JPH11332562A - 組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法 - Google Patents
組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法Info
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- JPH11332562A JPH11332562A JP11119317A JP11931799A JPH11332562A JP H11332562 A JPH11332562 A JP H11332562A JP 11119317 A JP11119317 A JP 11119317A JP 11931799 A JP11931799 A JP 11931799A JP H11332562 A JPH11332562 A JP H11332562A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は組織試料およびパラフィン包埋組織
試料からＰＣＲ増幅に適する核酸を迅速且つ効率的に抽
出する方法を提供する。 【解決手段】 抽出は、緩衝剤、少なくとも１つの非イ
オン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素を含んで成る
組成物を使って、数分以内に達成される。次いでその試
料をアルカリ性ｐＨで加熱しそして遠心分離段階の後、
上澄液中のＤＮＡを既知の増幅方法、例えばＰＣＲにお
いて直接使用することができる。
試料からＰＣＲ増幅に適する核酸を迅速且つ効率的に抽
出する方法を提供する。 【解決手段】 抽出は、緩衝剤、少なくとも１つの非イ
オン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素を含んで成る
組成物を使って、数分以内に達成される。次いでその試
料をアルカリ性ｐＨで加熱しそして遠心分離段階の後、
上澄液中のＤＮＡを既知の増幅方法、例えばＰＣＲにお
いて直接使用することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の抽出方法お
よびそのためのキットに関する。特に、本発明は組織試
料およびパラフィン包埋組織試料から核酸を抽出する方
法に関する。
よびそのためのキットに関する。特に、本発明は組織試
料およびパラフィン包埋組織試料から核酸を抽出する方
法に関する。
【０００２】生物学的診断の分野では、遺伝病、癌およ
び感染症の検出のために、核酸の増幅を含む分子技術の
使用が増加してきている。しかしながら、そのような増
幅技術を組織または他の重要な臨床試料に適用する際に
は、核酸調製物中に不純物が存在すると増幅感度や増幅
効率を抑制または低下させることがある〔Wilson, I.
G., Applied and Environmental Microbiology 63(10):
3741-3751, 1997 〕。
び感染症の検出のために、核酸の増幅を含む分子技術の
使用が増加してきている。しかしながら、そのような増
幅技術を組織または他の重要な臨床試料に適用する際に
は、核酸調製物中に不純物が存在すると増幅感度や増幅
効率を抑制または低下させることがある〔Wilson, I.
G., Applied and Environmental Microbiology 63(10):
3741-3751, 1997 〕。
【０００３】古記録（archival）のパラフィン包埋病理
学組織試料からのＤＮＡ抽出は、分子診断測定を患者の
結果と関連づけることができる追想的研究において特に
有用である。CrisanおよびMattson により指摘されたよ
うに（DNA and Cell Biology12:455-464, 1993 ）、追
想的ＤＮＡ分析の利点は多数あり、そして(i) ウイル
ス、細菌または原生動物の物質が病因の役割を果たすと
疑われ、潜在的な疫学または予後の相関関係が導き出せ
るようになる、多数の病気経過の研究；(ii)様々なタイ
プの悪性に関連する内因性ＤＮＡ異常の研究；(iii) 遺
伝病における遺伝したＤＮＡの研究；(iv)古記録試料の
使用が、新鮮組織を必要とする予想的研究において可能
であるよりも大きな患者研究グループを使用できるよう
にする、珍しい病気の追想的研究；および(v) 臨床結果
が既に知られている場合、特定の病気の有無、形態学的
診断またはタイプ、病期、予後、および治療に対する応
答と相関関係がある可能性の研究、に適用することがで
きる。
学組織試料からのＤＮＡ抽出は、分子診断測定を患者の
結果と関連づけることができる追想的研究において特に
有用である。CrisanおよびMattson により指摘されたよ
うに（DNA and Cell Biology12:455-464, 1993 ）、追
想的ＤＮＡ分析の利点は多数あり、そして(i) ウイル
ス、細菌または原生動物の物質が病因の役割を果たすと
疑われ、潜在的な疫学または予後の相関関係が導き出せ
るようになる、多数の病気経過の研究；(ii)様々なタイ
プの悪性に関連する内因性ＤＮＡ異常の研究；(iii) 遺
伝病における遺伝したＤＮＡの研究；(iv)古記録試料の
使用が、新鮮組織を必要とする予想的研究において可能
であるよりも大きな患者研究グループを使用できるよう
にする、珍しい病気の追想的研究；および(v) 臨床結果
が既に知られている場合、特定の病気の有無、形態学的
診断またはタイプ、病期、予後、および治療に対する応
答と相関関係がある可能性の研究、に適用することがで
きる。
【０００４】ＤＮＡの増幅について報告された方法は、
ＤＮＡポリメラーゼの使用（例えばポリメラーゼ連鎖反
応、ＰＣＲ）、リガーゼの使用（リガーゼ連鎖反応、Ｌ
ＣＲ）または両方の使用（ＧＡＰ−ＬＣＲ）のいずれか
に基づいている。それらの方法のうち、ＰＣＲが現在ま
で最も広く使われている。ＰＣＲは、適当な条件下でＤ
ＮＡ重合剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在
下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイズせしめ
ることを含んで成る。その結果は、数サイクルの増幅を
通じたプライマー伸長生成物の形成、および元の標的配
列の数の指数的増加である。ＰＣＲについての更なる詳
細は、米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,68
3,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis
他）明細書を調べることにより得ることができる。
ＤＮＡポリメラーゼの使用（例えばポリメラーゼ連鎖反
応、ＰＣＲ）、リガーゼの使用（リガーゼ連鎖反応、Ｌ
ＣＲ）または両方の使用（ＧＡＰ−ＬＣＲ）のいずれか
に基づいている。それらの方法のうち、ＰＣＲが現在ま
で最も広く使われている。ＰＣＲは、適当な条件下でＤ
ＮＡ重合剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在
下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイズせしめ
ることを含んで成る。その結果は、数サイクルの増幅を
通じたプライマー伸長生成物の形成、および元の標的配
列の数の指数的増加である。ＰＣＲについての更なる詳
細は、米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,68
3,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis
他）明細書を調べることにより得ることができる。
【０００５】固有の感受性のために、一般に試料間の生
成物の持ち越しや汚染がＰＣＲおよび核酸増幅方法に伴
う問題である。試料調製中の生成物の持ち越しは深刻な
問題である。それは試料が外部環境に暴露される時間の
量の関数であり、試料収容装置を開放することによって
試料を外部環境に暴露しなければならない回数に関係す
る。よって、迅速であり且つ外部環境への試料の暴露を
減少させるかまたは最小にする試料調製方法を提供する
ことが有利である。特に、試料収容装置を開放しなけれ
ならない回数が最小である核酸抽出方法を提供すること
が有利である。
成物の持ち越しや汚染がＰＣＲおよび核酸増幅方法に伴
う問題である。試料調製中の生成物の持ち越しは深刻な
問題である。それは試料が外部環境に暴露される時間の
量の関数であり、試料収容装置を開放することによって
試料を外部環境に暴露しなければならない回数に関係す
る。よって、迅速であり且つ外部環境への試料の暴露を
減少させるかまたは最小にする試料調製方法を提供する
ことが有利である。特に、試料収容装置を開放しなけれ
ならない回数が最小である核酸抽出方法を提供すること
が有利である。
【０００６】多数のヒト癌腫においてras プロトオンコ
ジーン中の点変異が高頻度で起こるので、それは潜在的
に重要な診断の標的である（Bos, J.L., Cancer Res. 4
9:4682-4689, 1989 ）。例えば、膵癌の90％位がＫ-ras
遺伝子中に変異を含み、大部分はコドン12において起こ
る（Almoguera 他, Cell 53:549-554, 1998 ）。ras変
異の存在を検出する方法は多数存在する。１つの方法と
して、制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥ
ＭＳ−ＰＣＲ）が最近記載されている（WO 96/32500
）。ＲＥＭＳ−ＰＣＲはＰＣＲ熱循環の間に耐熱性制
限酵素を使用することに基づく。ＲＥＭＳ−ＰＣＲは分
析と検出を単純化し且つそれに要する時間を大幅に短縮
する。
ジーン中の点変異が高頻度で起こるので、それは潜在的
に重要な診断の標的である（Bos, J.L., Cancer Res. 4
9:4682-4689, 1989 ）。例えば、膵癌の90％位がＫ-ras
遺伝子中に変異を含み、大部分はコドン12において起こ
る（Almoguera 他, Cell 53:549-554, 1998 ）。ras変
異の存在を検出する方法は多数存在する。１つの方法と
して、制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥ
ＭＳ−ＰＣＲ）が最近記載されている（WO 96/32500
）。ＲＥＭＳ−ＰＣＲはＰＣＲ熱循環の間に耐熱性制
限酵素を使用することに基づく。ＲＥＭＳ−ＰＣＲは分
析と検出を単純化し且つそれに要する時間を大幅に短縮
する。
【０００７】Volenandt 他により指摘されたように、抽
出されるＤＮＡの量はＰＣＲ反応の収率に大きく影響を
及ぼし得る（Polymerase Chain Reaction Analysis of
DNAfrom Paraffin-Embedded Tissue. Methods in Molec
ular Biology Vol. 15: Current Methods and Applicat
ions, 1993, B.A. White 編, Humana Press Inc., N.J.
