JPH0491800A - Ｃ型肝炎ウイルスおよびその関連核酸の簡便高感度検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はＣ型肝炎ウィルス（以後ＨＣＶと略する）の関
連核酸の検出法に関する。更に詳しくは微量の検体を蛋
白変性剤にて処理後、除蛋白して得られた核酸からｃＤ
ＮＡを合成し、次いでＤＮＡＤＮＡポリメラーゼを用い
て、オリゴＤＮＡをプライマーとしてｃＤＮＡを増幅す
ることを特徴とするＣ型肝炎ウィルスおよびその関連核
酸を簡便高感度に検出する方法に関する。

〈従来技術及び発明が解決しようとする課題〉ウィルス
性肝炎はＡ型、Ｂ型、デルタ（Ｄ）型のほか、非Ａ非Ｂ
型があり、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスには非経口伝播タイ
プと経口伝播タイプが存在すると推定されている。これ
らの中でＢ型肝炎および非経口伝播タイプの非Ａ非Ｂ型
肝炎において慢性肝炎が知られており、かかるタイプの
ウィルス肝炎の予防治療が現在重要な課題となっている
。Ｂ型肝炎においては既に原因ウィルスが特定され診断
・予防方法がほぼ確立され今後新たな発症もかなり少な
くなるものと考えられる。一方、非経口伝播タイプの非
Ａ非Ｂ型肝炎については、主に輸血により感染し、現在
受血者の１５〜１７％の血清肝炎発症者（日本において
年間１５〜３０万人く推定））の９５％が、この非経口
伝播タイプの非Ａ非Ｂ型肝炎と考えられている。更にこ
れらの非Ａ非Ｂ型肝炎発症者のうち約５０％は慢性肝炎
へ移行し１０〜２０年後には２０％の患者において肝硬
変・肝癌への転帰を取るものと推定されている。更に該
非Ａ、ｌｐ　Ｂ型肝炎は輸血のほかに、複数人に共通で
針を使用した予防接種あるいは何等かの血液・体液など
を介する行為により、非Ａ非Ｂ型肝炎のウィルス保持者
（日本において推定４００万人）および慢性肝炎患者（
日本において推定９０万人）が蓄積増加してきている。

現在特に輸血による非Ａ非Ｂ型肝炎の新たなる患者の発
生を防ぐ有効な方法が求められている。その一つの方法
として輸血に使いうる血液の安全性の一目安として従来
トランスアミナーゼＧＰＴ値が３５以下としていた基準
値を２５以下とした。しかしながらＧＰＴ値２５以下の
血液のみ一応安全としてもなお輸血患者の１５％は血清
肝炎となる故に、より有効な安全器の判定方法が求めら
れている。１９８７年米国０カイロン社によって輸血性
非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウィルスの一種と考えられるＣ型
肝炎ウィルスが発表されたくヨーロッパ特許０３１８２
１６　、１９８９年５月３１日公開）。該発表によると
輸血性非Ａ非Ｂ型肝炎を発症せしめたチンパンジーの血
清より抽出した核酸を遺伝子工学的手法により分離増幅
しタンパク質を発現せしめ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と
反応するものを選抜することにより原因ウィルスのＣ型
肝炎ウィルス（以後“ＨＣＶ″と略称する〉を特定し、
特定の抗原タンパク質を用いて血清と反応するものはＣ
型肝炎と判定されるとしている。更にカイロン社発表の
具体例のＣ型肝炎診断キットにおいてはＨＣＶの非構造
蛋白抗原を用いて患者血清中に存在するＣ型肝炎ウィル
ス抗体を検出するシステムによっているために、ＨＣＶ
感染初期に既にＨＣＶ保持者となっているにも拘らず、
ＨＣＶ抗体陰性と判定される可能性がある。このような
血清についてはｌ（ＣＶ含有面でありなからＨＣＶ抗体
陰性の判定により一応輸血に使用しても安全であると誤
って判断される。該発表ではＨＣＶのジェノミック核酸
は一本鎖ＲＮＡであり、その塩基配列の一部も記載され
ており、Ｃ型肝炎の診断のための特定の塩基配列につい
ても一部述べている。

