。在一些实施方式中，S是C或G。在一些实施方式中，W是A或T/U。在一些实施方式中，B是C或G或T/U。在一些实施方式中，D是A或G或T/U。在一些实施方式中，H是A或C或T/U。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:45)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CGATCNNNN-3’(SEQ ID NO:46)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-NNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ IDNO:47)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GAAGACNN-3’(SEQ IDNO:48)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCAGCNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:49)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CCATCNNNN-3’(SEQ ID NO:50)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-ACGGCNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:51)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-NNNNNNNNNNCGANNNNNNTGCNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:52)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GTATCCNNNNNN-3’(SEQ ID NO:53)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GTCTCN-3’(SEQ ID NO:49)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-ACCTGCNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-ACTGGGNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CTTGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GGTCTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-NNNNNNNNNACNNNNNCTCCNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GAGGAGNNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GTGCAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:62)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GTCTCN-3’(SEQ ID NO:49)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CGTCTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GGGACNNNNNNNNNN-3的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GAATGCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CTCAGNNNNNNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-ACCTGCNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCTCTTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCAATGNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-ACTGGN-3’(SEQ ID NO:69)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCGATGNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:70)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GGATGNN-3’(SEQ ID NO:71)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCAGTGNN-3’(SEQ ID NO:72)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CAGTGNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-NNNNNNNNNNNCAANNNNNGTGGNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:73)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CTCTTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GGCGGANNNNNNNNNNN-3’(SEQID NO:74)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CGTCTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CCCGCNNNN-3’(SEQ ID NO:75)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GGATGNNNNNNNNN-3’(SEQ IDNO:76)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GACGCNNNNN-3’(SEQID NO:77)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GGTGANNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:78)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CCTTCNNNNNN-3’(SEQ ID NO:79)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GAAGANNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:80)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GAGTCNNNNN-3’(SEQ ID NO:81)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:82)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-CCTCNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:83)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ IDNO:84)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GAGTCNNNN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCTCTTCN-3’的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含含有5’-GCATCNNNNN-3’(SEQ ID NO:85)的序列的核酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸如本文所提供或描述。
在一些实施方式中，提供了由具有下式的核酸分子编码的多肽：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。在一些实施方式中，核酸分子根据本文提供的任何方法制备。
在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:2的序列或与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ IDNO:3的序列或与SEQ ID NO:3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQID NO:4的序列或与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:5的序列或与SEQ ID NO:5至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:43的序列或与SEQ ID NO:43至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:6的序列或与SEQ ID NO:6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:7的序列或与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:8的序列或与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，用于产生文库诸如人框架受体片段的引物组包含SEQ ID NO:9的序列或与SEQ ID NO:9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列或与SEQ IDNO:2和/或SEQ ID NO:3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的序列或与SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:43的序列或与SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:43至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的序列或与SEQ IDNO:6和/或SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的序列或与SEQ IDNO:8和/或SEQ ID NO:9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。虽然本文提供的序列可以用5'生物素化来例示，但也可以使用执行与生物素类似功能的其他标签，或者可以使用生物素的其他修饰形式。
在一些实施方式中，引物组用于产生可用于生成CDR组的框架受体片段。在一些实施方式中，产生了4种不同的人框架区受体片段。在一些实施方式中，所产生的受体片段的序列如实施例部分的表3中所提供。在一些实施方式中，框架受体片段，其在一些实施方式中可以对应于FR1-CDRH1-FR2片段,包含SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。除了侧翼框架FR1和FR2之外，该框架受体片段可以例如包含人VH3-23种系CDR1区(CDRH1)。该片段可以例如使用包含SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3的引物组或者与SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的引物组来产生。
在一些实施方式中，可对应于框架3区(FR3)的框架受体片段包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:44的序列或者与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。该片段可以例如包含单个框架区FR3，其具有例如在末端的突出端，所述FR3区域可在该末端连接至人VH3-23基因的CDR2区。在一些实施方式中，该受体片段是使用包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物组或者包含SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:43或者与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:43至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的引物组生成的。在一些实施方式中，提供了包含FR3区的一部分的受体片段，其可以例如包含在末端具有突出端的单个框架区FR3，所述FR3区在该末端连接至人VH3-23基因的CDR3区。该片段例如可包含SEQ ID NO:12的序列或与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中,该片段可以例如使用包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7的引物组或者与SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的引物组来产生。
在一些实施方式中，提供了对应于抗体的FR4部分的片段。在一些实施方式中，片段包含SEQ ID NO:13的序列或与SEQ ID NO:13至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中,该片段可以例如使用包含SEQ IDNO:8和/或SEQ ID NO:9的引物组或者与SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的引物组来产生。
在一些实施方式中，抗体的CDR2区可以从免疫鸡的B细胞中产生。在一些实施方式中，CDR2区从cDNA扩增，所述cDNA由源自(提取自)免疫鸡的B细胞的RNA制备。CDR2片段可以例如使用引物扩增，诸如表4中所列的那些引物，其包括但不限于包含以下的引物：SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列或与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQID NO:36至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:14的序列，或与SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列,以及SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:36中的一个，或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中的一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。该序列在某些位置提供简并性，其中简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H，其中K是G或T/U；M是A或C；R是A或G；Y是C或T/U；S是C或G；W是A或T/U；B是C或G或T/U；D是A或G或T/U；A或C或T/U。
不受任何特定理论的束缚，这些引物库包含简并碱基以便对尽可能多的鸡免疫组库进行采样。这些引物例如可以包含AcuI限制酶识别位点(表4中的CTGAAG)，其定位使得限制酶的切割在期望连接点处留下突出端，用于连接至人框架区受体片段。其他限制性位点可用于生成类似的突出端。这些引物也可以例如在5'端进行生物素化，以捕获到链霉亲和素磁珠上并通过AcuI消化释放。5'生物素只是一个实例，其他结合部分可以用来代替生物素，并与已知的捕获系统一起使用。在一些实施方式中，包括生物素(捕获结合部分)和AcuI识别位点(或其他使用的限制性位点)之间的随机间隔序列以改善消化效率。
在一些实施方式中，片段产生后用限制酶(诸如但不限于AcuI)消化，以产生在末端具有突出端的CDR2，CDR2在该末端连接至FR3区。然后，CDR3片段可以例如连接至FR3受体片段，诸如但不限于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:44，或者与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。然后可以扩增该连接产物。产生的扩增产物可以是例如CDR2-FR3，其在末端具有突出端，CDR2在该末端连接到FR2。
