JPH072120B2 - 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法 - Google Patents

全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法

Info

Publication number
JPH072120B2
JPH072120B2 JP2097789A JP9778990A JPH072120B2 JP H072120 B2 JPH072120 B2 JP H072120B2 JP 2097789 A JP2097789 A JP 2097789A JP 9778990 A JP9778990 A JP 9778990A JP H072120 B2 JPH072120 B2 JP H072120B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
cells
sample
dna
whole blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2097789A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02292298A (ja
Inventor
アーサー バーディック ブレント
デイブィス イークゼ トバイアス
Original Assignee
イーストマン コダック カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イーストマン コダック カンパニー filed Critical イーストマン コダック カンパニー
Publication of JPH02292298A publication Critical patent/JPH02292298A/ja
Publication of JPH072120B2 publication Critical patent/JPH072120B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Perforating, Stamping-Out Or Severing By Means Other Than Cutting (AREA)
  • Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
  • Vehicle Body Suspensions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、全血またはそれらの末梢血単核細胞画分のい
ずれかに由来するDNAのような核酸を迅速に抽出する方
法に関する。本発明はまた、診断の目的で抽出された核
酸を増幅または検出するための方法にも関する。
〔従来の技術〕
生物学的診断分野の研究および分析方法では、生物学的
被検体、例えば全血またはその画分に由来する核酸の調
査が必要である。このような試験管内法では、第一段階
として核酸の単離が必要である。例えば、遺伝子疾患に
ついての試験を実施するにはゲノムDNAの相当純粋な試
料が必要であり、組換え技術はベクターDNAとクローン
化されるDNAとの単離が必要である。細菌およびウイル
ス感染細胞のような感染体の検出によるDNA診断法で
は、一般に細胞を溶解し、次いで放出されたDNAを検出
することが必要である。
一般的に、DNAは細胞内で遊離の分子として存在しない
で、むしろDNA,RNAおよびタンパク質の会合複合体とし
て存在する。このことは、遺伝情報のキャリヤーとして
の役割の重要さならびにその機能におけるRNAおよび各
種タンパク質との関連性にある。
被検体における他の物質とDNAのこの複雑な会合性のた
めに、効率的なDNA抽出では、DNAが破砕された細胞壁お
よび細胞膜から放出され、DNA−タンパク質複合体が変
性またはタンパク質分解によって解離され、そして他の
高分子からDNAが分離されることを必要とする。当該技
術分野では多様な手段が使用され、これらの結果の１以
上が達成されている。細胞溶解は、例えば、凍結−解
氷、超音波手段、剪断および他の機械的技法によって達
成されるか、あるいは酵素、界面活性剤またはキレート
剤による処理によって達成されている。プロテアーゼお
よびその他の加水分解性試薬を使用して、タンパク質か
らDNAを解離することができる。残存するタンパク質や
他の高分子は、フェノールまたは他のアルコール類のよ
うな各種溶媒を用いて抽出することができる。
いくつかのDNA単離方法は、例えば、ヨーロッパ特許公
開第145356号、同240191号および同245945号公報に記載
されており、これらの全ては、特定の調製段階でアルコ
ールと酵素的タンパク質分解剤を使用する。一般的に、
これらの手順はウイルスDNAの抽出に向けられており、
入手可能なDNAのすべてを得るには精確に実施されねば
ならない。従って、殆どの既知方法は労働集約的であ
り、好ましくない溶媒の使用を要し、さらに簡単に自動
化されない。
目的の核酸の単離または抽出には、ポリメラーゼ連鎖反
応を使用する核酸の増幅および検出についての最近の開
発の長所を取り入れることが必要である。米国特許第4,
683,195号および同4,683,202号明細書は、ポリメラーゼ
を使用する多様な生物学的被検体で見い出される核酸の
ための利用可能な増幅方法や検出方法を記載する。標準
的な核酸抽出法は、Maniatisらの、Molecular Cloning
:A Laboratory Manual（New York:Cold Spring Harbor
Laboratory,1982）、280〜281ページの参照文献に記載
されている。この文献は、細胞溶解にプロテアーゼの使
用とフェノール／クロロホルム抽出を含む標準的な抽出
方法に向けられており、全工程を行うには一般に長時間
かかり、危険な有機溶媒の使用を伴う。また、それは、
Nunbergら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75（11）,5553〜5
556ページ（1978）によればハムスターの卵巣細胞か
ら、Saikiら、Bio/Technology,3,1008〜1012ページ（19
85）によれば全血被検体のバッフィーコートから、そし
てBellら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78（９）、5759〜5
763ページ（1981）によれば全血からDNAを抽出するため
にも使用されている。
商業的に実施可能である診断試験では、さらに経済的な
競争性をも有するものでなければならない。このこと
は、手順の各態様が単純であり、使用が容易である程度
自動化されねばならないことを意味する。被検体からの
DNAの抽出は、被検体由来の最大量のDNAを得、ならびに
経済的な利益を得るために慎重な開発を必要とする１態
様である。さらに、診断結果が早急に必要とされる状況
下では、抽出法は迅速であらねばならない。
従って、前述の冗長で時間のかかる工程と有機溶媒の使
用を必要としない改良DNA抽出方法を開発するために相
当な研究がなされてきた。こうして、Koganらの、N.En
g.j.Med.，317（16）、985〜990ページ（1987）は、遠
心によって全血から採取された細胞を煮沸することで遺
伝子疾患を検出するための抽出を記載する。次に、抽出
されたDNAが増幅されている。
同様に、Saikiらの、Nature,324,163〜166ページ（198