しかし−重鎖ＲＮＡをゲノムとするウィルスにおいては
塩基配列がかなり変異していることが多く、ＨＣＶにお
いても同様と考えられることがらＨＣ■関連核酸を高感
度に検出する方法については、未だ不十分と言わざるを
得ない。

以上の記述からも明らかのように、先述のカイロン社発
表の特定抗原および塩基配列が全ての非Ａ非Ｂ型肝炎の
診断に有効とは考えられず、なお検討が必要であること
は明白である。

く課題を解決するための手段〉 検体からの核酸の調整方法には、プロテネスにのごとき
タンパク分解酵素を用いて行うことが一般的であるが、
この場合比較的多量のサンプルを必要とする欠点があっ
た。本発明においてはかかる欠点をタンパク変性剤を用
いることにより微量検体からでも高感度かつ簡便に検出
する方法を提供するものである。即ち、本発明は非経口
的に怒染伝播する非Ａ非Ｂ型肝炎の一種であるＨＣＶに
関連する核酸を微量の検体から簡便高感度に検出する方
法に関する。更に詳しくは、微量の検体を蛋白変性剤に
て処理後、除蛋白して得られた核酸からｃＤＮＡを合成
し、ついでｃＤＮＡに対し、ＤＮＡポリメラーゼおよび
プライマーＤＮＡセットを用いて、ｃＤＮＡを増幅する
ことを特徴とするＣ型肝炎ウィルスおよびその関連核酸
を簡便高感度に検出する方法である。

本発明においてはプライマーＤＮＡセットとして下記Ｄ
ＮＡ群１およびＤＮＡ群２よりそれぞれ少なくとも一種
選ばれなオリゴＤＮＡを用いることが好適である。

ＤＮＡ群１： オリゴＤＮＡＩ　　（５’−ＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＧＧ
ＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＴＴ−３’）オリゴＤＮＡ３　　
（５’−ＡＣＣＴＧＧＴＡＧＣＧＴＡＣＣＡＡＧＣＣ−
３’オリゴＤＮＡ５　　（５’−ＣＴＧＣＴＴＧＴＧＧ
ＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣ−３’オリゴＤＮＡ７　　（５’
−ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＣＡ−３オリ
ゴＤＮＡ９　　５’−ＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴ
ＴＣＣＴＴ−３’オリゴＤＮＡＩＩ　＋５’　−ＡＣＣ
ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴ−３’オリゴＤＮ
Ａ１３　（５’　−ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＧ
ＡＴＴＴ−３’　）オリゴＤＮＡ２１　＜５’　−ＧＧ
ＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＴ−３’　）オリ
ゴＤＮＡ２３　（５’　−ＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣ
ＴＧＴＣ−３’　）オリゴＤＮＡ２５＋５’　−ＴＴＣ
ＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧ−３’　）ＤＮＡ群２
： オリゴＤＮＡ２　　５’−ＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧＴＴＧ
ＡＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧ−３’）オリゴＤＮＡ４
　　（５’−ＴＡＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴ
Ｃ−３’オリゴＤＮＡ６　　（５’−ＴＣＣＡＣＡＣＧ
ＴＧＣＡＧＴＴＧＣＧＣＴ−３’オリゴＤＮＡｌ０　（
５’　−ＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＡ−
３’むゴＤＮＡ１２　＋５’　−ＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣ
ＡＴＧＡＴＧＴＡＴＴ−３’オリゴＤＮＡ１４　（５’
　−ＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴ−３’
オリゴＤＮＡ２２　（５’　−ＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣ
ＴＡＣＧＡＧＡＣＣ−３’オリゴＤＮＡ２４　５’−Ｔ
ＴＴＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３’）オリゴＤ
ＮＡ２６　５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣ
ＡＧＴ−３１本発明においては、）ＩＣＶ関連核酸の存
在を診断しようとする対象検体は微量の血清または肝臓
組織である。血清の場合１〜５００μ（、特に５〜１０
０μｐである。肝臓組織の場合１〜５００μｇ、特に５
〜１００μｇである。

