BR112021004130A2 - anticorpo anti-cd38, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico - Google Patents

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Mingjuan Song
Beibei Fu
Xiaohua Wang
Lei Zhang
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Abstract

“anticorpo anti-cd38, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico”.o presente pedido provê um anticorpo anti-cd38, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso farmacêutico. especificamente, o presente pedido provê um anticorpo derivado de murino, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado que compreende uma região cdr do anticorpo anti-cd38, uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-cd38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uma aplicação do mesmo como um fármaco. em particular, o presente pedido provê uma aplicação de um anticorpo anti-cd38 humanizado na preparação de um fármaco para o tratamento de uma doença ou um distúrbio positivo para cd38.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPO ANTI-CD38, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, E USO FARMACÊUTICO”
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente divulgação pertence ao campo da biotecnologia. Mais especificamente, a presente divulgação se refere a usos terapêuticos de anticorpos anti-CD38 e composições dos mesmos e métodos para produzir as moléculas de anticorpo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] As descrições nesse documento fornecem apenas informações básicas sobre a presente divulgação e não constituem necessariamente a técnica anterior.
[003] O mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna das células plasmáticas, na qual as células tumorais são derivadas das células plasmáticas da medula óssea, enquanto as células plasmáticas são células em estágio funcional final desenvolvidas a partir de linfócitos B. Portanto, o mieloma múltiplo também pode ser classificado como linfoma de linfócitos B.
[004] O mieloma múltiplo é caracterizado por proliferação anormal de células plasmáticas da medula óssea, acompanhada por produção excessiva de imunoglobulina monoclonal ou cadeia leve (proteína M); enquanto MM não secretor que não produz proteína M em poucos pacientes. O mieloma múltiplo costuma ser acompanhado por múltiplos danos osteolíticos, hipercalcemia, anemia e danos renais. Várias infecções bacterianas são facilmente encontradas devido à inibição da produção da imunoglobulina normal.
[005] A morbidade doméstica na China é estimada em 2 a 3 por 100.000 pessoas, e a proporção entre homens e mulheres é de 1,6:1. A maioria dos pacientes tem mais de 40 anos e a maioria tem mais de 60 anos. Atualmente, estima-se que haja cerca de 70.000 pacientes na China e cerca de 80.000 novos pacientes em todo o mundo a cada ano. O mieloma múltiplo é responsável por cerca de 10% dos vários tumores hematopoiéticos. O número de pacientes tende a aumentar ainda mais com o aumento do envelhecimento.
[006] Atualmente, o mieloma múltiplo é um tumor maligno hematológico incurável. Os principais tratamentos atualmente incluem: transplante de medula óssea, múltiplas quimioterapias de pequenas moléculas, especialmente inibidores da protease representados pelo carfilzomibe e imunomoduladores representados pelo lenalidomida, eles prolongam muito a sobrevida dos pacientes com MM. No entanto, a doença quase sempre recorre no final, e a sobrevida média após a recaída é de apenas 9 meses. O daratumumabe (Dara) disponível apenas na Janssen Company mostrou bons resultados em pacientes com mieloma múltiplo recidivado ou refratário (RRMM), então a FDA o considerou um avanço, e o daratumumabe foi aprovado para comercialização em novembro de 2015 para o tratamento de pacientes com RRMM. Atualmente, vários ensaios clínicos com Dara em combinação com pequenas moléculas foram realizados. O Dara em combinação com fármacos de moléculas pequenas pode melhorar muito a eficácia clínica.
[007] CD38 é uma proteína multifuncional transmembranar do tipo II com um domínio extracelular de 256 aminoácidos. Em um aspecto, foi demonstrado indiretamente que CD38 desempenha um papel na sinalização lateral por meio do ligando CD31, que pode causar adesão celular e desempenhar um papel na ativação de linfócitos e na diferenciação de células B. No entanto, não há evidências bioquímicas diretas para essa função. Por outro lado, o CD38 tem funções como ciclase e hidrolase, podendo não só promover a conversão de NAD (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo) em cADPR (Adenosina Difosfato Ribose cíclico) pela ação da ciclase, mas também promover a conversão de cADPR em ADPR (Adenosina Difosfato Ribose) pela ação da cADPR hidrolase. O CD38 pode regular o fluxo de Ca+2 e também pode promover a produção de adenosina nas células para suprimir a imunidade. Alterações no fluxo de Ca+2 podem afetar a secreção de insulina. Os camundongos com o gene CD38 sendo inativado mostraram sobrevivência normal, mas exibiram vários sintomas, tais como, diminuição da resposta imune humoral, diminuição da insulina e defeitos musculares cardíacos/pulmonares. O CD38 em humanos é expressado em células hematopoiéticas, células imunes e vários tecidos normais, tais como, cérebro, pâncreas, rim, músculo e semelhantes. Foi encontrado altamente expressado na próstata e no timo em nível de RNA, enquanto o nível de expressão foi significativamente aumentado em uma variedade de células tumorais hematológicas, especialmente em células de mieloma múltiplo. Os dados clínicos do Daratumumabe também verificaram a eficácia e a segurança do anticorpo CD38 no campo do mieloma múltiplo, sugerindo o valor potencial do desenvolvimento de CD38 alvo. Vários estudos na literatura mostraram que o mecanismo subjacente ao tratamento de MM com anticorpos anti-CD38 inclui principalmente: 1) ADCC, CDC, ADCP, mecanismo principalmente relacionado a epítopos e IgG1-Fc; 2) efeito direto de morte causado por apoptose; 3) afetar a sobrevivência das células tumorais ao inibir a atividade da enzima CD38; 4) depuração potencial para células Treg que expressam CD38.
[008] O CD38 alvo se tornou um ponto importante no tratamento do mieloma múltiplo. Outro importante anticorpo direcionado a CD38 é o isartuximab disponível na Sanofi, que também foi usado em uma série de ensaios clínicos para uso único e em combinação com fármacos de moléculas pequenas. A partir dos dados existentes, o isartuximab demonstrou a mesma eficácia e a mesma segurança que o daratumumabe. No momento, anticorpos como MOR202 (Morphasys) e TAK-079 (Takeda) entraram na clínica, e também há anticorpos biespecíficos CD38/CD3 e CD38-CAR-T em fase de pesquisa pré-clínica. Outras patentes relacionadas a anticorpos contra CD38 como alvo podem ser encontradas em, por exemplo, WO2006099875, WO2007042309, WO2008047242, WO2012092612, WO2016164656, WO2017149122, etc.
[009] Atualmente, ainda há uma necessidade urgente de continuar a desenvolver anticorpos com alta seletividade, alta afinidade e eficácia favorável.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] A presente divulgação fornece uma série de anticorpos CD38 com maior afinidade, melhor atividade antitumoral in vivo e atividade metabólica favorável in vivo.
Especificamente, a presente divulgação fornece um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a CD38 de humano.
[0011] Em algumas formas de realização, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo que se liga especificamente a CD38 de humano e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs como mostrado abaixo: (i) HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada como mostrado em SEQ ID Nos: 9, 10 e 11 respectivamente, ou variantes de
HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID
Nos: 9, 10 e 11 respectivamente; e LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve como mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID
Nos: 12, 13 e 14, respectivamente, ou variantes de LCDR tendo
3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com
LCDR1, LCDR2, LCDR3 como mostrado em SEQ ID Nos: 12, 13 e 14 respectivamente; ou
(ii) HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada como mostrado em SEQ ID Nos: 15, 16 e 17, respectivamente, ou variantes de
HCDR com 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID
Nos: 15, 16 e 17, respectivamente; e LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve como mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID
Nos: 18, 19 e 20, respectivamente, ou variantes de LCDR tendo
3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com
LCDR1, LCDR2, LCDR3 como mostrado em SEQ ID Nos: 18, 19 e 20 respectivamente; ou
(iii) HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada como mostrado em SEQ ID Nos: 15, 21 e 17, respectivamente, ou variantes de
HCDR com 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID
Nos: 15, 21 e 17, respectivamente; e LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve como mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID
Nos: 22, 19 e 23 respectivamente, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com LCDR1, LCDR2, LCDR3 como mostrado em SEQ ID Nos: 22, 19 e 23 respectivamente.
[0012] Em algumas formas de realização, as variantes de CDR com 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) da CDR (incluindo 3 CDRs da cadeia pesada e 3 CDRs da cadeia leve) do anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno são variantes de CDR com 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) obtida(s) por triagem por métodos de maturação por afinidade.
[0013] Em algumas formas de realização, a afinidade (KD) do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo para o CD38 de humano é menor que 10-8 M, menor que 10-9 M, menor que 10-10 M ou menor que 10-11 M.
[0014] Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-CD38 é um anticorpo de murino, quimérico ou humanizado, sendo preferível um anticorpo humanizado.
[0015] Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo de murino ou um anticorpo quimérico e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo é como mostrado nas SEQ ID Nos: 3, 5, 7, ou tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID Nos: 3, 5, 7; e/ou a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo é como mostrado nas SEQ ID Nos: 4, 6, 8, ou tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID Nos: 4, 6, 8.
[0016] Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve como mostrado abaixo: (a): uma região variável da cadeia pesada, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrado na SEQ ID No: 3 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 3, e uma região variável da cadeia leve, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrado na SEQ ID No: 4 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 4; (b): uma região variável da cadeia pesada, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrado na SEQ ID No: 5 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 5, e uma região variável da cadeia leve, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrado na SEQ ID No: 6 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 6;
(c): uma região variável da cadeia pesada, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrado na SEQ ID No: 7 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID No: 7, e uma região variável da cadeia leve, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrado na SEQ ID No: 8 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 8.
[0017] Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado e o anticorpo humanizado compreende regiões estruturais (FR) ou variantes da região estrutural derivadas da linha germinal de humano, e as variantes da região estrutural têm até 10 (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1) mutações reversas de aminoácidos nas regiões estruturais da cadeia leve e/ou regiões estruturais da cadeia pesada do anticorpo de humano, respectivamente. Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende qualquer um selecionado a partir de (d) a (f) a seguir:
[0018] (d) uma região variável da cadeia pesada, em que uma região variável da cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada e região(ões) estrutural(ais) da cadeia pesada, em que: a sequência de aminoácidos do HCDR1 é como mostrado na SEQ ID No: 9 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a SEQ ID No: 9,
a sequência de aminoácidos do HCDR2 é como mostrado na
SEQ ID No: 10 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 10,
a sequência de aminoácidos do HCDR3 é como mostrado na
SEQ ID No: 11 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 11,
a(s) região(ões) estrutural(ais) da cadeia pesada tem/têm uma ou mais de mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 2F, 38K, 44S, 48I, 67A, 66K, 69L, 71V e 73Q; e/ou uma região variável da cadeia leve, em que uma região variável da cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve e região(ões) estrutural(ais) da cadeia leve,
em que:
a sequência de aminoácidos da LCDR1 é como mostrado na
SEQ ID No: 12 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a SEQ ID No: 12,
a sequência de aminoácidos da LCDR2 é como mostrado na
SEQ ID No: 13 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 13,
a sequência de aminoácidos do LCDR3 é como mostrado na
SEQ ID No: 14 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 14,
a(s) região(ões) estrutural(ais) da cadeia leve tem/têm uma ou mais de mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 2F, 43S, 49K e 87F;
(e) uma região variável da cadeia pesada, em que uma região variável da cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2,
HCDR3 da cadeia pesada e região(ões) estrutural(ais) da cadeia pesada, em que:
a sequência de aminoácidos do HCDR1 é como mostrado na
SEQ ID No: 15 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a SEQ ID No: 15,
a sequência de aminoácidos do HCDR2 é como mostrado na
SEQ ID No: 16 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 16,
a sequência de aminoácidos do HCDR3 é como mostrado na
SEQ ID No: 17 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 17,
a(s) região(ões) estrutural(ais) da cadeia pesada tem/têm uma ou mais de mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 79F, 82A T, 91S e 76S; e/ou uma região variável da cadeia leve, em que uma região variável da cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve e região(ões) estrutural(ais) da cadeia leve,
em que:
a sequência de aminoácidos da LCDR1 é como mostrado na
SEQ ID No: 18 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a SEQ ID No: 18,
a sequência de aminoácidos da LCDR2 é como mostrado na
SEQ ID No: 19 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 19,
a sequência de aminoácidos do LCDR3 é como mostrado na
SEQ ID No: 20 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 20,
a(s) região(ões) estrutural(ais) da cadeia leve tem/têm uma ou mais de mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 58I, 68R e 85T;
(f) uma região variável da cadeia pesada, em que uma região variável da cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2,
HCDR3 da cadeia pesada e região(ões) estrutural(ais) da cadeia pesada, em que:
a sequência de aminoácidos do HCDR1 é como mostrado na
SEQ ID No: 15 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a SEQ ID No: 15,
a sequência de aminoácidos do HCDR2 é como mostrado na
SEQ ID No: 21 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 21,
a sequência de aminoácidos do HCDR3 é como mostrado na
SEQ ID No: 17 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 17,
a(s) região(ões) estrutural(ais) da cadeia pesada tem/têm uma ou mais de mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 48I, 77T e 82A T; e/ou uma região variável da cadeia leve, em que uma região variável da cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve e região(ões) estrutural(ais) da cadeia leve,
em que:
a sequência de aminoácidos da LCDR1 é mostrada na SEQ
ID No: 22 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) em comparação com a SEQ ID No: 22,
a sequência de aminoácidos da LCDR2 é como mostrado na
SEQ ID No: 19 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 19,
a sequência de aminoácidos do LCDR3 é como mostrado na
SEQ ID No: 23 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
em comparação com a sequência da SEQ ID No: 23,
a(s) região(ões) estrutural(ais) da cadeia leve tem/têm uma ou mais de mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 4L, 9A, 22S, 58I, 60A e 68R;
em que, os sítios de mutação reversa descritos acima são numerados de acordo com os critérios de numeração de
Kabat, e a mutação descrita acima, tal como “2F”, refere-se a que o aminoácido na posição 2 (numerado de acordo com os critérios de numeração de Kabat) sofreu mutação reversa para fenilalanina (Phe ou F), “82A T” refere-se a que o aminoácido na posição 82A (numerado de acordo com os critérios de numeração de Kabat) sofreu mutação reversa para treonina
(Thr ou T).
[0019] Em algumas formas de realização, as regiões FR da cadeia pesada do anticorpo são selecionadas da combinação de linha germinal de humano IGKV3-11*01 e hJK4.1 ou têm pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a mesma.
[0020] Em algumas formas de realização, as regiões FR da cadeia leve são selecionadas da combinação de linha germinal de humano IGKV3-11*01 and hJK4.1 ou têm pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a mesma.
[0021] Em algumas formas de realização, as regiões FR da cadeia pesada são selecionadas da combinação de linha germinal de humano IGHV3-7*01 e hJH6.1 FR4 ou têm pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a mesma.
[0022] Em algumas formas de realização, as regiões FR da cadeia leve são selecionadas da combinação de linha germinal de humano IGKV4-1*01 e hJK4.1 ou têm pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a mesma.
[0023] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada como mostrado nas SEQ ID Nos: 24, 32 ou 37 ou uma variante da mesma; em que a variante tem 1-10 (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1) mutações de aminoácidos nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada acima. Em algumas formas de realização, a mutação de aminoácido é selecionada de qualquer um dos seguintes: (g) uma ou mais de mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em 2F, 38K, 44S, 48I, 67A, 66K, 69L, 71V e 73Q nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada, como mostrado na SEQ ID No: 24; (h) uma ou mais de mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em 79F e 91S nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 32; (i) mutação reversa de 48I nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada, como mostrado na SEQ ID No: 37.
[0024] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende: a região variável da cadeia pesada como mostrado nas SEQ ID Nos: 26, 27, 28, 29, 34 ou 39, ou a região variável da cadeia pesada tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID Nos: 26, 27, 28, 29, 34 ou 39.
[0025] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende a região variável da cadeia leve como mostrado nas SEQ ID Nos: 25, 33 ou 38 ou uma variante da mesma; a variante tem 1-10 (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5,
4, 3, 2 ou 1) mutação(ões) de aminoácidos na região variável da cadeia leve, como mostrado em qualquer uma das SEQ ID Nos: 25, 33 ou 38.
[0026] Em algumas formas de realização, a mutação de aminoácido é selecionada de qualquer um dos seguintes (j) a (l): (j) uma ou mais de mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em 2F, 43S, 49K e 87F nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 25; (k) uma ou mais de mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em 58I, 68R e 85T nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 33; (l) uma ou mais de mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em 4L, 9A, 22S, 58I, 60A e 68R nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve, como mostrado na SEQ ID No: 38; em que os sítios de mutação reversa são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[0027] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve como mostrado nas SEQ ID Nos: 30, 31, 35, 36, 40, 41 ou 42, ou tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos: 30, 31, 35, 36,
40, 41 ou 42.
[0028] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende: (m) uma região variável da cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 24, 26, 27, 28 ou 29, e uma região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 25, 30 ou 31; ou (n) uma região variável da cadeia pesada como mostrado em SEQ ID Nos: 32 ou 34, e uma região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 33, 35 ou 36; ou (o) uma região variável da cadeia pesada como mostrado em SEQ ID Nos: 37 ou 39, e uma região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 38, 40, 41 ou 42;
[0029] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado compreende: (p) uma região variável da cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 26, e uma região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 30; ou (q) uma região variável da cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 32, e uma região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 33; ou (r) uma região variável da cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 37, e uma região variável da cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 38.
[0030] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende adicionalmente uma região constante; de preferência, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado, cuja região constante da cadeia pesada é derivada de anticorpo de humano IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, ou variantes convencionais de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4; cuja região constante da cadeia leve é derivada de cadeias capa, lambda de anticorpos de humanos ou variantes convencionais das mesmas. Em algumas formas de realização específicas, a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada é como mostrado nas SEQ ID Nos: 43 ou 44, ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as mesmas; a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve é como mostrado nas SEQ ID Nos: 45 ou tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as mesmas.
[0031] Em algumas formas de realização, a cadeia pesada é mostrada nas SEQ ID Nos: 46, 48, 49, 51, 52 ou 54, ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as mesmas; e/ou a cadeia leve é como mostrado nas SEQ ID Nos: 47, 50 ou 53, ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.