6）は、全血のバッフィーコート（末梢血単核細胞と顆
粒球を含む）を煮沸してβ−グロビンDNAを増幅するこ
とを記載する。ヨーロッパ公開237362号公報で鎌状赤血
球およびHLA DNAの検出に関して、同様な仕事が示され
ている。いくつかのケースでは、バッフィーコートの細
胞が加熱段階に先立って鉱油で上塗りされている。
〔発明が解決しようとする課題〕
これらの方法は、前述の冗長なフェノール／クロロホル
ム抽出を避け明らかに迅速（数分で行える）であるが、
全血試料中に多量に存在するDNA、例えばHLAまたはβ−
グロビンDNAの抽出に非常に有用であるにすぎない。多
くの感染体（例えば、ウイルス）が存在するケースのよ
うに目的のDNAが非常に少量存在する場合には、全血ま
たはバッフィーコート画分からの抽出でさらなる改良が
好感度検出にとって必要である。さらに、増幅に先立っ
て全血から除去することが必要でもあるポリメラーゼ活
性に対する多くの妨害物質も存在する。
最近では、冗長なフェノール／クロロホルム法の欠点が
非イオン溶菌性洗剤とタンパク質分解酵素を含有する組
成物の使用によって取り除かれている。この方法の原理
的な長所の一つは、２時間未満にDNA抽出の時間が短縮
されていることである。
この改良は当該技術分野で歓迎されているとはいえ、依
然として、なお一層簡単なDNA抽出方法が、特に被検体
中にDNAが非常に低濃度で存在する場合には必要であ
る。就中、全血やそれらの末梢血単核画分に由来するHI
V−I DNAの迅速かつ効率的な抽出方法に対する欲求が存
在する。
〔課題を解決するための手段〕
既知DNA抽出方法の前述の課題は、末梢血単核細胞の水
性試料に由来する核酸の迅速抽出方法であって、 A.感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有することが
予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜15分間温度
80〜120℃で加熱してその試料中の細胞を溶解してその
細胞由来の核酸を放出する工程、および B.前記加熱試料からその核酸を回収する工程、のみから
なる方法によって解決される。
さらに、前述の課題は次の方法によって解決される： ポリメラーゼ連鎖反応を使用する所定の核酸の増幅方法
であって、 A.（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有する
ことが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜15分
間温度80〜120℃で加熱してその試料中の細胞を溶解し
てその細胞由来の核酸を放出する工程、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、のみ
からなる抽出工程ならびに B.ポリメラーゼ連鎖反応を使用して回収した核酸を増幅
する工程、を含んでなる方法。
また、２つの相補的鎖を有する核酸の検出方法であっ
て、 A.（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有する
ことが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜15分
間温度80〜120℃で加熱してその試料中の細胞を溶解し
てその細胞由来の核酸を放出する工程、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、のみ
からなる抽出工程、 B.その回収された変性核酸をその核酸の分離された鎖に
相補的である第一プライマーおよび第二プライマーと接
触させて、これらのプライマーと相補的鎖のハイブリッ
ド生成物を形成する工程、 C.ハイブリッド生成物における前記プライマーの第一お
よび第二エクステンション生成物が、それらの相補体か
ら分離された場合にこれらのプライマーのエクステンシ
ョン生成物の合成用鋳型として機能しうるそれらのエク
ステンション生成物を形成する工程、 D.これらのプライマーエクステンション生成物が合成さ
れた鋳型からそれらを分離する工程、 E.分離された抽出生成物および所定の核酸を追加の第一
プライマーおよび第二プライマーと接触させ、相補的生
成物を形成するために前記核酸の増幅をもたらす工程、 F.工程Ｅで形成された相補的生成物からそれらのプライ
マーエクステンション生成物を分離する工程、ならびに G.水性試料における核酸存在の指標として増幅された核
酸を検出する工程、を含んでなる方法。
さらにまた、全血被検体に由来する核酸の迅速抽出方法
であって、 A.全血被検体を１種以上の多糖類を含む塩溶液と接触さ
せる工程、 B.工程Ａで得られた混合物を２〜15分間温度80〜120℃
で加熱して混合物中の細胞を溶解してその細胞から核酸
を放出する工程、および C.その加熱混合物から前記核酸を回収する工程、のみか
らなる方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、全血またはその末梢血単核細胞画分（PBMC）
のいずれかに由来する１種以上の所定の（すなわち、標
的）核酸の抽出、増幅または検出に向けられる。本発明
の主な目的は診断であるが、抽出されたDNAは各種研究
および医療調査分野でDNAもしくはメッセンジャーRNAの
クローニングまたはゲノムDNAの配列決定にも使用する
ことができる。抽出されたDNAの他の用途は、当業者に
とって容易に明らかであろう。
DNAは、ヒトまたは動物の血液から抽出することがで
き、ゲノムDNAであるかまたは細菌、ウイルスもしくは
酵母のような感染体によって生ずる細胞もしくは体液中
のものであってもよい。処理される被検体が全血である
場合には、抽出される核酸は一般にゲノムDNAである。
しかしながら、この発明は感染体（最も好ましくは、ヘ
ルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バール
ウイルス、肝炎ウイルスおよび風疹ウイルスのようなウ
イルスならびにHIV−I,HIV−IIおよびHTLV−Ｉのような
レトロウイルス）に侵された細胞由来のDNAの抽出およ
び検出に特に有用である。好ましくは、サイトメガロウ
イルス、エプスタイン−バールウイルスおよびHIV−Ｉ
ウイルスDNAが本発明によって抽出されそして検出さ
れ、HIV−ＩウイルスDNAの抽出および検出が最も好まし
いものである。
好ましい態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（より詳細は
後述する）を使用して抽出された核酸が増幅または検出
される。
末梢血単核細胞画分（PBMC）は、標準的な方法を使用す
る遠心によって全血からFicoll−Paque（商品名）のク
ッション上に得られる。それは、単球およびリンパ球よ
りなるものと信じられている。
PBMCが実用される場合、この発明の抽出方法における重
要な工程は、試料中のタンパク質を崩解せしめそして全
細胞を溶解せしめるに十分な時間、水の沸点またはその
付近の熱に細胞の水性試料をさらすことである。この試
料は媒体として緩衝剤を含んでよいが、幾つかの例にお
ける媒体は単に水だけである。この工程の温度は、大気
圧、煮沸時間および他の環境要因に応じて変化しうる。
一般的に、海面レベルで、加熱温度は約100℃である
が、80℃程の低温でも120℃程の高温であってもよい。
前記温度で試料を維持する時間は、試料中のタンパク質