本発明ではまず微量検体を蛋白変性剤にて処理後、除蛋
白した水溶液を調製する蛋白変性剤処理法としては、塩
酸グアニジンあるいはグアニジンチオシアネートの如き
変性剤による処理方法、デオキシコール酸ナトリウム塩
、ラウリル硫酸ナトリウム塩、あるいはＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウム塩の如きイオン性の界面活性性の
変性剤による変性処理、更にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
（ポリエチレングリコールモノ−ｐ−インオクチルフェ
ニルエーテル）　、　Ｂｒ１ｊｉ−５８＜ポリオキシエ
チレンセチルアルコールエーテル）　、　Ｂｒ１ｊｉ−
３５（ポリオキシエチレンラウリルアルコールエーテル
）７またはＴｗｅｅｎ　　（ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミ
テート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレー
ト等）の如き中性の界面活性剤による変性処理方法があ
る。

塩酸グアニジンあるいはグアニジンチオシアネートの如
き変性剤による処理の場合は、これらの変性剤の検体処
理溶液で終濃度０．１〜ＩＯＭ、好ましくは１〜６Ｍと
なるように添加する。デオキシコール酸ナトリウム塩、
ラウリル硫酸ナトリウム塩、あるいはＮ−ラウロイルサ
ルコシンナトリウム塩の如きイオン性の界面活性性の変
性剤による変性処理の場合は、これらの界面活性性の変
性剤を検体処理溶液での終濃度が０．０５〜２０％、好
ましくは０，５〜１０％となるように添加する。

Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ポリエチレングリコールモ
ノ−ｐ−インオクチルフェニルエーテル）　、　Ｂｒ１
ｊｉ−５８〈ポリオキシエチレンセチルアルコールエー
テル）、　Ｂｒ１ｊｉ−３５＜ポリオキシエチレンラウ
リルアルコールエーテル）、またはＴｗｅｅｎ　　（ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノステアレート等）の如き中性の界面活性剤
による変性処理の場合、これらの界面活性剤の終濃度を
０．２〜３０％、好ましくは０．５〜２０％となるよう
にする。

また検体からの蛋白成分の変性をより効果的にするため
に、上記の各種の変性剤の単独使用の外、二種以上の併
用は好ましいものである。更に蛋白変性溶液にβ−メル
カプトエタノールの如き蛋白変性剤の添加もまた好まし
いものであり、かかる変性剤の好ましい添加量として終
濃度０．１〜２％である。

また検体からの蛋白成分の変性処理温度は、核酸、特に
−重鎖のＲＮＡが化学的な変性を受けない条件であれば
何等特別な制限を受けないが、１０〜９８℃で行える。

変性処理時間として１秒〜２時間、好ましくは１０秒〜
３０分間である。

本発明においては蛋白変性剤にて処理後、次に除蛋白を
行う。除蛋白はフェノールまたはフェノール／クロロフ
ォルム混合液さらに必要な場合イソアミルアルコールを
フェノールの１／１０〜１／２０程度添加した混合液に
て１回以上抽出操作を行い、水相を回収し３Ｍ酢酸ナト
リウムの如き適当な塩溶液を１０分の１容量添加後つい
てエタノールを２〜３倍容量またはインプロパツールを
等容量加えて高速遠心して沈澱として核酸＋１１を得る
ことができる。本発明においては、上記のフェノールあ
るいはフェノール／クロロフォルムによる抽出除蛋白操
作後得られた水相に対して、り四ロフォルムまたはヂエ
チルエーテルの如き難水溶性の溶剤にて水相からフェノ
ールを除去するのみでも核酸の水溶液として得ることが
できる。