）。固定化組織からのＤＮＡを分析する時、添加する
抽出試料の容量とＰＣＲ増幅収率との間に反比例関係が
しばしば観察される。これは、或る種の固定剤およびTa
q ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する他の阻害剤の影響に
よるものである。更に、固定またはＤＮＡ抽出中に起こ
る核酸の断片化も、ＤＮＡ増幅の際に問題となり得る
（Greer 他, Am. J. Clin. Pathol. 95:117-124, 1991;
Crisan 他, Clin. Biochem. 25:99-103, 1992）。
出されるＤＮＡの量はＰＣＲ反応の収率に大きく影響を
及ぼし得る（Polymerase Chain Reaction Analysis of
DNAfrom Paraffin-Embedded Tissue. Methods in Molec
ular Biology Vol. 15: Current Methods and Applicat
ions, 1993, B.A. White 編, Humana Press Inc., N.J.
）。固定化組織からのＤＮＡを分析する時、添加する
抽出試料の容量とＰＣＲ増幅収率との間に反比例関係が
しばしば観察される。これは、或る種の固定剤およびTa
q ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する他の阻害剤の影響に
よるものである。更に、固定またはＤＮＡ抽出中に起こ
る核酸の断片化も、ＤＮＡ増幅の際に問題となり得る
（Greer 他, Am. J. Clin. Pathol. 95:117-124, 1991;
Crisan 他, Clin. Biochem. 25:99-103, 1992）。
【０００８】パラフィン組織片または新鮮組織片からの
ＤＮＡ抽出の場合、典型的には、複雑なＤＮＡ調製方法
が用いられる。そのような方法は、ＤＮＡを遊離させそ
して核酸増幅を妨害し得るタンパク質を分解するため
に、界面活性剤の存在下でプロテアーゼ酵素と共に長時
間インキュベートすることを必要とする。抽出されたＤ
ＮＡの精製の際に行われるその後の別段階として、混入
したＲＮＡを除去するためのＲＮアーゼによる処理に続
き、タンパク質や他の細胞性物質を除去するためのエタ
ノールのような溶媒またはフェノールとイソアミルアル
コールのような溶媒混合物を使ったＤＮＡの沈澱、次い
でＤＮＡの水和を含み得る（Volenandt 他, Polymerase
Chain Reaction Analysis of DNA from Paraffin-Embe
dded Tissue. Methods in Molecular Biology Vol. 15:
Current Methods and Applications, 1993, B.A. Whit
e 編, Humana Press Inc., N.J. ）。パラフィン包埋組
織の場合、普通はプロテイナーゼ段階の前に多段階法に
おいてキシレンのような溶媒を使って抽出することによ
り、パラフィンが除去される。Banerjee他による最近の
報告は、パラフィン包埋組織からのＤＮＡ遊離のための
プロトコールを提供している（BioTechniques 18:768-7
73, 1995）。この方法は次の段階を含む：(1)マイクロ
ウエーブ処理、(2) 遠心分離段階によるパラフィンの除
去、(3) プロテイナーゼＫ消化、および(4) プロテアー
ゼＫ活性を失活させるための加熱段階。
ＤＮＡ抽出の場合、典型的には、複雑なＤＮＡ調製方法
が用いられる。そのような方法は、ＤＮＡを遊離させそ
して核酸増幅を妨害し得るタンパク質を分解するため
に、界面活性剤の存在下でプロテアーゼ酵素と共に長時
間インキュベートすることを必要とする。抽出されたＤ
ＮＡの精製の際に行われるその後の別段階として、混入
したＲＮＡを除去するためのＲＮアーゼによる処理に続
き、タンパク質や他の細胞性物質を除去するためのエタ
ノールのような溶媒またはフェノールとイソアミルアル
コールのような溶媒混合物を使ったＤＮＡの沈澱、次い
でＤＮＡの水和を含み得る（Volenandt 他, Polymerase
Chain Reaction Analysis of DNA from Paraffin-Embe
dded Tissue. Methods in Molecular Biology Vol. 15:
Current Methods and Applications, 1993, B.A. Whit
e 編, Humana Press Inc., N.J. ）。パラフィン包埋組
織の場合、普通はプロテイナーゼ段階の前に多段階法に
おいてキシレンのような溶媒を使って抽出することによ
り、パラフィンが除去される。Banerjee他による最近の
報告は、パラフィン包埋組織からのＤＮＡ遊離のための
プロトコールを提供している（BioTechniques 18:768-7
73, 1995）。この方法は次の段階を含む：(1)マイクロ
ウエーブ処理、(2) 遠心分離段階によるパラフィンの除
去、(3) プロテイナーゼＫ消化、および(4) プロテアー
ゼＫ活性を失活させるための加熱段階。
【０００９】Slebosと彼の仲間は、パラフィン包埋組織
からＤＮＡを遊離させる方法であって、３つの10ミクロ
ン切片を使用し、非イオン性界面活性剤と共にインキュ
ベートし、そしてプロテイナーゼＫと共に18〜24時間イ
ンキュベートした後、遠心分離することを含んで成る方
法を報告している（Diagnostic Molecular Pathology1
(2); 136-141, 1992）。結果として得られた上澄液はそ
のままＰＣＲ増幅に使われる。
からＤＮＡを遊離させる方法であって、３つの10ミクロ
ン切片を使用し、非イオン性界面活性剤と共にインキュ
ベートし、そしてプロテイナーゼＫと共に18〜24時間イ
ンキュベートした後、遠心分離することを含んで成る方
法を報告している（Diagnostic Molecular Pathology1
(2); 136-141, 1992）。結果として得られた上澄液はそ
のままＰＣＲ増幅に使われる。
【００１０】プロテイナーゼＫとの長いインキュベーシ
ョンの必要性および加熱不活性化段階の必要性を回避す
るために、ニュージーランド特許NZ 233270 の仮明細書
は、細胞タンパク質を消化しそして核酸を遊離させるた
めに、プロテイナーゼＫに代わるものとして耐熱性プロ
テイナーゼの使用を記載している。この方法は速さと使
用容易性の改善を提供する。しかしながら、その方法で
は、パラフィン包埋組織から遊離される増幅可能なＤＮ
Ａの量が限定される。
ョンの必要性および加熱不活性化段階の必要性を回避す
るために、ニュージーランド特許NZ 233270 の仮明細書
は、細胞タンパク質を消化しそして核酸を遊離させるた
めに、プロテイナーゼＫに代わるものとして耐熱性プロ
テイナーゼの使用を記載している。この方法は速さと使
用容易性の改善を提供する。しかしながら、その方法で
は、パラフィン包埋組織から遊離される増幅可能なＤＮ
Ａの量が限定される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、その後の増幅
方法に適合する方法で、組織試料から迅速且つ高効率的
に核酸を抽出する方法が当業界でまだ要望されている。
方法に適合する方法で、組織試料から迅速且つ高効率的
に核酸を抽出する方法が当業界でまだ要望されている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は上述の課題を解