在一些实施方式中，CDR2-FR3片段连接至FR1-CDR1-FR2人框架区受体片段，诸如SEQ ID NO:10的序列或与SEQ ID NO:10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。(SEQ ID NO:10)。连接后，连接产物FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3片段可用作PCR扩增的模板，以生成侧翼为人VH3-23 FR1-CDR1-FR2和FR3的VH CDR2。然后可以将其与如本文所提供的产生的CDR3区结合。
在一些实施方式中，CDR3区可以从cDNA中扩增，所述cDNA由提取自免疫鸡的B细胞的RNA制备。在一些实施方式中，通过PCR和消化反应提取CD3。然后可以将CDR3片段连接到人框架区受体片段上，生成包含侧翼为人框架区的鸡CDR3的片段。其非限制性实例在图2中例示。在一些实施方式中，可以使用的引物包括但不限于包含SEQ ID NO:23-30或37-42的序列。在一些实施方式中，引物组包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:42中的一个以及SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQID NO:42中的一个。在一些实施方式中，引物组包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:42中的一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列,以及与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41或SEQ ID NO:42中的一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。该序列提供在某些位置包含简并性，其中简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H，其中K是G或T/U；M是A或C；R是A或G；Y是C或T/U；S是C或G；W是A或T/U；B是C或G或T/U；D是A或G或T/U；A或C或T/U。如本文所提供，引物可包含限制酶识别位点，诸如但不限于AcuI限制酶识别位点，其定位使得限制酶的切割在期望连接点处留下突出端，用于连接至人框架区受体片段。这些引物可以在5'端进行生物素化，以捕获到链霉亲和素磁珠上并通过AcuI消化释放。其他标签或捕获试剂可用于执行类似的功能。在一些实施方式中，可以在生物素和AcuI识别位点之间使用随机间隔序列，以例如改善消化效率。
在一些实施方式中，提供了鉴定靶标的结合配偶体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使靶标与由根据本文提供的方法制备的文库编码的蛋白质文库接触并且检测靶标的结合配偶体。靶标可以是任何靶标。在一些实施方式中，靶标是多次跨膜蛋白。在一些实施方式中，靶蛋白存在于病毒样颗粒诸如脂质体纳米粒的表面上。可以根据任何方法生成包含多次跨膜蛋白的脂质体纳米粒。例如，美国专利号9,902,765、9,213,027、8,574,590和8,377,691，其每一个的全部内容均通过援引并入本文。在一些实施方式中，结合配偶体是抗体。在一些实施方式中，抗体是scFv形式或本文提供的其他形式。
如本文所述，本文提供的文库可用于产生和/或鉴定抗体。抗体可用于多种用途，诸如治疗、诊断试剂、检测试剂等。
本文所用的术语“抗体”具有广义含义，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体，包括鼠、人、人源化和嵌合单克隆抗体和抗体片段，诸如ScFv或hexabody(PLOS Biology|DOI:10.1371/journal.pbio.1002344January 6,2016，其全部内容通过援引并入本文)。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA、mRNA或病毒RNA)中特定核苷酸序列的固有特性，以作为生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，诸如引入重组多核苷酸的黏粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在一些实施方式中，表达载体是如本文所述的甲病毒。
如本文所用，术语“人源化抗体”、“工程化抗体”、“适应人框架”和“HFA”旨在包括具有源自人源序列的可变区框架的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区可源自这样的人序列，例如人种系序列，或人种系序列的天然存在的(例如，同种异型)或突变形式。人源化抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
通常，抗体是表现出对特定抗原的结合特异性的蛋白质或多肽。完整抗体是由两条相同的轻链和两条相同的重链构成的异四聚体糖蛋白。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间有所不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链具有在一端的可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。每条轻链都具有在一端的可变结构域(VL)以及在其另一端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。任何脊椎动物物种的抗体轻链都可以基于其恒定结构域的氨基酸序列分为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。根据重链恒定结构域氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五种主要类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步细分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体、单链抗体分子和由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体。
本文所用的术语“抗原”是指具有直接或间接生成抗体能力的任何分子。“抗原”的定义中包括编码蛋白质的核酸。
如本文所用，“特异性结合”或“免疫特异性结合”或“免疫特异性地结合”是指抗体与预定抗原或抗原上存在的表位结合。在一些实施方式中，抗体以10-7M或更小的解离常数(KD)结合，并且以比其结合预定抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白或其他非特异性多肽)的KD小至少两倍的KD结合预定抗原。短语“识别抗原/蛋白质/靶标的抗体”和“对抗原/蛋白质/靶标具有特异性的抗体”在本文中可与术语“免疫特异性结合抗原/蛋白质/靶标的抗体”互换使用。
“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4thed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR或CDR区。因此，如果合适的话，本文所用的“CDR”是指所有三个重链CDR，或所有三个轻链CDR，或所有重链和所有轻链CDR。
CDR提供了用于抗体与抗原或表位结合的大部分接触残基。感兴趣的CDR可以源自供体抗体可变重链和轻链序列，并且包括天然存在的CDR的类似物，这些类似物也共享或保留与它们所源自的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
术语“同系物”是指与参考序列具有40％至100％序列同一性的蛋白质序列。可以使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen Corp.,Carslbad,Calif.)的AlignX模块的默认设置通过成对比对确定两条肽链之间的百分比同一性。在一些实施方式中，抗体或其片段与本文描述的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，与本文描述的序列相比，抗体具有保守置换。在一些实施方式中，置换的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8或9。这些基于％同一性或置换而不同的分子也可以称为“变体”。在表1所示的在重链和轻链序列中具有保守置换的抗体涵盖在所公开主题的范围内。保守置换可以位于框架区中或抗原结合位点中，只要它们不会对抗体的特性产生不利影响即可。可以进行置换以改善抗体特性，例如稳定性或亲和力。保守置换将产生具有与进行此类修饰的分子相似的功能和化学特征的分子。示例性氨基酸置换显示在下表中。
Figure BDA0004108523820000231
Figure BDA0004108523820000241
如本文所用，术语“联合”是指所述剂可以在混合物中一起、作为单一剂同时或作为单一剂以任何顺序依次给药于动物。
多克隆抗体是源自用抗原免疫的动物血清的异质抗体分子群。单克隆抗体包含对抗原具有特异性的基本上同质的抗体群，该群包含基本上相似的表位结合位点。MAb可以通过本领域技术人员已知的方法获得。参见例如Kohler and Milstein,Nature 256:495 497(1975)；美国专利号4,376,110；Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1987,1992)；以及Harlow and Lane ANTIBODIES:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；Colligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene PublishingAssoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)，所述参考文献的内容通过援引全部并入本文。这样的抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亚类。可以在体外、原位或体内培养产生mAb的杂交瘤。在体内或原位生产高效价的mAb使其成为目前优选的生产方法。
嵌合抗体是不同部分源自不同动物物种的分子，诸如具有源自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子，其主要用于降低应用中的免疫原性和提高生产产率，例如，其中鼠mAb具有更高的从杂交瘤的产率，但在人中具有更高的免疫原性，因此使用人/鼠嵌合mAb。嵌合抗体及其生产方法是本领域已知的(Cabilly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:32733277(1984)；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851 6855(1984)；Boulianne et al.,Nature 312:643 646(1984)；Cabilly et al.,欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Neuberger etal.,Nature 314:268 270(1985)；Taniguchi et al.,欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)；Morrison etal.,欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger et al.,PCT申请WO 86/01533,(1986年3月13日公开)；Kudo et al.,欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Morrison et al.,欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Sahagan etal.,J.Immunol.137:1066 1074(1986)；Robinson et al.,国际专利申请WO 1987/002671(1987年5月7日公开)；Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439 3443(1987)；Sunet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214 218(1987)；Better et al.,Science 240:10411043(1988)；以及Harlow and Lane Antibodies.a Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory(1988))。这些参考文献通过援引全部并入本文。
抗独特型(抗-Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。Id抗体可以通过用正在为其制备抗-Id的mAb免疫作为mAb来源的相同物种和遗传类型(例如，小鼠品系)的动物来制备。免疫动物将通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-Id抗体)来识别和响应于免疫抗体的独特型决定簇。参见，例如，美国专利号4,699,880，其全部内容通过援引并入本文。抗-Id抗体也可用作“免疫原”以在另一种动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id可以与诱导抗-Id的原始mAb在表位上相同。因此，通过使用针对mAb独特型决定簇的抗体，可以鉴定表达具有相同特异性的抗体的其他克隆。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)是指从基本上均质的抗体群获得的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体具有高度特异性，通常针对单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的基本上均质的特性，不需要通过任何特定方法产生抗体。例如，鼠mAb可以通过Kohler et al.,Nature 256:495-497(1975)的杂交瘤方法制备。可以通过美国专利号4,816,567所公开的方法制备嵌合mAb，其包含源自供体抗体(通常是鼠)的轻链和重链可变区以及源自受体抗体(通常是另一种哺乳动物物种，诸如人)的轻链和重链恒定区。可以通过Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:10029-10032(1989)和Hodgson et al.,Bio/Technology,9:421(1991)中公开的技术获得人源化mAb,其具有源自非人供体免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR，并且分子的其余免疫球蛋白衍生部分源自一种或多种人免疫球蛋白，可选地具有改变的框架支撑残基以保持结合亲和力。
除了本文所述的抗体之外，可用于人源化的示例性人框架序列公开于，例如，www“dot”ncbi“dot”nlm“dot”nih“dot”gov/entrez/query“dot”fcgi；www“dot”ncbi“dot”nih“dot”gov/igblast；www“dot”atcc“dot”org/phage/hdb“dot”html；www“dot”mrc-cpe“dot”cam“dot”ac“dot”uk/ALIGNMENTS“dot”php；“dot”www“dot”kabatdatabase“dot”com/top“dot”html；ftp“dot”ncbi“dot”nih“dot”gov/repository/kabat；www“dot”sciquest“dot”com；www“dot”abcam“dot”com；www“dot”antibodyresource“dot”com/onlinecomp“dot”html；www“dot”public“dot”iastate“dot”edu/“dot”about“dot”pedro/research_tools“dot”html；www“dot”whfreeman“dot”com/immunology/CH05/kuby05“dot”htm；www“dot”hhmi“dot”org/grants/lectures/1996/vlab；www“dot”path“dot”cam“dot”ac“dot”uk/“dot”about“dot”mrc7/mikeimages“dot”html；mcb“dot”harvard“dot”edu/BioLinks/Immunology“dot”html；www“dot”immunologylink“dot”com；pathbox“dot”wustl“dot”edu/“dot”about“dot”hcenter/index“dot”html；www“dot”appliedbiosystems“dot”com；www“dot”nal“dot”usda“dot”gov/awic/pubs/antibody；www“dot”m“dot”ehime-u“dot”ac“dot”jp/“dot”about“dot”yasuhito/Elisa“dot”html；www“dot”biodesign“dot”com；www“dot”cancerresearchuk“dot”org；www“dot”biotech“dot”ufl“dot”edu；www“dot”isac-net“dot”org；baserv“dot”uci“dot”kun“dot”nl/“dot”about“dot”jraats/links1“dot”html；www“dot”recab“dot”uni-hd“dot”de/immuno“dot”bme“dot”nwu“dot”edu；www“dot”mrc-cpe“dot”cam“dot”ac“dot”uk；www“dot”ibt“dot”unam“dot”mx/vir/V_mice“dot”html；http://www“dot”bioinf“dot”org“dot”uk/abs；antibody“dot”bath“dot”ac“dot”uk；www“dot”unizh“dot”ch；www“dot”cryst“dot”bbk“dot”ac“dot”uk/“dot”about“dot”ubcg07s；www“dot”nimr“dot”mrc“dot”ac“dot”uk/CC/ccaewg/ccaewg“dot”html；www“dot”path“dot”cam“dot”ac“dot”uk/“dot”about“dot”mrc7/humanisation/TAHHP“dot”html；www“dot”ibt“dot”unam“dot”mx/vir/structure/stat_aim“dot”html；www“dot”biosci“dot”missouri“dot”edu/smithgp/index“dot”html；www“dot”jerini“dot”de；imgt“dot”cines“dot”fr；以及Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Dept.Health(1987),每一个都通过援引整体并入本文。本文引用的万维网地址中的“点”适当时可以用“.”代替。