を変性し、細胞を溶解してDNAを放出するのに必要な時
間である。これは加熱工程中で試料の一部を採取し、全
タンパク質が残存するか否かを測定することによって容
易に決定することができる。この時間は、使用される温
度によっても変化し、すなわち、より低温ではより長い
加熱時間となる。一般に、最低２分間で15分間までの望
ましい温度に試料は加熱され、好ましくは４〜12分、最
適には10分間加熱される。
加熱は、試料を保持するのに十分なサイズを有し、加熱
処理に耐えうるいずれかの適当な容器で行うことができ
る。例えば、フラスコ、試験管、遠心管、毛細管、ビー
カー、キュベットおよび他の標準的な実験室備品で加熱
を行うことができる。好ましくは、加熱および化学反応
を含む多様な処理を目的に設計される自蔵式の反応容器
でそれが行われる。多くのこのような容器は当該技術分
野で既知である。好ましい自蔵式容器は、同時係属中の
特許出願明細書（Schnipelskyらによって1989年４月14
日付で出願された米国特許出願第339,923号明細書に対
応する）に記載されている。
試料中のPBMCを溶解するために加熱した後、放出された
核酸（一般に、DNA）は適当な方法で回収される。細胞
質およびすべての凝集砕片は、濾過、遠心、デカントお
よびサイフォン処理を含むいずれか適当な手段によって
可溶性DNA分子を含有する流体から分離される。濾過
は、標準的な濾過装置、または濾過膜を有する装置を使
用して実施することができる。特に有用な濾過手段は、
ポリアミド膜〔Loprodyne（商品名）またBiodyne（商品
名）膜〕のような微孔質濾過膜である。それらは、被覆
しないか、あるいは分析手順を促進する界面活性剤また
は他の材料で予め被覆して使用することができる。
これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するための適
当な容器と共に分離支持体として使用することができ
る。しかしながら、試験装置の一部として固定されてい
ることが好ましい。各種の試験装置が、米国特許第3,82
5,410号、同3,888,629号、同3,970,429号および同4,44
6,232号明細書に記載されるものを含む当該技術分野で
既知である。特に有用な装置は、同時係属中の特願昭63
−234692号（1988年９月18日出願）明細書に記載されて
いる。
全血が処理されて核酸が抽出されるこの発明の一の態様
では、加熱前に、希釈水性塩溶液中１種以上の多糖類を
含む溶液で全血試料が希釈される。多糖類は、希釈剤と
して使用し、そして望ましくない細胞砕片やヘモグロビ
ンから抽出DNAの分離に究極的に役立つであろう。場合
により、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタン誘導体またはポリグリコールエーテルの
ような非イオン界面活性剤を10重量％未満の量でこの溶
液に含めることができる。他の有用な界面活性剤は、特
に、界面活性剤についての標準的な文献、McCutcheon′
s Emulsifiers and Detergents,1986,North American E
dition,（McCutcheon Division Publishing Company）
を参照した後はとくに、当業者に容易に明らかとなるで
あろう。特に有用な界面活性剤としては、Triton（商品
名）Ｘ−100やNonidet（商品名）NP−40およびBrij（商
品名）35のような市販のその他のものが挙げられる。
多糖類の量は変動しうるが、一般に、全血試料を基準に
１〜10重量％を提供する量で使用される。３〜５重量％
が好ましい。
有用な多糖類は、一般に単一糖分子を少なくとも３個含
有する水溶性または水分散性炭水化物である。限定され
るものでないが、これらにはセルロースおよびセルロー
ス誘導体、カルボキシメチル化多糖類、リポ多糖類、デ
キストラン、デキストリンおよび殿粉が包含される。特
に有用な物質は、主としてα−Ｄ（１−６）結合したＤ
−グルコース構造単位の主鎖を有し、少なくとも1000の
分子量を有するデキストランとして既知のものである。
代表的なデキストランは、JeanesらのJ.A.C.S.，76,504
1〜5052ページ（1954）およびBankertらのJ.Immun.123
（６）,2466〜2474ページ（1979）に記載されている。
殆どのデキストランは市販されている。
前記塩溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リ
チウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムおよび全血中の細胞からDNAの抽出および単
離を妨害しない他の塩のような簡単な塩１種以上を含
む。原則的に、塩溶液は多糖類の溶解や等張液を提供す
るのに役立つ。この溶液中の塩の量は、一般に0.5〜1.5
重量％である。
この水性塩溶液は、生物学的被検体に適合するような緩
衝剤をも含むことができる。限定されるものでないが、
有用な緩衝剤としては、リン酸塩、ホウ酸塩、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸および当
該技術分野で既知の他のものが挙げられる。
この発明の加熱工程前に、全血試料を１種以上の緩衝液
と接触させることは必須でないが、幾かの例では望まし
い。有用な緩衝液は、以下「TE」緩衝液と称され、その
組成は後述する。TE緩衝液は、一般に核酸、特にDNAを
溶解するために使用される。いずれかの重金属イオンを
キレートするためにエチレンジアミン四酢酸がそれに含
められる。
プローブまたは核酸断片が検出されるものであるプライ
マーと関連して本明細書で使用される場合の「オリゴヌ
クレオチド」の語は、２以上のデオキシヌクレオチドま
たはリボヌクレオチドを、そして好ましくは３より大き
いものからなる分子をいう。正確なサイズは限定されな
いが、オリゴヌクレオチドの究極的な使用または機能を
含む多くの要因に左右される。オリゴヌクレオチドは合
成的またはクローニングによって誘導されうる。
「プライマー」の語は、天然由来かまたは合成的に生成
されたオリゴヌクレオチドであって、ある核酸鎖に相捕
的なプライマーエクステンション生成物合成が誘導され
る条件下に置かれたときに合成開始点として機能しうる
ものをいう。このような条件には、ヌクレオチド（例え
ば、４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン
酸）およびDNAポリメラーゼのような重合用試薬の存
在、ならびに適当な温度およびpHを包含する。
この発明の実施に際して、プライマー、プローブおよび
断片は、全血またはPBMCから抽出された標的核酸の特異
的な核酸配列に実質的に相補的である。「実質的に相補
的」とは、ハイブリダイゼーションが起こりうるように
マッチするのに十分な数の塩基が相捕体上に存在するこ
とを意味する。しかしながら、全ての塩基対がマッチし
うることを意味しない。
この発明の増幅および検出方法で利用可能なプライマー
は、各種起源から入手するかあるいは、例えば、ABI DN
A シンセサイダー（Applied Bio−systemより入手可）
またはBiosearch 8600シリーズもしくは8800シリーズの
シンセサイダー（Milli−gen−Biosearch,Inc.より入手
可）およびこれらの使用についての既知の方法を含む、
既知の方法および装置を使用して調製することができ
る。生物源から単離された天然由来のプライマー（制限