決し、且つその後の増幅方法に適合する方法で組織試料
から核酸を抽出する方法を提供する。よって、本発明の
目的は、組織試料およびパラフィン包埋組織試料から核
酸を抽出する方法並びにそのためのキットを提供するこ
とである。本発明の他の様々な目的および利点は、発明
の詳細な説明から明らかであろう。
決し、且つその後の増幅方法に適合する方法で組織試料
から核酸を抽出する方法を提供する。よって、本発明の
目的は、組織試料およびパラフィン包埋組織試料から核
酸を抽出する方法並びにそのためのキットを提供するこ
とである。本発明の他の様々な目的および利点は、発明
の詳細な説明から明らかであろう。
【００１３】一態様では、本発明は、組織試料から核酸
を抽出する方法に関する。この方法は、組織試料から核
酸を遊離させるのに十分な条件下で、組織試料を緩衝
剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロ
テアーゼ酵素と接触させることを含んで成る。次いでそ
の試料をプロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時
間に渡りアルカリ性ｐＨで加熱する。前記試料を遠心分
離することにより、上澄液中に核酸が単離される。本明
細書中に言及される全ての刊行物は参考として本明細書
中に組み込まれる。
を抽出する方法に関する。この方法は、組織試料から核
酸を遊離させるのに十分な条件下で、組織試料を緩衝
剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロ
テアーゼ酵素と接触させることを含んで成る。次いでそ
の試料をプロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時
間に渡りアルカリ性ｐＨで加熱する。前記試料を遠心分
離することにより、上澄液中に核酸が単離される。本明
細書中に言及される全ての刊行物は参考として本明細書
中に組み込まれる。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、抽出された核酸が既知
技術を使ったその後の増幅および検出に適するように、
組織試料から核酸を抽出する方法に関する。本発明を使
って、新鮮な組織試料とパラフィン包埋組織試料の両方
のヒト組織試料から、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮ
Ａ）を抽出することができる。本発明を使って核酸を抽
出することができる組織の例としては、正常のおよび癌
性の肺組織、結腸組織、膵臓組織、胸部組織、前立腺組
織、血液および他の体液、並びに検出することができる
核酸を含む細胞性物質が挙げられるが、それらに限定さ
れない。
技術を使ったその後の増幅および検出に適するように、
組織試料から核酸を抽出する方法に関する。本発明を使
って、新鮮な組織試料とパラフィン包埋組織試料の両方
のヒト組織試料から、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮ
Ａ）を抽出することができる。本発明を使って核酸を抽
出することができる組織の例としては、正常のおよび癌
性の肺組織、結腸組織、膵臓組織、胸部組織、前立腺組
織、血液および他の体液、並びに検出することができる
核酸を含む細胞性物質が挙げられるが、それらに限定さ
れない。
【００１５】本発明では、着目のＤＮＡを含むと思われ
る組織試料を、緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界
面活性剤およびプロテアーゼ酵素と同時にまたは連続的
に接触せしめる。適当な常用の生物学的緩衝剤として
は、ｐＨを約４〜約10、好ましくは約７〜約９で維持す
る１または複数の有機緩衝剤が挙げられる。有用な緩衝
剤としては、非限定的に、３−（Ｎ−モルホリノ）プロ
パンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホ
ン酸、トリシン、グリシン、トリス（TRIS）、リン酸塩
および当業者に容易に明らかな他のものが挙げられる。
使用する緩衝剤の量はｐＫａに依存し、そして所望のｐ
Ｈを維持するのに十分であるものである。
る組織試料を、緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界
面活性剤およびプロテアーゼ酵素と同時にまたは連続的
に接触せしめる。適当な常用の生物学的緩衝剤として
は、ｐＨを約４〜約10、好ましくは約７〜約９で維持す
る１または複数の有機緩衝剤が挙げられる。有用な緩衝
剤としては、非限定的に、３−（Ｎ−モルホリノ）プロ
パンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホ
ン酸、トリシン、グリシン、トリス（TRIS）、リン酸塩
および当業者に容易に明らかな他のものが挙げられる。
使用する緩衝剤の量はｐＫａに依存し、そして所望のｐ
Ｈを維持するのに十分であるものである。
【００１６】多数の非イオン性界面活性剤のいずれも本
発明に使用できる。本発明において有用な界面活性剤の
例としては、非限定的に、ポリオキシエチレンソルビタ
ン誘導体、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコー
ルエーテル、ペルフルオロアルキルポリオキシエチレ
ン、フッ素化アルキルアルコキシレート、およびフッ素
化アルキルエステル化合物が挙げられる。他の有用な界
面活性剤の種類および各種類の例は、特に界面活性剤の
標準参考文献であるMcCutcheon's Emulsfers andDeterg
ents, 1986 North American Edition, McCutcheon Divi
sion PublishingCo., Glen Rock, NJ.を参考にすれば、
当業者に容易に明白であろう。典型的な非イオン性界面
活性剤は米国特許第5,231,015 号（Cummins 他）明細書
中にも与えられており、その内容が参考として本明細書
中に組み込まれる。非イオン性界面活性剤の組合せも本
発明に用いることができる。
発明に使用できる。本発明において有用な界面活性剤の
例としては、非限定的に、ポリオキシエチレンソルビタ
ン誘導体、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコー
ルエーテル、ペルフルオロアルキルポリオキシエチレ
ン、フッ素化アルキルアルコキシレート、およびフッ素
化アルキルエステル化合物が挙げられる。他の有用な界
面活性剤の種類および各種類の例は、特に界面活性剤の
標準参考文献であるMcCutcheon's Emulsfers andDeterg
ents, 1986 North American Edition, McCutcheon Divi
sion PublishingCo., Glen Rock, NJ.を参考にすれば、
当業者に容易に明白であろう。典型的な非イオン性界面
活性剤は米国特許第5,231,015 号（Cummins 他）明細書
中にも与えられており、その内容が参考として本明細書
中に組み込まれる。非イオン性界面活性剤の組合せも本
発明に用いることができる。
【００１７】プロテアーゼ酵素は組織およびタンパク質
を分解して核酸を遊離させるために用いられる。プロテ
アーゼは遊離したＤＮＡをより安定にするヌクレアーゼ
も分解し得る。好ましくは、プロテアーゼ酵素は耐熱性
である。多種多様なプロテアーゼが本発明に使用するこ
とができ、その例としてはセリンプロテアーゼ（E.C.3.