本発明においてはこのようにして得た核酸に対しＤＮＡ
オリゴマーまたはＤ　Ｎ　Ａオリゴマーの混合物、好ま
しくはＤＮＡのテトラマールオクタマーの混合物、更に
好ましくはＤＮＡのヘプタマールペンタマーの混合物、
特に好ましくはＤＮＡヘキサマーの混合物、例えばベー
リンガー・マンハイム山之内■の゛ランダム′″ｐ（ｄ
Ｎ）６の如きものを用いてｃＤＮＡを合成する。さらに
該ｃＤＮＡを合成するに際して逆転写酵素を使用する。

逆転写酵素としては一般市販のものが使用でき特定の制
限はないが、ＡＭＶ　（エイビアン・ミエロブラストシ
・ウィルス）の逆転写酵素、Ｒ３Ｖ（ラウス・サルコー
マ・ウィルス）の逆転写酵素。

Ｍ−ＭＬＶ（モロニー・ミュリーン・リュウケミア・ウ
ィルス）の逆転写酵素などが、使用可能である。このな
かでもＭ−ＭＬＶの逆転写酵素は合成されなｃＤＮＡに
対してエンドヌクレアーゼ活性がなくかつＲＮａｓｅＨ
酵素活性が低いので好ましく使用される。これらの逆転
写酵素は各々の酵素の供給者の使用能書に従って使用し
ｃＤＮＡを調製することができる。ｃＤＮＡを合成する
際に使用したランダムなりＮＡオリゴマーの過剰量を必
要ならば、一般に知られたアルコール沈澱やゲル濾過の
如き操作により除去する。

本発明においては、次にＤＮＡポリメラーゼを用いてｃ
ＤＮＡの増幅を行う。使用するＤＮＡポリメラーゼとし
ては大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■。

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは耐熱ＤＮＡポリメラ
ーゼで知られる７ｔｈＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。これら
のＤＮＡポリメラーゼは夫々供給者の使用能書に従って
使用し得る。これらのＤＮＡポリメラーゼのうち、耐熱
ＤＮＡポリメラーゼで知られるＴｔｈＤＮＡポリメラー
ゼまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼが好ましい。使用す
る７ｔｈＤＮＡポリメラーゼは東洋紡製（Ｎｏ、　ＴＴ
Ｈ−１０３）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＰｒｏｍｅ
ｇａ社〈例えばｎｏ、　１０１４２３）、ボクスイ・ブ
ラウン社、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、宝酒
造社などから夫々販売されているものを使用できる。こ
れらのＤＮＡポリメラーゼのうちＴｔｈＤＮＡポリメラ
ーゼ、　Ｐｒｏｍｅｇａ社のＴ　ａ　ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼが酵素活性が高いので一層好ましい。

本発明において、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡの
増幅を行うに際して使用するブライマーとしてオリゴＤ
ＮＡセットを用いる。オリゴＤＮＡセットとしては前記
のＤＮＡ群１のオリゴＤＮＡのなかの少なくとも一種お
よびＤＮＡＮ２Ｏ２リゴＤＮＡのなかの少なくとも一種
の組合せのセットが好適である。プライマーとしてどこ
を選定するかによって検出状況が変化し、場合によって
は検出不能となる故にこの選定組合せは大事である。

本発明においてオリゴＤＮＡセットとして好ましい組合
せは、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　１１−１０のセット、オリゴ
Ｄ　Ｎ　Ａ　１１−２のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　１
１−４のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　１１−１２のセッ
ト、オリゴＤＮＡ１ｌ−１４のセット、オリゴＤ　Ｎ　
Ａ　１３−２のセットオリゴＤ　Ｎ　Ａ　１３−４のセ
ット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　１３〜１２のセット、オリゴ
Ｄ　Ｎ　Ａ　１３−１４のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　
７−２のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　７−４のセットオ
リゴＤＮＡ７−１２のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　７−
１４のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　３−１０のセット、
オリゴＤＮＡ３−４のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　３−
１２のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　２１−２２のセット
、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　２１−２６のセット、オリゴＤ　
Ｎ　Ａ　２１−２４のセット、オリゴＤＮＡ２３−２２
のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　２３−２６のセット、オ
リゴＤ　Ｎ　Ａ　２３−２４のセット、オリゴＤＮＡ　
２５−２２のセット、オリゴＤ　Ｎ　Ａ　２５−２６の
セット。