エンドヌクレアーゼ消化物のような）も利用可能であ
る。
ある態様では、この検出方法においてプライマー（また
はそのセット）少なくとも１つが特異的にバインディン
グするリガンドで標識される。
「標識される」の語は、リガンドが容易に離脱しないよ
うな状態でこのプライマーに付着されていることをい
う。特異的にバインドするリガンドとしては、ビチオン
もしくはその誘導体、アビジン、ストレプトアビジンも
しくはその誘導体、レクチン、糖、タンパク質、ハプテ
ン、薬剤または抗体もしくは抗原性物質のような免疫種
が挙げられる。
この発明は、２つの相捕的鎖を有する標的核酸の増幅ま
たは検出に有用である。多くの目的とする核酸配列は、
DNAに見い出されるもののごとく既に二本鎖である。し
かしながら、mRNAのように一本鎖の核酸配列も同様に増
幅されそして検出されうる。
特異的な核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核
酸を使用して調製されている。核酸が二本の鎖を含む場
合には、分離工程としてかまたはプライマーエクステン
ション生成物の形成と同時にそれらの鎖を分離すること
（いわゆる変性）が必要である。変性は、従来技術文献
に記載されているようないずれ適当な物理的、化学的ま
たは酵素的手段を使用し行うことができる。適当な温度
まで加熱することが好ましい手段である。全血またはPB
MC試料を加熱してDNAを抽出する場合には変性が起こり
うる。
分離された鎖が使用可能になったならば、一般にpH7〜
９に緩衝化された水溶液中で２つ以上のプライマー（標
識または未標識）を使用して追加の核酸鎖の合成を実施
することができる。好ましくは、１モル過剰の２つのプ
ライマーが緩衝液に添加され、具体的な量は従来技術
（例えば、米国特許第4,683,202号明細書）に教示され
ている。
新に合成された鎖とそれらの個々のプライマーを含んで
なる新に形成されたプライマーエクステンション生成物
は、この方法の次の工程で使用される最初の標的鎖と二
本鎖分子を形成する。次に、前述のようにこれらの鎖を
変性で分離して一本鎖分子を提供し、前述のようにこれ
によって新な核酸を合成する。
場合によって追加の試薬が増幅工程の進行を持続するた
めに必要であるかも知れない。この工程後、殆どのエク
ステンション生成物は２つのプライマーによって結合さ
れた特異的な核酸配列（すなわち、相補的生成物）から
成るであろう。
鎖の分離とエクステンション生成物合成工程は、必要に
よって繰り返えされて、使用、例えば検出に必要な目的
量の特異的な核酸を生成することができる。一般的に、
一連の工程は最低１度は繰り返えされ、好ましくは最低
10〜50回繰り返えされる。
サザーンブロット、ゲル電気泳動、染色および当該技術
分野で既知の他の方法を包含する各種検出手段を使用し
て検出可能なハイブリッドの存在を測定することができ
る。
少なくとも１個のプライマーエクステンション生成物が
生じた後、この発明の方法のいずれかの時点でその生成
物は検出可能に標識されたプローブ（後述）とハイブッ
ド化されうる。
特に好ましい態様では、前記標識がペルオキシダーゼで
あり、アッセイのある時点で過酸化水素と適当な色素生
成組成物が添加されて検出可能な色素を提供する。例え
ば、有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジ
ンやその誘導体、ならびに米国特許第4,089,747号明細
書に記載されるトリアリールイミダゾールロイコ染料の
ようなロイコ染料またはペルオキシダーゼと過酸化水素
の存在下で反応して色素を供給する他の化合物が挙げら
れる。特に有用な色素生成組成物は、国際公開WO88/028
06および同88/02807号公報および特開平１−100453号公
報に記載されている。
相補的生成物中に存在するプローブの存在の検出は、適
切かつ既知の検出装置および手順を使用して達成するこ
とができる。特定のプローブは検出器を使用することな
く目視可能である。
プローブが相補的生成物中で検出されるには、反応媒体
中の他の物質から相補的生成物を分離することがしばし
ば重要となる。これは、適当な不溶化手段、例えば本発
明の方法のある時点で固体素材に結合するかまたは結合
可能となるプライマーまたはプローブを使用することに
よって行うことができる。得られる不溶化複合体は、濾
過、遠心または他の適当な分離手段によって未複合化物
質から分離することができる。
特に有用な分離手段は、Pall Corpによって販売されて
いるポリアミド膜（前述）のような微孔質濾過膜であ
る。これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するのに
適する容器と共に分離支持体として使用することができ
る。しかしながら、好ましくは、前述したように試験装
置の一部としてそれらが固定される。
本明細書で開示される方法を使用して、生物学的被検体
で見い出されるガンのような細胞疾患、感染症または遺
伝子疾患に関連する特異的な核酸配列の検出または特性
付けを行うことができる。それはまた、法医学上の研
究、DNAの類別化および細胞の類別化にも使用されるか
も知れない。この発明の目的とする遺伝子疾患として
は、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、α−サラセミア、
β−サラセミアおよび当業者に容易に明らかとなる他の
疾患のような、いずれかの生物体に由来するヒトのゲノ
ムDNAの特異的な欠損または変異が挙げられる。各種感
染症は、生物体（それが酵母、細菌またはウイルスであ
るかどうかにかかわらず）を特性付ける少量の特異的な
DNA配列を有する細胞の存在によって診断することがで
きる。このような検出されうる細菌としては、限定され
るものではないが、サルモネラ（Salmonella）、クラミ
ジア（Chlamydia）、ゴノローエ（Gonorrhea）、シゲラ
（Shigella）およびリステリア（Listeria）が挙げられ
る。検出可能なウイルスとしては、限定されるものでな
いが、ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン
−バールウイルス、肝炎ウイルスならびにHTLV−１およ
びHIV−Ｉのようなレトロウイルスが挙げられる。原生
動物寄生体、酵母およびカビもまた検出可能である。他
の検出可能な種は、当業者にとって容易に明らかであろ
う。
この発明の方法を使用してHIV−Ｉの存在について新生
児の検査をすることもできる。新生児に由来する全血を
採取し、濾紙または他の適当な多孔質支持体上にスポッ
トし次いで乾燥させる。次に、乾燥血試料を有する支持
体部分を切り出し、水（250μｌ）中デキストラン（ま
たは他の適当な多糖、３重量％）、Triton（商品名）Ｘ
−100（または他の適当な非イオン界面活性剤、10重量
％）および塩化ナトリウム（または他の適当な塩、0.9
重量％）を含有する溶液に入れる。次に、この混合物を
５分間118℃で加熱してDNAを抽出する。次に、抽出され
たDNAはポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅され、先
に記載されているように検出される。
〔実施例〕
以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するための
ものであって、この発明をいずれかの方法に限定するこ
とを意味しない。