4.21 、例えばトリプシンおよびキモトリプシン）、チ
オールプロテアーゼ（E.C. 2.4.22 、例えばパパイン、
フィシン）、カルボキシプロテアーゼ（酸性プロテアー
ゼ、E.C. 2.4.23 、例えばペプシン）、およびメタロプ
ロテアーゼ（E.C. 2.4.24 、例えばサーモリシン、プロ
ナーゼ）が挙げられる。温度、ｐＨ、イオン強度、およ
び界面活性剤タイプの最適条件は、使用するプロテアー
ゼによって異なるだろう。好ましいプロテイナーゼとし
ては、プロテアーゼＫ〔E.C. 3.4.21.64、トリチラキウ
ム・アルブム（Tritirachium album）から〕、ストレプ
トマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から
のプロテアーゼ（P6911, Sigma Chemical Company, St.
Louis）およびPRETAQが挙げられる。PRETAQは、Peek,
K.他（Purification and characterization of thermos
table proteinase,Eur. J. Biochem. 207:1035-1044, 1
992）により記載されたように、テルムス（Thermus ）
種RT41株から単離された非常に耐熱性のアルカリ性プロ
テアーゼである。この酵素は70℃で24時間後に全く活性
の損失がなく、且つ室温で６か月以上も活性の損失がな
いと報告された非常に耐熱性の酵素である。PRETAQおよ
び同様の耐熱性酵素の使用は、75℃付近およびそれ以上
の温度でパラフィンが融解することから、パラフィン組
織からのＤＮＡの調製に有利である。よってそのような
高度の耐熱性プロテアーゼの使用は、プロテアーゼ消化
前にパラフィンを除去するための別個の溶媒抽出プロト
コールを行う必要性を除去する。溶媒によるパラフィン
除去方法は、上記に引用したVolkenandt他、Wright & M
anos、およびGreer による参考文献中に記載されてお
り、それはオクタンまたはキシレンを使った処理に続き
エタノールもしくは他のアルコールまたはアセトンのよ
うな溶媒を使った処理という多段階処理の使用に基づい
ている。
を分解して核酸を遊離させるために用いられる。プロテ
アーゼは遊離したＤＮＡをより安定にするヌクレアーゼ
も分解し得る。好ましくは、プロテアーゼ酵素は耐熱性
である。多種多様なプロテアーゼが本発明に使用するこ
とができ、その例としてはセリンプロテアーゼ（E.C.3.
4.21 、例えばトリプシンおよびキモトリプシン）、チ
オールプロテアーゼ（E.C. 2.4.22 、例えばパパイン、
フィシン）、カルボキシプロテアーゼ（酸性プロテアー
ゼ、E.C. 2.4.23 、例えばペプシン）、およびメタロプ
ロテアーゼ（E.C. 2.4.24 、例えばサーモリシン、プロ
ナーゼ）が挙げられる。温度、ｐＨ、イオン強度、およ
び界面活性剤タイプの最適条件は、使用するプロテアー
ゼによって異なるだろう。好ましいプロテイナーゼとし
ては、プロテアーゼＫ〔E.C. 3.4.21.64、トリチラキウ
ム・アルブム（Tritirachium album）から〕、ストレプ
トマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から
のプロテアーゼ（P6911, Sigma Chemical Company, St.
Louis）およびPRETAQが挙げられる。PRETAQは、Peek,
K.他（Purification and characterization of thermos
table proteinase,Eur. J. Biochem. 207:1035-1044, 1
992）により記載されたように、テルムス（Thermus ）
種RT41株から単離された非常に耐熱性のアルカリ性プロ
テアーゼである。この酵素は70℃で24時間後に全く活性
の損失がなく、且つ室温で６か月以上も活性の損失がな
いと報告された非常に耐熱性の酵素である。PRETAQおよ
び同様の耐熱性酵素の使用は、75℃付近およびそれ以上
の温度でパラフィンが融解することから、パラフィン組
織からのＤＮＡの調製に有利である。よってそのような
高度の耐熱性プロテアーゼの使用は、プロテアーゼ消化
前にパラフィンを除去するための別個の溶媒抽出プロト
コールを行う必要性を除去する。溶媒によるパラフィン
除去方法は、上記に引用したVolkenandt他、Wright & M
anos、およびGreer による参考文献中に記載されてお
り、それはオクタンまたはキシレンを使った処理に続き
エタノールもしくは他のアルコールまたはアセトンのよ
うな溶媒を使った処理という多段階処理の使用に基づい
ている。
【００１８】試料はＤＮＡを遊離させるのに十分な条件
下で緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ
酵素と接触せしめられる。使用する条件は、使用する組
織試料とプロテアーゼによって異なるだろうが、それは
当業者により容易に決定することができる。例えば、PR
ETAQプロテアーゼを使う時、70℃〜100 ℃において、温
度によって５分間〜３時間、試料を緩衝剤、非イオン性
界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることができ
る。90℃〜100 ℃で10〜15分間が好ましい。プロテアー
ゼＫを使う場合、試料を30分〜24時間、緩衝剤、非イオ
ン性界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることが
できる。30分〜60分間が好ましい。
下で緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ
酵素と接触せしめられる。使用する条件は、使用する組
織試料とプロテアーゼによって異なるだろうが、それは
当業者により容易に決定することができる。例えば、PR
ETAQプロテアーゼを使う時、70℃〜100 ℃において、温
度によって５分間〜３時間、試料を緩衝剤、非イオン性
界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることができ
る。90℃〜100 ℃で10〜15分間が好ましい。プロテアー
ゼＫを使う場合、試料を30分〜24時間、緩衝剤、非イオ
ン性界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることが
できる。30分〜60分間が好ましい。
【００１９】次いでプロテアーゼを不活性化するのに十
分な時間に渡りアルカリ性ｐＨで試料を加熱する。試料
のｐＨは、アルカリ性ｐＨが得られるまで試料に水酸化
ナトリウムまたは水酸化カリウムを添加することにより
調整することができる。次いで抽出された核酸を遠心分
離により単離することができる。
分な時間に渡りアルカリ性ｐＨで試料を加熱する。試料
のｐＨは、アルカリ性ｐＨが得られるまで試料に水酸化
ナトリウムまたは水酸化カリウムを添加することにより
調整することができる。次いで抽出された核酸を遠心分
離により単離することができる。
【００２０】本発明に開示される方法は多数の利点を有
する。本発明の方法は迅速であり、潜在的に毒性の溶媒
を使用する必要性をなくし、そして試料収容装置を開放
しなければならない操作の回数を最小にする。加熱した
アルカリでの処理段階を含めることは、多分二本鎖ＤＮ
Ａを変性させそしてそれをＰＣＲで一層容易に増幅でき
る一本鎖ＤＮＡの小片に変えることにより、ＰＣＲ増幅
を改善する。熱アルカリでの処理はプロテアーゼを変性
させ、そのため残余のプロテアーゼ活性がその後の増幅
に必要なTaq ポリメラーゼまたは他の酵素を阻害してし
まうかもしれないという心配を取り除くと期待される。
第三に、ＰＣＲ増幅を阻害することが知られている幾つ
かの化学物質（ヘパリン、ビリルビン、ヘモグロビン
等）が熱アルカリ処理により変性されることも期待され
る。第四に、熱アルカリ処理は、或るＰＣＲ増幅プロト
コールを妨害することがあるＲＮＡを破壊する。最後
に、熱アルカリ処理はまた、脂質、脂肪酸および他の重
要な細胞膜の可溶化をもたらすと期待されよう。この細
胞膜の完全性の破壊は更に、細胞および組織から遊離さ
れるＤＮＡを増加させると期待される。
する。本発明の方法は迅速であり、潜在的に毒性の溶媒
を使用する必要性をなくし、そして試料収容装置を開放
しなければならない操作の回数を最小にする。加熱した
アルカリでの処理段階を含めることは、多分二本鎖ＤＮ
Ａを変性させそしてそれをＰＣＲで一層容易に増幅でき
る一本鎖ＤＮＡの小片に変えることにより、ＰＣＲ増幅
を改善する。熱アルカリでの処理はプロテアーゼを変性
させ、そのため残余のプロテアーゼ活性がその後の増幅
に必要なTaq ポリメラーゼまたは他の酵素を阻害してし
まうかもしれないという心配を取り除くと期待される。
第三に、ＰＣＲ増幅を阻害することが知られている幾つ
かの化学物質（ヘパリン、ビリルビン、ヘモグロビン
等）が熱アルカリ処理により変性されることも期待され
る。第四に、熱アルカリ処理は、或るＰＣＲ増幅プロト
コールを妨害することがあるＲＮＡを破壊する。最後
に、熱アルカリ処理はまた、脂質、脂肪酸および他の重
要な細胞膜の可溶化をもたらすと期待されよう。この細
胞膜の完全性の破壊は更に、細胞および組織から遊離さ
れるＤＮＡを増加させると期待される。
【００２１】本発明に従って組織試料から抽出される核
酸は、当該技術分野で既知の方法（例えばＰＣＲやＬＣ
Ｒ）を使ったその後の増幅に適当である。ＰＣＲを使っ