本文所述的抗体可包括但不限于重链恒定区(Hc)、重链可变区(Hv)、轻链可变区(Lv)和轻链恒定区(Lc)中的至少一个，其中多克隆Ab、单克隆Ab、其片段和/或区域包括至少一个重链可变区(Hv)或轻链可变区(Lv)，其结合靶标的一部分并可用于检测抗原。抗体也可以是通过免疫鸡产生的单克隆抗体。来自编码分离的单克隆抗体的核酸序列的可变链可以通过使用技术诸如但不限于PCR来分离。然后可以将通过这些技术分离的可变链置于具有人Fc的scFv载体中。因此，抗体可以是具有人Fc和两个scFv臂的抗体。然后可以将抗体(诸如本文和整个本公开描述的那些抗体)修饰为人抗体或人源化抗体。如何修饰抗体(包括鸡抗体)的实例可以在例如以下中找到：Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G(1988).Reshaping human antibodies for therapy”.Nature 332(6162):332–323；Tsurushita N,Park M,Pakabunto K,Ong K,Avdalovic A,Fu H,Jia A,Vásquez M,KumarS.(2004)；以及“Humanization of a chicken anti-IL-12monoclonal antibody”ImmunolMethods 295(1-2):9-19；Nishibori N,Horiuchi H,Furusawa S,Matsuda H.(2006)“Humanization of chicken monoclonal antibody using phage display system”MolImmunol.43(6):634-42，其各自通过援引整体并入。
用于通过竞争性抑制确定mAb特异性和亲和力的方法可在以下中找到：Harlow,etal.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988),Colligan et al.,eds.,Current Protocols inImmunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)，以及Muller,Meth.Enzymol.92:589 601(1983)，其参考文献通过援引整体并入本文。
如本文所用，术语“抗原结合区”是指抗体分子的部分，其包含与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗体区域包括维持抗原结合残基的正确构象所必需的“框架”氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合区是鼠源的。在一些实施方式中，抗原结合区可源自其他动物物种，特别是啮齿动物诸如兔、大鼠或仓鼠，或禽类诸如鸡。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括Fab片段，一种具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab)2片段，一种包含通过铰链区的一个或多个二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；具有VH和CH1结构域的Fd片段；具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；结构域抗体或dAb片段(Ward et al.,1989Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及分离的互补决定区(CDR)，尤其是CDR3(参见例如WO03/025019，其内容通过援引并入本文)。
“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。不同轻链(即L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)或重链(即H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)的框架区序列在一个物种内相对保守。因此，“人框架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的框架区基本上相同(约85％或更多，通常90-95％或更多)的框架区。抗体的框架区(即组分轻链和重链的组合框架区)用于定位和对齐CDR。重链和轻链二者的可变区的四个框架亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)被如Kabat数据库(Kabat et al.,Variable region genes for theimmunoglobulin framework are assembled from small segments of DNA—ahypothesis,PNAS 75(5):2429-33,1978)中所定义的三段高变序列或互补决定区(CDR)中断，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，以及CDR3位于FR3和FR4之间。没有将特定的亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4时，框架区(如其他人所称)代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文所用，FR代表四个亚区之一，并且FR's代表构成框架区的四个亚区中的两个或更多个。不同轻链或重链的框架区序列在物种内相对保守。
术语“互补决定区(CDR)”基于序列可变性(Wu and Kabat,J.Exp.Med.132:211-250,1970)。有六个CDR——三个在可变重链或VH中，通常命名为H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且三个CDR在可变轻链或VL中，通常命名为L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域中结构可变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia and Lesk,Mol.Biol.196:901-917,1987)。有六个HVR，三个在VH中(H1、H2、H3)并且三个在VL中(L1、L2、L3)。Chothia和Lesk将结构上保守的HV称为“规范结构”。Lefranc(Lefranc et al.,Developmental&Comparative Immunology27:55-77,2003)基于来自免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域的比较，提出了另一种描述形成抗原结合位点的区域的方法(Lefranc etal.,Developmental&Comparative Immunology 27:55-77,2003)。根据Almagro(Almagro,Mol.Recognit.17:132-43,2004)，抗原结合位点也可以基于“特异性决定残基使用(Specificity Determining Residue Usage)(SDRU)”来描述，其中SDRU是指直接参与抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH天然由分开的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头连接它们，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird et al.,1988Science 242:423-426；以及Hustonet al.,1988Proc.Nat.Acad.Sci.85:5879-5883)。此类单链抗体涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且可以以与完整抗体相同的方式使用。
如本文所用，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。分离的抗体也可以是无菌的或无热原的或配制为本文所述的可注射药物。
“抗原”是能够被抗体结合的分子或分子的一部分，该抗体另外能够诱导动物产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可具有一个或多于一个表位。上面提到的特异性反应旨在表明,抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不与可由其他抗原引起的大量其他抗体反应。在一些实施方式中，结合抗体、抗体片段和区域的抗原包括至少5个氨基酸。在一些实施方式中，细胞是完整细胞。完整细胞是未使用去污剂或其他试剂裂解或破开的细胞。已经用破坏细胞膜或在细胞膜上打孔的去污剂或其他试剂处理的细胞不是完整细胞。通过在细胞或颗粒(例如脂质体纳米粒)表面上表达受体，受体可以呈现构象表位，如果使用纯化的蛋白质，这些表位可能不存在。本文提供了实例。在一些实施方式中，不使用佐剂，但可以使用佐剂。在一些实施方式中，将颗粒注射到禽类(例如鸡)体内以刺激免疫应答并生成针对颗粒表面上存在的蛋白质的抗体。适用于生成抗体的颗粒在美国专利号：8,377,691、7,763,258、8,158,130和美国专利申请公开号20050123563和20120195882中有所描述，它们各自通过援引并入本文。这些出版物和专利描述了可用于表达跨膜蛋白(例如多次跨膜蛋白、离子通道等)的各种颗粒(包括脂质体纳米粒)的生成。
术语“表位”是指任何分子的能够在Ab的一个或多个抗原结合区被抗体识别和结合的部分。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位的实例包括但不限于。
如本文所用，术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由嵌合H链通过二硫桥与嵌合L链缔合形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是由两个HL二聚体通过至少一个二硫桥缔合形成的四聚体(H2L2)。也可以产生多价嵌合抗体，例如，通过使用聚集的CH区(例如，来自IgM H链或μ链)。在一些实施方式中，鼠和嵌合抗体、片段和区域包含单独的重(H)/或轻(L)免疫球蛋白链。
具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合H链和L链的抗体、片段或衍生物也可以根据已知的方法步骤通过各个多肽链的适当缔合来制备，例如，根据下文的Ausubel、下文的Harlow和下文的Colligan，其参考文献的内容通过援引完全并入本文。使用这种方法，表达嵌合H链(或其衍生物)的宿主与表达嵌合L链(或其衍生物)的宿主分开培养，并且免疫球蛋白链被分别回收然后缔合。替代地，可以将宿主共培养，并且使链在培养基中自发缔合，然后回收组装的免疫球蛋白、片段或衍生物。
杂交细胞通过非人抗体产生细胞通常是针对天然或重组抗原或抗原蛋白序列的肽片段免疫的动物的脾细胞的融合形成。替代地，非人抗体产生细胞可以是从用抗原免疫的动物的血液、脾脏、淋巴结或其他组织中获得的B淋巴细胞。
提供永生化功能的第二融合配偶体可以是淋巴样干细胞或浆细胞瘤或骨髓瘤细胞，其本身不是抗体产生细胞，而是恶性的。融合配偶体细胞包括但不限于杂交瘤SP2/0-Ag14，缩写为SP2/0(ATCC CRL1581)和骨髓瘤P3X63Ag8(ATCC TIB9)，或其衍生物。参见例如下文的Ausubel、下文的Harlow和下文的Colligan，其参考文献的内容通过援引完全并入本文。
可以根据本文提供的实例生成抗体。一旦序列已知，也可以根据已知方法生成抗体。抗体也可以转化为不同的类型，诸如转化为人IgG等。通过将抗体转化为人抗体，人受试者不应将抗体识别为外来物。这将导致更有效的响应。将非人IgG抗体转化为人IgG抗体是众所周知的，并且一旦知道天然序列就可以按常规进行。如本文所讨论，可根据已知方法对抗体进行修饰。这样的方法描述于例如以下中：Riechmann L,Clark M,Waldmann H,WinterG(1988).Reshaping human antibodies for therapy”.Nature 332(6162):332–323；Tsurushita N,Park M,Pakabunto K,Ong K,Avdalovic A,Fu H,Jia A,Vásquez M,KumarS.(2004)；以及“Humanization of a chicken anti-IL-12monoclonal antibody”ImmunolMethods 295(1-2):9-19；Nishibori N,Horiuchi H,Furusawa S,Matsuda H.(2006)“Humanization of chicken monoclonal antibody using phage display system”MolImmunol.43(6):634-42，其各各自通过援引整体并入。
贡献编码嵌合抗体的抗原结合区的核苷酸序列的抗体产生细胞也可以通过转化非人(诸如灵长类动物)或人细胞来产生。例如，产生抗体的B淋巴细胞可以被病毒(诸如爱泼斯坦-巴尔病毒)感染和转化，以生产永生化的抗体产生细胞(Kozbor et al.,Immunol.Today 4:72 79(1983))。替代地，可通过提供转化基因或转化基因产物来转化B淋巴细胞，如本领域所熟知的。参见例如下文的Ausubel、下文的Harlow和下文的Colligan，其参考文献的内容通过援引完全并入本文。
细胞融合通过免疫学领域技术人员熟知的标准程序完成。用于融合和选择杂交瘤以及筛选mAb的融合配偶体细胞系和方法是本领域众所周知的。参见例如下文的Ausubel、下文的Harlow和下文的Colligan，其参考文献的内容通过援引完全并入本文。
可以通过将分泌抗体的杂交瘤或转染瘤细胞注射到小鼠的腹膜腔中，并在适当的时间后，收集含有高滴度的mAb的腹水并从中分离mAb来大量产生抗原特异性鼠或嵌合mAb。对于这种用非鼠类杂交瘤(例如大鼠或人)体内产生mAb，杂交瘤细胞优选地在受辐射或无胸腺的裸鼠中生长。替代地，可以通过在体外培养杂交瘤或转染瘤细胞并从细胞培养基中分离分泌的mAb来产生或在真核或原核细胞中重组产生抗体。
可以修饰抗体的序列以生产人IgG抗体。可以修饰本文提供的序列的转化以生产其他类型的抗体。CDR也可以与其他抗体、蛋白质或分子连接，以产生与靶标结合的抗体片段。本文提供的CDR和抗体序列也根据已知方法人源化或完全人化。也可以将序列制成本文所述的嵌合抗体。
在一些实施方式中，抗体包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含本文提供的序列或其片段。在一些实施方式中，抗体包含如本文提供的一个或多个氨基酸序列、其抗原结合片段或其人IgG变体。“其人IgG变体”是指当起始抗体不是人IgG抗体时已经被修饰成人IgG的抗体。
如本文所述，具有已知序列的抗体的产生是常规的并且可以通过任何方法进行。因此，在一些实施方式中，提供了编码抗体或其片段的核酸。在一些实施方式中，核酸编码本文提供的序列。也可将抗体修饰为嵌合抗体或人抗体。抗体也可用在可注射药物组合物中。同样如本文所述，抗体可以是分离的抗体或工程抗体。
在一些实施方式中，提供了抗体、其片段、区域或衍生物的“衍生物”，该术语包括由截短或修饰的基因编码的那些蛋白质，以生产功能上类似于免疫球蛋白片段的分子种类。修饰包括但不限于添加编码细胞毒性蛋白(诸如植物和细菌毒素)的基因序列。修饰还可以包括报告蛋白，诸如荧光或化学发光标签。片段和衍生物可以以任何方式产生。