オリゴＤ　Ｎ　Ａ　２５−２４のセットである。

更に本発明においては、これらのオリゴＤＮＡのセット
の２セット以上の組合せで核酸増幅反応を実施すること
は、−層核酸の検出をよくするので好ましい。

検出はＤＮＡ発色剤にて発色させる、あるいは特定の化
合物にて標識された既知のＣ型肝炎ウィルスの増幅核酸
プローブとのハイブリダイゼーションにより行うことが
好適である。

検出は増幅させたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し次
いでエチヂウムブロマイドにて染色したものをＵＶ照射
して発色せしめ特定核酸バンドを検出する。ＤＮＡのア
ガロースゲル電気泳動・エチヂウムブロマイドによる染
色・ＵＶ照射による発色特定核酸バンドの検出の操作は
当業界一般公知の方法で実施できる。

特定ＤＮＡバンドが発色で見られないときは、再度核酸
の増幅を行うか、あるいは特定の化合物にて標識された
既知のＨＣＶの増幅核酸とのサザーンハイプリダイゼー
ションを行う。再度の核酸増幅は前記１回目の核酸増幅
で得られた水溶液の一部〈例えば１１５〜１／２０）に
対してプライマーとしてのオリゴＤＮＡは１回目増幅で
使用したと同じオリゴＤＮＡセットまたは該オリゴＤＮ
Ａのそれぞれ３′側下流に位！するオリゴＤＮＡを使用
できる。

サザーンハイプリダイゼーションを行って検出する場合
、使用するプローブ核酸としてはジゴキシゲニンあるい
はビオチンにて標識されなＨＣＶの増幅核酸を用いる。

ここで用いる７０−ブ用核酸はさきに記載したと同様の
方法でも調製できるが、検出しようとするＤＮＡと同し
領域内の塩基配列であって１５塩基以上であればよい。

ハイブリダイゼーションのプローブに使用する核酸にジ
ゴキシゲニンを標識として入れるにはベーリンガー・マ
ンハイム社製のＤＮＡラベリング・デテクション・キッ
ト（ｎｏ、　１．０９３６５７）を用いて、あるいはビ
オチンを標識として入れるにはベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリ−社製のビオチンラベリング・キットなどを用
いて、供給者の使用マニュアルに従って行うことができ
る。

また、これらの標識核酸を用いたハイブリダイゼーショ
ンは、夫々の検出システム即ちジゴキシゲニン標識の場
合は上記デテクション・キット（ｎｏ、　１０９３６５
７）にて、ビオチン標識の場合はベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−社製のＤＮＡ検出システム（ｎｏ、　８２
７９ＳＡ）を用いて、各供給者の使用能書に従って実施
し得る。

〈発明の効果〉 本発明の方法はＨＣＶの抗原抗体系によるＣ型肝炎判定
と異なりＨＣＶ関連核酸を増幅検出するので、ＨＣＶ感
染初期あるいはＨＣＶ抗体が非常に少ない場合にも高感
度にて）ＩＣＶ関連核酸を検出できるので有用な方法で
ある。

〈実施例〉 以下実施例を挙げて更に具体的に述べるが、本発明はこ
れらの実施例に限るものではない。

〈実施例１および比較例１〉 非Ａ非Ｂ型慢性肝炎と診断されかつ米国オーツ社製ＨＣ
Ｖ抗体＜ＥＬＩＳＡ）テストシステムで抗体陽性者の血
清５０μｇにグアニヂンチオシアネート水溶液（５Ｍグ
アニジンチオシアネート／２５ｍＭクエン酸ナトリウム
１０６５％サルコシル１０．２Ｍβ−メルカプトエタノ
ール）２００μｇを添加し３７℃・３０分間・１１００
ｒｐで振盪後、フェノール／り四ロフォルム（４／１　
）混合液４００μｐで３回抽出した。この水相に１０分
の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，４）、１Ｍｇグ
リコーゲン、２．５倍容のエタノールを添加し、−８０
℃。３０分間保持後、遠心して得られたペレットを７０
％エタノール次いで１００％エタノールで洗浄後、核酸
を得、これを２０μｆＪ　ＴＥ　［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　ＨＣＩ　／　１＋ｎＭ　　ＥＤＴＡ　（ＰＨ７，５）
］水溶液に溶解した。