た核酸の増幅および検出のための一般原理および条件は
十分に周知であり、その詳細は多数の刊行物、例えば米
国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202号
（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）明細書
に提供されている。それらの刊行物は全て参考として本
明細書中に組み込まれる。好ましくは、ＰＣＲは耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを使って実施される。多数の適当な
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において報告
されており、例えば米国特許第4,965,188 号（Gelfand
他）および同第4,889,818 号（Gelfand 他）明細書中に
詳細に記載されている。その両刊行物は参考として本明
細書中に組み込まれる。ＰＣＲにおいて使用することが
できる他の試薬としては、例えば、増幅前に耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを抑制する、該ＤＮＡポリメラーゼに特
異的な抗体が挙げられる。そのような抗体は米国特許第
5,338,671 号（Scalice 他）明細書（その内容は参考と
して本明細書に組み込まれる）中に記載されたモノクロ
ーナル抗体により代表される。
酸は、当該技術分野で既知の方法（例えばＰＣＲやＬＣ
Ｒ）を使ったその後の増幅に適当である。ＰＣＲを使っ
た核酸の増幅および検出のための一般原理および条件は
十分に周知であり、その詳細は多数の刊行物、例えば米
国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202号
（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）明細書
に提供されている。それらの刊行物は全て参考として本
明細書中に組み込まれる。好ましくは、ＰＣＲは耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを使って実施される。多数の適当な
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において報告
されており、例えば米国特許第4,965,188 号（Gelfand
他）および同第4,889,818 号（Gelfand 他）明細書中に
詳細に記載されている。その両刊行物は参考として本明
細書中に組み込まれる。ＰＣＲにおいて使用することが
できる他の試薬としては、例えば、増幅前に耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを抑制する、該ＤＮＡポリメラーゼに特
異的な抗体が挙げられる。そのような抗体は米国特許第
5,338,671 号（Scalice 他）明細書（その内容は参考と
して本明細書に組み込まれる）中に記載されたモノクロ
ーナル抗体により代表される。
【００２２】増幅された核酸は、多数の既知方法、例え
ば米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）明細書に記載
されたものにより検出することができる。例えば、増幅
された核酸はサザンブロット法、ドットブロット技術、
または標識プローブによる非同位体オリゴヌクレオチド
捕捉検出法を使って検出することができる。あるいは、
適当に標識されたプライマーを使って増幅を実施し、そ
して前記標識の検出のための手順および装置を使って増
幅されたプライマー伸長生成物を検出することができ
る。よって、当該技術分野の技術と本明細書中に提供さ
れる特別な技術を考慮すれば、当業者は、新鮮組織試料
またはパラフィン包埋組織試料からその後のＰＣＲ増幅
および検出に適当な核酸を抽出するために何ら困難なし
に本発明を実施できるだろう。
ば米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）明細書に記載
されたものにより検出することができる。例えば、増幅
された核酸はサザンブロット法、ドットブロット技術、
または標識プローブによる非同位体オリゴヌクレオチド
捕捉検出法を使って検出することができる。あるいは、
適当に標識されたプライマーを使って増幅を実施し、そ
して前記標識の検出のための手順および装置を使って増
幅されたプライマー伸長生成物を検出することができ
る。よって、当該技術分野の技術と本明細書中に提供さ
れる特別な技術を考慮すれば、当業者は、新鮮組織試料
またはパラフィン包埋組織試料からその後のＰＣＲ増幅
および検出に適当な核酸を抽出するために何ら困難なし
に本発明を実施できるだろう。
【００２３】本明細書中、時間に対して言及する時、
「約」という語は、その時間限界値の±10％を指す。温
度に対して言及する時、「約」という語は、±５℃を指
す。
「約」という語は、その時間限界値の±10％を指す。温
度に対して言及する時、「約」という語は、±５℃を指
す。
【００２４】次の実施例は本発明の幾つかの態様を例証
するために提供されるのであって、本発明を限定するも
のと解釈してはならない。
するために提供されるのであって、本発明を限定するも
のと解釈してはならない。
【００２５】
【実施例】材料および方法：パラフィン包埋組織 パラフィン包埋組織の分析用に、パラフィン塊から10ミ
クロン片を切り取り、そして1.5 mLの無菌スクリューキ
ャップ付試験管に入れた。試料間の汚染を防止するため
に、新たなパラフィン塊毎に新しい刃を使った。各切片
を切った後、圧縮空気の噴射により、刃とミクロトーム
領域を清浄した。新しい木製アプリケーター棒を使って
各切片を収容試験管に移した。
クロン片を切り取り、そして1.5 mLの無菌スクリューキ
ャップ付試験管に入れた。試料間の汚染を防止するため
に、新たなパラフィン塊毎に新しい刃を使った。各切片
を切った後、圧縮空気の噴射により、刃とミクロトーム
領域を清浄した。新しい木製アプリケーター棒を使って
各切片を収容試験管に移した。
【００２６】制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ
（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）変異分析 ＲＥＭＳ−ＰＣＲを使ってＫ−ras 遺伝子のコドン12の
１番目と２番目の塩基の変異を検出した。各ＰＣＲ反応
は３セットのプライマーを含んだ（表１）。診断プライ
マーは野性型ras 中にBstN-1制限部位を誘導するが、コ
ドン12の変異は誘導しない。よって、ras 野性型ＤＮＡ
はＰＣＲ熱循環の間に選択的に開裂され、そしてコドン
12のところのras 変異型配列が富化される。ＰＣＲ対照
プライマーはＰＣＲ増幅可能ＤＮＡが抽出されることを
確かめ、そして酵素対照プライマーは制限酵素が機能し
ていることを確かめるために用いる。
（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）変異分析 ＲＥＭＳ−ＰＣＲを使ってＫ−ras 遺伝子のコドン12の
１番目と２番目の塩基の変異を検出した。各ＰＣＲ反応
は３セットのプライマーを含んだ（表１）。診断プライ
マーは野性型ras 中にBstN-1制限部位を誘導するが、コ
ドン12の変異は誘導しない。よって、ras 野性型ＤＮＡ
はＰＣＲ熱循環の間に選択的に開裂され、そしてコドン
12のところのras 変異型配列が富化される。ＰＣＲ対照
プライマーはＰＣＲ増幅可能ＤＮＡが抽出されることを
確かめ、そして酵素対照プライマーは制限酵素が機能し
ていることを確かめるために用いる。
【００２７】
【表１】
【００２８】ＲＥＭＳ−ＰＣＲ用の反応混合物は、12単
位／100 μL の組換えTaq ポリメラーゼ、0.842 μL の
Taq 阻害抗体TP4-9.2 （５倍過剰）、10 mM HT50緩衝剤
（100 mM NaCl および50 mM Tris-HCl, pH 8.3）、0.3
μM のプライマー 5BKITおよび3K2 、0.05μM のプライ
マー 5BK5, 3K6, 5BK28 および3K29、0.2 mM全ジヌクレ
オシド三リン酸（dNTPs ）、0.6 単位／μL のBstn1
（New England BioLabs,Beverly, MA）、１mMジチオス
レイトール(DTT) 、４mM MgCl2、試料（典型的には３μ
L ）並びに最終容量100 μL までの脱イオン水を含ん
だ。典型的には、Taq ポリメラーゼと抗Taq 抗体を混合
し、そして10〜15分間インキュベートした後、その他の
ＰＣＲ反応成分を添加した。Bstn1 制限酵素は、試料の
添加の直前に最後に反応混合物に添加した。
位／100 μL の組換えTaq ポリメラーゼ、0.842 μL の
Taq 阻害抗体TP4-9.2 （５倍過剰）、10 mM HT50緩衝剤
（100 mM NaCl および50 mM Tris-HCl, pH 8.3）、0.3
μM のプライマー 5BKITおよび3K2 、0.05μM のプライ
マー 5BK5, 3K6, 5BK28 および3K29、0.2 mM全ジヌクレ
オシド三リン酸（dNTPs ）、0.6 単位／μL のBstn1
（New England BioLabs,Beverly, MA）、１mMジチオス
レイトール(DTT) 、４mM MgCl2、試料（典型的には３μ
L ）並びに最終容量100 μL までの脱イオン水を含ん