片段包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。这些片段缺少完整抗体的Fc片段，从循环中清除得更快，并且可以具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316 325(1983))。这些片段是使用本领域熟知的方法从完整抗体产生的，例如通过用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')f片段)进行蛋白水解切割。
由本文描述的Ab识别的这些抗原结合区和/或表位的鉴定提供了生成具有与本申请的实施方式相似的相似结合特征和治疗或诊断效用的额外单克隆抗体所必需的信息。
编码本文所述抗体的核酸序列可以是基因组DNA或cDNA，或编码至少一个本文所述可变区的RNA(例如mRNA)。使用染色体基因片段作为编码V区抗原结合区段的DNA来源的一种方便的替代方案是使用cDNA构建嵌合免疫球蛋白基因，例如Liu et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 84:3439(1987)和J.Immunology 139:3521(1987)报道的，其参考文献通过援引完全并入本文。cDNA的使用需要适合宿主细胞的基因表达元件与基因结合，以实现期望蛋白质的合成。cDNA序列的使用优于基因组序列(其包含内含子)，因为cDNA序列可以在细菌或其他缺乏适当RNA剪接系统的宿主中表达。
例如，基于本文提供的氨基酸序列的使用，可以使用已知方法提供编码能够检测、结合或中和靶标的V区抗原结合区段的cDNA。因为遗传密码是简并的，所以可以使用多个密码子来编码特定的氨基酸(Watson,et al.,见下文)。使用遗传密码，可以鉴定一种或多种不同的寡核苷酸，其每一种都能够编码氨基酸。事实上，特定寡核苷酸将构成实际编码序列的概率可以通过考虑异常碱基配对关系和特定密码子在表达抗体或片段的真核或原核细胞中实际使用(编码特定氨基酸)的频率来估计。此类“密码子使用规则”由Lathe,et al.,J.Molec.Biol.183:1 12(1985)公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，鉴定包含能够编码抗体可变区或恒定区序列的理论上“最可能的”核苷酸序列的单个寡核苷酸或一组寡核苷酸。
本文所述的可变区可以与任何类型的恒定区结合，包括人恒定区或鼠恒定区。编码抗体、片段和区域的恒定(C)区的人基因可以通过已知方法源自人类胎儿肝脏文库。人C区基因可源自任何人细胞，包括表达和产生人免疫球蛋白的那些细胞。人CH区可源自人H链的任何已知类别或同种型，包括γ、μ、α、δ或ε，以及其亚型，诸如G1、G2、G3和G4。由于H链同种型负责抗体的各种效应子功能，因此CH区的选择将由期望的效应子功能指导，诸如补体固定，或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的活性。优选地，CH区源自γ1(IgG1)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)或μ(IgM)。人CL区可源自人L链同种型、κ或λ。
编码人免疫球蛋白C区的基因可以通过标准克隆技术从人细胞获得(Sambrook,etal.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)以及Ausubel et al.,eds.Current Protocolsin Molecular Biology(1987 1993))。人C区基因容易从包含代表两类L链、五类H链及其亚类的基因的已知克隆中获得。嵌合抗体片段，诸如F(ab')2和Fab，可以通过设计适当截短的嵌合H链基因来制备。例如，编码F(ab')2片段的H链部分的嵌合基因包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，然后是翻译终止密码子以生产截短的分子。
通常，通过克隆编码抗原特异性抗体的H链和L链抗原结合区的DNA区段，并将这些DNA区段分别连接至编码CH和CL区域的DNA区段以产生鼠、人或嵌合免疫球蛋白编码基因，来产生本文所述的鼠、人或鼠和嵌合抗体、抗体的片段和区域。
因此，在一些实施方式中，产生了融合嵌合基因，其包含至少编码非人源的抗原结合区的第一DNA区段，诸如具有连接(J)区段的功能重排的V区，其与至少编码人C区的一部分的第二DNA区段相连。
因此，编码抗体V区和C区的cDNA，根据本文描述的一些实施方式产生嵌合抗体的方法涉及如下示例的几个步骤：1.从产生抗抗原抗体的细胞系和从供应重链和轻链恒定区的可选额外的抗体中分离信使RNA(mRNA)；从中克隆和生产cDNA；2.从纯化的mRNA制备全长cDNA文库，从中L链和H链基因的适当V和/或C区基因区段可以：(i)用适当的探针鉴定，(ii)测序，和(iii)使其与嵌合抗体的其他种抗体的C或V基因区段相容；3.如上所述，通过将克隆的特定V区基因区段连接至克隆的C区基因，来构建完整的H或L链编码序列；4.在选定宿主(包括原核和真核细胞)中表达和产生L链和H链，以提供鼠-鼠、人-鼠、人-人或人鼠抗体。
所有免疫球蛋白H链和L链基因及其编码的mRNA的一个共同特征是J区。H和L链J区具有不同序列，但各组之间存在高度序列同源性(大于80％)，尤其是C区附近。这种同源性在该方法中得到利用，并且H链和L链J区的共有序列可用于设计寡核苷酸，用作将有用的限制性位点引入J区的引物，以便随后将V区区段连接至人C区区段。
从人细胞制备的C区cDNA载体可以通过定点诱变进行修饰以在人序列中的类似位置处放置限制性位点。例如，可以克隆完整的人κ链C(Ck)区和完整的人γ-1C区(Cγ-1)。在这种情况下，基于基因组C区克隆作为C区载体来源的替代方法将不允许这些基因在细菌系统中表达，其中不存在需要去除间插序列的酶。克隆的V区区段被切除并连接至L或H链C区载体。替代地，可以通过引入终止密码子来修饰人Cγ-1区，从而生成编码Fab分子的H链部分的基因序列。然后将具有连接的V区和C区的编码序列转移到适当的表达负载体中，用于在适当的原核或真核宿主中表达。
如果连接导致连续可翻译的序列而不改变或中断三联体阅读框，则称两个编码DNA序列“可操作地连接”。如果连接导致该基因表达元件的正确功能以导致编码序列的表达，则DNA编码序列可操作地连接至基因表达元件。
表达负载体包括质粒或其他载体。其中优选的是携带功能完整的人CH或CL链序列的负载体，其具有经改造的适当限制性位点，使得具有适当粘性末端的任何VH或VL链序列可容易地插入其中。因此，包含人CH或CL链序列的负载体充当在任何适当宿主中表达任何期望的完整H或L链的中间体。
嵌合抗体(诸如小鼠-人或人-人)通常由构建体中使用的小鼠H和L链V区天然的染色体基因启动子驱动的基因合成；剪接通常发生在小鼠J区中的剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，也发生在人C区内的剪接区；多腺苷酸化和转录终止发生在人编码区下游的天然染色体位点。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”旨在意指其修饰值的±5％。因此，约100意指95至105。
在一些实施方式中，本文所述的抗体用于检测抗原的存在。本抗体可用于任何装置或方法中以检测抗原的存在。
关于抗体的术语“纯化的”是指基本上不含在其天然环境中与该分子缔合的其他物质的抗体。例如，纯化的蛋白质基本上不含来自它所源自的细胞或组织的细胞物质或其他蛋白质。该术语是指其中分离的蛋白质足够纯以供分析的制剂，或至少70％至80％(w/w)纯，至少80％-90％(w/w)纯，90-95％纯；以及至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。在一些实施方式中，抗体是纯化的。
术语“特异性结合”、“特异性地结合”等是指两个或更多个分子形成复合物，该复合物在生理或测定条件下是可测量的并且是选择性的。在以下情况下，抗体或抗原结合蛋白或其他分子被称为与蛋白质、抗原或表位“特异性结合”：如果在适当选择的条件下，这样的结合基本上没有被抑制，同时非特异性结合被抑制。特异性结合的特征在于高亲和力并且对化合物、蛋白质、表位或抗原具有选择性。非特异性结合通常具有低亲和力。例如，IgG抗体中的结合通常以至少约10-7M或更高，诸如至少约10-8M或更高，或至少约10-9M或更高，或至少约10-10M或更高，或至少约10-11M或更高，或至少约10-12M或更高的亲和力为特征。该术语也适用于例如抗原结合结构域对许多抗原不携带的特定表位具有特异性的情况，在这种情况下，携带抗原结合结构域的抗体或抗原结合蛋白通常不会结合其他抗原。在一些实施方式中，捕获试剂对其结合配偶体(例如抗原)的Kd等于或小于10-9M、10-10M或10-11M。在一些实施方式中，捕获试剂对其结合配偶体具有大于或等于109M-1的Ka。
完整抗体，也称为免疫球蛋白，通常是由两条各约25kDa的轻(L)链和两条各约50kDa的重(H)链构成的四聚体糖基化蛋白。抗体中存在两种类型的轻链，称为λ和κ。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分为五种主要类别：A、D、E、G和M，并且这些中的几个可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每条轻链由N末端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)构成。每条重链由N末端V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH)和铰链区构成。最靠近VH的CH结构域指定为CH1。VH和VL结构域由被称为框架区的四个相对保守序列的区域(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，它们形成用于三个高变序列区域(互补决定区，CDR)的支架。CDR包含负责抗体或抗原结合蛋白与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组分称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR组分称为L1、L2和L3。CDR3是抗体或抗原结合蛋白结合位点内分子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域众所周知的。有关抗体结构的综述，参见Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Eds.Harlow et al.,1988。本领域技术人员将认识到每个亚基结构，例如CH、VH、CL、VL、CDR和/或FR结构，包含活性片段。例如，活性片段可由VH、VL或CDR亚基的结合抗原的部分，即抗原结合片段，或CH亚基的结合和/或激活Fc受体和/或补体的部分组成。
除了本文所述的片段之外，本文使用的术语“抗原特异性抗体”内所涵盖的结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段；以及(vi)分离的CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以通过合成接头重组连接，产生其中VL和VH结构域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))的单个蛋白质链。最常用的接头是15残基(Gly4Ser)3肽，但其他接头也是本领域已知的。单链抗体也旨在涵盖在术语“抗体或抗原结合蛋白”或抗体的“抗原结合片段”内。抗体也可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗原结合片段、Fc片段、单链抗体或其任何衍生物。
这些抗体可以使用本领域技术人员已知的和本文描述的常规技术获得，并且片段以与完整抗体相同的方式使用。抗体多样性是由编码可变结构域和各种体细胞事件的多个种系基因产生的。体细胞事件包括具有多样性的可变基因区段(D)和连接(J)基因区段重组以形成完整VH结构域，以及可变基因区段和连接基因区段重组以形成完整VL结构域。重组过程本身是不精确的，导致V(D)J连接处氨基酸的丢失或添加。这些多样性机制发生在抗原暴露之前的发育中的B细胞中。抗原刺激后，B细胞中表达的抗体基因发生体细胞突变。基于种系基因区段的估计数量、这些区段的随机重组和随机VH-VL配对，可能会产生最多达1.6X107种不同的抗体(Fundamental Immunology,3rd ed.(1993),ed.Paul,Raven Press,New York,N.Y.)。当考虑到有助于抗体多样性的其他过程(诸如体细胞突变)时，认为可能会生成超过1X1010种不同的抗体(Immunoglobulin Genes,2nd ed.(1995),eds.Jonio etal.,Academic Press,San Diego,Calif.)。由于生成抗体多样性涉及许多过程，因此具有相同抗原特异性的独立衍生的单克隆抗体不太可能具有相同的氨基酸序列。
可以通过本领域技术人员熟知的方法产生能够与本文描述的抗原、表位或其他分子特异性相互作用的抗体或抗原结合蛋白分子。例如，可以根据已知方法通过生成杂交瘤来产生单克隆抗体。然后可以使用标准方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和生物传感器分析筛选以这种方式形成的杂交瘤，以鉴定杂交瘤产生与感兴趣的分子或化合物特异性相互作用的抗体的一种或多种杂交瘤。
作为制备单克隆抗体分泌杂交瘤的替代方案，可以通过利用本文所述的多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)从而分离与多肽结合的免疫球蛋白文库成员,来鉴定和分离针对多肽的单克隆抗体。用于生成和筛选噬菌体展示文库的技术和市售试剂盒是本领域技术人员众所周知的。此外，特别适用于生成和筛选抗体或抗原结合蛋白展示文库的方法和试剂的实例可以在文献中找到。因此，本文所述的表位可用于筛选可用于治疗、诊断或用作研究工具的其他抗体。
包含抗体的给药、组合物和试剂盒
然而，分离的抗体结合靶标上的表位，根据本文提供的实施方式产生的抗体或其抗原结合片段可适合作为用于治疗人和动物的病症的治疗剂和预防剂。
在一些实施方式中，该方法包括将治疗或预防有效量的一种或多种本文提供的抗体或抗体的抗原结合片段给药于易感受试者或表现出抗体被认为有用的病症的受试者。可以给药抗体的任何活性形式，包括但不限于Fab和F(ab')2片段。
在一些实施方式中，所使用的抗体与受体物种相容，使得对MAb的免疫应答不会导致不可接受的短循环半衰期或在受试者中诱导对MAb的免疫应答。在一些实施方式中，给药的MAb表现出一些次要功能，诸如结合受试者的Fc受体和激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)机制。
个体的治疗可以包括给药治疗有效量的本文提供的抗体。抗体可以在如下所述的试剂盒中提供。抗体可以单独或与其他治疗剂、止痛剂或诊断剂混合使用或给药。
合适的负载体及其制剂和包装描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy(21st ed.,Troy,D.ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,Md.(2005)第40和41章)。可以采用额外的药物方法来控制作用的持续时间。可通过使用聚合物复合或吸收化合物来实现控释制剂。其他通过控释制剂控制作用持续时间的可能方法是将化合物掺入聚合物材料诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物的颗粒。替代地，不是将这些剂掺入聚合物颗粒中，而是可以将这些材料分别包裹在制备的微胶囊中，例如界面聚合，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或在胶体药物递送系统中，例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊，或在粗乳液中。
一般而言，如果给药全身剂量的抗体，则希望为受体者提供以下范围的抗体剂量：约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1ug/kg、1ug/kg-100ug/kg、100ug/kg-500ug/kg、500ug/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(受体者的体重)，尽管可以给药更低或更高的剂量。预计低至约1.0mg/kg的剂量会显示出一些功效。在一些实施方式中，约5mg/kg是可接受的剂量，尽管最多达约50mg/kg的剂量水平也是优选的，尤其是对于治疗用途。替代地，可以给予不基于患者体重的特定量的抗体的给药，诸如1ug-100ug、1mg-100mg或1gm-100gm范围内的量。例如，部位特异性给药可以是至身体隔室或腔，诸如关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮方式。
本文所述的抗体组合物可以制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其他给药，特别是液体溶液或悬浮液的形式。该制剂也可适用于可注射制剂。在一些实施方式中，可注射制剂是无菌的。在一些实施方式中，可注射制剂不含热原。在一些实施方式中，该制剂不含结合本文所述抗原以外的其他抗原的其他抗体。
如果剂的剂量、给药途径和施用方案足以影响这样的响应，则称量足以或“治疗有效量”以“影响”症状的减轻。对抗体给药的响应可以通过成像技术分析受试者受影响的组织、器官或细胞或通过组织样品的离体分析来测量。如果剂的存在导致受体患者的生理发生可检测的变化，则该剂在生理学上是重要的。