[0032] Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-CD38 compreende:
(i) uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 46 ou 48, e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 47; ou (ii) uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 49 ou 51, e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 50; ou (iii) uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 52 ou 54, e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 53.
[0033] Em algumas formas de realização específicas, o anticorpo anti-CD38 compreende: (iv) uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 48 e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 47; ou (v) uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 51 e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 50; ou (vi) uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID No: 54 e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID No: 53.
[0034] Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem atividade de ADCC aumentada, que é alcançada pela modificação da afinidade da região Fc do anticorpo ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo para FcIIIa. Por exemplo, mutações F243L, R292P, Y300L e combinações das mesmas mencionadas na Patente WO2008140603 da MacroGenics, mutações S239D, I332E ou combinação das mesmas na região Fc de IgG1 mencionada na Patente US20080260731 de Xencor, e outras mutações capazes de potencializar a função de ADCC divulgada na técnica.
[0035] Em algumas formas de realização, o fragmento de ligação a antígeno é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, diacorpo e dsFv.
[0036] A presente divulgação também fornece um anticorpo anti-CD38 competindo com o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno descrito acima para ligação a CD38 de humano, ou competindo com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima para ligação ao mesmo epítopo de antígeno CD38.
[0037] A presente divulgação também fornece uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno descrito acima, e um ou mais de carreadores, diluentes, tampões ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. De preferência, a composição farmacêutica pode conter 0,01 a 99% em peso do anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo em dosagem unitária; ou a composição farmacêutica pode conter, de preferência 0,1-2000 mg, mais de preferência 1-1000 mg do anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo em dosagem unitária.
[0038] A presente divulgação também fornece uma molécula de ácido nucleico isolada, que codifica o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima.
[0039] A presente divulgação também fornece um vetor, que compreende a molécula de ácido nucleico descrita acima.
[0040] A presente divulgação também fornece uma célula hospedeira transformada (ou transduzida ou transfectada) com o vetor descrito acima. Também divulga uma célula hospedeira, que contém o vetor descrito acima. A célula hospedeira é selecionada de célula procariótica e célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira não inclui qualquer célula de humano capaz de se desenvolver em um ser completo, tal como célula tronco embrionária de humano, ovo fertilizado e célula germinativa; de preferência, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, mais de preferência uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero inclui, mas não se limita a, CHO, 293, NSO, e uma célula de mamífero na qual a edição do gene é realizada para alterar a modificação de glicosilação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, modificando assim a função de ADCC do anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, por exemplo, inativando os genes, tais como FUT8 ou GnT-III; em algumas formas de realização, a célula de mamífero não inclui a célula de humano.
[0041] A presente divulgação também fornece um método para preparar o anticorpo anti-CD38 ou os fragmentos de ligação a antígeno descritos acima, o método compreende as etapas de cultivo das células hospedeiras descritas acima e,
em seguida, recuperar o anticorpo anti-CD38 ou os fragmentos de ligação a antígeno do mesmo; incluindo opcionalmente a etapa de purificação do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0042] A presente divulgação também fornece um método para detectar ou medir CD38 de humano, compreendendo o contato do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno descrito acima com uma amostra a ser testada.
[0043] A presente divulgação também fornece um reagente para detectar ou medir CD38 de humano, o reagente compreende o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima.
[0044] A presente divulgação também fornece um agente de diagnóstico para doenças relacionadas ao CD38 de humano, o agente de diagnóstico compreende o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima.
[0045] A presente divulgação também fornece um método para diagnosticar doenças relacionadas a CD38 de humano, compreendendo a detecção ou medição de células de humano CD38 ou CD38 positivas usando o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima.
[0046] A presente divulgação também fornece o uso do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima na preparação de um agente de diagnóstico para doenças relacionadas ao CD38 de humano.
[0047] A presente divulgação também fornece um método para tratar ou prevenir uma doença, compreendendo a administração a um ser de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno descrito acima, ou uma composição farmacêutica que compreende o mesmo, ou o ácido nucleico molecular descrito acima.
[0048] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é tumor ou doença imunológica.
[0049] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é doença ou distúrbio CD38 positivo.
[0050] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio descrita(o) acima é um tumor.
[0051] Em algumas formas de realização, o tumor descrito acima é selecionado do grupo que consiste em leucemia, linfoma de células B, tumor maligno de células plasmáticas, linfoma de células T/NK e mieloma. Em algumas formas de realização, a leucemia é selecionada do grupo que consiste em leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda e crônica. Em algumas formas de realização, o mieloma é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, tumor medular anterior, amiloidose de cadeia leve e semelhantes. Em algumas formas de realização, o linfoma é linfoma não-Hodgkin ou linfoma de Hodgkin. Em algumas formas de realização, o tumor é leucemia/linfoma de células B, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em: tumor de células B maduras, leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras, linfoma não-Hodgkin de células B e linfoma de Hodgkin de células B. Em algumas formas de realização, o tumor é selecionado do grupo que consiste em leucemia linfocítica crônica de células B (LLC), leucemia linfocítica de pequenas células (LLPC), leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia pré-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células do manto (LCM), linfoma folicular (FL) de baixo grau/ de grau intermediário/de alto grau, linfoma central folicular cutâneo, linfoma de células B de zona marginal (incluindo tipo MALT, tipo linfonodo MZBL, tipo MZBL de baço), leucemia de células pilosas, linfoma difuso de grandes células B, Linfoma de Burkitt, tumor de células plasmáticas/mieloma de células plasmáticas, leucemia de células plasmáticas, doença linfoproliferativa pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de células plasmáticas, linfoma anaplásico de grandes células (LAGC) e linfoma de células pilosas
[0052] Em algumas formas de realização, o tumor é linfoma de células B ou mieloma múltiplo.
[0053] Em algumas formas de realização, o tumor é mieloma múltiplo.
[0054] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio descrita(o) acima é uma doença imunológica, tal como uma doença imunológica envolvendo células B, células plasmáticas, monócitos e células T que expressam CD38.
[0055] Em algumas formas de realização, a doença imunológica inclui, mas não se limita a: artrite reumatoide, psoríase, espondilite anquilosante, psoríase articular, dermatite, esclerodermia sistêmica e esclerose, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome de angústia respiratória, meningite, encefalite, gastrite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, arteriosclerose, deficiência de adesão de leucócitos, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite imunocomplexa, nefropatia por IgA, polineuropatia por IgM, sintoma de trombocitopenia imunomediada (por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática aguda, púrpura trombocitopênica idiopática crônica), anemia hemolítica, miastenia gravis, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide (AR), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, esclerose múltipla, HIV e doenças relacionadas ao vírus do herpes, síndrome respiratória aguda grave e coriorretinite, doença enxerto contra hospedeiro e doença imunológica causada por infecção viral (tal como doença causada ou mediada por células B infectadas com o vírus Ebola (EBV)).
[0056] Em algumas formas de realização, a doença imunológica é selecionada do grupo que consiste em: artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, asma, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença de Crohn, gastrite, tireoidite de Hashimoto, espondilite anquilosante e doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é artrite reumatoide.
[0057] A presente divulgação fornece ainda o uso do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito acima ou a composição farmacêutica ou a molécula de ácido nucleico descrita acima na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doenças ou distúrbios.
[0058] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é tumor ou doença imunológica.
[0059] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é doença ou distúrbio CD38 positivo.
[0060] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio descrita(o) acima pode ser tumor, por exemplo, a doença é caracterizada pela presença de células tumorais que expressam CD38.
[0061] Em algumas formas de realização, o tumor descrito acima é selecionado do grupo que consiste em leucemia, linfoma de células B, tumor maligno de células plasmáticas, linfoma de células T/NK e mieloma.
[0062] Em algumas formas de realização, a leucemia é selecionada do grupo que consiste em leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda e crônica.
[0063] Em algumas formas de realização, o mieloma é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, tumor medular anterior e amiloidose de cadeia leve.
[0064] Em algumas formas de realização, o linfoma é linfoma não-Hodgkin ou linfoma de Hodgkin.
[0065] Em algumas formas de realização, o tumor descrito acima é leucemia/linfoma de células B, por exemplo, é selecionado de tumores de células B maduras ou linfoma/leucemia linfoblástica de células B precursoras, ou selecionado de linfoma não-Hodgkin de células B ou linfoma de Hodgkin de células B.
[0066] Em algumas formas de realização, o tumor descrito acima é selecionado do grupo que consiste em: leucemia linfocítica crônica de células B (LLC), leucemia linfocítica de pequenas células (LLPC), leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia pré-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células do manto (LCM), linfoma folicular (incluindo LF de baixo grau, de grau intermediário ou de alto grau), linfoma central folicular cutâneo, linfoma de células B da zona marginal (incluindo tipo MALT, tipo de linfonodo MZBL, tipo MZBL de baço), leucemia de células pilosas, linfoma de grandes células B difusas, linfoma de Burkitt, tumor de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, leucemia de células plasmáticas, doença linfoproliferativa pós- transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de células plasmáticas, linfoma anaplásico de grandes células (LAGC) e linfoma de células pilosas.
[0067] Em algumas formas de realização, o tumor é linfoma de células B ou mieloma múltiplo.
[0068] Em algumas formas de realização, o tumor é mieloma múltiplo.
[0069] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é uma doença imunológica, tal como uma doença imunológica envolvendo células B, células plasmáticas, monócitos e células T que expressam CD38.
[0070] Em algumas formas de realização, a doença imunológica pode ser selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, psoríase, espondilite anquilosante,
psoríase articular, dermatite, esclerodermia sistêmica e esclerose, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de
Crohn, colite ulcerativa, síndrome da dificuldade respiratória, meningite, encefalite, gastrite, uveíte,
glomerulonefrite, eczema, asma, arteriosclerose, deficiência de adesão de leucócitos, síndrome de Raynaud, síndrome de
Sjogren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de
Behçet, nefrite imunocomplexa, nefropatia por IgA,
polineuropatia mediada por IgA, polineuropatia imunomediada por IgA (por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática aguda, púrpura trombocitopênica idiopática crônica), anemia hemolítica, miastenia gravis, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide (AR), dermatite atópica, miastenia gravis, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide (AR), dermatite atópica,
pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto,
granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, esclerose múltipla, HIV e doenças relacionadas ao vírus do herpes,
síndrome respiratória aguda grave, coriorretinite, doença enxerto contra hospedeiro e doença imunológica causada por infecção viral (tais como doenças causadas ou mediadas por células B infectadas com o vírus Ebola (EBV)). Em algumas formas de realização, a doença imunológica é selecionada do grupo que consiste em: artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, asma, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença de Crohn, gastrite, tireoidite de Hashimoto, espondilite anquilosante e doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio imune é a artrite reumatoide.
[0071] A presente divulgação fornece adicionalmente um anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica, ou uma molécula de ácido nucleico, para uso no tratamento ou na prevenção das doenças ou dos distúrbios descrita(o)s acima.
[0072] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é tumor ou doença imunológica; em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio é doença ou distúrbio CD38 positivo.
[0073] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio descrita(o) acima é um tumor. Por exemplo, a doença é caracterizada pela presença de células tumorais que expressam CD38. Em algumas formas de realização, o tumor é selecionado do grupo que consiste em leucemia, linfoma de células B, tumor maligno de células plasmáticas, linfoma de células T/NK e mieloma. Em algumas formas de realização, a leucemia é selecionada do grupo que consiste em leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda e crônica. Em algumas formas de realização,
o mieloma é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, tumor medular anterior e amiloidose de cadeia leve.
Em algumas formas de realização, o linfoma é linfoma não- Hodgkin ou linfoma de Hodgkin. Em algumas formas de realização, o tumor é leucemia/linfoma de células B, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em: tumor de células B maduras, leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras, linfoma não-Hodgkin de células B e linfoma de Hodgkin de células B. Em algumas formas de realização, o tumor é selecionado do grupo que consiste em: leucemia linfocítica crônica de células B (LLC), leucemia linfocítica de pequenas células (LLPC), leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia pré-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células do manto (LCM), linfoma folicular (incluindo LF de baixo grau, de grau intermediário ou de alto grau), linfoma central folicular cutâneo, linfoma de células B da zona marginal (incluindo tipo MALT, tipo de linfonodo MZBL, tipo MZBL de baço), leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, tumor de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, leucemia de células plasmáticas, doença linfoproliferativa pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de células plasmáticas, linfoma anaplásico de grandes células (LAGC) e linfoma de células pilosas. Em algumas formas de realização,
o tumor é linfoma de células B ou mieloma múltiplo. Em algumas formas de realização, o tumor é mieloma múltiplo.
[0074] Em algumas formas de realização, a doença ou o distúrbio descrita(o) acima é uma doença imunológica, por exemplo, doença imunológica envolvendo células B, células plasmáticas, monócitos e células T que expressam CD38.
[0075] Em algumas formas de realização, a doença imunológica pode ser selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, psoríase, psoríase articular, dermatite, esclerodermia sistêmica e esclerose, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da angústia respiratória, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, arteriosclerose, deficiência de adesão de leucócitos, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite imunocomplexa, nefropatia por IgA, polineuropatia por IgM, sintoma de trombocitopenia imunomediada (por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática aguda, púrpura trombocitopênica idiopática crônica), anemia hemolítica, miastenia gravis, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide (AR), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, esclerose múltipla, HIV e doenças relacionadas ao vírus do herpes, síndrome respiratória aguda grave, coriorretinite e doença imunológica causada por infecção viral (tal como doença causada ou mediada por células B infectadas com vírus Ebola (EBV)). Em algumas formas de realização, a doença imunológica é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, asma, doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, doença de Crohn, gastrite, tireoidite de Hashimoto, espondilite anquilosante e doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas formas de realização, a doença imunológica é a artrite reumatoide.
[0076] Os anticorpos anti-CD38 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente divulgação exibem eficiência favorável em ambos os testes bioquímicos e ensaios farmacodinâmicos in vivo. No teste para detectar a afinidade de anticorpo para antígeno, o anticorpo da presente divulgação hu9E mostrou valor KD de 1,31 nM para CD38 de humano, hu11E mostrou valor KD de 0,568 nM para CD38 de humano e hu160E mostrou valor KD de 0,0585 nM para CD38 de humano, enquanto o anticorpo de controle apresentou valor KD de 2,35 nM, sugerindo que os anticorpos da presente divulgação têm maior afinidade (Tabela 18).
[0077] No teste de inibição in vivo do tumor, verificou- se que ambos os anticorpos hu11E e hu160E da presente divulgação podem inibir efetivamente o crescimento do tumor em camundongos. A taxa de inibição tumoral de hu11E a uma dosagem de 1mpk foi de até 93,14%, e hu160E exibiu taxa de inibição tumoral de 70,02%, ambos foram significativamente maiores do que a do anticorpo de controle Dara (a taxa de inibição tumoral foi de 56,83%) (Tabela 20).
[0078] Além disso, os anticorpos monoclonais anti-CD38 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente divulgação têm propriedades cinéticas metabólicas favoráveis em ratos e mostram uma meia-vida mais longa e maior biodisponibilidade.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0079] Figura 1A: Resultados do teste de ADCP in vitro de anticorpos CD38 em células Molp-8.
[0080] Figura 1B: Resultados do teste de ADCP in vitro de anticorpos CD38 em células Daudi.
[0081] Figura 2: Efeitos de inibição de tumor de anticorpos CD38 em camundongos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Terminologia
[0082] A fim de tornar a presente divulgação mais facilmente compreendida, certos termos técnicos e científicos são definidos especificamente abaixo. A menos que definido explicitamente de outra forma nesse documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados nesse documento têm o significado comumente entendido por aqueles habilitados na técnica aos quais essa divulgação se refere.
[0083] Os códigos de três letras e os códigos de uma letra para os aminoácidos usados na presente divulgação são como descritos em J. biol. Chem, 243, p3558 (1968).
[0084] Como usado nesse documento, “anticorpo” refere- se a imunoglobulina, uma estrutura de cadeia de quatro peptídeos ligados entre si por ligação dissulfeto entre duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas.
Diferentes regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina exibem diferentes composições e sequências de aminoácidos, portanto, apresentam antigenicidade diferente.
Consequentemente, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco tipos (ou isotipos de imunoglobulina), ou seja, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, correspondendo à cadeia pesada , , ,  e , respetivamente, de acordo com a sua composição de aminoácidos da região de dobradiça e o número e a localização das ligações dissulfeto da cadeia pesada, o mesmo tipo de Ig pode ainda ser dividido em diferentes subtipos, por exemplo, IgG pode ser dividido em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A cadeia leve pode ser dividida em cadeia  ou  com base em diferentes regiões constantes. Cada um dos cinco tipos de Ig tem cadeia  ou .
[0085] Cerca de 110 sequências de aminoácidos adjacentes ao terminal N das cadeias pesada e leve do anticorpo são altamente variáveis, conhecidas como região variável (região Fv); o resto das sequências de aminoácidos próximas ao terminal C são relativamente estáveis, conhecidas como região constante. A região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVRs) e quatro regiões estruturais relativamente conservadas (FRs). As três regiões hipervariáveis que determinam a especificidade do anticorpo também são conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Cada região variável da cadeia leve (VL ou LCVR) e cada região variável da cadeia pesada (VH ou HCVR) consiste em três regiões CDR e quatro regiões FR, com ordem sequencial do terminal amino ao terminal carboxila como o seguinte: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As três regiões CDR da cadeia leve referem-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3, e as três regiões CDR da cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3.
[0086] Os anticorpos da presente divulgação incluem anticorpos de murino, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, de preferência anticorpos humanizados.
[0087] Como usado nesse documento, o termo “anticorpo de murino” refere-se a anticorpos monoclonais anti-CD38 de humano preparados de acordo com o conhecimento e habilidades na técnica. Durante a preparação, o ser de teste é injetado com o antígeno CD38, e então um hibridoma que expressa o anticorpo que possui a sequência desejada ou características funcionais é isolado. Em uma forma de realização preferencial da presente divulgação, o anticorpo CD38 de murino ou fragmento de ligação a antígeno compreende adicionalmente uma região constante da cadeia leve de cadeia ,  de murino ou variante da mesma, ou compreende adicionalmente uma região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2 de murino, IgG3 ou variante da mesma.