だ。典型的には、Taq ポリメラーゼと抗Taq 抗体を混合
し、そして10〜15分間インキュベートした後、その他の
ＰＣＲ反応成分を添加した。Bstn1 制限酵素は、試料の
添加の直前に最後に反応混合物に添加した。
【００２９】上記反応混合物を、米国特許第5,089,233
号、同第5,229,297 号および同第5,380,489 号明細書に
記載された核酸増幅および検出のためのオルソ−クリニ
カルダイアグノスティクス，インコーポレイティドのパ
ウチ収容システムを使って増幅しそして検出した。簡単
に言えば、上述した通りに試料とＰＣＲ試薬を混合し、
パウチの膨れ部分（ブリスター）に充填し、そしてパウ
チをシールした。ビオチン標識診断プライマー、ＰＣＲ
対照プライマーおよび酵素対照プライマーを増幅に使っ
た。「ＰＣＲ反応ブリスター」を94℃で１分間加熱し、
次いで30サイクル増幅させた。各サイクルは、94℃の融
解温度および10秒間のインキュベーションに続き、58℃
で75秒間のアニーリングを含んだ。103 ℃で５分間の加
熱後インキュベーションの後、反応生成物を検出チャン
バーに通過させ、そこで反応生成物がビーズに取り付け
た相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ体；表２）とハイ
ブリダイズすることにより、増幅生成物を検出した。西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）路および洗浄路は
55℃であり、一方、検出路では40℃の温度を使った。Ｈ
ＲＰ−ストレプトアビジンおよびその後にＨＲＰ−色素
基質を検出路に通過させた後、ハイブリダイズした生成
物を検出した。
号、同第5,229,297 号および同第5,380,489 号明細書に
記載された核酸増幅および検出のためのオルソ−クリニ
カルダイアグノスティクス，インコーポレイティドのパ
ウチ収容システムを使って増幅しそして検出した。簡単
に言えば、上述した通りに試料とＰＣＲ試薬を混合し、
パウチの膨れ部分（ブリスター）に充填し、そしてパウ
チをシールした。ビオチン標識診断プライマー、ＰＣＲ
対照プライマーおよび酵素対照プライマーを増幅に使っ
た。「ＰＣＲ反応ブリスター」を94℃で１分間加熱し、
次いで30サイクル増幅させた。各サイクルは、94℃の融
解温度および10秒間のインキュベーションに続き、58℃
で75秒間のアニーリングを含んだ。103 ℃で５分間の加
熱後インキュベーションの後、反応生成物を検出チャン
バーに通過させ、そこで反応生成物がビーズに取り付け
た相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ体；表２）とハイ
ブリダイズすることにより、増幅生成物を検出した。西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）路および洗浄路は
55℃であり、一方、検出路では40℃の温度を使った。Ｈ
ＲＰ−ストレプトアビジンおよびその後にＨＲＰ−色素
基質を検出路に通過させた後、ハイブリダイズした生成
物を検出した。
【００３０】
【表２】
【００３１】表２の各オリゴヌクレオチドの３′末端
に、ポリスチレンビーズへの付着のために次の配列：５
５７Ｔを有するリンカーを使用した。ここで塩基＃５は
テトラエチレングリコール(TEG) スペーサーであり、そ
して塩基＃７はアミノジオールリンカー（ADリンカー）
であり、そしてＴはチミジン配列である。
に、ポリスチレンビーズへの付着のために次の配列：５
５７Ｔを有するリンカーを使用した。ここで塩基＃５は
テトラエチレングリコール(TEG) スペーサーであり、そ
して塩基＃７はアミノジオールリンカー（ADリンカー）
であり、そしてＴはチミジン配列である。
【００３２】各パウチは３つの検出ブリスターを含み、
各々が200 μL の液体を有した（ストレプトアビジン−
ＨＲＰ 200μL ／ブリスター；洗浄溶液 200μL ／ブリ
スター；および色素／ゲル 200μL ／ブリスター）。ブ
リスターの順序はストレプトアビジンブリスター、次に
洗浄溶液ブリスター、そして最後に色素／ゲルブリスタ
ーであった。
各々が200 μL の液体を有した（ストレプトアビジン−
ＨＲＰ 200μL ／ブリスター；洗浄溶液 200μL ／ブリ
スター；および色素／ゲル 200μL ／ブリスター）。ブ
リスターの順序はストレプトアビジンブリスター、次に
洗浄溶液ブリスター、そして最後に色素／ゲルブリスタ
ーであった。
【００３３】捕捉オリゴ体ビーズは次の順序でパウチ中
に配置された（流れの方向で）：INC 26.7a , K-Cap 6
M, 無スポット, K-CapD8, 無スポット, K-Cap2E およ
びINC26.7a 。
に配置された（流れの方向で）：INC 26.7a , K-Cap 6
M, 無スポット, K-CapD8, 無スポット, K-Cap2E およ
びINC26.7a 。
【００３４】実施例１：Pre-Taq 処理後、NaOHおよび加
熱処理の有無のもとでのパラフィン包埋組織からのＤＮ
Ａの抽出 この実施例では、異なる癌試料からの厚さ10ミクロンの
パラフィン切片を次のように抽出した。ミクロトーム切
断後、切片試料を1.5 mLのスクリューキャップ付超遠心
管に入れた。80μL のＴＥＫ緩衝液（10 mM Tris-HCl緩
衝剤, pH 8.0および0.5 ％Tween 20）を添加し、次いで
10μL の耐熱性プロテアーゼＫ（Pre-Taq ）（0.3 単位
／μL, Gibco/BRL Products, Gaithersburg, MD ）を添
加した。試験管を100 ℃で５分間加熱した。まだ熱い状
態で１セットの複製試験管を14,000 rpmで２分間遠心分
離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を新しい試験管
に移し、分析まで４℃で冷蔵保存した。第二セットの複
製試験管に、10μL の250mM NaOH を加え、そして試験
管をヒートブロック中で105 ℃で３分間加熱した。まだ
熱い状態でその試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離
し、そしてパラフィン層の下の上澄液を取り出し、新し
い試験管に移し、分析まで４℃で保存した。
熱処理の有無のもとでのパラフィン包埋組織からのＤＮ
Ａの抽出 この実施例では、異なる癌試料からの厚さ10ミクロンの
パラフィン切片を次のように抽出した。ミクロトーム切
断後、切片試料を1.5 mLのスクリューキャップ付超遠心
管に入れた。80μL のＴＥＫ緩衝液（10 mM Tris-HCl緩
衝剤, pH 8.0および0.5 ％Tween 20）を添加し、次いで
10μL の耐熱性プロテアーゼＫ（Pre-Taq ）（0.3 単位
／μL, Gibco/BRL Products, Gaithersburg, MD ）を添
加した。試験管を100 ℃で５分間加熱した。まだ熱い状
態で１セットの複製試験管を14,000 rpmで２分間遠心分
離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を新しい試験管
に移し、分析まで４℃で冷蔵保存した。第二セットの複
製試験管に、10μL の250mM NaOH を加え、そして試験
管をヒートブロック中で105 ℃で３分間加熱した。まだ
熱い状態でその試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離
し、そしてパラフィン層の下の上澄液を取り出し、新し
い試験管に移し、分析まで４℃で保存した。
【００３５】各上澄液の５μL を１mLキュベットに添加
し、そしてBeckman DU70型分光光度計上で260 nmの吸光
度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。その
結果を下の表３に与える。
し、そしてBeckman DU70型分光光度計上で260 nmの吸光
度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。その
結果を下の表３に与える。
【００３６】
【表３】
【００３７】ここで調べた組織の各々について、NaOH処
理を行った時のパラフィン片からはPre-Taq 処理だけの
ものと比較して、抽出されたＤＮＡ量に約２倍の増加が
観察された。
理を行った時のパラフィン片からはPre-Taq 処理だけの
ものと比較して、抽出されたＤＮＡ量に約２倍の増加が
観察された。
【００３８】各上澄液の４μL を、上述した「パウチア
ッセイ」におけるＲＥＭＳ−ＰＣＲに基づいて、コドン
12のＫ−ras 変異の検出を目的としたＰＣＲ増幅にかけ
た。パウチ法での二重反復アッセイの結果を表４に与え
る。
ッセイ」におけるＲＥＭＳ−ＰＣＲに基づいて、コドン
12のＫ−ras 変異の検出を目的としたＰＣＲ増幅にかけ
た。パウチ法での二重反復アッセイの結果を表４に与え
る。
【００３９】
【表４】
【００４０】上記結果は、NaOH処理した膵臓組織切片か
らのＤＮＡ抽出についてのK-12 ras診断用目視評点が、
NaOH処理しない対照と比較して、有意な増加を示す。Na
OH処理した直腸結腸癌および肺癌切片においても、対照
と比較して、わずかではあるが検出可能な評点の改善を
示した。扁桃癌試料はNaOH処理をしてもしなくても強力
な増幅（目視評点が６）を示した。
らのＤＮＡ抽出についてのK-12 ras診断用目視評点が、
NaOH処理しない対照と比較して、有意な増加を示す。Na