可以根据已知的方法配制抗体以制备药学上有用的组合物，由此将这些材料或其功能性衍生物与药学上可接受的运载体负载体混合组合。治疗可以以单剂量方案或多剂量方案给予，其中主要治疗过程可以是1-10次单独的剂量，随后在维持和/或加强响应所需的后续时间间隔内给予其他剂量，例如，在1-4个月时进行第二剂量，并且如果需要，几个月后进行一个或多个后续剂量。合适的治疗时间表的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起期望的响应以减轻疾病症状或降低疾病严重程度的时间表。在一些实施方式中，每周、每两周一次、或每3周一次、或每月一次给药抗体。
还提供了可用于实施本文所述的实施方式的试剂盒。本试剂盒包括第一容器，其包含或包装有上述抗体。该试剂盒还可以包括其他容器，该容器包含或包装有对于实施这些实施方式是必要的或方便的溶液。容器可以由玻璃、塑料或箔制成，并且可以是小瓶、瓶、袋、管、包等。试剂盒还可以包含书面信息，诸如实施实施方式的程序或分析信息，诸如第一容器装置中包含的试剂的量。容器可以连同书面信息在其他容器设备(例如盒或包)中。
在一些实施方式中，提供了以下实施方式：
1.一种产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)，所述方法包括：
a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：
所述第一引物退火至所述鸡抗体的CDR的上游或下游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游或下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且
如果所述第一引物在所述CDR上游退火，则所述第二引物退火至所述鸡抗体的CDR的下游一定距离处的区域；或
如果所述第一引物在所述CDR下游退火，则所述第二引物退火至所述鸡抗体的CDR的上游一定距离处的区域。
2.根据实施方式1所述的方法，进一步包括用所述限制酶消化所述扩增的核酸分子群以在编码所述CDR的序列的紧上游产生5'突出端以产生消化产物。
3.根据实施方式2所述的方法，进一步包括通过将所述消化产物连接至编码人抗体的第一FR的核酸序列来制备第一连接产物，
其中，所述人抗体的第一FR在其3'端包括与所述消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得所述第一FR连接至第一消化产物的上游。
4.根据实施方式1所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸的位置处切割，其中所述边界在编码所述CDR的序列的内部或外部。
5.根据实施方式4所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸的位置处切割。
6.根据实施方式1所述的方法，其中所述限制酶在距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
7.根据实施方式1所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
8.根据实施方式7所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
9.根据实施方式1所述的方法，其中所述第二引物退火至距离所述鸡抗体的CDR下游或上游不大于mRNA转录物长度处的区域。
10.根据实施方式2所述的方法，其中紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸。
11.根据实施方式10所述的方法，其中紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2或3个核苷酸。
12.根据实施方式3所述的方法，所述方法进一步包括在足以产生编码鸡CDR的第二扩增的核酸分子群的条件下，用第三引物和第四引物制备第二扩增的核酸分子群，其中：
所述第三引物退火至所述第一连接产物中存在的编码所述CDR的核酸序列紧下游的区域，其中所述第三引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且
所述第四引物在所述连接产物中CDR上游一定距离处退火至所述第一连接产物中存在的编码所述第一FR的核酸分子的一部分。
13.根据实施方式12所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸的位置处切割。
14.根据实施方式13所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸的位置处切割。
15.根据实施方式12所述的方法，其中所述限制酶在距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
16.根据实施方式12所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
17.根据实施方式16所述的方法，其中所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
18.根据实施方式12所述的方法，其中所述第二引物退火至距离所述鸡抗体的CDR的下游不大于mRNA转录物长度处的区域。
19.根据实施方式12所述的方法，进一步包括用所述限制酶消化所述第二扩增的核酸分子群以在编码所述CDR的序列的紧下游产生5'突出端以产生第二消化产物。
20.根据实施方式19所述的方法，其中紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸。
21.根据实施方式20所述的方法，其中紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2或3个核苷酸。
22.根据实施方式19所述的方法，进一步包括将所述第二消化产物连接至编码人抗体的第二FR的核酸序列以产生第二连接产物，其中所述第二FR在其5'端包括与所述第二消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得所述第二FR连接至所述第二消化产物的下游。
23.根据实施方式22所述的方法，进一步包括在足以产生编码侧翼为人抗体的两个FR的所述CDR的核酸分子群的条件下，用退火至所述人抗体的第一FR的第一FW引物和退火至所述人抗体的第二FR的第二引物扩增所述第二连接产物。
24.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，其中所述CDR是鸡CDR1、CDR2或CDR3。
25.根据实施方式1-24中任一项所述的方法，其中所述FR是人FR1、FR2、FR3或FR4。
26.根据实施方式25所述的方法，其中所述第一FR是人FR1并且所述第二FR是人FR2。
27.根据实施方式25所述的方法，其中所述第一FR是人FR2并且所述第二FR是人FR3。
28.根据实施方式25所述的方法，其中所述第一FR是人FR3并且所述第二FR是人FR4。
29.根据实施方式1-28中任一项所述的方法，其中所述限制酶是IIS型酶。
30.根据实施方式29所述的方法，其中所述IIS型酶是在距离所述识别序列大于至少10个碱基的距离处切割的任何IIS型酶。
31.根据实施方式30所述的方法，其中所述IIS型酶在距离所述识别序列14-21个碱基的距离处切割。
32.根据实施方式31所述的方法，其中所述IIS型酶是AcuI、BpmI、BpuEI、BsgI、MmeI或NmeAllI。
33.根据实施方式1-32中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸。
34.根据实施方式33所述的方法，其中产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸包括对根据实施方式1-32中任一项所述的方法产生的第一连接产物、第二连接产物和第三连接产物进行重叠PCR，其中：
所述第一连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；
所述第二连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且
所述第三连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。
35.根据实施方式33所述的方法，其中产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸包括连接根据实施方式1-32中任一项所述的方法产生的第一连接产物、第二连接产物和第三连接产物，其中：
所述第一连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；
所述第二连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且
所述第三连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。
36.根据实施方式33-35中任一项所述的方法，其中编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
37.根据实施方式33-35中任一项所述的方法，其中编码包含鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的核酸分子编码抗体可变区。
38.根据实施方式1-37中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含含有下式的核酸序列：
5’-(N)xR(N)n-3’，
其中，
R是识别序列；
N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基；
x为0-11；并且
n为1-21。
39.根据实施方式38所述的方法，其中R是CTGAAG、CGATC、ACNNNNGTAYC、GAAGAC、GCAGC、CCATC、ACGGC、CGANNNNNNTGC、GTATCC、GTCTC、ACCTGC、ACTGGG、CTGGAG、CTTGAG、GGTCTC、ACNNNNNCTCC、GAGGAG、GTGCAG、GTCTC、CGTCTC、GGGAC、GAATGC、CTCAG、ACCTGC、GCTCTTC、GCAATG、ACTGG、GCGATG、GGATG、GCAGTG、CAGTG、CAANNNNNGTGG、CTCTTC、GGCGGA、CGTCTC、CCCGC、GGATG、GACGC、GGTGA、CCTTC、GAAGA、GAGTC、TCCRAC、CCTC、GCCGAG、GAGTC、GCTCTTC或GCATC。
40.根据实施方式38所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
41.根据实施方式38所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
43.根据实施方式41所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
43.根据实施方式38所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
44.根据实施方式43所述的方法，其中K是G或T/U。
45.根据实施方式43所述的方法，其中M是A或C。
46.根据实施方式43所述的方法，其中R是A或G。
47.根据实施方式43所述的方法，其中Y是C或T/U。
48.根据实施方式43所述的方法，其中S是C或G。
49.根据实施方式43所述的方法，其中W是A或T/U。
50.根据实施方式43所述的方法，其中B是C或G或T/U。
51.根据实施方式43所述的方法，其中D是A或G或T/U。
52.根据实施方式43所述的方法，其中H是A或C或T/U。
53.根据实施方式1-52中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含的核酸序列包含5’-CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:45)的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
54.根据实施方式53所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
55.根据实施方式53所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
56.根据实施方式55所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
57.根据实施方式53所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
58.根据实施方式57所述的方法，其中K是G或T/U。
59.根据实施方式57所述的方法，其中M是A或C。
60.根据实施方式57所述的方法，其中R是A或G。
61.根据实施方式57所述的方法，其中Y是C或T/U。
62.根据实施方式57所述的方法，其中S是C或G。
63.根据实施方式57所述的方法，其中W是A或T/U。
64.根据实施方式57所述的方法，其中B是C或G或T/U。
65.根据实施方式57所述的方法，其中D是A或G或T/U。
66.根据实施方式57所述的方法，其中H是A或C或T/U。
67.根据实施方式1-52中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含的核酸序列包含5’-CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
68.根据实施方式67所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
69.根据实施方式67所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
70.根据实施方式69所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
71.根据实施方式67所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
72.根据实施方式71所述的方法，其中K是G或T/U。
73.根据实施方式71所述的方法，其中M是A或C。
74.根据实施方式71所述的方法，其中R是A或G。
75.根据实施方式71所述的方法，其中Y是C或T/U。
76.根据实施方式71所述的方法，其中S是C或G。
77.根据实施方式71所述的方法，其中W是A或T/U。
78.根据实施方式71所述的方法，其中B是C或G或T/U。
79.根据实施方式71所述的方法，其中D是A或G或T/U。
80.根据实施方式71所述的方法，其中H是A或C或T/U。
81.根据实施方式1-52中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含的核酸序列包含5’-CTTGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
82.根据实施方式81所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
83.根据实施方式81所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
84.根据实施方式83所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
85.根据实施方式81所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
86.根据实施方式85所述的方法，其中K是G或T/U。
87.根据实施方式85所述的方法，其中M是A或C。
88.根据实施方式85所述的方法，其中R是A或G。
89.根据实施方式85所述的方法，其中Y是C或T/U。
90.根据实施方式85所述的方法，其中S是C或G。
91.根据实施方式85所述的方法，其中W是A或T/U。
92.根据实施方式85所述的方法，其中B是C或G或T/U。
93.根据实施方式85所述的方法，其中D是A或G或T/U。
94.根据实施方式85所述的方法，其中H是A或C或T/U。
95.根据实施方式1-52中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含的核酸序列包含5’-GTGCAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:62)的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
96.根据实施方式95所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
97.根据实施方式95所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
98.根据实施方式97所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
99.根据实施方式95所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
100.根据实施方式99所述的方法，其中K是G或T/U。
101.根据实施方式99所述的方法，其中M是A或C。
102.根据实施方式99所述的方法，其中R是A或G。
103.根据实施方式99所述的方法，其中Y是C或T/U。
104.根据实施方式99所述的方法，其中S是C或G。
105.根据实施方式99所述的方法，其中W是A或T/U。