[0088] O termo “anticorpo quimérico” é um anticorpo obtido pela fusão da região variável de um anticorpo de uma espécie (tal como de murino) com a região constante de anticorpo de outra espécie (tal como humano), e o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imunológica induzida por anticorpo murino. Para preparar um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal de murino específico secretor de hibridoma é primeiro preparado e o gene da região variável é clonado a partir do hibridoma de murino; então o gene da região constante é clonado do anticorpo de humano de acordo com a necessidade; o gene da região variável de murino é conectado ao gene da região constante de humano para formar um gene quimérico, que pode ser subsequentemente inserido em um vetor de expressão. Finalmente, a molécula de anticorpo quimérico será expressada em sistema eucariótico ou procariótico. Em uma forma de realização específica da presente divulgação, a cadeia leve do anticorpo do anticorpo quimérico CD38 compreende adicionalmente uma região constante da cadeia leve de uma cadeia capa, lambda de humano ou uma variante da mesma. A cadeia pesada do anticorpo CD38 quimérico compreende adicionalmente uma região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 de humano ou uma variante convencional da mesma, de preferência compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 de humano, e mais de preferência compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 com mutações de aminoácidos (tal como a mutação E333A) que aumentam a função de CDC.
[0089] O termo “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo gerado por enxerto de sequências de CDR de murino em estruturas de região variável de anticorpo de humano, isto é, um anticorpo produzido em diferentes tipos de sequências estruturais de anticorpo de linha germinal de humano. O anticorpo humanizado pode evitar respostas heterólogas induzidas por anticorpo quimérico que carrega um grande número de componentes de proteína de murino. Essas sequências estruturais podem ser obtidas a partir de banco de dados público de DNA ou referências publicadas cobrindo sequências do gene do anticorpo da linha germinal. Por exemplo, sequências de DNA de linha germinal de genes de região variável das cadeia pesada e leve de humano podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linha germinal de humano “VBase” (www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Para evitar uma diminuição na atividade causada pela imunogenicidade diminuída, as sequências estruturais na região variável do anticorpo de humano podem ser submetidas a mutações reversas mínimas ou mutações reversas para manter a atividade. Os anticorpos humanizados da presente divulgação também incluem anticorpos humanizados obtidos após maturação de afinidade de CDR por exibição de fago ou exibição de levedura.
[0090] O enxerto de CDR pode resultar na diminuição da afinidade do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para o antígeno, devido à alteração dos resíduos estruturais responsáveis pelo contato com o antígeno. Essas interações podem ser resultantes de mutações altamente somáticas. Portanto, é necessário enxertar os aminoácidos da estrutura do doador na estrutura do anticorpo humanizado. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação a antígeno derivados de anticorpo não humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo podem ser identificados verificando a sequência e a estrutura da região variável do anticorpo monoclonal animal. Os diferentes resíduos de aminoácidos entre a estrutura de CDR doadora e as linhas germinais podem ser considerados relacionados. Se não for possível determinar a linha germinal mais intimamente relacionada, a sequência pode ser alinhada contra a sequência de consenso compartilhada entre os subtipos ou contra a sequência de murino tendo alta porcentagem de similaridade. Pensa-se que resíduos raros na estrutura são o resultado de uma mutação em células somáticas e desempenham um papel importante na ligação.
[0091] Em algumas formas de realização específicas da presente divulgação, a cadeia leve do anticorpo do anticorpo humanizado CD38 compreende adicionalmente uma região constante da cadeia leve de uma cadeia capa, lambda de humano ou uma variante convencional da mesma. A cadeia pesada do anticorpo do anticorpo humanizado CD38 compreende adicionalmente uma região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 de humano ou uma variante convencional da mesma, de preferência compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 de humano e, mais de preferência, compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 com mutações de aminoácidos (tal como a mutação E333A) que aumentam a função de CDC.
[0092] As “variantes convencionais” da região constante da cadeia pesada do anticorpo de humano e da região constante da cadeia leve do anticorpo descritas na presente divulgação referem-se às variantes da região constante da cadeia pesada ou leve de humano divulgadas na técnica anterior que não alteram a estrutura e a função das regiões variáveis do anticorpo.
Variantes de exemplo incluem variantes da região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 por modificação direcionada ao sítio e substituições de aminoácidos na região constante da cadeia pesada. As substituições específicas são, por exemplo, mutação YTE, mutação L234A e/ou L235A, mutação S228P, mutação E333A e/ou mutações resultando em uma estrutura protuberâncias-em-buracos (fazendo com que a cadeia pesada do anticorpo tenha uma combinação de protuberância-Fc e buraco- Fc), etc. Foi comprovado que essas mutações conferem ao anticorpo novas propriedades, sem afetar a função da região variável do anticorpo.
[0093] O termo “mutação reversa” refere-se à reversão dos resíduos de aminoácidos nas regiões FR derivadas do anticorpo de humano de volta aos resíduos de aminoácidos correspondentes aos do anticorpo original. A fim de evitar a diminuição da atividade causada pelo anticorpo humanizado, usualmente as regiões variáveis dos anticorpos humanizados podem ser submetidas a mutações reversas mínimas para manter a atividade do anticorpo.
[0094] “Anticorpo humano (HuMAb)”, “anticorpo derivado de humano”, “anticorpo de humano completo” e “anticorpo de humano completo” podem ser usados indistintamente e podem ser anticorpos derivados de humanos ou anticorpos obtidos de um organismo geneticamente modificado que foi “manipulado geneticamente” por qualquer método conhecido na técnica para produzir anticorpos de humanos específicos em resposta à estimulação com antígeno. Em algumas tecnologias, elementos de loci das cadeia pesada e leve de humano são introduzidos em cepas de células de organismos derivadas de linhas de células tronco embrionárias, nas quais os loci das cadeia pesada e leve endógenos foram inativados especificamente. Os organismos transgênicos podem sintetizar anticorpos de humanos específicos para antígenos humanos, e os organismos podem ser usados para produzir hibridomas que secretam anticorpos de humanos. Um anticorpo de humano também pode ser um anticorpo no qual as cadeias pesada e leve são codificadas por sequências de nucleotídeos derivadas de um ou mais de DNA de fontes de humanos. Os anticorpos de humanos completos também podem ser construídos por métodos de transfecção de genes ou cromossomos e tecnologia de exibição de fago, ou construídos a partir de células B ativadas in vitro, todos os métodos são conhecidos na técnica.
[0095] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo completo”, “anticorpo inteiro” e “anticorpo completo” são usados indistintamente nesse documento e referem-se a um anticorpo em uma forma substancialmente completa, que é distinta do fragmento de ligação a antígeno definido abaixo. O termo refere-se especificamente a anticorpos que contêm regiões constantes nas cadeias leve e pesada.
[0096] Em algumas formas de realização, os anticorpos de comprimento total da presente divulgação incluem anticorpos de comprimento total formados ligando a região variável da cadeia leve à região constante da cadeia leve, e a região variável da cadeia pesada à região constante da cadeia pesada, como mostrado na Tabela 1 abaixo. Os habilitados na técnica podem selecionar a região constante da cadeia leve e a região constante da cadeia pesada de várias fontes de anticorpos de acordo com a necessidade, tais como, a região constante da cadeia leve derivada de anticorpo de humano (ou variante convencional da mesma) e a região constante da cadeia pesada (ou variante convencional da mesma). Ao mesmo tempo, a combinação das regiões variáveis das cadeia leve e pesada descritas na Tabela 1 pode formar um anticorpo de cadeia única (scFv), Fab ou outras formas de fragmentos de ligação a antígeno compreendendo scFv ou Fab.
Tabela 1: Combinações da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada de anticorpo humanizado anti-CD38 Combinação de Região variável da Região variável regiões variáveis cadeia pesada VH da cadeia leve VL h009-01V h009 VH1 h009 VL1 h009-02V h009 VH2 h009 VL1 h009-03V h009 VH3 h009 VL1 h009-04V h009 VH4 h009 VL1 h009-05V h009 VH5 h009 VL1 h009-06V h009 VH1 h009 VL2 h009-07V h009 VH2 h009 VL2 h009-08V h009 VH3 h009 VL2 h009-09V h009 VH4 h009 VL2 h009-10V h009 VH5 h009 VL2 h009-11V h009 VH1 h009 VL3 h009-12V h009 VH2 h009 VL3
Combinação de Região variável da Região variável regiões variáveis cadeia pesada VH da cadeia leve VL h009-13V h009 VH3 h009 VL3 h009-14V h009 VH4 h009 VL3 h009-15V h009 VH5 h009 VL3 h011-01V h011 VH1 h011VL1 h011-02V h011 VH2 h011VL2 h011-03V h011 VH1 h011VL3 h011-04V h011 VH2 h011VL1 h011-05V h011 VH1 h011VL2 h011-06V h011 VH2 h011VL3 h160-01V h160 VH1 h160 VL1 h160-02V h160 VH1 h160 VL2 h160-03V h160 VH1 h160 VL3 h160-04V h160 VH1 h160 VL4 h160-05V h160 VH2 h160 VL1 h160-06V h160 VH2 h160 VL2 h160-07V h160 VH2 h160 VL3 h160-08V h160 VH2 h160 VL4 Observação: Por exemplo, “h009-01V” representa o par de regiões variáveis da cadeia leve/pesada de h009-01V, em que a região variável da cadeia pesada é h009VH1 (SEQ ID No: 24), e a região variável da cadeia leve é h009VL1 (SEQ ID No: 25) e assim por diante.
[0097] O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes (por exemplo, variantes contendo mutações de ocorrência natural ou mutações produzidas durante a fabricação de preparações de anticorpos monoclonais, que usualmente estão presentes em quantidades mínimas). Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que geralmente contêm diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal (formulação) é dirigido contra um único determinante no antígeno. Portanto, o prefixo “monoclonal” indica as características do anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como anticorpo fabricado por um método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais usados de acordo com a presente divulgação podem ser preparados por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fago e métodos usando animais transgênicos contendo todos os, ou parte dos, loci de imunoglobulina de humano. Tais métodos e outros métodos de exemplo para a preparação de anticorpos monoclonais são descritos nesse documento.
[0098] O termo “fragmento de ligação a antígeno” ou “fragmento funcional” de um anticorpo refere-se a um ou mais de fragmentos do anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, CD38). Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo de comprimento total podem ser usados para atingir a função de ligação a um antígeno específico.
Exemplos dos fragmentos de ligação contidos no termo “fragmento de ligação a antígeno” de um anticorpo incluem (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente composto de domínios VL, VH, CL e CH1; (ii)
fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente formado por dois fragmentos Fab conectados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça, (iii) fragmento Fv composto pelos domínios VH e VL de um braço do anticorpo; (iv) dsFv, um fragmento de ligação a antígeno estável formado por VH e VL via ligação(ões) dissulfeto intercadeia; e (v) diacorpo,
anticorpo biespecífico e anticorpo multiespecífico contendo fragmentos, tais como, scFv, dsFv e Fab.
Além disso, o domínio VL e o domínio VH em um fragmento Fv são codificados por dois genes separados; no entanto, eles podem ser ligados por um ligante sintético usando métodos recombinantes, para gerar uma única cadeia de proteína na qual uma molécula monovalente é formada pelo pareamento dos domínios VL e VH
(referido como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo,
Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al
(1988) Proc.
Natl.
Acad.
Sci USA85: 5879-5883). Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser incluídos no termo “fragmento de ligação a antígeno". Tais fragmentos de anticorpos são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas na área, e triados para fragmentos funcionais usando o mesmo método que para um anticorpo intacto.
As porções de ligação a antígeno podem ser produzidas por tecnologia de DNA recombinante ou por digestão enzimática ou química de uma imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem estar na forma de diferentes isotipos, por exemplo, anticorpo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou subtipo IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM. Em algumas formas de realização, os fragmentos de ligação a antígeno do mesmo da presente divulgação incluem Fab, F(ab’)2, Fab’, anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo), região V estabilizada por ligação dissulfeto (dsFv), e assim por diante.
[0099] Fab é um fragmento de anticorpo obtido pelo tratamento de uma molécula de anticorpo IgG com uma papaína (que cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H). O fragmento obtido tem um peso molecular de cerca de
50.000 e tem atividade de ligação a antígeno, em que cerca de metade da cadeia H no lado N-terminal e toda a cadeia L estão ligadas por meio de ligação(ões) dissulfeto.
[00100] O Fab da presente divulgação pode ser produzido tratando o anticorpo monoclonal da presente divulgação com papaína. Adicionalmente, o Fab pode ser produzido inserindo DNA que codifica Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico e introduzindo o vetor em um procarioto ou eucarioto para expressar o Fab.
[00101] “F(ab’)2” refere-se a um fragmento de anticorpo com um peso molecular de cerca de 100.000 e atividade de ligação a antígeno, que é obtido por digestão de IgG pela pepsina na parte a jusante das duas ligações dissulfeto na região de dobradiça. F(ab’)2 contém dois Fabs conectados na região de dobradiça.
[00102] O F(ab’)2 da presente divulgação pode ser produzido tratando o anticorpo monoclonal da presente divulgação com pepsina. Além disso, F(ab’)2 pode ser produzido ligando o Fab’ descrito abaixo através de ligação tioéter ou ligação dissulfeto.
[00103] “Fab’” é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação a antígeno, que é obtido pela clivagem de uma ligação dissulfeto na região de dobradiça do F(ab’)2 descrito acima.
O Fab’ da presente divulgação pode ser produzido tratando F(ab’)2 da presente divulgação com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Além disso, o Fab’ pode ser produzido inserindo DNA que codifica Fab’ do anticorpo em um vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico e introduzindo o vetor em um procarioto ou eucarioto para expressar Fab’.
[00104] O termo “anticorpo de cadeia simples”, “Fv de cadeia simples” ou “scFv” refere-se a uma molécula que compreende o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo
(ou região; VH) conectado ao domínio variável da cadeia leve do anticorpo (ou região; VL) por um ligante. Tais moléculas de scFv têm estrutura geral de NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH- ligante-VL-COOH. Um ligante adequado na técnica anterior consiste em sequência de aminoácidos GGGGS repetida ou variante da mesma, por exemplo, variante com 1-4 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:6444-6448). Outros ligantes que podem ser usados na presente divulgação são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol.
31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
[00105] O scFv da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs que codificam o VH e VL do anticorpo monoclonal da presente divulgação, construção de um DNA que codifica o scFv, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico, e então introdução do vetor de expressão em um procarioto ou eucarioto para expressar o scFv.
[00106] “Diacorpo” é um fragmento de anticorpo em que o scFv é dimerizado e é um fragmento de anticorpo tendo atividade de ligação a antígeno divalente. Na atividade de ligação a antígeno divalente, os dois antígenos podem ser iguais ou diferentes.
[00107] Anticorpo biespecífico e multiespecífico refere-se a um anticorpo que pode se ligar simultaneamente a dois ou mais de antígenos ou determinantes antigênicos, incluindo scFv ou fragmentos Fab que podem se ligar a CD38.
[00108] O diacorpo da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs que codificam VH e VL do anticorpo monoclonal da presente divulgação, construção de um DNA que codifica scFv para fazer o comprimento de um peptídeo ligante de 8 ou menos resíduos de aminoácidos, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico e, em seguida, introdução do vetor de expressão em um procarioto ou eucarioto para expressar o diacorpo.
[00109] “dsFv” é obtido substituindo um resíduo de aminoácido em cada um de VH e VL por um resíduo de cisteína e, em seguida, conectando os polipeptídeos substituídos por meio de uma ligação dissulfeto entre os dois resíduos de cisteína. Os resíduos de aminoácidos a serem substituídos por um resíduo de cisteína podem ser selecionados com base na previsão da estrutura tridimensional do anticorpo de acordo com métodos conhecidos (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
[00110] O dsFv da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs que codificam o VH e VL do anticorpo monoclonal da presente divulgação, construção de um DNA que codifica o dsFv, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico, e então introdução do vetor de expressão em um procarioto ou eucarioto para expressar o dsFv.
[00111] Como usado nesse documento, o termo “estrutura (FR)” refere-se a uma parte do domínio variável (seja VL ou VH), que serve como um andaime para os enovelamentos de ligação a antígeno (CDRs) no domínio variável. Essencialmente, é um domínio variável sem CDRs.
[00112] O termo “diferença de aminoácidos” ou “mutação de aminoácidos” refere-se à diferença ou mutação entre um polipeptídeo e sua variante, e refere-se à alteração de aminoácido ou mutação presente na proteína ou variante do polipeptídeo em comparação com a proteína ou o polipeptídeo original, incluindo 1, 2, 3 ou mais substituição(ões), inserção(ões) ou eliminação(ões) de aminoácido com base na proteína ou no polipeptídeo original.
[00113] O termo “região determinante de complementaridade”, “CDR” ou “região hipervariável” refere- se a uma das seis regiões hipervariáveis presentes no domínio variável do anticorpo que contribuem principalmente para a ligação a antígeno. Geralmente, existem três CDRs (HCDR1, HCDR2, HCDR3) em cada região variável da cadeia pesada e três CDRs (LCDR1, LCDR2, LCDR3) em cada região variável da cadeia leve. Os limites da sequência de aminoácidos das CDRs podem ser determinados por qualquer critério bem conhecido, incluindo os critérios de numeração “Kabat” (ver Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5ª edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), critérios de numeração “Chothia” (ver Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273: 927-948) e critérios de numeração ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc MP, Immunologist, 7, 132 - 136 (1999); Lefranc, MP, etc., Dev.
Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) e semelhantes. Por exemplo, para o formato clássico, os critérios de Kabat podem ser seguidos, os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável da cadeia pesada (VH) são numerados como 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável da cadeia leve (VL) são numerados como 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3). Seguindo os critérios de Chothia, os resíduos de aminoácidos de CDR em VH são numerados como 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácidos em VL são numerados como 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91- 96 (LCDR3). Ao combinar Kabat e Chothia para definir CDR, as CDRs são compostas pelos resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) no VH de humano e resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89- 97 (LCDR3) no VL de humano. Seguindo os critérios de IMGT, os resíduos de aminoácidos de CDR em VH são aproximadamente numerados como 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) e 93-102 (CDR3), e os resíduos de aminoácidos de CDR em VL são aproximadamente numerados como 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) e 89-97 (CDR3).