OH処理した直腸結腸癌および肺癌切片においても、対照
と比較して、わずかではあるが検出可能な評点の改善を
示した。扁桃癌試料はNaOH処理をしてもしなくても強力
な増幅（目視評点が６）を示した。
【００４１】実施例２：プロテアーゼＫでの処理後、Na
OH処理したまたは処理しないパラフィン包埋組織からの
ＤＮＡの抽出 この実験では、次のようにして４つの異なるパラフィン
包埋結腸直腸片を処理した：ミクロトープ切断後、各切
片を1.5 mLのスクリューキャップ付遠心管に入れた。87
μL のＴＥＫ緩衝液を添加し、次いで３μL の耐熱性プ
ロテアーゼＫ（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, M
N ）を添加した。試験管をヒートブロック中で65℃で４
時間インキュベートした。１セットの複製試験管を100
℃で５分間ヒートブロック中に置き、そしてまだ熱い状
態で14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン
層の下の上澄液を新しい試験管に移し、分析まで４℃で
保存した。第二セットの複製試験管に、10μL の250 mM
NaOH を加え、そして試験管をヒートブロック中で105
℃で３分間加熱した。まだ熱い状態でその試験管を14,0
00 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の
上澄液を取り出し、新しい試験管に移し、分析まで４℃
で保存した。
OH処理したまたは処理しないパラフィン包埋組織からの
ＤＮＡの抽出 この実験では、次のようにして４つの異なるパラフィン
包埋結腸直腸片を処理した：ミクロトープ切断後、各切
片を1.5 mLのスクリューキャップ付遠心管に入れた。87
μL のＴＥＫ緩衝液を添加し、次いで３μL の耐熱性プ
ロテアーゼＫ（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, M
N ）を添加した。試験管をヒートブロック中で65℃で４
時間インキュベートした。１セットの複製試験管を100
℃で５分間ヒートブロック中に置き、そしてまだ熱い状
態で14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン
層の下の上澄液を新しい試験管に移し、分析まで４℃で
保存した。第二セットの複製試験管に、10μL の250 mM
NaOH を加え、そして試験管をヒートブロック中で105
℃で３分間加熱した。まだ熱い状態でその試験管を14,0
00 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の
上澄液を取り出し、新しい試験管に移し、分析まで４℃
で保存した。
【００４２】上述したのと同様に分光光度測定した時、
プロテアーゼＫ処理細胞を使った実験の結果は、対照に
比較して、NaOHで処理した試料において抽出されるＤＮ
Ａがわずかにしか増加しなかったことを示す。しかしな
がら、表６に示されるように、NaOHで処理した試料では
ＰＣＲ対照プライマーを用いた増幅は強力であり、そし
てNaOH処理段階を省略するとＰＣＲ対照プライマーによ
る増幅は全く検出されなかった。
プロテアーゼＫ処理細胞を使った実験の結果は、対照に
比較して、NaOHで処理した試料において抽出されるＤＮ
Ａがわずかにしか増加しなかったことを示す。しかしな
がら、表６に示されるように、NaOHで処理した試料では
ＰＣＲ対照プライマーを用いた増幅は強力であり、そし
てNaOH処理段階を省略するとＰＣＲ対照プライマーによ
る増幅は全く検出されなかった。
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲイリー ジェイ．チルソン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14058, エルバ，ログ シティー ロード 6584, ポスト オフィス ボックス
Claims (1)
- 【請求項１】 組織試料から核酸を抽出する方法であっ
て、前記試料から前記核酸を遊離させるのに十分な条件
下で、前記試料を緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性
界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触させ；前記プ
ロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時間に渡り、
アルカリ性ｐＨで前記試料を加熱し；そして前記試料を
遠心分離して上澄液中に前記核酸を単離することを含ん
で成る方法。
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|---|---|---|---|
| US8335698P | 1998-04-28 | 1998-04-28 | |
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7303876B2 (en) | 2000-11-28 | 2007-12-04 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases |
| JP2008541761A (ja) * | 2005-05-31 | 2008-11-27 | インヴィトロジェン コーポレーション | パラフィン含有試料からの核酸の分離及び精製 |
| JP2010259443A (ja) * | 1998-04-28 | 2010-11-18 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | 組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法 |
| JP2013503639A (ja) * | 2009-09-03 | 2013-02-04 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 直接的な化学的溶解のための方法および組成物 |
| JP2014045689A (ja) * | 2012-08-30 | 2014-03-17 | Toppan Printing Co Ltd | 包埋組織からの核酸抽出方法、核酸抽出用キット、及び核酸抽出装置 |
| WO2022085530A1 (ja) * | 2020-10-19 | 2022-04-28 | 東洋紡株式会社 | 外来性核酸を検出する方法に供する試料の調製のための前処理方法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2228520T3 (es) | 1999-05-04 | 2005-04-16 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Capatura rapida y eficaz de adn de una muestra sin usar reactivo de lisis celular. |
| US7262006B1 (en) | 2000-05-01 | 2007-08-28 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Rapid and efficient capture of DNA from sample without using cell lysing reagent |
| CA2424584A1 (en) * | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Detection of ras mutations |
| GB2369822A (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-12 | Genovar Diagnostics Ltd | Nucleic acid extraction method and kit |
| GR1003896B (el) * | 2001-03-13 | 2002-05-23 | Γεωργακοπουλος Ελευθεριος Δρ. | ΝΕΑ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ (total RNA) ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ ΠΑΡΑΦΙΝΗΣ |
| WO2006039563A2 (en) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Epigenomics Ag | Method for providing dna fragments derived from an archived sample |
| US10233440B2 (en) | 2012-09-28 | 2019-03-19 | Cepheid | Methods for DNA and RNA extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples |
| TWI462930B (zh) * | 2013-06-06 | 2014-12-01 | Rbc Bioscience Corp | 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 |