106.根据实施方式99所述的方法，其中B是C或G或T/U。
107.根据实施方式99所述的方法，其中D是A或G或T/U。
108.根据实施方式99所述的方法，其中H是A或C或T/U。
109.根据实施方式1-52中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含的核酸序列包含5’-TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
110.根据实施方式109所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
111.根据实施方式109所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
112.根据实施方式111所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
113.根据实施方式109所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
114.根据实施方式113所述的方法，其中K是G或T/U。
115.根据实施方式113所述的方法，其中M是A或C。
116.根据实施方式113所述的方法，其中R是A或G。
117.根据实施方式113所述的方法，其中Y是C或T/U。
118.根据实施方式113所述的方法，其中S是C或G。
119.根据实施方式113所述的方法，其中W是A或T/U。
120.根据实施方式113所述的方法，其中B是C或G或T/U。
121.根据实施方式113所述的方法，其中D是A或G或T/U。
122.根据实施方式113所述的方法，其中H是A或C或T/U。
123.根据实施方式1-52中任一项所述的方法，其中所述第一引物和第三引物包含的核酸序列包含5’-GCCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
124.根据实施方式123所述的方法，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
125.根据实施方式123所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
126.根据实施方式125所述的方法，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
127.根据实施方式123所述的方法，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
128.根据实施方式127所述的方法，其中K是G或T/U。
129.根据实施方式127所述的方法，其中M是A或C。
130.根据实施方式127所述的方法，其中R是A或G。
131.根据实施方式127所述的方法，其中Y是C或T/U。
132.根据实施方式127所述的方法，其中S是C或G。
133.根据实施方式127所述的方法，其中W是A或T/U。
134.根据实施方式127所述的方法，其中B是C或G或T/U。
135.根据实施方式127所述的方法，其中D是A或G或T/U。
136.根据实施方式127所述的方法，其中H是A或C或T/U。
137.一种产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子文库的方法，所述方法包括组合：
i)侧翼为编码人框架区1(FR1)和人框架区2(FR2)的核酸序列的编码鸡互补决定区1(CDR1)结构域的第一核酸分子文库；
ii)侧翼为编码人框架区2(FR2)和人框架区3(FR3)的核酸序列的编码鸡互补决定区2(CDR2)结构域的第二核酸序列文库；
iii)侧翼为编码人框架区3(FR3)和人框架区4(FR4)的核酸序列的编码鸡互补决定区3(CDR3)结构域的第三核酸序列文库；
其中所述编码抗体的人源化可变区的核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
138.根据实施方式137所述的方法，其中所述组合包括连接所述第一核酸分子文库、第二核酸分子文库和第三核酸分子文库以产生编码所述抗体的人源化可变区的核酸分子。
139.根据实施方式137所述的方法，其中所述组合包括用所述第一核酸分子文库、第二核酸分子文库和第三核酸分子文库进行重叠PCR以产生编码所述抗体的人源化可变区的核酸分子。
140.根据实施方式1-139中任一项所述制备的核酸分子文库。
141.根据实施方式140所述的核酸分子文库，其中所述文库包含核酸分子群，所述群的多个核酸分子编码具有下式的多肽：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
142.根据实施方式141的文库，其中所述文库中存在的至少两种编码不同多肽的核酸分子。
143.一种退火至鸡抗体CDR紧上游或下游的区域的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点由在识别位点下游一定距离处切割的限制酶识别。
144.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含含有下式的核酸序列的序列：
5’-(N)xR(N)n-3’，
其中，
R是识别序列；
N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基；
x为0-11；并且
n为1-21。
145.根据实施方式144所述的寡核苷酸，其中R是CTGAAG、CGATC、ACNNNNGTAYC、GAAGAC、GCAGC、CCATC、ACGGC、CGANNNNNNTGC、GTATCC、GTCTC、ACCTGC、ACTGGG、CTGGAG、CTTGAG、GGTCTC、ACNNNNNCTCC、GAGGAG、GTGCAG、GTCTC、CGTCTC、GGGAC、GAATGC、CTCAG、ACCTGC、GCTCTTC、GCAATG、ACTGG、GCGATG、GGATG、GCAGTG、CAGTG、CAANNNNNGTGG、CTCTTC、GGCGGA、CGTCTC、CCCGC、GGATG、GACGC、GGTGA、CCTTC、GAAGA、GAGTC、TCCRAC、CCTC、GCCGAG、GAGTC、GCTCTTC或GCATC。
146.根据实施方式144所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
147.根据实施方式144所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
148.根据实施方式147所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
149.根据实施方式144所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
150.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
151.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
152.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
153.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
154.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
155.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
156.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
157.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
158.根据实施方式149所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
159.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含的核酸序列的序列包含5’-CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:45)的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
160.根据实施方式159所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
161.根据实施方式159所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
162.根据实施方式161所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
163.根据实施方式159所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
164.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
165.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
166.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
167.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
168.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
169.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
170.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
171.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
172.根据实施方式163所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
173.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含的核酸序列的序列包含5’-CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
174.根据实施方式173所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
175.根据实施方式173所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
176.根据实施方式175所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
177.根据实施方式173所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
178.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
179.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
180.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
181.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
182.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
183.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
184.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
185.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
186.根据实施方式177所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
187.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含的核酸序列的序列包含5’-CTTGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
188.根据实施方式187所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
189.根据实施方式187所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
190.根据实施方式189所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
191.根据实施方式187所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
192.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
193.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
194.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
195.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
196.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
197.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
198.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
199.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
200.根据实施方式191所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
201.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含的核酸序列的序列包含5’-GTGCAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:62)的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
202.根据实施方式201所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
203.根据实施方式201所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
204.根据实施方式203所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
205.根据实施方式201所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
206.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
207.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
208.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
209.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
210.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
211.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
212.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
213.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
214.根据实施方式205所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
215.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含的核酸序列的序列包含5’-TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
216.根据实施方式215所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
217.根据实施方式215所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
218.根据实施方式217所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
219.根据实施方式215所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