これらの例で使用した材料は以下の通りである： 「TE」緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン塩酸緩衝剤（10ミリモル濃度）およびエチレンジア
ミン四酢酸（１ミリモル濃度）から成り、塩酸を使用し
てpH8に調整した。
電気泳動に使用する「移動緩衝剤」は、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（89ミリモル濃度）、ホウ酸
（89ミリモル濃度）およびエチレンジアミン四酢酸（２
ミリモル濃度）からなっていた。
ハンクス液はSigma Chemical Co.より入手した。
例 1:全血のPBMC画分からHIV−I DNAの抽出 この例は、全血のPBMC画分から核酸どのように抽出する
かを具体的に説明する。PBMC画分を得るための標準的方
法を示し、次いでこの発明の抽出、増幅および検出方法
を具体的に示す。
下記方法を使用してHIV−Ｉを保有することが予測され
る患者の全血試料から末梢血単核細胞（PBMC）を得た： ヘパリン試験管に集めた全血（10ml）を遠心管に入れ、
10分間1200rpmで遠心した。血漿層約0.5mlを除いてすべ
ての層を除去した。赤血球をできるだけ多くあとに残
し、バッフィーコートを可能な限り多く採取し15mlの遠
心管に移した。次に、このバッフィーコート細胞にハン
クス液（HBSS,5ml）を加え、次いでこれらにFicoll−Pa
que（商品名）（3.5μｌ）で下層を形成した。得られた
混合物を16分間1900rpmで遠心し、フィコール（ficol
l）層上のPBMCのバンドを採取し、別の15ml遠心管に移
した。HBSS（5ml）を加え、次いで混合物を10分間1200r
pmで遠心した。PBMC250〜300μｌ等価を含有する得られ
たペレットを2mlのスクリューキャップ付微量管に移
し、−70℃で保存した。
約２〜３×106cell/ml含有のPBMC試料（1ml）をエッペ
ンドルフ微量遠心管に入れ、10分間14,000rpmで遠心し
た。上澄みを廃棄し、ペレットを「TE」緩衝液（1ml）
に懸濁させた。この試料を10分間100℃で加熱し、次い
で２秒間14,000rpmで遠心した。上澄試料（50μｌ）を
下記のポリメラーゼ連鎖反応混合物100mlと混ぜた。増
幅は下記のように行った。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は次のものを含んでいた：
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝剤
（pH8、10ミリモル濃度）、塩化カリウム（50ミリモル
濃度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）、ゼラチ
ン（100μg/ml）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸
類（dNTP、各0.17ミリモル濃度）およびサーマス・アク
アティカス（Thermus aquaticus）から単離されたDNA
ポリメラーゼ（7.5単位）。使用したプライマー類（各
１マイクロモル濃度）は次の核酸配列を有していた： ５′−ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT−３′ ５′−Ｘ−TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC−３′ 上式中、Ｘは、国際公開WO89/02931号公報に記載される
ような核酸配列に結合し調製されたビオチンテトラエチ
レングリコール・スペーサーを表す。
反応混合物とPBMC画分を混合し、次いで35サイクルのポ
リメラーゼ連鎖反応によって増幅させた〔繰り返しサイ
クルは、0.5分間97℃（変性）、0.5分間55℃（ハイブッ
ト化）および15分間70℃（プライマーエクステンション
生成物の形成）〕。アリコート（６μｌ）を抜き取り、
FMA Bio Products由来の４％アガロースゲル〔３％ NuS
ieve（商品名）および１％Seakem（商品名）〕にかけ
た。このゲルは、水中エチジウムブロミド溶液（10mg/m
l）４μｌで予め染色した。ゲルを１時間120ボルトで電
気泳動し、次いで写真をとりバンドを可視化した。結果
は、PBMC画分からのHIV−I DNAの単離と増幅を表す強い
バンドを示した。HIV−I DNAを含まない既知の対照溶液
からは全くバンドが見られなかった。
例 2:全血由来のβ−グロビンDNAの抽出および検出 この例は、患者から得られ、次いで濾紙上にスポットし
そして乾燥された全血由来のヒトβ−グロビンDNAの抽
出および検出を具体的に説明する。
新生児から全血試料（50μｌ）を得て、標準的な濾紙上
にスポットし、次いで４時間室温で空気乾燥した。乾燥
した血液の円形スポットを紙支持体が付着したまま切り
出し、次いで塩化ナトリウム（0.9重量％）溶液中デキ
ストラン（３重量％）およびTriton（商品名）Ｘ−100
（10重量％）溶液に加えた。得られた混合物を10秒間渦
巻き攪拌し、次いで５分間118℃で加熱した。加熱混合
物を0.45μｍのフィルターを介して濾過し、濾液（10〜
20μｌ部）をポリメラーゼ連鎖反応増幅処理に使用し
た。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は次のものを含む：塩化カ
リウム（0.05モル濃度）、塩化マグネシウム（2.5ミリ
モル濃度）、ゼラチン（100μg/ml）、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン塩酸（pH8、0.01モル濃
度）、デオキシリボヌクレオシド類（dNTP、各0.175ミ
リモル濃度）およびサーマス・アクアティカスから単離
されたDNAポリメラーゼ（８単位）。プライマー類（各
0.2マイクロモル濃度）は次のヌクレオチド配列を有す
る： ５′−ACACAACTGTGTTCACTAGC−３′ ５′−CAACTTCATCCACGTTCACC−３′ 前記反応混合物（94μｌ）を抽出した全血溶液（10〜20
μｌ）と混合し、増幅は30サイクル行った〔繰り返しサ
イクル:0.5分間95℃（変性）、0.5分間55℃（ハイブッ
ト化）および１分間70℃（プライマーエクステンション
生成物の形成）〕。
アリコート（５μｌ）を抜き取り、ゲル電気泳動を使用
してアッセイし、次いでエチジウムブロミドで染色し
た。試験結果は、新生児試料から得られたDNAが成功裏
に単離および増幅することを表す強いバンドを示した。
ヒトβ−グロビンDNAを含まない既知の負対照はバンド
を示さなかった。
例 3:全血由来のヒト白血球抗原DNAの抽出および検出 この例は、本発明の方法を使用する全血に由来するヒト
白血球抗原DNAの抽出を具体的に説明する。
患者由来の全血試料（100μｌ）を1.5mlのエッペンドル
フ管に置き、次いでデキストラン（３重量％）および塩
化ナトリウム（0.9重量％）を含有する溶液（250μｌ）
を加え、引き続きこれらの管を反転させることによって
十分攪拌した。次に、５分間沸騰水で加熱した後、10秒
間遠心した。上澄を採取し、清浄な1.5mlのエッペンド
ルフ管に入れた。アリコートを採取し、下記のポリメラ
ーゼ反応混合物と混合し、下記のように増幅させた。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、塩化カリウム（0.05モ
ル濃度）、塩化マグネシウム（2.5ミリモル濃度）、ゼ