Seguindo os critérios IMGT, as regiões CDR de um anticorpo podem ser determinadas usando o programa IMGT/DomainGap Align.
[00114] O termo “epítopo” ou “determinante antigênico” refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou um anticorpo se liga especificamente (por exemplo, um sítio específico na molécula de CD38). Os epítopos tipicamente incluem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos ou não contíguos em uma conformação espacial única. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, GE Morris Ed. (1996).
[00115] O termo “ligar-se especificamente a” ou “ligar-se seletivamente a” refere-se à ligação de um anticorpo a um epítopo predeterminado em um antígeno.
Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade (KD) menor que cerca de 10-8 M, por exemplo, menor que cerca de 10-9 M, 10-10 M ou 10-11 M ou ainda menos.
[00116] O termo “KD” refere-se à constante de equilíbrio de dissociação para uma interação particular anticorpo-antígeno. Tipicamente, o anticorpo da presente divulgação se liga a CD38 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) menor que cerca de 10-7 M, por exemplo, menor que cerca de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menos, por exemplo, como determinado pela tecnologia ressonância plasmônica de superfície (SPR) no instrumento BIACORE.
[00117] Quando o termo “competição” é usado no contexto de proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, proteínas de ligação a antígeno neutralizantes ou anticorpos neutralizantes) que competem pelo mesmo epítopo, isso significa que ocorre competição entre as proteínas de ligação a antígeno, o que é determinado por um ensaio em que uma proteína de ligação a antígeno a ser testada (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) evita ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma proteína de ligação a antígeno de referência (por exemplo, um ligando ou anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, um antígeno CD38 ou fragmento do mesmo).
Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva estão disponíveis para determinar se uma proteína de ligação a antígeno compete com outra. Esses ensaios são, por exemplo, radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver, por exemplo, Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253); EIA de biotina-avidina direta em fase sólida (ver, por exemplo, Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619; Cheung et al., 1990, Virology176: 546-552), ensaio de rotulação direta em fase sólida, ensaio de sanduíche de rotulação direta em fase sólida (ver, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de rotulação direta em fase sólida com rótulo I-125 (ver, por exemplo, Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15); e RIA de rotulação direta (Moldenhauer et al, 1990, Scand.
J. Immunol. 32: 77-82). Tipicamente, o ensaio envolve o uso de um antígeno purificado capaz de se ligar a uma proteína de ligação a antígeno de teste não rotulada e a uma proteína de ligação a antígeno de referência rotulada (o antígeno está em uma superfície sólida ou superfície celular). A inibição competitiva é determinada medindo a quantidade de rótulo ligado à superfície sólida ou à superfície da célula na presença da proteína de ligação a antígeno de teste.
Usualmente, a proteína de ligação a antígeno de teste está presente em excesso. As proteínas de ligação a antígeno identificadas por ensaio competitivo (proteína de ligação a antígeno competitiva) incluem: proteínas de ligação a antígeno que se ligam ao mesmo epítopo que a proteína de ligação a antígeno de referência; e proteínas de ligação a antígeno que se ligam a um epítopo que é suficientemente próximo ao epítopo ao qual a proteína de ligação a antígeno de referência se liga, onde os dois epítopos interferem espacialmente um com o outro, interferindo assim na ligação.
Detalhes adicionais sobre os métodos para determinar a ligação competitiva são fornecidos nos Exemplos nesse documento. Tipicamente, quando uma proteína de ligação a antígeno competitiva está presente em excesso, ela irá inibir (por exemplo, reduzir) pelo menos 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65 -70%, 70-75% ou ainda mais da ligação específica da proteína de ligação a antígeno de referência ao antígeno comum. Em alguns casos, a ligação é inibida em pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% ou até mais.
[00118] Como usado nesse documento, o termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas de preferência é DNA de fita dupla. Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor ou potencializador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação, quando afeta a transcrição da sequência.
[00119] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Em uma forma de realização, o vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um enovelamento de DNA circular de fita dupla em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Em outra forma de realização, o vetor é um vetor viral, em que segmentos de
DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Os vetores divulgados nesse documento são capazes de se autorreplicar na célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos), ou podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais).
[00120] Os métodos para a produção e a purificação de anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, capítulos 5-8 e 15. Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados com CD38 de humano ou fragmentos dos mesmos, e os anticorpos resultantes podem então ser renaturados, purificados e sequenciados para sequências de aminoácidos usando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Os fragmentos de ligação a antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. Os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente divulgação são manipulados geneticamente para enxertar uma ou mais de regiões FR de humanos em CDRs derivadas de anticorpos não humanos. As sequências da linha germinal de FR de humano podem ser obtidas na ImMunoGeneTics (IMGT) através do site http://imgt.cines.fr ou do The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351, alinhando-se com o banco de dados de genes de linha germinal variável de anticorpos de humanos IMGT usando software MOE.
[00121] O termo “célula hospedeira” refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir microrganismos (tais como bactérias), plantas ou células animais. As bactérias susceptíveis de serem transformadas incluem membros da família Enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; a família Bacillaceae, tais como, Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Os microrganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhas de células hospedeiras de animais adequadas incluem CHO (Linha de Célula de Ovário de Hamster Chinês) e células NS0.
[00122] Os anticorpos manipulados geneticamente ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente divulgação podem ser preparados e purificados usando métodos conhecidos. Por exemplo, sequências de cDNA que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser clonadas e manipuladas geneticamente em um vetor de expressão GS. Os vetores que expressam imunoglobulina recombinante podem então ser transfectados de forma estável em células CHO.
Como um método mais recomendado bem conhecido na técnica, os sistemas de expressão de mamíferos resultarão em glicosilação, tipicamente em sítios N-terminais altamente conservados na região Fc. Obtiveram-se clones estáveis que expressam um anticorpo que se liga especificamente a CD38 de humano. Os clones positivos podem ser expandidos em meio de cultura sem soro em biorreatores para a produção de anticorpos. O meio de cultura, para o qual um anticorpo foi segregado, pode ser purificado por técnicas convencionais.
Por exemplo, a purificação pode ser realizada em coluna de Proteína A ou G Sepharose FF que foi modificada com tampão.
Os componentes de ligação não específicos são removidos por lavagem. O anticorpo ligado é eluído por gradiente de pH e fragmentos de anticorpo são detectados por SDS-PAGE e, em seguida, agrupados. Os anticorpos podem ser filtrados e concentrados usando técnicas comuns. As misturas e os agregados solúveis podem ser removidos eficazmente por técnicas comuns, tal como exclusão por tamanho ou troca iônica. O produto resultante às vezes precisa ser congelado imediatamente, tal como a -70 °C, ou liofilizado.
“Administração”, “administrar” ou “tratamento” que se aplica a um animal, humano, ser, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, refere-se ao contato de um(a) agente ou composição farmacêutico, terapêutico(a), diagnóstico(a), exógeno(a) com o(a) animal, humano, ser, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. “Administração”, “administrar” ou
“tratamento” pode se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa e experimentais. O tratamento de uma célula envolve o contato de um reagente com a célula, bem como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula.
“Administração”, “administrar” ou “tratamento” também significa tratamentos in vitro ou ex vivo, por exemplo, de uma célula, com um reagente, diagnóstico, composto de ligação ou com outra célula. “Tratamento”, no que se refere a um ser humano, veterinário ou ser de pesquisa, refere-se a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, a aplicações de pesquisa e diagnóstico.
[00123] “Tratamento” significa a administração de um agente terapêutico, tal como uma composição contendo qualquer um dos anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno da presente divulgação, ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, interna ou externamente a um paciente tendo um ou mais sintoma(s) de doença para os quais o agente terapêutico é conhecido por ter efeito terapêutico.
Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintoma(s) da doença no paciente ou na população a ser tratado(a), seja induzindo a regressão ou inibindo a progressão de tal(ais) sintoma(s) por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também referido como a “quantidade terapeuticamente eficaz”) pode variar de acordo com vários fatores, tais como, o estado de doença, a idade e o peso corporal do paciente, e a capacidade do fármaco de provocar uma resposta desejada no paciente. Se um sintoma de doença foi aliviado pode ser avaliado por qualquer medição clínica tipicamente usada por médicos ou outros profissionais de saúde habilitados para avaliar a gravidade ou o estado de progressão desse sintoma. Embora uma forma de realização da presente divulgação (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) possa não ser eficaz no alívio de cada sintoma de doença alvo, ela deve aliviar o(s) sintoma(s) de doença alvo em um número estatisticamente significativo de seres, como determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como teste t de Student, teste do qui- quadrado, teste U de acordo com Mann e Whitney, teste de Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.
[00124] “Modificação conservadora” ou “substituição ou substituição conservadora” refere-se à substituição de aminoácido(s) em uma proteína por outro(s) aminoácido(s) tendo características similares (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação de estrutura e rigidez, etc.), de modo que as alterações possam ser feitas frequentemente sem afetar a atividade biológica da proteína. Os habilitados na técnica reconhecem que, em geral, a substituição de um único aminoácido em regiões não essenciais de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224 (4ª Ed.)). Além disso, as substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente similares têm menos probabilidade de interromper a atividade biológica. Substituições conservativas de exemplo são apresentadas na Tabela 2 “Substituições conservativas de aminoácidos de exemplo” abaixo.
Tabela 2. Substituições conservativas de aminoácidos de exemplo Resíduo original Substituição conservativa Ala (A) Gly; Ser Arg(R) Lys; His Asn (N) Gln; His; Asp Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala; Val Gln(Q) Asn; Glu Glu (E) Asp; Gln Gly (G) Ala His (H) Asn; Gln Ile (I) Leu; Val Leu (L) Ile; Val Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; Ile; Tyr Phe (F) Tyr; Met; Leu Pro(P) Ala
Ser(S) Thr Thr(T) Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) Ile; Leu
[00125] “Quantidade eficaz” ou “dosagem eficaz” refere-se à quantidade do agente, do composto ou da composição farmacêutica necessária para obter qualquer um ou mais de resultados benéficos ou desejados. Para aplicações profiláticas, os resultados benéficos ou desejados incluem a eliminação ou redução do risco, redução da gravidade ou atraso no início da doença, incluindo os sintomas bioquímicos, histológicos e comportamentais da condição, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários durante o desenvolvimento da condição. Para aplicações terapêuticas, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, tal como redução da incidência de várias condições associadas ao antígeno alvo da presente divulgação ou melhora de um ou mais sintoma(s) da condição, redução da dosagem de outros agentes necessários para tratar a condição, aumento da eficácia de outro agente e/ou retardo da progressão da condição associada ao antígeno alvo da presente divulgação em pacientes.
[00126] “Exógeno” refere-se a substâncias produzidas fora de organismos, células ou humanos de acordo com as circunstâncias.
[00127] “Endógeno” refere-se a substâncias produzidas dentro de organismos, células ou corpos humanos de acordo com as circunstâncias.
[00128] A “sequência mutada” mencionada na presente divulgação refere-se à sequência de nucleotídeos e sequência de aminoácidos de identidade de sequência de porcentagem variável com aquelas da presente divulgação, que são obtidas após a modificação da sequência de nucleotídeos e da sequência de aminoácidos da presente divulgação por substituição, inserção ou exclusão apropriada. A identidade de sequência descrita na presente divulgação pode ser de pelo menos 85%, 90% ou 95%, exemplos não limitativos incluem 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%.
[00129] Como aqui usado, “homologia” ou “identidade” refere-se à semelhança de sequência entre duas sequências de polinucleotídeos ou entre duas sequências polipeptídicas.
Quando uma posição em ambas as sequências a serem comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácido, por exemplo, quando uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada pela mesma base, então as moléculas são conhecidas como homólogas nessa posição. A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições totais a serem comparadas e, em seguida,
multiplicado por 100. Por exemplo, quando duas sequências estão alinhadas de forma otimizada, se 6 de 10 posições nas duas sequências são correspondentes ou homólogas, então as duas sequências são 60% homólogas; se 95 de 100 posições nas duas sequências forem correspondentes ou homólogas, então as duas sequências são 95% homólogas. Geralmente, as duas sequências a serem comparadas são submetidas a alinhamento para resultar em uma porcentagem máxima de homologia. Por exemplo, a comparação pode ser realizada pelo algoritmo BLAST, no qual os parâmetros do algoritmo são selecionados para dar a correspondência máxima entre cada sequência ao longo de todo o comprimento de cada sequência de referência.
As seguintes referências referem-se ao algoritmo BLAST frequentemente usado para análise de sequência: Algoritmo BLAST (BLAST ALGORITHMS): Altschul, SF et al., (1990) J.
Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. et al., (1993) Nature Genet.
3:266-272; Madden, TL et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131- 141; Altschul, SF et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402; Zhang, J. et al. (1997) Genome Res. 7:649-656. Outros algoritmos BLAST convencionais, tais como aqueles disponíveis no NCBI BLAST, também são bem conhecidos pelos habilitados na técnica.
[00130] Como usadas nesse documento, as expressões “célula”, “linha celular” e “cultura celular” são usadas indiferentemente e todas essas designações incluem descendência. Assim, “transformante” e “célula transformada” incluem as células do ser primárias e culturas derivadas das mesmas, independentemente do número de passagens. Também deve ser entendido que toda a descendência pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações intencionais ou não intencionais. A descendência mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como triada nas células originalmente transformadas está incluída. Onde designações diferentes se destinam, será claramente entendido a partir do contexto.
[00131] Como usado nesse documento, “reação em cadeia da polimerase” ou “PCR” refere-se a um procedimento ou uma técnica em que quantidades mínimas de uma porção específica de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas como descrito em, por exemplo, Pat. N 4.683.195. Geralmente, a informação da sequência nas extremidades ou além da região de interesse precisa estar disponível, de modo que os iniciadores de oligonucleotídeos possam ser projetados; esses iniciadores serão idênticos ou similares à sequência da cadeia complementar do molde a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5’ dos dois iniciadores podem ser idênticos às extremidades do material amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas do genoma total e cDNA transcrito de RNA celular total, sequências de bacteriófagos ou plasmídeos, etc. Ver geralmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; editora Erlich, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY). A PCR usada na presente divulgação é considerada um (mas não o único) exemplo de métodos de reação de polimerase para amplificar uma amostra de ácido nucleico a ser testada. O método compreende o uso de sequências de ácidos nucleicos conhecidas como iniciadores juntamente com a polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar uma porção específica de ácido nucleico.
[00132] “Isolado” refere-se a um estado purificado, no qual a molécula designada está substancialmente livre de outras moléculas biológicas, tais como, ácidos nucleicos, proteínas, lipídios, carboidratos ou outros materiais, tais como, detritos celulares e meio de crescimento. Em geral, o termo “isolado” não se destina a significar a ausência completa desses materiais ou a ausência de água, tampões ou sais, a menos que estejam presentes em uma quantidade que interfira significativamente com o uso experimental ou terapêutico do composto, como descrito nesse documento.
[00133] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou a circunstância que se segue pode ocorrer, mas não necessariamente, e a descrição indicará os casos em que o evento ou circunstância ocorre ou não ocorre. Por exemplo, “opcionalmente contém 1-3 regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo” significa que a região variável da cadeia pesada do anticorpo com sequência específica pode estar, mas não precisa estar, presente.
[00134] “Composição farmacêutica” refere-se a uma mistura contendo um ou mais de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos de acordo com a presente divulgação e outros componentes químicos, tais como, carreadores ou excipientes fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica visa promover a administração a um organismo, facilitando a absorção do princípio ativo e, dessa forma, exercendo um efeito biológico.
[00135] O termo “carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a qualquer substância inativa adequada para uso em uma formulação para a dispensação de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno. O carreador pode ser um agente antiadesivo, aglutinante, agente de revestimento, agente desintegrante, carga ou diluente, conservante (tal como agente antioxidante, antibacteriano ou antifúngico), adoçante, agente retardador de absorção, agente umectante, emulsificante, tampão e semelhantes. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, etanol, polióis (tais como, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes) dextrose, óleo vegetal (tal como azeite), solução salina, tampão, solução salina tamponada e agente isotônico, tais como, açúcares, polióis, sorbitol e cloreto de sódio.
[00136] “Doença ou distúrbio CD38 positivo” é uma doença ou um distúrbio em que as células que expressam CD38 estão presentes. Sem limitação, em relação às doenças imunes envolvendo células B que expressam CD38, células plasmáticas, monócitos e células T, uma característica da doença é, por exemplo, uma doença tumoral com células tumorais que expressam CD38, tal como leucemia que expressa CD38, Linfoma de células B, tumor maligno de células plasmáticas, linfoma de células T/NK e mieloma. Em algumas formas de realização da presente divulgação, a leucemia é selecionada do grupo que consiste em leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda e crônica. Em algumas formas de realização, o mieloma é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, tumor medular anterior e amiloidose de cadeia leve. Em algumas formas de realização, o linfoma é linfoma não-Hodgkin ou linfoma de Hodgkin. Em algumas formas de realização, o tumor pode ser selecionado de leucemia/linfoma de células B, incluindo, mas não se limitando a: leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras, linfoma não-Hodgkin de células B ou Linfoma de Hodgkin de células B, tumor de células B maduras. Em algumas formas de realização, o tumor é selecionado do grupo que consiste em: leucemia linfocítica crônica de células B (LLC), leucemia linfocítica de pequenas células (LLPC), leucemia linfocítica aguda de células B,
leucemia pré-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células do manto (LCM),
linfoma folicular (incluindo LF de baixo grau, de grau intermediário ou de alto grau), linfoma central folicular cutâneo, linfoma de células B da zona marginal (incluindo tipo MALT, tipo de linfonodo MZBL, tipo MZBL de baço),
leucemia de células pilosas, linfoma de grandes células B difusas, linfoma de Burkitt, tumor de células plasmáticas,
mieloma de células plasmáticas, leucemia de células plasmáticas, doença linfoproliferativa pós-transplante,
macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de células plasmáticas, linfoma anaplásico de grandes células (LAGC) e linfoma de células pilosas.
Em algumas formas de realização,
o tumor é mieloma múltiplo.