220.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
221.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
222.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
223.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
224.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
225.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
226.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
227.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
228.根据实施方式219所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
229.根据实施方式143所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含的核酸序列的序列包含5’-GCCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
230.根据实施方式229所述的寡核苷酸，其中所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
231.根据实施方式229所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
232.根据实施方式231所述的寡核苷酸，其中所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
233.根据实施方式229所述的寡核苷酸，其中所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H。
234.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中K是G或T/U。
235.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中M是A或C。
236.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中R是A或G。
237.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中Y是C或T/U。
238.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中S是C或G。
239.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中W是A或T/U。
240.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中B是C或G或T/U。
241.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中D是A或G或T/U。
242.根据实施方式233所述的寡核苷酸，其中H是A或C或T/U。
243.如本文提供或描述的寡核苷酸。
244.一种多肽，其由具有下式的核酸分子编码：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4，
其中所述核酸分子是根据实施方式1-139中任一项制备的。
245.一种鉴定靶标的结合配偶体的方法，所述方法包括使所述靶标与由根据实施方式1-139中任一项所述的方法制备的文库编码的蛋白质文库接触。
246.根据实施方式245所述的方法，其中所述结合配偶体是抗体。
247.根据权利要求245所述的方法，其中所述结合配偶体是scFv。
尽管关于各种实施方式已经描述了实施方式，但是并不意在限制于此，而是本领域的技术人员将认识到，可以在本文内进行变化和修改,这些变化和修改在实施方式的精神及其范围内。
实施例1：鸡VH文库人源化：该实施例提供了非限制性方法，用于从免疫鸡的B细胞中提取VH CDR2和CDR3，然后与人框架区组装以形成包含鸡CDR的人源化VH编码区。
人框架区受体片段通过从包含种系人V基因的质粒进行PCR扩增而生成，随后用限制酶消化以留下与提取的鸡CDR相容的突出端。由于在氨基酸水平上与鸡V基因的相似性，选择了VH3-23。VH3-23 V基因以及人JH1(FR4)(SEQ ID 1)的序列显示在表1中。对VH3-23 V基因加JH1进行密码子优化以确保在计划的连接点与鸡密码子的同一性，并插入到pUC载体中用作框架扩增的模板。
VH3-23 V基因和人JH1的核酸序列(SEQ ID NO:1)
CGAGGTGCAGCTGCTCGAATCCGGTGGTGGCCTGGTCCAACCTGGCGGCAGCCTG
CGCCTGTCTTGCGCTGCCTCCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGGTG
CGCCAAGCTCCTGGTAAAGGCCTGGAATGGGTCAGCGCTATCAGCGGTTCTGGCG
GCTCCACCTATTACGCTGATTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAAC
TCTAAGAATACACTGTATCTGCAAATGAACTCCCTCCGCGCCGAAGACACTGCAGT
CTACTACTGCGCCAAAGGCTGGGGTCAAGGCACCCTGGTGACTGTCTCCAGCACT
AGTGGGGCCGGTGGGGCCCAGAATTCCAGCTGCG
表1.VH3-23 V基因和人JH1的核酸序列(SEQ ID NO:1)
用于生成人框架区受体片段的引物列于表2(SEQ ID 2-9)中。每个引物对中的一个引物包含AcuI限制酶识别位点(表2中的CTGAAG)，其位置使得限制酶的切割会在用于连接至提取的鸡CDR的期望连接点处留下突出端。这种引物还在5'端进行生物素化，以捕获到链霉亲和素磁珠上并通过AcuI消化释放。包括生物素和AcuI识别位点之间的随机间隔序列以改善消化效率。随机间隔序列允许AcuI有效切割，并且长度受引物合成限制。
Figure BDA0004108523820000621
表2：用于人框架区受体片段的引物序列。
使用2X Phusion MasterMix(NEB)、1ng模板(SEQ ID 1)和0.5uM每种引物，使用以下热循环条件设置PCR反应：98℃ 30sec，98℃ 5sec 30个循环、72℃ 15sec，以及72℃2min的最终循环。热循环完成后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化反应，并使用50ul链霉亲和素磁珠(NEB)捕获。捕获后，用洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA)然后1XCutsmart缓冲液(NEB)洗涤珠。通过设置与AcuI(NEB)、Cutsmart缓冲液(NEB)和S-腺苷甲硫氨酸(NEB)的限制性消化反应，并在热混合器中在37℃温育，以1,500rpm摇动30min，从珠中释放PCR产物。消化后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化包含释放的PCR产物的上清液。
生成了4个人框架区受体片段，并且它们的序列列于表3中。FR1-CDRH1-FR2片段(SEQ ID NO:10)包含人VH3-23种系CDR1区(CDRH1)以及侧翼框架FR1和FR2。该片段是使用表2中的引物组A生成的。FR3(H2突出端)片段(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:44)包含在末端具有突出端的单个框架区FR3，FR3区在该末端连接至人VH3-23基因的CDR2区。该片段是使用表2中的引物组B之一生成的。FR3(H3突出端)片段(SEQ ID NO:12)包含在末端具有突出端的单个框架区FR3，FR3区在该末端连接至人VH3-23基因的CDR3区。该片段是使用表2中的引物组C生成的。FR4片段(SEQ ID NO:13)包含单个框架区FR4，并且是使用表2中的引物组D生成的。
人框架区受体片段
Figure BDA0004108523820000631
Figure BDA0004108523820000641
表3：人框架区受体片段。通过AcuI生成的突出端区域带有下划线。
获得鸡抗体VH链的CDR2区并插入到人框架中。从cDNA扩增鸡VH CDR2，所述cDNA是从提取自免疫鸡B细胞的RNA制备的。通过如本文和上文所述的若干个PCR和消化反应提取CDR2片段。然后将CDR2片段连接到人框架区受体片段上，生成包含侧翼为人框架区的鸡CDR2的片段。
用于CDR2扩增的引物列于表4中(SEQ ID No:14-28)。对于每个PCR步骤，引物组包括与CDR邻近的鸡框架区结合的引物的库。不受任何特定理论的束缚，这些引物库包含简并碱基以便对尽可能多的鸡免疫组库进行采样。这些引物包含AcuI限制酶识别位点(表4中的CTGAAG)，其定位使得限制酶的切割在期望连接点处留下突出端，用于连接至人框架区受体片段。将这些引物在5'端进行生物素化，以捕获到链霉亲和素磁珠上并通过AcuI消化释放。包括生物素和AcuI识别位点之间的随机间隔序列以改善消化效率。包含AcuI识别位点的引物设计在图1中示出。
Figure BDA0004108523820000642
Figure BDA0004108523820000651
表4：用于鸡VH CDR2扩增的引物序列
在一些实施方式中，SEQ ID NO:15-22的引物分别被SEQ ID NO:31-36替代。
为了获得鸡CDR2片段，使用2X Phusion MasterMix(NEB)、1ul cDNA、0.5uM正向引物(SEQ ID NO:14)和0.5uM反向引物库(SEQ ID NO:15-18)使用以下热循环条件设置PCR反应：98℃ 30sec，98℃ 5sec 15个循环、65℃ 10sec、72℃ 5sec，以及72℃ 2min的最终循环。热循环完成后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化反应，并使用50ul链霉亲和素磁珠(NEB)捕获。捕获后，用洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA)然后1XCutsmart缓冲液(NEB)洗涤珠。通过设置与AcuI(NEB)、Cutsmart缓冲液(NEB)和S-腺苷甲硫氨酸(NEB)的限制性消化反应，并在热混合器中在37℃温育，以1,500rpm摇动30min，从珠中释放PCR产物。消化后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化包含释放的PCR产物的上清液。该消化产物是包含在末端具有突出端的鸡CDR2的片段，CDR2在该末端连接至FR3区域。
下一步是将该鸡CDR2片段连接至FR3人框架区受体片段(SEQ ID NO：11)。使用各1皮摩尔的鸡CDR2片段和人FR3受体片段，使用快速连接酶反应缓冲液(Quick LigaseReaction Buffer)(NEB)和快速连接酶(Quick Ligase)(NEB)设置连接反应。该反应在25℃下温育5min，然后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。下一步是PCR反应，其扩增包含鸡CDR2和人FR3的连接产物。使用作为模板的纯化的连接产物、2X Phusion MasterMix(NEB)、0.5uM反向引物(SEQ ID NO:3)和0.5uM正向引物库(SEQ ID NO:19-22)，使用以下热循环条件设置PCR反应：98℃ 30sec，98℃5sec 15个循环、61℃ 10sec、72℃ 5sec，以及72℃ 2min的最终循环。热循环完成后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化反应，并使用50ul链霉亲和素磁珠(NEB)捕获。捕获后，用洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA)然后1XCutsmart缓冲液(NEB)洗涤珠。通过设置与AcuI(NEB)、Cutsmart缓冲液(NEB)和S-腺苷甲硫氨酸(NEB)的限制性消化反应，并在热混合器中在37℃温育，以1,500rpm摇动30min，从珠中释放PCR产物。消化后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化包含释放的PCR产物的上清液。所得产物是CDR2-FR3的片段，其在末端具有突出端，CDR2在该末端连接至FR2。
下一步是将该CDR2-FR3片段连接至FR1-CDR1-FR2人框架区受体片段(SEQ ID NO:10)。使用各1皮摩尔的CDR2-FR3片段和FR1-CDR1-FR2片段，使用快速连接酶反应缓冲液(NEB)和快速连接酶(NEB)设置连接反应。该反应在25℃下温育5min，然后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。纯化的连接产物(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3片段)用作最终PCR扩增的模板，其使用2X Phusion MasterMix(NEB)、0.5uM的每种引物(SEQ ID 2-3)，使用以下热循环条件：98℃ 30sec，98℃ 5sec 15个循环、72℃ 15sec，以及72℃ 2min的最终循环。通过凝胶电泳分析PCR产物，并将组装的片段从凝胶中切下并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。最终产物包含侧翼为人VH3-23 FR1-CDR1-FR2和FR3的鸡VH CDR2。
获得鸡抗体VH链的CDR3区并插入到人框架中。从cDNA扩增鸡VH CDR3，所述cDNA是从提取自免疫鸡B细胞的RNA制备的。通过若干个PCR和消化反应提取CDR3。然后将CDR3片段连接到人框架区受体片段上，生成包含侧翼为人框架区的鸡CDR3的片段。步骤在图2中示出。
用于CDR3扩增的引物列于表5中(SEQ ID NO:23-30)。对于每个PCR步骤，引物组包括与CDR邻近的鸡框架区域结合的引物的库。这些引物库包含简并碱基以便对尽可能多的鸡免疫组库进行采样。这些引物包含AcuI限制酶识别位点(表5中的ctgaag)，其定位使得限制酶的切割在期望连接点处留下突出端，用于连接至人框架区受体片段。将这些引物在5'端进行生物素化，以捕获到链霉亲和素磁珠上并通过AcuI消化释放。包括生物素和AcuI识别位点之间的随机间隔序列以改善消化效率。
Figure BDA0004108523820000671
表5：用于鸡VH CDR3扩增的引物序列
为了获得鸡CDR3片段，使用2X Phusion MasterMix(NEB)、1ul cDNA、0.5uM正向引物库(SEQ ID NO:23-27)和0.5uM反向引物库(SEQ ID NO:28)使用以下热循环条件设置PCR反应：98℃ 30sec，98℃ 5sec 15个循环、52℃ 10sec、72℃ 5sec，以及72℃ 2min的最终循环。热循环完成后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化反应，并使用50ul链霉亲和素磁珠(NEB)捕获。捕获后，用洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA)然后1XCutsmart缓冲液(NEB)洗涤珠。通过设置与AcuI(NEB)、Cutsmart缓冲液(NEB)和S-腺苷甲硫氨酸(NEB)的限制性消化反应，并在热混合器中在37℃温育，以1,500rpm摇动30min，从珠中释放PCR产物。消化后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化包含释放的PCR产物的上清液。所得产物是包含在末端具有突出端的鸡CDR3的片段，CDR3在该末端连接至FR3区域。
通过设置连接反应将该产物连接至FR3人框架区受体片段(SEQ ID NO:12)，该反应包含各1皮摩尔的消化PCR产物和受体片段、快速连接酶反应缓冲液(NEB)和快速连接酶(NEB)。该反应在25℃下温育5min，然后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。为了扩增连接产物，使用作为模板的纯化的连接反应、2X Phusion MasterMix(NEB)、0.5uM正向引物(SEQ ID NO:6)和0.5uM反向引物库(SEQ ID 29-30)，使用以下热循环条件设置下一PCR步骤：98℃ 30sec，98℃ 5sec 15个循环、68℃ 10sec、72℃ 5sec，以及72℃2min的最终循环。热循环完成后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化反应，并使用50ul链霉亲和素磁珠(NEB)捕获。捕获后，用洗涤缓冲液(0.5MNaCl、20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA)然后1X Cutsmart缓冲液(NEB)洗涤珠。通过设置与AcuI(NEB)、Cutsmart缓冲液(NEB)和S-腺苷甲硫氨酸(NEB)的限制性消化反应，并在热混合器中在37℃温育，以1,500rpm摇动30min，从珠中释放PCR产物。消化后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化包含释放的PCR产物的上清液。所得产物是FR3-CDR3的片段，其在末端具有突出端，CDR3在该末端连接至FR4。