ラチン（100μg/ml）、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝剤（pH8、0.01モル濃度）、デオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸類（dNTP、各0.175ミリモル濃
度）、サーマス・アクアティカスから単離されたDNAポ
リメラーゼ（８単位）を含めた。プライマー類（24μ
ｌ、各10マイクロモル濃度）は下記のようなヌクレオチ
ド配列を有していた： ５′−GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG−３′ ５′−CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG−３′ 前記反応混合物（94μｌ）を抽出した全血溶液（10μ
ｌ）と混合し、増幅反応は30サイクル行った〔次のサイ
クルが繰り返えされた:0.5分間90℃（変性）、0.5分間5
5℃（ハイブッド化）および１分間70℃（プライマーエ
クステンション生成物の形成）〕。
アリコート（５μｌ）を抜き取り、ゲル電気泳動および
エチジウムブロミド染色を使用してアッセイした。結果
は、試料からヒト白血球抗原NDAが成功裏に抽出および
増幅することを表す試料に対する強いバンドを示した。
このようなDNAを含まない既知の対照は全くバンドを示
さなかった。
〔発明の効果〕
この発明の抽出方法は、全血または、特にそれらから得
られる末梢血単核細胞画分（PBMC）からDNAを抽出する
ことが迅速であり、かつ有効である。この方法は、当該
技術分野で既知の冗長で複雑なコストのかかる手順を避
けて数分で実施することができる。さらに、望ましくな
い有機溶媒を必要とせず、この方法は、例えばあるタイ
プの一体となった容器で自動化しやすい。高価な溶解酵
素（例えば、プロテイナーゼＫ）の使用も不要である。
この発明の実施は、たとえAIDSや他のウイルス感染症の
ような感染症のごとく核酸が非常に少量存在する場合で
あっても、その核酸を得ることを可能にすることが明ら
かである。
これらの利点は、単に、少なくとも２分間そして一般に
は15分間未満水の沸点またはその付近でPBMC画分を加熱
することによって達成される。この簡単な工程は、DNA
を含むことが最も適する細胞物質からDNAを抽出する上
で望ましい効果を奏し、しかも後の増幅または検出に向
けられる相補的鎖を変性する。抽出されたDNAは、適当
な方法を使用して被検体から分離することができる。ヘ
モグロビン（増幅を妨害する可能性がある）や増幅試薬
と不適合な全血成分はこの方法で除去される。
また、この発明は、煮沸しヘモグロビンや他の不要な全
血成分を除去した後でさえも検出可能である量でDNAが
存在するような場合には、全血由来のDNAを抽出する手
段も提供する。全血被検体は、煮沸工程前に塩と多糖類
を含む希釈組成物と混合される。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】末梢血単核細胞の水性試料に由来する核酸
    の迅速抽出方法であって、 A.感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有することが
    予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜15分間温度
    80〜120℃で加熱して、その試料中の細胞を溶解してそ
    の細胞由来の核酸を放出する工程、および B.前記加熱試料からその核酸を回収する工程、のみから
    なる方法。
  2. 【請求項２】ポリメラーゼ連鎖反応を使用する所定の核
    酸の増幅方法であって、 A.（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有する
    ことが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜15分
    間温度80〜120℃で加熱して、その試料中の細胞を溶解
    してその細胞由来の核酸を放出する工程、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、のみ
    からなる抽出工程ならびに B.ポリメラーゼ連鎖反応を使用して回収した核酸を増幅
    する工程、を含んでなる方法。
  3. 【請求項３】２つの相補的鎖を有する核酸の検出方法で
    あって、 A.（１）感染体またはヒトゲノム由来の核酸を含有する
    ことが予測される末梢血単核細胞の水性試料を２〜15分
    間温度80〜120℃で加熱して、その試料中の細胞を溶解
    してその細胞由来の核酸を放出する工程、および （２）前記加熱試料からその核酸を回収する工程、のみ
    からなる抽出工程、 B.その回収された変性核酸をその核酸の分離された鎖に
    相補的である第一プライマーおよび第二プライマーと接
    触させて、これらのプライマーと相補的鎖のハイブリッ
    ド生成物を形成する工程、 C.ハイブリッド生成物における前記プライマーの第一お
    よび第二エクステンション生成物が、それらの相補体か
    ら分離された場合にこれらのプライマーのエクステンシ
    ョン生成物の合成用鋳型として機能しうるそれらのエク
    ステンション生成物を形成する工程、 D.これらのプライマーエクステンション生成物が合成さ
    れた鋳型からそれらを分離する工程、 E.分離された抽出生成物および所定の核酸を追加の第一
    プライマーおよび第二プライマーと接触させ、相補的生
    成物を形成するために前記核酸の増幅をもたらす工程、 F.工程Ｅで形成された相補的生成物からそれらのプライ
    マーエクステンション生成物を分離する工程、ならびに G.水性試料における核酸存在の指標として増幅された核
    酸を検出する工程、を含んでなる方法。
  4. 【請求項４】全血被検体に由来する核酸の迅速抽出方法
    であって、 A.全血被検体を１種以上の多糖類を含む塩溶液と接触さ
    せる工程、 B.工程Ａで得られた混合物を２〜15分間温度80〜120℃
    で加熱して、混合物中の細胞を溶解してその細胞から核
    酸を放出する工程、および C.その加熱混合物から前記核酸を回収する工程、のみか
    らなる方法。
JP2097789A 1989-04-17 1990-04-16 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法 Expired - Lifetime JPH072120B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33943789A 1989-04-17 1989-04-17
US339437 1989-04-17
US07/406,222 US5334499A (en) 1989-04-17 1989-09-12 Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction
US406222 1989-09-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02292298A JPH02292298A (ja) 1990-12-03
JPH072120B2 true JPH072120B2 (ja) 1995-01-18