Em algumas formas de realização,
a doença imunológica pode ser selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, psoríase, espondilite anquilosante, psoríase articular, dermatite, esclerodermia sistêmica e esclerose, doença inflamatória intestinal (IBD),
doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da angústia respiratória, meningite, encefalite, gastrite, uveíte,
glomerulonefrite, eczema, asma, arteriosclerose, deficiência de adesão de leucócitos, síndrome de Raynaud, síndrome de
Sjogren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite imunocomplexa, nefropatia por IgA, polineuropatia mediada por IgM, sintoma de trombocitopenia imunomediada (por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática aguda, púrpura trombocitopênica idiopática crônica), anemia hemolítica, miastenia gravis, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide (AR), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, esclerose múltipla, HIV e doenças relacionadas ao vírus do herpes, síndrome respiratória aguda grave, coriorretinite, doença enxerto contra hospedeiro e doença imunológica causada por infecção por vírus (tal como doença causada ou mediada por células B infectadas com o vírus Ebola (EBV)). Em algumas formas de realização, a doença imunológica é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, asma, doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, doença de Crohn, gastrite, tireoidite de Hashimoto, espondilite anquilosante e doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas formas de realização, a doença imunológica é a artrite reumatoide.
[00137] Além disso, a presente divulgação fornece agentes para o tratamento ou a prevenção de doenças relacionadas a células alvo antígeno positivas (por exemplo, CD38). O agente contém o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente divulgação como um ingrediente ativo e uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do agente pode ser administrada a um ser em necessidade de tratamento ou prevenção de doenças CD38 positivo. Os anticorpos anti-CD38 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem inibir atividades relacionadas à doença induzida por CD38 ou eliminar ou reduzir o número de células que expressam CD38. A quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz da composição contém 0,1-3000 mg (de preferência 0,1-2000 mg, mais de preferência 1-1000 mg) do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação a antígeno descrito acima, em uma dosagem unitária.
[00138] Além disso, a presente divulgação se refere a métodos para imunodetecção ou determinação de antígenos alvo (por exemplo, CD38), reagentes para imunodetecção ou determinação de antígenos alvo (por exemplo, CD38), métodos para imunodetecção ou determinação de células que expressam antígenos alvo (por exemplo, CD38), e os agentes de diagnóstico para diagnosticar doenças associadas a células alvo antígeno (por exemplo, CD38) positivas, compreendendo o anticorpo ou o fragmento de anticorpo da presente divulgação que reconhece especificamente e se liga ao antígeno alvo (por exemplo, CD38 de humano), como um ingrediente ativo.
[00139] Na presente divulgação, o método para detectar ou medir a quantidade do antígeno alvo (por exemplo, CD38) pode ser qualquer método conhecido. Por exemplo, inclui método de imunoensaio ou imunodetecção.
[00140] O método de imunoensaio ou imunodetecção é um método para detectar ou medir a quantidade de um anticorpo ou antígeno com um antígeno ou anticorpo rotulado. Exemplos de métodos de imunoensaio ou imunodetecção incluem imunométodo usando anticorpo rotulado com substância radioativa (RIA), imunoensaio enzimático (EIA ou ELISA), imunoensaio de fluorescência (FIA), imunoensaio de luminescência, Western blotting, método físico-químico e semelhantes.
[00141] As doenças relacionadas com células CD38 positivas descritas acima podem ser diagnosticadas através da detecção ou medição de células que expressam CD38 usando os anticorpos ou fragmentos de anticorpos dos mesmos da presente divulgação.
[00142] As células que expressam o polipeptídeo podem ser detectadas pelos métodos de imunodetecção conhecidos, de preferência por imunoprecipitação, coloração com células fluorescentes, coloração imunohistoquímica e semelhantes.
Além disso, o método, tal como um método de coloração de anticorpo fluorescente usando o sistema FMAT8100HTS (Applied Biosystem), pode ser usado.
[00143] Na presente divulgação, as amostras a serem detectadas ou medidas para o antígeno alvo (por exemplo, CD38) não são particularmente limitadas, desde que sejam possíveis conter células que expressam o antígeno alvo (por exemplo, CD38), tais como, células de tecido, sangue, plasma , soro, secreção pancreática, urina, fezes, fluido de tecido ou meio de cultura.
[00144] Dependendo do método de diagnóstico necessário, o agente de diagnóstico contendo o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo do mesmo da presente divulgação também pode conter reagentes para realizar uma reação antígeno-anticorpo ou reagentes para detectar a reação. Os reagentes para realizar uma reação antígeno- anticorpo incluem tampões, sais e semelhantes. Os reagentes para detecção incluem agentes comumente usados em métodos de imunoensaio ou imunodetecção, por exemplo, um anticorpo secundário rotulado que reconhece o anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo ou conjugado do mesmo, e um substrato correspondente ao rótulo.
[00145] Os detalhes de uma ou mais de formas de realização da presente divulgação são apresentados na descrição acima. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora qualquer método e material similar ou idêntico aos descritos nesse documento possa ser usado na prática ou no teste da presente divulgação. Através do relatório descritivo e das reivindicações, outra(o)s características, objetivos e vantagens da presente divulgação se tornarão aparentes.
[00146] No relatório descritivo e nas reivindicações, a forma singular também se refere às suas contrapartes no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que definido explicitamente de outra forma nesse documento, todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento têm o significado comumente entendido por aqueles habilitados na técnica aos quais essa divulgação se refere. Todas as patentes e publicações citadas no relatório descritivo são incorporadas por referência. Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar mais completamente as formas de realização preferidas da presente divulgação. Esses exemplos não devem ser interpretados como limitando o escopo da presente divulgação de qualquer forma, e o escopo da presente divulgação é definido pelas reivindicações.
Exemplos e Exemplos de Teste
[00147] Os seguintes exemplos e exemplos de teste são fornecidos para descrever melhor a presente divulgação, mas não se destinam a limitar o escopo da divulgação. Os métodos experimentais para os quais as condições específicas não são indicadas nos exemplos e exemplos de teste da presente divulgação são geralmente realizados de acordo com as condições convencionais, tais como Sambrook et al., Antibodies Laboratory Manual, Molecular Cloning, por Cold Spring Harbor Laboratory; ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Os reagentes cujas fontes não são especificamente indicadas são reagentes comercialmente disponíveis.
Exemplo 1. Preparação do antígeno CD38
[00148] As sequências de aminoácidos dos antígenos e proteínas para detecção usadas na presente divulgação foram projetadas usando ADP-Ribocicliase/ADP-Ribo-hidrolase1 UniProt (proteína CD38 de humano, Uniprot No.: P28907) como molde de CD38, opcionalmente, várias etiquetas, tais como, etiqueta His ou Fc foram fundidos na proteína CD38. Os antígenos e as proteínas para detecção usados na presente divulgação foram obtidos por um processo que compreende: clonagem em vetor pTT5 (Biovector, Cat #: 102762) ou vetor pTargeT (Promega, A1410) respectivamente, expressando transitoriamente em células 293 ou expressando de forma estável em Células CHO-S e purificação.
[00149] Proteína de fusão do domínio extracelular de CD38 e IgG2a-Fc de camundongo: CD38-ECD-mFc, usada como imunógeno;
VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNI TEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWC GEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKN STFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNI YRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVL MISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMV
TDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVV HEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID No: 1) Observação: A parte sublinhada representa a parte IgG2a-Fc de camundongo;
[00150] Proteína de fusão do domínio extracelular de CD38 e IgG1Fc de humano: CD38-ECD-Fc, usada como imunógeno;
VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNI TEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWC GEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKN STFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNI YRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID No: 2) Observação: A parte sublinhada representa a parte IgG1-Fc de humano;
[00151] Proteína de fusão do domínio extracelular de CD38 com etiqueta His: CD38-ECD-His, para uso como imunógeno ou reagente de detecção:
VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNI TEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWC GEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKN
STFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNI YRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEIHHHHHH (SEQ ID No: 57) Observação: A parte sublinhada representa etiqueta 6 × His.
Exemplo 2. Purificação de proteína recombinante relacionada a CD38
1. Etapas para purificar a proteína recombinante com etiqueta His:
[00152] A amostra de sobrenadante de expressão celular foi centrifugada em alta velocidade para remover impurezas, o tampão foi substituído por PBS e imidazol foi adicionado a uma concentração final de 5 mM. A coluna de níquel foi equilibrada com solução de PBS contendo imidazol 5 mM e lavada com 2-5 vezes o volume da coluna. A amostra de sobrenadante celular substituída foi aplicada na coluna Ni Sepharose excel (GE, 17-3712-02). A coluna foi lavada com solução de PBS contendo imidazol 5 mM até a leitura de A280 cair para a referência. A coluna de cromatografia foi rinsada com PBS + imidazol 10 mM para remover impurezas de proteínas não especificamente ligadas e o efluente foi coletado. A proteína alvo foi eluída com solução de PBS contendo imidazol 300 mM e o pico de eluição foi coletado. O eluado coletado foi concentrado e posteriormente purificado por cromatografia em gel Superdex200 (GE, 28-9893-35) com PBS como fase móvel. O pico agregado foi removido e o pico principal foi coletado. A proteína resultante foi identificada por eletroforese, mapa de peptídeos e LC-MS, e as proteínas confirmadas foram divididas em alíquotas para uso. O CD38-ECD-His marcado com His (SEQ ID No: 57) foi obtido, para uso como um imunógeno para a preparação dos anticorpos da presente divulgação ou como reagente de detecção. CD38-ECD-His foi acoplado a KLH por química in vitro e foi usado como imunógeno para estimular a imunidade de camundongo.
2. Etapas para purificar a proteína de fusão CD38-ECD-Fc:
[00153] A amostra de sobrenadante de expressão celular foi centrifugada em alta velocidade para remover impurezas e o sobrenadante foi submetido a cromatografia por afinidade MabSelect Sure (GE, 17-5438-01). A coluna MabSelect Sure foi regenerada primeiro com NaOH 0,1 M, lavada com água pura e então equilibrada com PBS, após o sobrenadante ser ligado, PBS foi usado para lavar até o valor de A280 cair para a referência. A proteína alvo foi eluída com tampão de ácido acético 0,1 M, pH 3,5 e neutralizada com Tris-HCl 1 M. A amostra eluída foi devidamente concentrada e, em seguida, foi posteriormente purificada por cromatografia em gel equilibrada com PBS Superdex200 (GE,
28-9893-35), vários tubos das proteínas alvo foram agrupados e concentrados para uma concentração apropriada. Esse método foi usado para purificar a proteína de fusão CD38-ECD-Fc (SEQ ID No: 2). Também pode ser usado para purificar as proteínas do anticorpo humanizado na presente divulgação.
Exemplo 3. Obtenção e preparação de anticorpo monoclonal de hibridoma anti-CD38 de humano
1. Imunização
[00154] Anticorpos monoclonais anti-CD38 de humano foram produzidos imunizando camundongos. Camundongos SJL brancos, fêmeas, 4-6 semanas de idade foram usados para experimentos (Beijing Charles River Experimental Animal Technology Co., Ltd., número de licença de produção animal: SCXK (Beijing) 2012-0001).
[00155] Ambiente de alimentação: grau SPF. Após a aquisição dos camundongos, os mesmos foram adaptados ao ambiente de laboratório por 1 semana, ciclo de claro/escuro de 12/12 horas, em temperatura de 20 a 25 °C; umidade de 40 a 60%. Os camundongos que se adaptaram ao ambiente foram imunizados de acordo com vários protocolos, 3-5 camundongos em cada grupo.
[00156] O antígeno imune pode ser CD38-ECD-His, CD38- ECD-Fc, CD38-FL-CHOS (células CHOS transfectadas com CD38 de humano de comprimento total) e semelhantes. A imunização foi realizada com um único reagente em combinação com diferentes adjuvantes imunes ou com diferentes tipos de imunógenos para fins de imunização cruzada. O sítio imunizado foi intraperitoneal ou subcutâneo nas costas, alternativamente, a imunização foi realizada alternativamente em ambos os sítios. O método de imunização de exemplo foi, por exemplo, a imunização com Titermax (Sigma Lote Núm: T2684) ou alúmen (Thremo Lote Núm: 77161). A razão de antígeno para adjuvante (título máximo) foi de 1:1, e a razão de antígeno para adjuvante (alúmen) foi de 4:1, 25-50 g ou 1 x 107 células/camundongo (imunização primária), 25-50 g ou 1 x 107 células/camundongo (imunização de reforço). No dia 0, o antígeno foi injetado por via intraperitoneal (IP) ou subcutânea (SC), e a imunização foi repetida a cada duas semanas após a imunização primária. Amostras de sangue foram coletadas a cada três semanas, e o título de anticorpos no soro de camundongo foi determinado pelo método ELISA. Após 8 a 12 imunizações, os camundongos com um título elevado de anticorpos no soro atingindo o platô foram selecionados para fusão de esplenócitos. Três dias antes da fusão de esplenócitos, a solução de antígeno preparada com solução salina foi injetada intraperitonealmente (IP), com 25-50 g/camundongo ou 1 x 107 células/camundongo, para imunização de reforço.
2. Fusão celular
[00157] Camundongos com um alto título de anticorpo sérico (ver Exemplo de Teste 1, método ELISA para ligação de CD38) atingindo o platô foram selecionados para fusão de esplenócitos, e os camundongos selecionados foram submetidos à imunização de reforço 3 dias antes da fusão. As células de hibridoma foram obtidas por fusão de linfócitos esplênicos com células Sp2/0 de mieloma (ATCC® CRL-8287TM) usando um procedimento de fusão mediado por PEG otimizado. As células de hibridoma fundidas foram suspensas em meio completo HAT (meio RPMI-1640 contendo FBS a 20%, 1xHAT e 1xOPI) e divididas em alíquotas em placa de cultura de células de 96 poços (1 x 105 células/150μl/poço), e incubadas a 37 °C, CO2 a 5%. No dia 5 após a fusão, o meio completo HAT foi adicionado, 50 μl/poço, e incubado a 37 °C, CO2 a 5%. Do dia 7 ao dia 8 após a fusão, o meio foi completamente trocado com meio completo HT (meio RPMI-1640 contendo FBS a 20%, 1xHT e 1xOPI), 200μl/poço, de acordo com a densidade de crescimento celular, e incubado a 37 °C, CO2 a 5%.
3. Triagem de células de hibridoma
[00158] 10-11 dias após a fusão, o ensaio ELISA de ligação a CD38 foi realizado de acordo com a densidade de crescimento das células (ver Exemplo de Teste 1). O sobrenadante celular de poços positivos detectados por ELISA foi testado pelo método FACS para a ligação de CD38-FL-CHO- S (ver Exemplo de Teste 2). O meio nos poços positivos foi alterado, e as células foram expandidas em placas de 24 poços de acordo com a densidade das células. As linhas celulares transferidas para uma placa de 24 poços foram testadas novamente para confirmação e, em seguida, subclonadas pela primeira vez. Após a triagem das primeiras células subclonadas (ver exemplos de teste 1 e 2), as células positivas foram preservadas e submetidas à segunda subclonagem. As células positivas triadas na segunda subclonagem (ver exemplos de teste 1 e 2) foram preservadas e usadas para a expressão de proteínas. Células de hibridoma com alta afinidade para CD38 foram obtidas após várias fusões.
[00159] Os clones de hibridoma m009, m011 e m160 foram obtidos por triagem via ensaio de bloqueio e ensaio de ligação. Os anticorpos foram adicionalmente preparados pelo método de cultura de células sem soro. Os anticorpos foram purificados de acordo com o exemplo de purificação e usados para os Exemplos de Teste.
[00160] A sequência da região variável de anticorpo de murino do clone de hibridoma 009 é mostrada como a seguir: > m009 VH: sequência de região variável da cadeia pesada m009
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNLNWVKQSNGKSLEWIGVINPKYDAIN
YNQKFKDKATLTVDQSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGWGKALDYWGPGTSVIVSS SEQ ID No: 3; > m009 mVL: sequência de região variável da cadeia leve m009
DFVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSIYTNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIP
SRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDSGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK SEQ ID No: 4; Observação: As sequências de CDR determinadas de acordo com os critérios de numeração de Kabat estão sublinhadas, as sequências de FR são apresentadas em itálico e as sequências são arranjadas na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
[00161] A sequência da região variável do anticorpo de murino do clone de hibridoma m011 é como a seguir: > m011 VH: sequência de região variável da cadeia pesada m011
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYSCARNYVSSYGYFDYWGQGTTLTV
SS SEQ ID No: 5; > m011 VL: sequência de região variável da cadeia leve m011
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
SGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGSGTKLEIK SEQ ID No: 6; Observação: As sequências de CDR determinadas de acordo com os critérios de numeração de Kabat estão sublinhadas, as sequências de FR são apresentadas em itálico e as sequências são arranjadas na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
[00162] A sequência da região variável do anticorpo de murino do clone de hibridoma m160 é como a seguir:
> m160 VH: sequência da região variável da cadeia pesada m160
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCVASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWIAFISTGSSNIY YVDKVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTLTV
SS SEQ ID No: 7; > m160 VL: sequência de região variável da cadeia leve m160
DIVLTQSPASLAVSLGQRATVSCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
SGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQTNKDPLTFGGGTKLELK SEQ ID No: 8; Observação: As sequências de CDR determinadas de acordo com os critérios de numeração de Kabat estão sublinhadas, as sequências de FR são apresentadas em itálico e as sequências são arranjadas na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
[00163] A sequência de cada região de CDR da cadeia pesada e da cadeia leve é mostrada na Tabela 3: Tabela 3. Sequências de regiões CDR das cadeia pesada e leve Anticorpo Cadeia Pesada Cadeia Leve m009 HCDR1 DYNLN LCDR1 RASQSIYTNLH SEQ ID No: 9 SEQ ID No: 12 HCDR2 VINPKYDAINYNQKFKD LCDR2 YASQSIS SEQ ID No: 10 SEQ ID No: 13 HCDR3 EGWGKALDY LCDR3 QQSNSWPLT SEQ ID No: 11 SEQ ID No: 14 m011 HCDR1 DYGMH LCDR1 RASENVDNYGISFMH SEQ ID No: 15 SEQ ID No: 18 HCDR2 FISSGSSSIYYADTVKG LCDR2 RASNLES SEQ ID No: 16 SEQ ID No: 19
Anticorpo Cadeia Pesada Cadeia Leve HCDR3 NYVSSYGYFDY LCDR3 QQSNKDPLT SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 20 m160 HCDR1 DYGMH LCDR1 RASESVDNYGISFMH SEQ ID No: 15 SEQ ID No: 22 HCDR2 FISTGSSNIYYVDKVKG LCDR2 RASNLES SEQ ID No: 21 SEQ ID No: 19 HCDR3 NYVSSYGYFDY LCDR3 QQTNKDPLT SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 23
4. Preparação de anticorpo quimérico IgG1 de humano
[00164] As moléculas candidatas obtidas da triagem de hibridoma foram amplificadas e sequenciadas para obter as sequências de genes que codificam as regiões variáveis. Os iniciadores direto e reverso foram projetados com base nas sequências obtidas por sequenciamento, os genes sequenciados foram usados como moldes para construir o fragmento do gene VH/VK de cada anticorpo via PCR e, em seguida, inseridos no vetor de expressão pHr (com um peptídeo sinal e gene da região constante hIgG1/hcapa (CH1-Fc/CL) fragmento) via recombinação homóloga para construir um plasmídeo de expressão para a expressão de um comprimento completo de anticorpo quimérico recombinante VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr, resultando em anticorpos quiméricos ch-009, ch-011 e ch-160 de clones de hibridoma m009, m011 e m160.