通过设置连接反应将该产物连接至FR4受体片段(SEQ ID NO:13)，该反应包含各1皮摩尔的消化PCR产物和受体片段、快速连接酶反应缓冲液(NEB)和快速连接酶(NEB)。该反应在25℃下温育5min，然后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。纯化的连接反应用作最终PCR扩增的模板，其使用2X Phusion MasterMix(NEB)、0.5uM的每种引物(SEQ ID NO:6、9)，使用以下热循环条件：98℃ 30sec，98℃ 5sec 15个循环、72℃ 15sec，以及72℃ 2min的最终循环。通过凝胶电泳分析产物，并将组装的片段从凝胶中切下并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。最终产物包含侧翼为人VH3-23 FR3和FR4的鸡VH CDR3。
在一些实施方式中，使用SEQ ID NO:37-41的序列代替SEQ ID NO:23-27。在一些实施方式中，使用SEQ ID NO:42的序列代替SEQ ID NO:28。这些可以使用并且仍然能够引发，但由于高Tm而具有错配，这可以用于不包括如本文所述的第二PCR/消化/连接步骤。
人源化抗体VH链的组装
使用人源化鸡CDR2和CDR3片段(片段FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3和FR3-CDR3-FR4)通过重叠PCR组装VH。使用2X Phusion Mastermix(NEB)、0.5uM每种引物(SEQ ID NO：2、9)和1皮摩尔每种片段使用以下条件设置PCR反应：98℃ 30sec，98℃ 5sec 15个循环、72℃20sec，以及72℃ 2min的最终循环。通过凝胶电泳分析产物，并将组装的片段从凝胶中切下并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。
最终产物是人源化VH编码序列，其包含人VH3-23 FR1、CDR1、FR2和FR3区，人JH1，以及鸡来源的CDR2和CDR3。这与以类似方式制备的包含鸡CDR的人源化VL片段配对以生成人源化抗体文库。将文库克隆到噬粒中，以通过针对免疫抗原的噬菌体展示进行亲和力选择。
亲和力成熟和结合测试。使用从如本文提供的和上面描述的用膜蛋白抗原免疫的鸡中提取的CDR构建人源化scFv文库，并克隆到噬粒载体中。在通过噬菌体展示对靶抗原进行两轮亲和力选择后，从单个克隆的细菌培养物中制备周质提取物。通过ELISA测试scFv提取物。测试结果如图3所示。
这些结果例示了利用本文产生的文库产生抗体是成功的，并且可以用于产生具有特异性结合的不同抗体组。

Claims (59)

1.一种产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)，所述方法包括：
a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：
所述第一引物退火至所述鸡抗体的CDR的上游或下游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游或下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且
如果所述第一引物在所述CDR上游退火，则所述第二引物退火至所述鸡抗体的CDR的下游一定距离处的区域；或
如果所述第一引物在所述CDR下游退火，则所述第二引物退火至所述鸡抗体的CDR的上游一定距离处的区域。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用所述限制酶消化所述扩增的核酸分子群以在编码所述CDR的序列的紧上游产生5'突出端以产生消化产物。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括通过将所述消化产物连接至编码人抗体的第一FR的核酸序列来制备第一连接产物，
其中，所述人抗体的第一FR在其3'端包括与所述消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得所述第一FR连接至第一消化产物的上游。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸的位置处切割，其中所述边界在编码所述CDR的序列的内部或外部。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸的位置处切割。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶在距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二引物退火至距离所述鸡抗体的CDR的下游或上游不大于mRNA转录物长度处的区域。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2或3个核苷酸。
12.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括在足以产生编码鸡CDR的第二扩增的核酸分子群的条件下，用第三引物和第四引物制备第二扩增的核酸分子群，其中：
所述第三引物退火至所述第一连接产物中存在的编码所述CDR的核酸序列紧下游的区域，其中所述第三引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且
所述第四引物在所述连接产物中CDR上游一定距离处退火至所述第一连接产物中存在的编码所述第一FR的核酸分子的一部分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸的位置处切割。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸的位置处切割。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述限制酶在距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第二引物退火至距离所述鸡抗体的CDR的下游不大于mRNA转录物长度处的区域。
19.根据权利要求12所述的方法，进一步包括用所述限制酶消化所述第二扩增的核酸分子群以在编码所述CDR的序列的紧下游产生5'突出端以产生第二消化产物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2或3个核苷酸。
22.根据权利要求19所述的方法，进一步包括将所述第二消化产物连接至编码人抗体的第二FR的核酸序列以产生第二连接产物，其中，所述第二FR在其5'端包括与所述第二消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得所述第二FR连接至所述第二消化产物的下游。
23.根据权利要求22所述的方法，进一步包括在足以产生编码侧翼为人抗体的两个FR的所述CDR的核酸分子群的条件下，用退火至所述人抗体的第一FR的第一FW引物和退火至所述人抗体的第二FR的第二引物扩增所述第二连接产物。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，所述CDR是鸡CDR1、CDR2或CDR3。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述FR是人FR1、FR2、FR3或FR4。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第一FR是人FR1并且所述第二FR是人FR2。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第一FR是人FR2并且所述第二FR是人FR3。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第一FR是人FR3并且所述第二FR是人FR4。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶是IIS型酶。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述IIS型酶是在距离识别序列大于至少10个碱基的距离处切割的任何IIS型酶。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述IIS型酶在距离所述识别序列14-21个碱基的距离处切割。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述IIS型酶是AcuI、BpmI、BpuEI、BsgI、MmeI或NmeAllI。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸包括对根据权利要求1-32中任一项所述的方法产生的第一连接产物、第二连接产物和第三连接产物进行重叠PCR，其中：
所述第一连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；
所述第二连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且
所述第三连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸包括连接根据权利要求1-32中任一项所述的方法产生的第一连接产物、第二连接产物和第三连接产物，其中：
所述第一连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；
所述第二连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且
所述第三连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中，编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的所述核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
37.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中，编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的所述核酸分子编码抗体可变区。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括下式：
5’-(N)xR(N)n-3’，
其中，
R是识别序列；
N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基；
x为0-11；并且
n为1-21。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，R是CTGAAG、CGATC、ACNNNNGTAYC、GAAGAC、GCAGC、CCATC、ACGGC、CGANNNNNNTGC、GTATCC、GTCTC、ACCTGC、ACTGGG、CTGGAG、CTTGAG、GGTCTC、ACNNNNNCTCC、GAGGAG、GTGCAG、GTCTC、CGTCTC、GGGAC、GAATGC、CTCAG、ACCTGC、GCTCTTC、GCAATG、ACTGG、GCGATG、GGATG、GCAGTG、CAGTG、CAANNNNNGTGG、CTCTTC、GGCGGA、CGTCTC、CCCGC、GGATG、GACGC、GGTGA、CCTTC、GAAGA、GAGTC、TCCRAC、CCTC、GCCGAG、GAGTC、GCTCTTC或GCATC。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，所述天然存在的核酸碱基是C、G、T、A或U。
41.根据权利要求38所述的方法，其中，所述非天然存在的核酸碱基稳定DNA双链体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述非天然存在的核酸碱基是AP-dC、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C(5)-丙炔基胞嘧啶或C(5)-丙炔基尿嘧啶。
43.根据权利要求38所述的方法，其中，所述简并核酸碱基是K、M、R、Y、S、W、B、D或H，其中K是G或T/U；M是A或C；R是A或G；Y是C或T/U；S是C或G；W是A或T/U；B是C或G或T/U；
D是A或G或T/U；A或C或T/U。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括5’-CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:45)的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
45.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括5’-CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
46.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括5’-CTTGAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
47.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括5’-GTGCAGNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO:62)的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
48.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括5’-TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
49.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括5’-GCCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’的序列，其中N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基。
50.一种产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子文库的方法，所述方法包括组合：
i)侧翼为编码人框架区1(FR1)和人框架区2(FR2)的核酸序列的编码鸡互补决定区1(CDR1)结构域的第一核酸分子文库；
ii)侧翼为编码人框架区2(FR2)和人框架区3(FR3)的核酸序列的编码鸡互补决定区2(CDR2)结构域的第二核酸序列文库；
iii)侧翼为编码人框架区3(FR3)和人框架区4(FR4)的核酸序列的编码鸡互补决定区3(CDR3)结构域的第三核酸序列文库；
其中所述编码抗体的人源化可变区的核酸分子具有下式：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述组合包括连接所述第一核酸分子文库、第二核酸分子文库和第三核酸分子文库以产生编码所述抗体的人源化可变区的核酸分子。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述组合包括用所述第一核酸分子文库、第二核酸分子文库和第三核酸分子文库进行重叠PCR以产生编码所述抗体的人源化可变区的核酸分子。
53.一种核酸分子文库，其根据权利要求1-52中任一项所述制备。
54.根据权利要求53所述的核酸分子文库，其中，所述文库包括核酸分子群，所述群的多个核酸分子编码具有下式的多肽：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4。
55.一种寡核苷酸，其退火至鸡抗体的CDR紧上游或下游的区域，并且其中，所述寡核苷酸包括限制酶识别位点，所述限制酶识别位点由在所述识别位点下游一定距离处切割的限制酶识别，其中所述寡核苷酸包括核酸序列的序列，所述核酸序列的序列包括下式：
5’-(N)xR(N)n-3’，
其中，
R是识别序列；
N是任何核酸碱基，诸如天然存在的、非天然存在的或简并核酸碱基；
x为0-11；并且
n为1-21。
56.一种寡核苷酸或引物组，包括SEQ ID NO:1-85中任一个或如本文所述的序列。
57.一种多肽，其由具有下式的核酸分子编码：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中
FR1是人FR1；
CDR1是鸡CDR1；
FR2是人FR2；
CDR2是鸡CDR2；
FR3是人FR3；
CDR3是鸡CDR3；并且
FR4是人FR4，
其中，所述核酸分子是根据权利要求1-52中任一项所述制备的。
58.一种鉴定靶标的结合配偶体的方法，所述方法包括使所述靶标与由根据权利要求1-52中任一项所述的方法制备的文库编码的蛋白质文库接触。
59.根据权利要求245所述的方法，其中，所述结合配偶体是抗体，诸如scFv。
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