Family

ID=26991623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2097789A Expired - Lifetime JPH072120B2 (ja) 1989-04-17 1990-04-16 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5334499A (ja)
EP (2) EP0393744B1 (ja)
JP (1) JPH072120B2 (ja)
KR (1) KR900016463A (ja)
AT (2) ATE162222T1 (ja)
CA (1) CA2013316A1 (ja)
DE (2) DE69016079T2 (ja)
DK (1) DK0620282T3 (ja)
FI (1) FI901917A0 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2481791A1 (en) 2011-01-31 2012-08-01 Tokyo University of Agriculture & Technology Nucleic acid extraction method

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
WO1991008308A1 (en) * 1989-11-30 1991-06-13 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
EP0534640B1 (en) * 1991-09-23 1996-10-02 Pfizer Inc. Process for detecting specific mRNA and DNA in cells
AU664050B2 (en) * 1991-12-18 1995-11-02 Becton Dickinson & Company Process for lysing mycobacteria
US5686238A (en) * 1992-02-10 1997-11-11 Baxter International Inc. Method and device for testing blood units for viral contamination
US5629154A (en) * 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5837453A (en) * 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
EP0590327B1 (en) * 1992-09-11 2003-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of nucleic acids in blood
IL110463A0 (en) * 1993-08-13 1994-10-21 Du Pont In situ extraction of microbial DNA
JP3451667B2 (ja) * 1993-08-24 2003-09-29 東ソー株式会社 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法
US6043032A (en) * 1993-09-22 2000-03-28 Tosoh Corporation Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences
GB2282138B (en) * 1993-09-28 1997-09-03 Tosoh Corp Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences
GB9323305D0 (en) * 1993-11-11 1994-01-05 Medinnova Sf Isoaltion of nucleic acid
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5622822A (en) 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5705366A (en) 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
DE19530132C2 (de) * 1995-08-16 1998-07-16 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien
WO1997042344A1 (de) * 1996-05-03 1997-11-13 Institut Für Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens
AU7404498A (en) * 1996-11-27 1998-06-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A rapid method for diagnosing the various forms of thalassemia
US5922288A (en) * 1997-05-29 1999-07-13 Herst; C. V. Taylor Device for isolating a component of a physiological sample
US6914137B2 (en) * 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
DE69805649T2 (de) * 1997-12-06 2002-12-05 Dna Res Innovations Ltd Isolierung von nukleinsäuren
JPH11332562A (ja) * 1998-04-28 1999-12-07 Ortho Clinical Diagnostics Inc 組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法
EP1147226B1 (en) * 1999-01-27 2013-01-23 Folim G. Halaka Materials and methods for the purification of polyelectrolytes
AU3377500A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Myriad Genetics, Inc. Method for extracting dna from dried specimens
US6469159B1 (en) 1999-04-26 2002-10-22 Robert T. Belly Methods for extracting nucleic acids from tissue samples and paraffin-embedded tissues
CA2370122C (en) * 1999-05-04 2011-04-26 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Rapid and efficient capture of dna from sample without using cell lysing reagent
US7262006B1 (en) 2000-05-01 2007-08-28 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Rapid and efficient capture of DNA from sample without using cell lysing reagent
FR2822477B1 (fr) * 2001-03-23 2003-08-08 Inst Nat Sante Rech Med Methode de genotypage sans extraction de l'adn
US20040106109A1 (en) * 2001-10-02 2004-06-03 Belly Robert T Detection of ras mutations
WO2003062462A2 (en) 2002-01-16 2003-07-31 Dynal Biotech Asa Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
US20040014097A1 (en) * 2002-05-06 2004-01-22 Mcglennen Ronald C. Genetic test apparatus and method
US8594948B2 (en) * 2002-09-18 2013-11-26 Ronald C. McGlennen Apparatus and methods for medical testing
US20060278242A1 (en) * 2005-03-23 2006-12-14 Mcglennen Ronald C Apparatus and methods for medical testing
WO2004094634A1 (ja) * 2003-04-22 2004-11-04 Arkray Inc. 核酸の単離方法ならびに核酸単離用のキット及び装置
EP2407243B1 (en) 2003-07-31 2020-04-22 Handylab, Inc. Multilayered microfluidic device
US8852862B2 (en) 2004-05-03 2014-10-07 Handylab, Inc. Method for processing polynucleotide-containing samples
WO2006004611A2 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Invitrogen Corporation Separation of nucleic acid
JP4765058B2 (ja) * 2004-12-13 2011-09-07 国立大学法人 岡山大学 核酸修飾前の検体の前処理方法
WO2006064737A1 (ja) * 2004-12-13 2006-06-22 National University Corporation Okayama University 遺伝子のメチル化検出方法及びメチル化検出による新生物の検査方法
US9505846B2 (en) 2005-01-28 2016-11-29 Life Technologies Corporation Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases
US20060264714A1 (en) * 2005-03-23 2006-11-23 Mcglennen Ronald C Apparatus and methods for medical testing
US8628918B2 (en) * 2005-05-09 2014-01-14 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
US8632970B2 (en) 2005-05-09 2014-01-21 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
WO2006124771A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Panomics, Inc. Multiplex branched-chain dna assays
ES2434915T3 (es) * 2005-06-20 2013-12-18 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Detección múltiplex de ácidos nucleicos
US7927798B2 (en) * 2005-10-05 2011-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
ES2276630B1 (es) * 2005-12-13 2008-06-16 Universitat Autonoma De Barcelona Metodo y kit para genotipificacion de hla-b basados en la pcr en tiempo real.
US11806718B2 (en) 2006-03-24 2023-11-07 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
US7998708B2 (en) 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US10900066B2 (en) 2006-03-24 2021-01-26 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US8883490B2 (en) 2006-03-24 2014-11-11 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
ES2692380T3 (es) 2006-03-24 2018-12-03 Handylab, Inc. Método para realizar PCR con un cartucho con varias pistas
US8039234B1 (en) * 2006-05-22 2011-10-18 Applied Biosystems, Llc Methods, panels of identification markers, and kits for identifying forensic samples
KR100785017B1 (ko) * 2006-06-05 2007-12-12 삼성전자주식회사 혈액으로부터 핵산을 증폭하는 방법
EP2035836B1 (en) * 2006-07-03 2013-02-27 Thermo Finnigan LLC Device for processing whole blood for analyte determination
JP2008167722A (ja) * 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
ES2648798T3 (es) 2007-07-13 2018-01-08 Handylab, Inc. Materiales de captura de polinucleótidos y métodos de utilización de los mismos
US8182763B2 (en) 2007-07-13 2012-05-22 Handylab, Inc. Rack for sample tubes and reagent holders
US8287820B2 (en) 2007-07-13 2012-10-16 Handylab, Inc. Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system
US8105783B2 (en) 2007-07-13 2012-01-31 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge
US9186677B2 (en) 2007-07-13 2015-11-17 Handylab, Inc. Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples
US8895240B2 (en) * 2008-05-19 2014-11-25 E I Du Pont De Nemours And Company Method, kit and system for collecting and processing samples for DNA and RNA detection
WO2012039422A1 (ja) 2010-09-22 2012-03-29 株式会社カネカ 核酸の検出方法及びデバイス、キット
ES2562821T3 (es) 2010-10-21 2016-03-08 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Método ultrasensible para la detección in situ de ácidos nucleicos
EP2697657B8 (en) 2011-04-15 2017-08-16 Becton, Dickinson and Company Scanning real-time microfluidic thermocycler and methods for synchronized thermocycling and scanning optical detection
EP2773892B1 (en) 2011-11-04 2020-10-07 Handylab, Inc. Polynucleotide sample preparation device
US20180135108A1 (en) * 2014-01-20 2018-05-17 Board Of Trustees Of Michigan State University Method for detecting bacterial and fungal pathogens
US10260111B1 (en) 2014-01-20 2019-04-16 Brett Eric Etchebarne Method of detecting sepsis-related microorganisms and detecting antibiotic-resistant sepsis-related microorganisms in a fluid sample
CN108368543B (zh) 2015-10-12 2023-06-13 领先细胞医疗诊断有限公司 高噪声样品中原位检测核苷酸变体及相关的组合物和方法
BR102018003245A2 (pt) 2018-02-20 2019-09-10 Fundação Oswaldo Cruz oligonucleotídeo, conjunto de oligonucleotídeos, método para detecção simultânea de neisseria meningitidis, streptococcus pneumoniae e haemophilus influenzae, e, kit.
US20220396824A1 (en) * 2019-09-24 2022-12-15 Genepath Diagnostics Inc. Composition and method for improving detection of biomolecules in biofluid samples
CN112458051A (zh) * 2020-11-11 2021-03-09 海南优尼科尔生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞的提取收集方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1202743B (de) * 1960-12-28 1965-10-14 Toyo Boseki Verfahren zur Extraktion von Ribonucleinsaeure aus Hefe
US4515890A (en) * 1982-11-08 1985-05-07 Abbott Laboratories Immunoassay of terminal deoxynucleotidyl transferase
GB8331071D0 (en) * 1983-11-22 1983-12-29 Karayiannis P Assay for dna/rna
US4750982A (en) * 1985-03-21 1988-06-14 Lifecodes Corp. Process and apparatus for purifying and concentrating DNA from crude mixtures containing DNA
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0240191A3 (en) * 1986-03-13 1989-10-25 Seiko Instruments Inc. Method of isolating dna contained in a virus or cell
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
EP0245945B1 (en) * 1986-04-11 1993-11-10 Applied Biosystems, Inc. Automated nucleic acid extractor