Exemplo 4. Humanização de anticorpos monoclonais de hibridoma anti-CD38
[00165] Os genes da linha germinal da região variável da cadeia pesada/leve com alta homologia com m009, m011 e m160, respectivamente, foram selecionados como moldes alinhando o banco de dados do gene da linha germinal da região variável das cadeia pesada e leve do anticorpo de humano IMGT usando análise de software MOE. As CDRs dos três anticorpos de murino foram enxertados no molde humano correspondente para formar uma sequência de região variável de anticorpo humanizado na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4.
[00166] Seleção de regiões FR de humano e mutações reversas de aminoácidos em regiões FR: Com base na estrutura típica resultante do anticorpo de murino VH/VL CDR, as sequências homólogas da região variável da cadeia leve (VL) e da região variável da cadeia pesada (VH) foram recuperadas da base de dados de linha germinal de humano, arranjadas por homologia de FR de alto a baixo, e a linha germinal com a homologia de FR maior foi selecionada como o molde principal; As regiões CDR do anticorpo de murino foram enxertadas no molde de humano; Além disso, projetos de mutações reversas foram realizados nos resíduos incorporados, os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR e os resíduos que têm uma influência importante na conformação de VL e VH usando software com base na estrutura tridimensional do anticorpo de murino; Os resíduos de aminoácidos quimicamente instáveis foram otimizados e as moléculas humanizadas finais foram obtidas.
1. Seleção de estruturas para o clone de hibridoma humanizado m009
[00167] Para o anticorpo de murino m009, os moldes da cadeia leve humanizados foram IGKV3-11*01 e hJK4.1, e os moldes da cadeia pesada humanizada foram IGHV1-3*01 e hJH4.1.
As CDRs de m009 foram enxertadas nos moldes de humano e as sequências de região variável humanizada resultantes são como a seguir: > enxerto h009VH-CDR
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGQRLEWMGVINPKYDAIN
YNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS SEQ ID No: 24; > enxerto H009VL-CDR
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIYTNLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSISGIP
ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIK SEQ ID No: 25; Observação: As sequências de CDR determinadas de acordo com os critérios de numeração de Kabat estão sublinhadas, as sequências de FR são apresentadas em itálico e as sequências são arranjadas na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
2. As mutações reversas projetadas para a humanização do clone de hibridoma m009 são mostradas na Tabela 4: Tabela 4. Mutações reversas para a humanização do clone de hibridoma m009
VL VH h009 VL1 enxerto h009 VH1 enxerto h009 VL2 A43S, Y49K h009 VH2 V2F, R44S, R71V I2F, A43S, V2F, R44S, M48I, V67A, h009 VL3 h009 VH3 Y49K, Y87F R71V V2F, R38K, R44S, R66K, h009 VH4 I69L, R71V, T73Q V2F, R38K, R44S, M48I, h009 VH5 V67A, R66K, I69L, R71V, T73Q Observação: Enxerto significa que as CDRs dos anticorpos de murino foram enxertados nas regiões FR da linha germinal de humano; “A43S” significa que o “A” na posição 43 (numerado de acordo com os critérios de Numeração de Kabat) sofreu mutação reversa para “S” e assim por diante.
[00168] As sequências da região variável do anticorpo humanizado do clone de hibridoma m009 são como a seguir: > h009 VH1 (SEQ ID No: 24)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGQRLEWMGVINPKYDAIN
YNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS > h009 VH2 (SEQ ID No: 26)
EFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGQSLEWMGVINPKYDAIN
YNQKFKDRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS > h009 VH3 (SEQ ID No: 27)
EFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGQSLEWIGVINPKYDAIN
YNQKFKDRATITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS > h009 VH4 (SEQ ID No: 28)
EFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVKQAPGQSLEWMGVINPKYDAIN
YNQKFKDKVTLTVDQSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS > h009 VH5 (SEQ ID No: 29)
EFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVKQAPGQSLEWIGVINPKYDAIN
YNQKFKDKATLTVDQSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS > h009 VL1 (SEQ ID No: 25)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIYTNLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSISGIP
ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIK > h009 VL2 (SEQ ID No: 30)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIYTNLHWYQQKPGQSPRLLIKYASQSISGIP
ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIK > h009 VL3 (SEQ ID No: 31)
EFVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIYTNLHWYQQKPGQSPRLLIKYASQSISGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPLTFGGGTKVEIK.
[00169] A região variável da cadeia leve humanizada e a região variável da cadeia pesada descritas acima foram combinadas, respectivamente, com a região constante da cadeia leve da linha germinal de humano (tais como as regiões constantes da cadeia leve das cadeias ,  de humano) e a região constante da cadeia pesada (tal como a região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de humano ou variante da mesma), para formar uma cadeia pesada e uma cadeia leve do anticorpo humanizado, resultando assim em um anticorpo humanizado completo de m009 (h009). Como um exemplo, os anticorpos humanizados de comprimento total (h009-01 a h009-15) foram obtidos combinando a região variável da cadeia pesada do anticorpo h009 acima mencionada e a região variável da cadeia leve com a região constante da cadeia pesada da IgG1 de humano como mostrado na SEQ ID No: 43 e a região constante da cadeia leve capa de humano como mostrado na SEQ ID No: 45 respectivamente. As sequências da região variável são mostradas na Tabela 5: Tabela 5. Região variável da cadeia pesada e sequências variáveis da cadeia leve do anticorpo humanizado h009 Região h009 VL1 h009 VL2 h009 VL3 variável h009 VH1 h009-01 h009-06 h009-11 h009 VH2 h009-02 h009-07 h009-12 h009 VH3 h009-03 h009-08 h009-13 h009 VH4 h009-04 h009-09 h009-14 h009 VH5 h009-05 h009-10 h009-15 Observação: Por exemplo, para “h009-07” na tabela, sugere que a região variável das cadeia pesada e leve do anticorpo humanizado h009-07 são h009 VH2 e h009VL2, respectivamente, e assim por diante.
3. Seleção de estruturas para o clone de hibridoma humanizado m011
[00170] Para o anticorpo de murino m011, os moldes da cadeia leve humanizados foram IGKV4-1*01 e hJK4.1, e os moldes da cadeia pesada humanizados foram IGHV3-7*01 e hJH6.1. A fim de eliminar os pontos quentes potenciais, N 82A T (de acordo com os critérios de numeração de Kabat, asparagina (abrev. N ou Asn) na posição 82A foi substituída por treonina (abrev. T ou Thr)) e N76S (de acordo com os critérios de numeração de Kabat, asparagina (abrev. N ou Asn) na posição 76 foi substituída por serina (abr. S ou Ser)) foram introduzidas nas regiões FR da linha germinal de humano IGHV3-7*01 e hJH6.1; as CDRs de m011 foram enxertadas em moldes de humano e as sequências de região variável humanizada resultantes são como a seguir: > enxerto h011VH- CDR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKSSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV
SS SEQ ID No: 32; > enxerto h011VL-CDR
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNKDPLTFGGGTKVEIK SEQ ID No: 33; Observação: As sequências de CDR determinadas de acordo com os critérios de numeração de Kabat estão sublinhadas, as sequências de FR são apresentadas em itálico e as sequências são arranjadas na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
4. As mutações reversas projetadas para o clone de hibridoma m011 são mostradas na Tabela 6: Tabela 6. Mutações reversas para a humanização do clone de hibridoma m011
VL VH h011 VL1 enxerto h011 VH1 enxerto, N 82A T, N76S Y79F, N 82A T, Y91S, h011 VL2 G68R h011 VH2 N76S h011 VL3 V58I, G68R, V85T Observação: enxerto significa que as CDRs de anticorpo de murino foram enxertadas nas sequências da região FR da linha germinal de humano. G68R significa que “G” na posição 68 (numerada de acordo com os critérios de numeração de Kabat) sofreu mutação reversa para R após o enxerto e assim por diante.
[00171] As sequências específicas das regiões variáveis do anticorpo humanizado h011 são como a seguir: > h011 VH1 (SEQ ID No: 32)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKSSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV
SS > h011 VH2 (SEQ ID No: 34)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKSSLFLQMTSLRAEDTAVYSCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV
SS > h011 VL1 (SEQ ID No: 33)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNKDPLTFGGGTKVEIK > h011 VL2 (SEQ ID No: 35)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
SGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNKDPLTFGGGTKVEIK > h011VL3 (SEQ ID No: 36)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGIPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQSNKDPLTFGGGTKVEIK.
[00172] A região variável da cadeia leve humanizada e a região variável da cadeia pesada descritas acima foram combinadas, respectivamente, com a região constante da cadeia leve da linha germinal de humano (tais como as regiões constantes da cadeia leve da cadeia κ,  de humano) e regiões constantes da cadeia pesada (tal como a região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de humano ou variante da mesma), para formar uma cadeia pesada e uma cadeia leve do anticorpo humanizado, resultando assim em um anticorpo humanizado completo de m011 (h011). Como um exemplo, os anticorpos humanizados de comprimento total (h011-01 a h011-06) foram obtidos combinando a região variável da cadeia pesada do anticorpo h011 mencionada acima e a região variável da cadeia leve com a região constante da cadeia pesada da IgG1 de humano como mostrado na SEQ ID No: 43 e a região constante da cadeia leve capa de humano como mostrado na SEQ ID No: 45 respectivamente. As sequências da região variável são mostradas na Tabela 7: Tabela 7: Combinações de regiões variáveis das cadeia pesada e leve do anticorpo humanizado h0011 h011VL1 h011VL2 h011 VL3 h011 VH1 h011-01 h011-03 h011-05 h011 VH2 h011-02 h011-04 h011-06 Observação: Por exemplo, para “h011-04” na tabela, isso sugere que a região variável das cadeia pesada e leve do anticorpo humanizado h011-04 são h011 VH2 e h011VL2, respectivamente, e assim por diante.
5. Seleção de estruturas para o clone de hibridoma humanizado m160
[00173] Para o anticorpo de murino m160, os moldes da cadeia leve humanizados foram IGKV4-1*01 e hJK4.1 e os moldes da cadeia pesada humanizada foram IGHV3-7*01 e hJH6.1. A fim de eliminar os pontos quentes potenciais presentes nas regiões FR da linha germinal de humano, as mutações S77T (de acordo com os critérios de numeração de Kabat, serina (abr.
S ou Ser) na posição 77 foi substituída por treonina (abr.
T ou Thr)) e N 82A T (de acordo com os critérios de Numeração de Kabat, asparagina (abrev. N ou Asn) na posição 82A foi substituída por treonina (abrev. T ou Thr)) foram introduzidas nas regiões FR da linha germinal de humano IGHV3-7*01 e hJH6.1. As CDRs m160 foram enxertadas no molde humano e as sequências da região variável humanizada resultantes são como a seguir: > enxerto h160VH-CDR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISTGSSNIY YVDKVKGRFTISRDNAKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SS
SEQ ID No: 37 > enxerto h160VL-CDR
DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIK SEQ ID No: 38 Observação: As sequências de CDR determinadas de acordo com os critérios de numeração de Kabat estão sublinhadas, as sequências de FR são apresentadas em itálico e as sequências são arranjadas na ordem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
6. As mutações reversas projetadas para a humanização do clone de hibridoma m160 são mostradas na Tabela 8: Tabela 8. Mutações reversas para a humanização do clone de hibridoma m160
VL VH h160 VL1 Enxerto, D9A h160 VH1 Enxerto, S77T, N 82A T h160 VL2 M4L, D9A h160 VH2 V48I, S77T, N 82A T h160 VL3 M4L, D9A, D60A, G68R M4L, D9A, N22S, V58I, h160 VL4 D60A, G68R Observação: Enxerto significa que as CDRs dos anticorpos de murinos foram enxertados nas regiões FR da linha germinal de humano; “M4L” significa que o “M” na posição 4 (numerado de acordo com os critérios de numeração de Kabat) sofreu mutação reversa para “L” após o enxerto e assim por diante.
[00174] As sequências específicas das regiões variáveis do anticorpo humanizado h160 são como a seguir:
> h160 VH1 (SEQ ID No: 37)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISTGSSNIY
YVDKVKGRFTISRDNAKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SS; > h160 VH2 (SEQ ID No: 39)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWIAFISTGSSNIY
YVDKVKGRFTISRDNAKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SS; > h160 VL1 (SEQ ID No: 38)
DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIK; > h160 VL2 (SEQ ID No: 40)
DIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIK; > h160 VL3 (SEQ ID No: 41)
DIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPARFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIK; > h160 VL4 (SEQ ID No: 42)
DIVLTQSPASLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGIPARFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIK.
[00175] A região variável da cadeia leve humanizada e a região variável da cadeia pesada descritas acima foram combinadas, respectivamente, com a região constante da cadeia leve da linha germinal de humano (tais como as regiões constantes da cadeia leve das cadeias ,  de humano) e regiões constantes da cadeia pesada (tais como a região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de humano ou variante do mesmo), para formar uma cadeia pesada e uma cadeia leve do anticorpo humanizado, resultando assim em um anticorpo humanizado completo de m160 (h160). Como um exemplo, os anticorpos humanizados de comprimento total (h160-01 a h160-08) foram obtidos combinando a região variável da cadeia pesada do anticorpo h160 acima mencionada e a região variável da cadeia leve com a região constante da cadeia pesada da IgG1 de humano como mostrado na SEQ ID No: 43 e a região constante da cadeia leve capa de humano como mostrado na SEQ ID No: 45 respectivamente. As sequências da região variável são mostradas na Tabela 9: Tabela 9. Região variável da cadeia pesada e sequências variáveis da cadeia leve do anticorpo humanizado h016 h160 VL1 h160 VL2 h160 VL3 h160 VL4 h160 VH1 h160-01 h160-02 h160-03 h160-04 h160 VH2 h160-05 h160-06 h160-07 h160-08 Observação: Por exemplo, para “h160-07” na tabela, sugere que a região variável das cadeia pesada e leve do anticorpo humanizado h160-07 são h160 VH2 e h160 VL3, respectivamente, e assim por diante.
Exemplo 5. Construção e expressão de formato IgG1 ou IgG1- E333A de anticorpo anti-CD38 humanizado de humano
[00176] Vários iniciadores foram projetados, o fragmento do gene VH/VK de cada anticorpo humanizado foi amplificado por PCR e, em seguida, inserido no vetor de expressão pHr (com um peptídeo sinal e fragmento do gene da região constante (CH1-FC/CL), construído em laboratório) via recombinação homóloga para construir um vetor de expressão para um anticorpo de comprimento total VH-CH1-FC-pHr/VK-CL- pHr. Para o anticorpo humanizado, a região constante da cadeia leve pode ser selecionada da região constante da cadeia leve da cadeia  ou λ de humano e a região constante da cadeia pesada pode ser selecionada a partir da região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de humano ou variante da mesma. Exemplos não limitativos incluem otimizar a região constante de IgG1, IgG2 ou IgG4 de humano para melhorar a função do anticorpo. Por exemplo, a região constante IgG1-E333A pode ser obtida pela introdução da mutação pontual E333A em IgG1, que pode potencializar a capacidade de ligação de IgG1-Fc a C1q e, consequentemente, potencializar a função de CDC do anticorpo (ver US6528624).
As seguintes regiões constantes específicas da cadeia leve/pesada não se destinam a limitar as regiões constantes do anticorpo da presente divulgação, e outras regiões constantes da cadeia leve/pesada do anticorpo e variantes das mesmas conhecidas na técnica também podem ser usadas.
[00177] As regiões constantes das cadeia pesada e leve de exemplo são como a seguir:
Região constante da cadeia pesada de IgG1:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 43; Região constante da cadeia pesada IgG1-E333A:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 44; Região constante da cadeia leve capa:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ
DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 45.