このようにして得られた核酸のＴＥ溶液１０μρに対し
て５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ８，３）／７５ｍ
ｂｌ　　ＫＣＩ　／１０ｍＭヂチオスレイトール／　５
　ｍＭ　　ＭｇＣｂ　／　４　ｍｌｌ！燐酸ナトリウム
／１ｍＭ　　ｄＮＴＰｓ　（Ｎ＝、Ａ、Ｃ，Ｇ。

Ｔ）／１．６μｇランダムプライマー（ベーリンガー・
マンハイム社製ｎｏ、１０３４７３１）　、　０．２ｕ
／μＪ）　ＡＭＶ逆転写酵素（総量２０μｐ）となるよ
うに各成分を加え、４２°Ｃで１時間ｃＤＮＡの合成を
行った。

このようにして得られたｃＤＮＡ溶液に対して１０倍の
耐熱ＤＮＡポリメラーゼ溶液＜０．５ＭＫＣＯ，１Ｍ　
Ｔｒｉｓ　）ＩＣＩ、　１５ｍＭ　　ＮｇＣｈ　、　０
．１％ゼラチン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の
水溶液）５μρ、滅菌水２９μｆＪ　、ｄＮＴＰｓミク
スチャ−（ｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ
各々の１．２５ｍＭ溶液）の８μｇ、下記オリゴＤＮＡ
、１３および１４＜各オリゴＤＮＡ、（濃度０．１　ｕ
ｇ／１ｔｆＪ　＞を各々２．５μＪ））、更にＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｎｏ、　１０１
４２３）１．２５ユニツト、更に流動パラフィン５０μ
ｇを加え、９５℃・１分間、次いで５７℃・２分間、次
いで７２°Ｃ・３分間更にこの３段階の温度時間変化の
操作を３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間ポリメラ
ーゼ反応を行った。次に反応溶液８μρを２％アガロー
スゲル上で電気泳動しエチヂウムブロマイドで染色後、
ＵＶ照射し大きさ約４５０ｂｐのＤＮＡバンドを観察し
た。

オリゴＤＮＡ１３：　　５’−ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣ
ＡＧＴＣＧＡＴＴＴ−３’オリゴＤＮＡ１４：　　５’
−ＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴ−３’く
比較例１〉 実施例１の血清２５μ℃に対して、米国オーツ社製ＨＣ
Ｖ抗体＜ＥＬＩＳＡ）テストシステムにてＨＣＶ抗体を
検出しようとしたが、陽性の判定を明確に得ることがで
きなかった。

実施例１および比較例１からも明らかなように、本発明
の方法によれば、微少量の検体を使用して、逆転者によ
りｃＤＮＡを調製し、適当なオリゴＤＮＡセットのプラ
イマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り返し行う
ことによりＣ型肝炎のＲＮＡを検出することができ、米
国オーツ社製ＨＣ■抗体検出キットにて検出困難な検体
でもＣ型肝炎を高感度にかつ簡便に検出でき、本発明の
方法が優れた方法であることが判る。

〈実施例２および比較例２〉 非Ａ非Ｂ型慢性肝炎と診断されかつ米国オーツ社製ＨＣ
Ｖ抗体（ＥＬＩ　ＳＡ）テストシステムで抗体陽性者の
血清５μｇにグアニヂンチオシアネート水溶液＜２Ｍグ
アニジンチオシアネート１５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０）　１５　μｆＪを添加し５０℃・３分間更に９５℃
・２分間保持後、フェノール／クロロフォルム（４，／
１）混合液３０μρで３回抽出した。