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2481791A1 (en) 2011-01-31 2012-08-01 Tokyo University of Agriculture & Technology Nucleic acid extraction method
US8877918B2 (en) 2011-01-31 2014-11-04 Tokyo University Of Agriculture And Technology Nucleic acid extraction method

Also Published As

Publication number Publication date
DE69031957D1 (de) 1998-02-19
EP0393744A1 (en) 1990-10-24
DE69016079D1 (de) 1995-03-02
FI901917A0 (fi) 1990-04-17
EP0620282A1 (en) 1994-10-19
ATE117377T1 (de) 1995-02-15
CA2013316A1 (en) 1990-10-17
ATE162222T1 (de) 1998-01-15
EP0393744B1 (en) 1995-01-18
DE69016079T2 (de) 1995-09-14
DK0620282T3 (da) 1998-09-14
JPH02292298A (ja) 1990-12-03
DE69031957T2 (de) 1998-06-10
US5334499A (en) 1994-08-02
EP0620282B1 (en) 1998-01-14
KR900016463A (ko) 1990-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH072120B2 (ja) 全血またはｐｂｍｃ画分由来の核酸の抽出、増幅および測定方法
JP2533969B2 (ja) タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法
US5935825A (en) Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences
JP2552691B2 (ja) 生物学的試料中の核酸評価のためのカオトロピック方法
EP0456304B1 (en) Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by avidin-biotin cleavage
US6274308B1 (en) Method for purifying nucleic acids
JP4354537B2 (ja) 弱塩基性ポリマーを用いる核酸の捕捉および選択的放出方法ならびにその増幅方法
EP0393743B1 (en) Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
JPH0398586A (ja) プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法
EP0795751A2 (en) Whole blood sample preparation for polymerase chain reaction using ammonium chloride and a carboxylic acid or metal carboxylate for selective red blood cell lysis
WO1991008308A1 (en) A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
JPH09238687A (ja) 核酸合成法
KR920007664B1 (ko) 핵산의 정제, 증폭 및 검사방법
EP0751226B1 (en) Process for amplifying nucleic acid sequences
EP0989192A2 (en) Method for synthesis of nucleic acids
JP4503712B2 (ja) 核酸合成法
JP4186270B2 (ja) 核酸合成法
CA2024978A1 (en) Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction
JPH07298897A (ja) ２つの標識プライマーを用いた標的核酸の生成、増幅及び検出方法並びにそれらを含有するｐｃｒキット
JPH0494700A (ja) Ｃ型肝炎ウイルスおよびその関連核酸の高感度検出法ならびにプライマー用オリゴｄｎａセット
JPH0491800A (ja) Ｃ型肝炎ウイルスおよびその関連核酸の簡便高感度検出法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080118

Year of fee payment: 13

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090118

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090118

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100118

Year of fee payment: 15

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118

Year of fee payment: 16

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118

Year of fee payment: 16