[00178] Como um exemplo, a região variável da cadeia leve humanizada e a região variável da cadeia pesada dos clones de hibridoma acima mencionados m009, m011 e m160 foram respectivamente combinadas com a região constante da cadeia pesada de IgG1 de humano como mostrado na SEQ ID No: 43 e a região constante da cadeia leve capa de humano como mostrado na SEQ ID No: 45, e os anticorpos humanizados de comprimento total resultantes são mostrados na Tabela 5, na Tabela 7 e na Tabela 9; Como outro exemplo, a região variável da cadeia leve humanizada e a região variável da cadeia pesada dos clones de hibridoma acima mencionados m009, m011 e m160 foram respectivamente combinadas com a região constante da cadeia pesada IgG1-E333A de humano como mostrado na SEQ ID No: 44 e a região constante da cadeia leve capa de humano, como mostrado na SEQ ID No: 45, e os anticorpos humanizados de comprimento total resultantes são mostrados na Tabela 10: Tabela 10. Sequências de região variável dos anticorpos humanizados (a região constante da cadeia pesada é IgG1- E333A de humano e a região constante da cadeia leve é capa) Anticorpo Região variável Região da cadeia pesada variável da VH cadeia leve
VL h009-01E h009 VH1 h009 VL1 h009-02E h009 VH2 h009 VL1 h009-03E h009 VH3 h009 VL1 h009-04E h009 VH4 h009 VL1 h009-05E h009 VH5 h009 VL1 h009-06E h009 VH1 h009 VL2 h009-07E h009 VH2 h009 VL2 (Também referido como hu9E) h009-08E h009 VH3 h009 VL2 h009-09E h009 VH4 h009 VL2 h009-10E h009 VH5 h009 VL2 h009-11E h009 VH1 h009 VL3
Anticorpo Região variável Região da cadeia pesada variável da VH cadeia leve
VL h009-12E h009 VH2 h009 VL3 h009-13E h009 VH3 h009 VL3 h009-14E h009 VH4 h009 VL3 h009-15E h009 VH5 h009 VL3 h011-01E h011 VH1 h011VL1 (Também referido como hu11E) h011-02E h011 VH2 h011VL2 h011-03E h011 VH1 h011VL3 h011-04E h011 VH2 h011VL1 h011-05E h011 VH1 h011VL2 h011-06E h011 VH2 h011VL3 h160-01E h160 VH1 h160 VL1 (Também referido como hu160E) h160-02E h160 VH1 h160 VL2 h160-03E h160 VH1 h160 VL3 h160-04E h160 VH1 h160 VL4 h160-05E h160 VH2 h160 VL1 h160-06E h160 VH2 h160 VL2 h160-07E h160 VH2 h160 VL3 h160-08E h160 VH2 h160 VL4
[00179] Como exemplo, as sequências de aminoácidos de comprimento total dos anticorpos humanizados h009-07, hu9E, h011-01, hu11E, h160-01 e hu160E são como a seguir: Sequência da cadeia pesada do anticorpo h009-07:
EFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGQSLEWMGVINPKYDAIN YNQKFKDRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 46; Sequência da cadeia leve do anticorpo h009-07:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIYTNLHWYQQKPGQSPRLLIKYASQSISGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 47; Sequência da cadeia pesada do anticorpo hu9E:
EFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGQSLEWMGVINPKYDAIN YNQKFKDRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGWGKALDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 48; Sequência da cadeia leve do anticorpo hu9E:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIYTNLHWYQQKPGQSPRLLIKYASQSISGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No: 47; Sequência da cadeia pesada do anticorpo h011-01:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKSSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 49; Sequência da cadeia leve do anticorpo h011-01:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNKDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 50; Sequência da cadeia pesada do anticorpo hu11E:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKSSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 51; Sequência da cadeia leve do anticorpo hu11E:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASENVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNKDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 50; Sequência da cadeia pesada do anticorpo h160-01:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISTGSSNIY YVDKVKGRFTISRDNAKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 52; Sequência da cadeia leve do anticorpo h160-01:
DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 53; Sequência da cadeia pesada do anticorpo hu160E:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISTGSSNIY YVDKVKGRFTISRDNAKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARNYVSSYGYFDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 54; Sequência da cadeia leve do anticorpo hu160E:
DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTNKDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 53;
[00180] O anticorpo anti-CD38, Daratumumabe (abrev.
Dara, refere-se a WHO Drug Information, Vol. 24, No. 1, 2010 para sequências) foi usado como um anticorpo de controle na presente divulgação, e suas sequências da cadeia pesada e da cadeia leve são como a seguir: Sequência da cadeia pesada de Dara:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No: 55; Sequência da cadeia leve de Dara:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No: 56.
[00181] O desempenho e o efeito dos presentes antibióticos foram verificados pelos seguintes testes: Exemplo de teste 1. Teste de ELISA de ligação à proteína CD38 para anticorpos CD38
[00182] A afinidade dos anticorpos anti-CD38 foi determinada pela quantidade de anticorpos que se ligam a CD38 imobilizado na placa de ELISA. 2 μg/ml de estreptavidina (Abcam, CAT # ab123480) foi revestido em uma placa de ELISA de 96 poços (Costar, CAT #3590), a placa foi lavada, bloqueada e, em seguida, 2 μg/ml de CD38-ECD-His rotulados com biotina foram adicionados. Após a incubação, as amostras de anticorpo anti-CD38 diluídas com várias concentrações foram adicionadas, lavadas e depois adicionadas com anticorpo F(ab’)2 anti-humano de cabra - peroxidase de rábano (Jackson, CAT# 109-036-097).
A placa foi lavada novamente e solução de tetrametil benzidina foi adicionada para a reação de cor. Finalmente, a solução de parada foi adicionada. A OD450 foi medida em um leitor de microplaca e o valor de EC50 foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 11.
Tabela 11. Afinidade do anticorpo CD38 humanizado Anticorpo EC50 (μg/ml) hu9E 0,02594 hu11E 0,02762 hu160E 0,02801
[00183] Os resultados mostram que os anticorpos humanizados da presente divulgação podem se ligar especificamente à proteína CD38 com forte capacidade de ligação.
Exemplo de teste 2. Ensaio de ligação de anticorpos CD38 a células CD38-FL-CHO-S
[00184] Células CHO-S (células CHO-S FreeStyle, Invitrogen, R80007) transfectadas de forma estável com CD38 de humano de comprimento total (número Uniprot: P28907) (CD38-FL-CHOS) foram cultivadas em meio de cultura CHO CD (Gibco, REF#10743 -029). 1 x 106 células/ml de células CD38- FL-CHO-S foram bloqueadas com BSA a 1%, e as amostras de anticorpo anti-CD38 diluídas com várias concentrações foram adicionadas, lavadas duas vezes e, em seguida, anticorpo anti-humano de cabra-Alexa Fluor 488 (H+L) (Invitrogen, CAT #A11013) foi adicionado, lavado duas vezes e os valores do sinal de fluorescência foram lidos com citômetro de fluxo.
Os resultados são mostrados na Tabela 12.
Tabela 12. Afinidade do anticorpo CD38 humanizado Anticorpo EC50 (μg/ml) hu9E 0,4020 hu11E 0,4813 hu160E 0,4740
[00185] Os resultados do teste FACS mostram que os anticorpos humanizados da presente divulgação têm forte capacidade de ligação a CD38 natural presente na superfície celular.
Exemplo de teste 3. Ensaio de inibição de anticorpos CD38 na atividade da enzima CD38
[00186] O CD38-ECD-His foi preparado para uma solução com uma concentração de 4 μg/ml com tampão Tris-HCl 20 mM (pH 6,5). De modo similar, várias concentrações de amostras de anticorpos anti-CD38 foram preparadas com tampão. 25 l de cada amostra de anticorpo CD38-ECD-His e anti-CD38 foram adicionados a uma placa de 96 poços com fundo transparente e parede preta (Corning, CAT #3603). Depois de incubado em temperatura ambiente por 15 minutos, 50 l de substrato NGD 200μM (Sigma, CAT#N5131-25MG) foram adicionados. Após incubação em temperatura ambiente por 2 horas, a produção de GDP ribose cíclica (cGDPR) foi medida por FlexStation 3 (Molecular Devices), no comprimento de onda de emissão de 410 nm (luz de excitação de 300 nm). Os resultados são mostrados na Tabela 13.
Tabela 13. Resultados inibitórios do anticorpo CD38 humanizado na atividade da enzima CD38 Anticorpo IC50 (μg/ml) Imax (Taxa de inibição máxima %) Dara 3,147 44,54 hu9E 1,559 89,63 hu11E 1,827 44,31 hu160E 1,199 47,67
[00187] Os resultados do teste mostram que hu9E exibe uma taxa de inibição máxima de 89,63% para a atividade enzimática, significativamente superior à do anticorpo de controle Dara; enquanto hu11E e hu160E têm taxas de inibição máximas de 44,31% e 47,67%, respectivamente, para a atividade enzimática, comparável à do anticorpo de controle.
Exemplo de Teste 4. Ensaio de ADCC in vitro de anticorpos CD38 em células Molp-8 e Daudi
[00188] Linha celular de mieloma múltiplo humano Molp-8 (Cobioer, Nanjing, CBP60562) ou células Daudi da linha de células de linfoma de Burkitt de humano (ATCC, CCL-123) foram coletadas, centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos e em suspensão com meio RPMI 1640 livre de vermelho de fenol (Gibco, CAT#11835-030) contendo soro bovino fetal de IgG ultrabaixo a 10% (Gibco, CAT #1921005PJ). As células foram contadas com Citomêtro (Countstar, IC1000) e diluídas para 1 x 105 células/ml.
[00189] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de sangue humano fresco por Ficoll (GE, CAT #17-5442-02), recolocadas em suspensão em meio RPMI
1640 sem vermelho de fenol, contadas com citômetro e diluídas para 3 x 106 células/ml.
[00190] 50 l de cada um de Molp-8 (ou Daudi) e diferentes concentrações de anticorpos CD38 ou IgG de controle negativo (C25-hIgG1 (WT), preparado no laboratório) foram adicionados em uma placa de 96 poços na proporção de 1:1, incubados por 30 minutos (37 °C, CO2 a 5%), e 50 l de células efetoras PBMCs foram adicionados na razão de 30:1 (célula efetora:célula alvo). Após incubação por 4 horas (37 °C, CO2 a 5%), a liberação de LDH (lactato desidrogenase) foi detectada com o kit de teste de não radiocitotoxicidade CytoTox 96 (Promega, CAT #G1780). Foram adicionados 50 µl de sobrenadante celular e 50 µl de reagente CytoTox 96®. Após incubação em temperatura ambiente por 30 minutos, a solução de parada foi adicionada. Os valores de absorbância (490 nm) foram detectados com FlexStation 3 (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14. Resultados de ADCC de anticorpos CD38 humanizados em células alvo Molp-8 Daudi Emax Anticorpo IC50 Emax (Eficiência IC50 (Eficiência (μg/ml) máxima, %) (μg/ml) máxima %) hu9E 4,5 83,6 4,9 102,5 hu11E 3,8 72,0 2,6 92,5 hu160E 2,7 71,5 3,1 96,7
[00191] Os resultados experimentais mostram que os anticorpos humanizados da presente divulgação têm forte efeito de ADCC em células Molp-8 e Daudi in vitro e podem atingir significativamente a lise das células alvo.
Exemplo de Teste 5. CDC de anticorpos CD38 em células Molp- 8 e Daudi por ensaio in vitro
[00192] Células Molp-8 ou Daudi foram coletadas, centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos e recolocadas em suspensão. As células foram contadas com Citômetro (Countstar, IC1000) e recolocadas em suspensão em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol (Gibco, CAT #11835-030) contendo soro bovino fetal de IgG ultrabaixo a 10% (Gibco, CAT # 1921005PJ) a 1 x 106 células/ml. Subsequentemente, as células foram divididas em uma placa de 96 poços (Corning, CAT #3903) a 5 x 104 células/poço (50 μl/poço). Em seguida, foram adicionados 50 μl de várias concentrações de anticorpos anti- CD38 e controle negativo. Após incubação por 30 minutos (37 °C, CO2 a 5%), 50 μl de soro humano (feito em laboratório) foram adicionados a cada poço. Após incubação por 2 horas (37 °C, CO2 a 5%), 16,6 μl de Reagente Alamar Blue (Thermo, CAT #DAL1025) foram adicionados a cada poço e incubados por 20 horas (37 °C, CO2 a 5%). Finalmente, a detecção foi realizada com FlexStation 3 (Molecular Devices) no comprimento de onda de emissão de 585 nm (comprimento de onda de excitação de 570 nm) e os resultados são mostrados na Tabela 15.
Tabela 15. Resultados de CDC de anticorpos CD38 humanizados em células alvo Molp-8 Daudi Emax Emax Anticorpo IC50 IC50 (Eficiência (Eficiência (μg/ml) (μg/ml) máxima, %) máxima, %) hu9E 281,4 79,7 51,1 92,8 hu11E 289,9 67,4 70,1 91,4 hu160E 393,2 61,5 65,7 88,1
[00193] Os resultados experimentais mostram que os anticorpos humanizados da presente divulgação têm um forte efeito de CDC em células Molp-8 e Daudi in vitro e podem atingir significativamente a lise das células alvo.
Exemplo de teste 6. Teste de sistema de relatório de ADCP in vitro de anticorpos CD38 em células Molp-8 e Daudi
[00194] Células Molp-8 ou Daudi foram coletadas, centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos e recolocadas em suspensão. As células foram contadas com Citômetro (Countstar, IC1000) e recolocadas em suspensão em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol (Gibco, CAT #11835-030) contendo soro bovino fetal de IgG ultrabaixo a 10% (Gibco, CAT #1921005PJ) a 1 x 106 células/ml. Subsequentemente, as células foram divididas em uma placa de 96 poços (Corning, CAT #3903) a 2,5 x 104 células/poço (25 μl/poço), 25 μl de várias concentrações de anticorpos anti-CD38 e controle negativo foram adicionados, e incubadas por 30 minutos (37 °C, CO2 a 5%). Jurkat (Células NFAT Jurkat-Lucia,
Invivogene) estavelmente transformadas com FcIIa de humano de comprimento total (número Uniprot: P12318) foram coletadas como células efetoras, e 7,5 x 104 células/poço (50 μl/poço) de células efetoras foram adicionadas em uma placa de 96 poços incubadas com as células-alvo e anticorpos.
Após incubação por 6 horas (37 °C, CO2 a 5%), 10 μl de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa de 96 poços (Corning, CAT #3903), 90 μl/poço de QUANTI-Luc (Invivogene, rep-qlc1) foram adicionados, e a quimioluminescência foi detectada com VITOR (VITOR3, PerkinElmer). Os resultados são mostrados na Tabela 16 e na Figura 1.
Tabela 16. Resultados do teste do sistema repórter de ADCP in vitro de anticorpos CD38 humanizados em células alvo Molp-8 Daudi Anticorpo Razão de sinal em relação a Dara (vezes) Dara 1,00 1,00 hu9E 2,00 2,30 hu11E 1,83 2,00 hu160E 1,87 1,80
[00195] Os resultados experimentais mostram que todos os anticorpos humanizados da presente divulgação têm efeitos de teste do sistema repórter de ADCP in vitro em células Molp-8 e Daudi significativamente melhores do que o anticorpo de controle Dara.
Exemplo de teste 7. Afinidade de anticorpos CD38 detectados por BIAcore
[00196] As afinidades dos anticorpos quiméricos (ch- 009, -011 e -160 preparados de acordo com o Exemplo 3), anticorpos humanizados da presente divulgação e Dara para o antígeno CD38-ECD-His humano foram detectados por instrumento Biacore.
[00197] A molécula de captura de Fc de humano foi acoplada covalentemente ao chip de biossensor CM5 (CAT #BR- 1005-30, GE) de acordo com o método descrito no manual do Kit de Captura de Fc de Humano (CAT #BR-1008-39, GE), para captura por afinidade dos anticorpos a serem testados. Em seguida, o antígeno CD38-ECD-His de humano passou pela superfície do chip e uma detecção em tempo real para o sinal de reação foi realizada com o instrumento Biacore. As curvas de ligação e dissociação resultantes foram ajustadas para calcular os valores de afinidade. Após a dissociação de cada ciclo no experimento, o biochip foi lavado e regenerado com a solução de regeneração fornecida no Kit de Captura de Fc de Humano (GE). Os resultados são mostrados na Tabela 17 e na Tabela 18.
Tabela 17. Resultados da afinidade do anticorpo anti-CD38 para CD38 de humano por BIAcore Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ch-009 2,04E+06 4,77E-04 2,34E-10 h009-07 2,11E+06 2,10E-03 9,95E-10 h009-08 1,89E+06 2,23E-03 1,18E-09
Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) h009-09 2,29E+06 4,89E-03 2,14E-09 h009-10 2,04E+06 4,33E-03 2,12E-09 h009-11 2,33E+06 1,21E-02 5,17E-09 h009-12 2,24E+06 9,17E-04 4,09E-10 h009-13 2,28E+06 1,06E-03 4,65E-10 h009-14 2,27E+06 1,85E-03 8,15E-10 h009-15 2,28E+06 1,70E-03 7,45E-10 ch-011 7,46E+06 1,48E-03 1,99E-10 h011-01 6,68E+06 2,08E-03 3,11E-10 h011-02 6,59E+06 1,95E-03 2,97E-10 h011-03 6,97E+06 2,13E-03 3,06E-10 h011-04 6,76E+06 2,02E-03 2,99E-10 h011-05 6,89E+06 2,13E-03 3,09E-10 h011-06 6,71E+06 2,01E-03 3,00E-10 ch-160 2,74E+06 1,70E-04 6,20E-11 h160-01 1,99E+06 1,36E-04 6,87E-11 h160-02 1,93E+06 1,63E-04 8,46E-11 h160-03 2,40E+06 1,87E-04 7,79E-11 h160-04 2,12E+06 1,84E-04 8,67E-11 h160-05 2,05E+06 1,41E-04 6,91E-11 h160-06 2,09E+06 1,64E-04 7,82E-11 h160-07 2,43E+06 1,82E-04 7,48E-11 h160-08 2,29E+06 1,79E-04 7,82E-11
[00198] Os resultados mostram que todos os anticorpos humanizados obtidos na presente divulgação têm alta afinidade para o CD38 de humano.
Tabela 18. Resultados da afinidade do anticorpo anti-CD38 para CD38 de humano por BIAcore ka Ligando Analito kd (1/s) KD (M) (1/Ms) Dara 6,45E+05 1,51E-03 2,35E-09 hu9E CD38-His 1,05E+06 1,38E-03 1,31E-09 hu11E de Humano 2,07E+06 1,17E-03 5,68E-10 hu160E 1,96E+06 1,15E-04 5,85E-11
[00199] Os resultados mostram que os anticorpos hu9E, hu11E e hu160E obtidos na presente divulgação têm todos alta afinidade para o CD38 de humano e os valores de KD são mais baixos do que os do anticorpo de controle Dara, melhores do que os do anticorpo de controle.
Avaliação in vivo da atividade biológica Exemplo de teste 8. Teste farmacocinético in vivo de anticorpos CD38
[00200] 18 ratos SD, machos, foram divididos em 6 grupos igualmente. Os animais foram fornecidos por Sipur- Bikai Laboratory Animal Co., Ltd.; Os animais foram administrados respectivamente com injeção intravenosa ou injeção subcutânea, na dosagem de 3 mg/kg. Para o grupo administrado com injeção intravenosa, 0,2 ml de sangue total foram coletados sem anticoagulação antes da dosagem, 5 min, 8h, 1d, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d e 28 d após a administração; Após a coleta, o sangue foi colocado a 4 °C por 30 min, centrifugado a 1000g por 15 min, e o sobrenadante (soro) foi transferido para tubos de EP e armazenado a -80 °C; Para o grupo administrado por injeção subcutânea, o sangue total foi coletado antes da dosagem, 1h, 8h, 1d, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d e 28d após a administração. O sangue total foi coletado nos dias 7, 10, 14, 21 e 28. O soro foi isolado, transferido em tubos de EP e armazenado a -80 °C.