この水相をヂエチルエーテル３０μｆで３回抽出し得ら
れた水相の５μｇに対して５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ（
ｐＨ８，３）　／　７５ｍＭ　ＫＣＩ／　１０ｍＭヂチ
オスレイトール１５ｍＭ　　ＭｇＣｈ　／４ｍＭｍ酸ナ
トリウム／１ｍＭｄＮＴＰｓ　（Ｎ＝Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔ）
／１．６　μｇシランムプライマー〈ベーリンガー・マ
ンハイム社製ｎ０１０３４７３１）、０．２ｕ／μρＡ
ＭＶ逆転写酵素（総量２０μρ）となるように各成分を
加え、４２℃で１時間ｃＤＮＡの合成反応を行った。

このようにして得られたｃＤＮＡ溶液１０μｇに対して
１０倍の耐熱ＤＮＡポリメラーゼ溶液＜０．５ＭＫＣｌ
、　　０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　　１５ｍＭ　　
ＭｇＣｌ。、　０．１％ゼラチン、０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００の水溶液）５μρ、滅菌水２９μρ、ｄ
ＮＴＰｓミクスチャ−（ｃｌＡＴＰｄＣＴＰ、　ｄＧＴ
Ｐ、　ｄＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液）の８ｕｆＪ　
、下記オリゴＤ　Ｎ　Ａ　１３および１４＜各オリゴＤ
ＮＡ　（濃度０．１μｆ／μ、！２）を各々２．５μｇ
）更にＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製
　ｎｏ、１０１４２３１１．２５ユニツト、更に流動パ
ラフィン５０μρを加え、９５℃・２分間処理後、次い
で９２℃・３０秒間、５５℃・１分間、７２℃・２分間
の３段階の温度・時間変化の操作を４０回繰り返し、最
後に７２℃・７分間ポリメラーゼ反応を行った。次に反
応溶液８μｇを２％アガロースゲル上で電機泳動しエチ
ヂウムブロマイドで染色後、ＵＶ照射し大きさ約４５０
ｂｐのＤＮＡバンドを観察した。

オリゴＤＮＡ１３：　　５’−ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣ
ＡＧＴＣＧＡＴＴＴ−３’オリゴＤＮＡ１４：　　５’
−ＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴ−３’〈
比較例２〉 実施例１の血清２５μｇに対して、米国オーツ社製ＨＣ
Ｖ抗体（ＥＬＩＳＡ）テストシステムにてＨＣＶ抗体を
検出しようとしたが、陽性の判定を明確に得ることがで
きなかった。

実施例２および比較例２からも明らかなように、本発明
の方法によれば、微少量の検体を使用して、逆転者によ
りｃＤＮＡを調製し、適当なオリゴＤＮＡセットのプラ
イマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を緑り返し行う
ことによりＣ型肝炎のＲＮＡを検出することができ、米
国オーツ社製ＨＣ■抗体検出キットにて検出困難な検体
でもＣ型肝炎を高感度にかつ簡便に検出でき、本発明の
方法が優れた方法であることが判る。

〈実施例３〜６および比較例３〜６〉 非Ａ非Ｂ型慢性肝炎と診断された患者（＃３゜４．５．
６）の各々の血清１５μβに実施例１と同様のグアニヂ
ンチオシアネート水溶液５０μｇを添加し４０℃・５分
間保持後、フェノール／クロロフォルム（４／１　）混
合液８０μｇで３回抽出した。

この水相に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム＜ｐＨ５
，４）、１μｇグリコーゲン、２．５倍容のエタノール
を添加し、−８０℃・３０分間保持後、遠心して得られ
たペレットを７０％エタノール次いで１００％エタノー
ルで洗浄後、核酸を得、これを１０μ、ＱＴＥ［１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ７，５）］水溶液に溶解した。