| CN105420224A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-03-23 | 天津法莫西医药科技有限公司 | 从直肠癌石蜡包埋组织中提取dna的方法 |
| AU2016298048B2 (en) | 2015-07-24 | 2022-08-04 | Cepheid | Compositions and methods for DNA and RNA extraction from tissue samples |
| CN113265444A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-17 | 深圳职业技术学院 | 一种快速生物制品核酸释放试剂盒及核酸释放方法 |
| WO2023235875A1 (en) * | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Autonomous Medical Devices Incorporated | Methods for sample preparation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07236499A (ja) * | 1994-03-01 | 1995-09-12 | Sumitomo Metal Ind Ltd | 血液成分からのウイルス核酸抽出キットおよび該試薬を用いるウイルス核酸抽出方法 |
| JP2638684B2 (ja) * | 1993-08-13 | 1997-08-06 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 微生物ｄｎａのインサイチュー抽出法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US5229297A (en) | 1989-02-03 | 1993-07-20 | Eastman Kodak Company | Containment cuvette for PCR and method of use |
| US5334499A (en) * | 1989-04-17 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction |
| US5089233A (en) | 1989-06-12 | 1992-02-18 | Eastman Kodak Company | Processing apparatus for a chemical reaction pack |
| US5231015A (en) | 1989-10-18 | 1993-07-27 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme |
| NZ233270A (en) | 1990-04-10 | 1993-02-25 | Pacific Enzymes Ltd | Diagnosing characteristic dna sequence including preparing a sample of it and applying an amplification technique to it |
| US5380489A (en) | 1992-02-18 | 1995-01-10 | Eastman Kodak Company | Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes |
| US5338671A (en) | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| AUPN245295A0 (en) | 1995-04-13 | 1995-05-11 | Johnson & Johnson Research Pty. Limited | Assay for genetic abnormalities |
| CA2270023C (en) * | 1998-04-28 | 2010-10-12 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Improved methods for extracting nucleic acids from tissue samples and paraffin-embedded tissues |
-
1999
- 1999-04-27 CA CA 2270023 patent/CA2270023C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-27 EP EP99303263A patent/EP0953635B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1999-04-27 EP EP10075363A patent/EP2267127A1/en not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-07-23 JP JP2010166117A patent/JP5399993B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2638684B2 (ja) * | 1993-08-13 | 1997-08-06 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 微生物ｄｎａのインサイチュー抽出法 |
| JPH07236499A (ja) * | 1994-03-01 | 1995-09-12 | Sumitomo Metal Ind Ltd | 血液成分からのウイルス核酸抽出キットおよび該試薬を用いるウイルス核酸抽出方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6009004373, 臨床遺伝研究， １７ （１９９５） ｐ．１５−２３ * |
| JPN6009004375, ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４［３］ （１９９３） ｐ．４４８−４５３ * |
| JPN7009000563, Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ．， ４３［３］ （１９９３） ｐ．３０９−３２０ * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010259443A (ja) * | 1998-04-28 | 2010-11-18 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | 組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法 |
| US7303876B2 (en) | 2000-11-28 | 2007-12-04 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases |
| JP2008541761A (ja) * | 2005-05-31 | 2008-11-27 | インヴィトロジェン コーポレーション | パラフィン含有試料からの核酸の分離及び精製 |
| US9243241B2 (en) | 2005-05-31 | 2016-01-26 | Life Technologies Corporation | Separation and purification of nucleic acid from paraffin-containing samples |
| JP2013503639A (ja) * | 2009-09-03 | 2013-02-04 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 直接的な化学的溶解のための方法および組成物 |
| US10190152B2 (en) | 2009-09-03 | 2019-01-29 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for direct chemical lysis |
| US10323267B2 (en) | 2009-09-03 | 2019-06-18 | Becton Dickinson And Company | Methods and compositions for direct chemical lysis |
| US11434519B2 (en) | 2009-09-03 | 2022-09-06 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for direct chemical lysis |
| JP2014045689A (ja) * | 2012-08-30 | 2014-03-17 | Toppan Printing Co Ltd | 包埋組織からの核酸抽出方法、核酸抽出用キット、及び核酸抽出装置 |
| WO2022085530A1 (ja) * | 2020-10-19 | 2022-04-28 | 東洋紡株式会社 | 外来性核酸を検出する方法に供する試料の調製のための前処理方法 |
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