[00201] As curvas padrão para as diferentes amostras foram geradas de acordo com o método descrito no Exemplo de Teste 1 (ELISA de ligação à proteína CD38 dos anticorpos anti-CD38).
As amostras de soro, em substituição dos anticorpos anti-CD38 na diluição 1:1000, foram adicionadas ao sistema de reação.
As concentrações séricas dos anticorpos anti-CD38 em diferentes pontos no tempo foram calculadas com base na OD450 e os parâmetros farmacocinéticos foram analisados e calculados com base nos dados coletados pelo software Phoenix WinNonlin.
Os resultados farmacocinéticos in vivo dos anticorpos hu9E, hu11E e hu160E são mostrados na Tabela 19.
Tabela 19. Avaliação da farmacocinética em ratos para anticorpos hu9E hu11E hu160E
IV SC IV SC IV SC Dosagem 3mg/kg 3mg/kg 3mg/kg 3mg/kg 3mg/kg 3mg/kg Biodisponi- - 81,4% - 113,8% - 113,9% bilidade T1/2 (dia) 11,4 11,1 13,3 12,1 13,6 10,9 Observação: Na tabela, T1/2 significa meia-vida, IV significa injeção intravenosa, SC significa injeção subcutânea.
[00202] PK (farmacocinética) de hu9E, hu11E e hu160E foi medida em ratos após injeção subcutânea e intravenosa a uma dosagem de 3mpk. Os resultados mostram que os anticorpos têm desempenho de PK favorável em ratos: alta biodisponibilidade é observada em todos os anticorpos quando injetados por via subcutânea, e com T1/2 médio de injeção intravenosa é de 11,4 dias, 13,3 dias e 13,6 dias, respectivamente; o T1/2 médio de injeção subcutânea é 11,1 dias, 12,1 dias e 10,9 dias, respectivamente, sugerindo estabilidade favorável de anticorpos em ratos e a possibilidade de desenvolver formulações subcutâneas.
Exemplo de teste 9. Teste de farmacodinâmica in vivo de anticorpos CD38 em tumor em camundongos
[00203] Camundongos nus Balb/c, SPF, 14-16 g, fêmeas, foram adquiridos a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.
Camundongos nus Balb/c foram autorizados a se adaptar ao ambiente de laboratório por 6 dias e foram inoculados por via subcutânea com células AMO-1 (Cobioer, Nanjing, CBP60242, 5 x 106 + matrigel a 50%/camundongo, membrana basal Matrigel, BD, Cat. N #356237) nas costelas direitas. 9 dias depois, os camundongos foram divididos em um total de 7 grupos, 8 camundongos/grupo, com volume tumoral médio de cerca de 197,21 ± 9,25 mm3 (d0). Os grupos foram como a seguir: Grupo de controle em branco, IgG (3mg/kg) (C25-hIgG1 (WT), feito em laboratório);
grupo Dara (1 mg/kg); grupo Dara (3 mg/kg); grupo hu11E (1 mg/kg); grupo hu11E (3 mg/kg); grupo hu160E (1 mg/kg); grupo hu160E (3 mg/kg);
[00204] A injeção intraperitoneal foi realizada, duas vezes por semana, por 3 semanas. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana e os dados foram registrados. Os camundongos foram sacrificados e os tumores removidos após a conclusão de todas as administrações.
[00205] O software estatístico Excel 2003 foi usado para calcular a média (avg), o valor de DP (STDEV) e o valor SEM (STDEV/SQRT); o valor P para a diferença entre os grupos foi calculado pelo TTEST.
[00206] O volume do tumor (V) foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: V = 1/2 x Llongo x Lcurto2 Volume relativo (RTV) = VT/V0 Taxa de inibição do tumor (%) = (CRTV -TRTV)/CRTV (%) em que V0 e VT se referem aos volumes do tumor no início e no final do experimento, respectivamente. CRTV e TRTV referem-se aos volumes tumorais relativos do grupo de controle e do grupo de teste no final do experimento, respectivamente. Os resultados são mostrados na Tabela 20 e na Figura 2.
Tabela 20. Resultados antitumorais in vivo de anticorpos anti-CD38 Taxa de Anticorpo Dosagem Inibição De Tumor (%) 1 mpk 56,83 Dara 3 mpk 87,44 1 mpk 93,14 hu11E 3 mpk 99,52 1 mpk 70,02 hu160E 3 mpk 89,89 Observação: mpk significa mg/kg.
[00207] Os resultados da eficiência antitumoral in vivo em camundongos mostram que ambos os anticorpos humanizados hu11E e hu160E da presente divulgação podem inibir significativamente o crescimento do tumor. Em comparação com o grupo de IgG de controle em branco (3 mg/kg), o grupo hu11E (1 mg/kg) e o grupo hu160E (1 mg/kg) exibem taxa de inibição do tumor de 93,14% e 70,02%, respectivamente; O grupo hu11E (3 mg/kg) e o grupo hu160E (3 mg/kg) exibem taxa de inibição do tumor de 99,52% e 89,89%, respectivamente. Durante o processo de administração, os animais em cada grupo apresentaram peso corporal normal, indicando que os anticorpos da presente divulgação não têm efeitos tóxicos e colaterais óbvios.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente ao CD38 humano, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo: (i) uma cadeia pesada HCDR1, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 9 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 9, uma cadeia pesada HCDR2, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 10 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 10, uma cadeia pesada HCDR3, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 11 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 11, uma cadeia leve LCDR1, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 12 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 12, uma cadeia leve LCDR2, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 13 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 13, e uma cadeia leve LCDR3, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 14 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 14; ou
(ii)
uma cadeia pesada HCDR1, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 15 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 15,
uma cadeia pesada HCDR2, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 16 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 16,
uma cadeia pesada HCDR3, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 17 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 17,
uma cadeia leve LCDR1, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 18 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 18,
uma cadeia leve LCDR2, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 19 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 19, e uma cadeia leve LCDR3, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 20 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 20; ou
(iii)
uma cadeia pesada HCDR1, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 15 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 15,
uma cadeia pesada HCDR2, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 21 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 21, uma cadeia pesada HCDR3, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 17 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 17, uma cadeia leve LCDR1, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 22 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 22, uma cadeia leve LCDR2, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 19 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 19, e uma cadeia leve LCDR3, a sequência de aminoácidos da mesma é como mostrada na SEQ ID No: 23 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 23.
2. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo murino, anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado.
3. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo murino ou anticorpo quimérico compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que: (a) a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID No: 3 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 3, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é como mostrada na SEQ ID No: 4 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 4; (b) a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID No: 5 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 5, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é como mostrada na SEQ ID No: 6 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 6; ou (c) a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID No: 7 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 7, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é como mostrada na SEQ ID No: 8 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 8.
4. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende regiões estruturais ou variantes da região estrutural derivadas de anticorpo humano, e as variantes da região estrutural têm até 10 mutações reversas de aminoácidos nas regiões estruturais da cadeia leve e/ou regiões estruturais da cadeia pesada do anticorpo humano, respectivamente; preferivelmente, o anticorpo humanizado compreende qualquer um selecionado a partir dos seguintes (d) a (f):
(d) uma região variável da cadeia pesada, em que a região variável da cadeia pesada compreende: HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada e região(ões) estrutural(is) da cadeia pesada,
em que a sequência de aminoácidos do HCDR1 é como mostrada na
SEQ ID No: 9 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 9, a sequência de aminoácidos da HCDR2 é como mostrada na SEQ ID No: 10 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 10, a sequência de aminoácidos da HCDR3 é como mostrada na SEQ ID No:
11 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 11, e a(s) região(ões) estrutural(is)
da cadeia pesada compreende(m) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em: 2F, 38K, 44S, 48I, 67A,
66K, 69L, 71V e 73Q; e/ou uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende: LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve e região(ões) estrutural(is) da cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos do LCDR1 é como mostrada na SEQ ID
No: 12 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 12, a sequência de aminoácidos da
LCDR2 é como mostrada na SEQ ID No: 13 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 13, a sequência de aminoácidos da LCDR3 é como mostrada na SEQ ID No:
14 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 14, e a(s) região(ões) estrutural(is)
da cadeia leve compreende(m) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em: 2F, 43S, 49K e 87F;
(e) uma região variável da cadeia pesada, em que a região variável da cadeia pesada compreende: HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada e região(ões) estrutural(is) da cadeia pesada,
em que a sequência de aminoácidos do HCDR1 é como mostrada na
SEQ ID No: 15 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
quando comparada com a SEQ ID No: 15, a sequência de aminoácidos da HCDR2 é como mostrada na SEQ ID No: 16 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No:
16, a sequência de aminoácidos da HCDR3 é como mostrada na SEQ
ID No: 17 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 17, e a(s) região(ões) estrutural(is)
da cadeia pesada compreende(m) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em: 79F, 82A T, 91S e 76S;
e/ou uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende: LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve e região(ões) estrutural(is) da cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos do LCDR1 é como mostrada na SEQ ID
No: 18 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 18, a sequência de aminoácidos da
LCDR2 é como mostrada na SEQ ID No: 19 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 19, a sequência de aminoácidos da LCDR3 é como mostrada na SEQ ID No:
20 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 20, e a(s) região(ões) estrutural(is)
da cadeia leve compreende(m) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em: 58I, 68R e 85T; e
(f) uma região variável da cadeia pesada, em que a região variável da cadeia pesada compreende: HCDR1, HCDR2, HCDR3 da cadeia pesada e região(ões) estrutural(is) da cadeia pesada,
em que a sequência de aminoácidos do HCDR1 é como mostrada na
SEQ ID No: 15 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s)
quando comparada com a SEQ ID No: 15, a sequência de aminoácidos da HCDR2 é como mostrada na SEQ ID No: 21 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No:
21, a sequência de aminoácidos da HCDR3 é como mostrada na SEQ
ID No: 17 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 17, e a(s) região(ões) estrutural(is)
da cadeia pesada compreende(m) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em: 48I, 77T e 82A T; e/ou uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende: LCDR1, LCDR2, LCDR3 da cadeia leve e região(ões) estrutural(is) da cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos do LCDR1 é como mostrada na SEQ ID
No: 22 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 22, a sequência de aminoácidos da
LCDR2 é como mostrada na SEQ ID No: 19 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 19, a sequência de aminoácidos da LCDR3 é como mostrada na SEQ ID No: 23 ou tem 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido(s) quando comparada com a SEQ ID No: 23, e a(s) região(ões) estrutural(is) da cadeia leve compreende(m) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em: 4L, 9A, 22S, 58I, 60A e 68R; em que os locais de mutação reversa são numerados de acordo com os critérios de numeração de Kabat.
5. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende: uma região variável da cadeia pesada como mostrada nas SEQ ID Nos: 24, 32, ou 37, ou uma variante da mesma, em que a variante tem mutação(ões) de 1 a 10 aminoácidos nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada, como mostrado nas SEQ ID Nos: 24, 32 ou 37.
6. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a variante é selecionada de qualquer um dos seguintes (g) a (i): (g) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 2F, 38K, 44S, 48I, 67A, 66K, 69L, 71V e 73Q nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada, como mostrado na SEQ ID No: 24; (h) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 79F e 91S nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada, como mostrado na SEQ ID No: 32; e (i) mutação reversa de 48I nas regiões estruturais da região variável da cadeia pesada, como mostrado na SEQ ID No: 37; preferivelmente, em que o anticorpo humanizado compreende: uma região variável da cadeia pesada como mostrada nas SEQ ID Nos: 26, 27, 28, 29, 34 ou 39, ou uma região variável da cadeia pesada com pelo menos 95% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos: 26, 27, 28, 29, 34, ou 39.
7. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende: uma região variável da cadeia leve como mostrada nas SEQ ID Nos: 25, 33, ou 38, ou uma variante da mesma, em que a variante tem mutação(ões) de 1 a 10 aminoácidos nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve, como mostrado nas SEQ ID Nos: 25, 33 ou 38.
8. Anticorpo anti-CD38 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a variante é selecionada de qualquer um dos seguintes (j) a (l): (j) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 2F, 43S, 49K e 87F nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve, como mostrado na SEQ ID No: 25; (k) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 58I, 68R e 85T nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve, como mostrado na SEQ ID No: 33; (l) uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 4L, 9A, 22S, 58I, 60A e 68R nas regiões estruturais da região variável da cadeia leve, como mostrado na SEQ ID No: 38; preferivelmente, em que o anticorpo humanizado compreende: uma região variável da cadeia leve como mostrada nas SEQ ID Nos: 30, 31, 35, 36, 40, 41 ou 42, ou uma região variável da cadeia leve com pelo menos 95% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos: 30, 31, 35, 36, 40, 41 ou 42.
9. Anticorpo anti-CD38 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (m) uma região variável da cadeia pesada como mostrada nas SEQ ID Nos: 24, 26, 27, 28 ou 29, e uma região variável da cadeia leve como mostrada nas SEQ ID Nos: 25, 30 ou 31; (n) uma região variável da cadeia pesada como mostrada nas SEQ ID Nos: 32 ou 34, e uma região variável da cadeia leve como mostrada nas SEQ ID Nos: 33, 35 ou 36; ou (o) uma região variável da cadeia pesada como mostrada nas SEQ ID Nos: 37 ou 39, e uma região variável da cadeia leve como mostrada nas SEQ ID Nos: 38, 40, 41 ou 42; preferivelmente, o anticorpo humanizado compreende: (p) uma região variável da cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 26 e uma região variável da cadeia leve como mostrada na sequência SEQ ID No: 30; ou (q) uma região variável da cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 32 e uma região variável da cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 33; ou (r) uma região variável da cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 37 e uma região variável da cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 38.
10. Anticorpo anti-CD38 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende regiões constantes; preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado, e a região constante da cadeia pesada do mesmo é derivada do anticorpo humano IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, ou uma variante convencional de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, e a região constante da cadeia leve do mesmo é derivada do anticorpo humano κ, cadeia λ, ou uma variante convencional da cadeia κ, λ;
mais preferivelmente, a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada é como mostrada nas SEQ ID Nos: 43 ou 44 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos: 43 ou 44, mais preferivelmente, a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve é como mostrada na SEQ ID No: 45 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID No:
45.
11. Anticorpo anti-CD38 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende: uma cadeia pesada como mostrada na sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 46, 48, 49, 51, 52 ou 54 ou com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 46, 48, 49, 51, 52 ou 54; e/ou uma cadeia leve como mostrada na sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 47, 50 ou 53, ou com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 47, 50 ou 53.
12. Anticorpo anti-CD38 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 46 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 47; uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 48 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 47; uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 49 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 50; uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 51 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 50; uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 52 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 53; ou uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No: 54 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID No: 53.
13. Anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao CD38 humano com o anticorpo anti-CD38 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 pela ligação ao CD38 humano.
14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD38 ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e um ou mais carreadores, diluentes, tampões ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
15. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
16. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação
15.
17. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor conforme definido na reivindicação 16; preferivelmente, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula procariótica e uma célula eucariótica, preferivelmente uma célula eucariótica, mais preferivelmente uma célula de mamífero.
18. Método para preparar o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar as células hospedeiras conforme definidas na reivindicação 17, recuperar o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; opcionalmente, purificar o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
19. Método para detectar ou medir CD38 humano caracterizado pelo fato de que compreende: contactar o anticorpo anti-CD38 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 com uma amostra a ser testada; determinar a presença ou nível de CD38 humano na amostra a ser testada.
20. Reagente para detectar ou medir CD38 humano caracterizado pelo fato de que compreende: o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13; ou a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 16.
21. Uso de uma substância selecionada de qualquer um dos seguintes (m) a (o) caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de doença ou distúrbio: (m) o anticorpo anti-CD38 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, (n) a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 14, e (o) a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 15; preferivelmente, a doença ou o distúrbio é tumor ou doença autoimune.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio é doença ou distúrbio positivo para CD38.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que: a doença ou o distúrbio é tumor ou doença autoimune, a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em: artrite reumatoide, psoríase, espondilite anquilosante, psoríase articular, dermatite, esclerodermia sistêmica e esclerose, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do desconforto respiratório, meningite, encefalite, gastrite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, arteriosclerose, deficiência de adesão leucocitária, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite de complexo imunológico, nefropatia por IgA, polineuropatia por IgM, sintoma de trombocitopenia imunomediada, anemia hemolítica, miastenia gravis, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, esclerose múltipla, doenças relacionadas ao vírus do HIV e herpes, síndrome respiratória aguda grave e coriorretinite,
doença do enxerto versus hospedeiro, e doença autoimune causada por infecção viral;
preferivelmente, a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em: artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, asma, doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, doença de Crohn, gastrite, tireoidite de Hashimoto,
espondilite anquilosante, doença do enxerto versus hospedeiro,
trombocitopenia imunomediada;
preferivelmente, o sintoma de trombocitopenia imunomediada é púrpura trombocitopênica idiopática aguda ou púrpura trombocitopênica idiopática crônica;
mais preferivelmente, a doença autoimune é artrite reumatoide;
o tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em:
leucemia, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de células NK, tumor maligno de células plasmáticas e mieloma;
preferivelmente, o linfoma de células B é selecionado a partir do grupo que consiste em: tumor de células B maduras,
leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras,
linfoma não Hodgkin de células B e linfoma de Hodgkin de células
B;
mais preferivelmente, o tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda ou crônica,
mieloma múltiplo, tumor medular anterior, amiloidose de cadeia leve, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia linfocítica pequena, leucemia linfocítica aguda de células B,
leucemia pré-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células do manto, linfoma folicular, linfoma central folicular cutâneo, linfoma de células B da zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, tumor de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, leucemia de células plasmáticas, doenças linfoproliferativas pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de células plasmáticas e linfoma anaplásico de células grandes e linfoma de células pilosas;
mais preferivelmente, o tumor é mieloma múltiplo.
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