このようにして得られた核酸のＴＥ浴溶液０μｇに対し
て５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（ｐＨ８，３）　／
７５ｍＭ　ＫＣＩ／１０ｍ１ヂチオスレイトール／　５
　ｍＭ　　ＭｇＣｈ　／　４　ｍＭｇＡ酸ナトツナトリ
ウム／１ｍＭＮＴＰｓ　（Ｎ＝Ａ、Ｃ，Ｇ。

Ｔ）／１．６μｇランダムプライマーくベーリンガー・
マンハイム社製ｎｏ、１０３４７３１）　、０．２ｕ／
μρＡＭＶ逆転写酵素（総量２０μ、！２）となるよう
に各成分を加え、４２℃で１時間ｃＤＮＡの合成反応を
行った。

得られた各々のｃＤＮＡ溶液に対して１０倍の耐熱ＤＮ
Ａポリメラーゼ溶液（０，５Ｍ　ＫＣｌ１０．　ＬＭＴ
ｒｉｓ　ＨＣＩ／１５ｍｂ！　　ＭｇＣｈ　１０゜１％
ゼラチン、０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の水溶液
）５μＪ）、滅菌水２９μｆＪ　。

ｄＮＴＰｓミクスチャー（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄ
ＧＴＰ、　ｄＴＴＰ各々の１．２５ｍＭ溶液＞　８μＪ
ｌ）　、各ｃＤＮＡに対し表］の如きオリゴＤＮＡ　［
各オリゴＤＮＡ　（濃度０１ｔ−ｔｔｒ／１ｔｆｌ”）
を各々２．５μＪ）］を、更にＴ　ａ　ｑＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ｎｏ、　１０１４２３）
１．２５ユニツト、更に流動パラフィン５０μρを加え
、９５℃・１分間、次いで５７℃・２分間次いで７２℃
・３分間更にこの３段階の温度・時間変化の操作を３０
回縁り返し、ｉ＆後に後に７２℃・７分間ポリメラーゼ
反応を行った。次にエチヂウムブロマイドで染色後、Ｕ
Ｖ照射し大きさ表１のようなりＮＡバンドが観察された
。

オリゴＤＮＡ３ オリゴＤＮＡＩＩ オリゴＤＮＡ１３ オリゴＤＮＡ４ オリゴＤＮＡ１２ オリゴＤＮＡ１４ 表 ５’　−ＡＣＣＴＧＧＴＡＧＣＧＴＡＣＣＡＡＧＣＣ−
３５’　−ＡＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴ
−３’５’　−ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＧＡＴ
ＴＴ−３’５’　−ＴＡＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＡＡ
ＧＧＴＣ−３’５’−ＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴ
ＧＴＡＴＴ−３’５’　−ＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣ
ＣＣＡＣＧＡＴ−３’く比較例３〜６〉 実施例３〜６の各血清１５μρに対して、米国オーツ社
製ＨＣＶ抗体（ＥＬＩＳＡ）テストシステムにてＨＣＶ
抗体を検出しようとしたが、いずれの血清に対しても陽
性の判定を明確に得ることができなかった。

実施例３〜６および比較例３〜６からも明らかなように
、本発明の方法によれば、微少量の検体を使用して、逆
転写によりｃＤＮＡを調製し、適当なオリゴＤＮＡセッ
トのブライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り
返し行うことによりＣ型肝炎のＲＮＡを検出することが
でき、米国オーツ社製ＨＣＶ抗体検出キットにて検出困
難な検体でもＣ型肝炎を高感度にかつ簡便に検出できる
ことが判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体を蛋白変性剤にて処理後、除蛋白して得られた
   核酸から、ｃＤＮＡを合成し、ついで該ｃＤＮＡに対し
   、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーＤＮＡセットを
   用いてｃＤＮＡを増幅することを特徴とするＣ型肝炎ウ
   ィルスおよびその関連核酸を簡便高感度に検出する方法
   。 ２、該ＤＮＡプライマーセットが下記ＤＮＡ群１および
   ＤＮＡ群２よりそれぞれ少なくとも一種選ばれたオリゴ
   ＤＮＡである請求項１記載の方法。 ＤＮＡ群１： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】