CN105420224A - 从直肠癌石蜡包埋组织中提取dna的方法 - Google Patents
从直肠癌石蜡包埋组织中提取dna的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，该方法包括脱蜡，消化和抽提和沉淀三个步骤，该提取方法只通过较少的步骤即可获得足够纯度和数量的DNA，可有效用于PCR扩增和DNA测序。该方法不仅易于操作，适合大规模生产，且制备的DNA体性质稳定、纯度高，对诊断直肠癌极具应用价值,为直肠癌石蜡包埋组织中DNA的制备提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA提取方法，特别涉及一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法。
背景技术
福尔马林固定石蜡包埋组织作为一种最为方便的临床材料来源，常被用于大宗病例的回顾性研究。近年，随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标记物的出现，以石蜡组织切片为材料进行分子水平的基因检测及筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段。对于各种基因分析方法而言，重要的是首先获得足够纯度和数量的DNA。传统的酚/氯仿抽提法是最早从直肠癌石蜡包埋组织中纯化DNA的方法，虽可满足PCR等分析要求，但其所用试剂毒性强、操作步骤复杂、样品损失量大，交叉污染也随之增多，不适合大量临床标本特别是常规检测的需要。目前已发展了多种改良方法以简化操作步骤，包括一些商品化的试剂盒，但仍然存在不同程度的缺陷。为此，本研究提出一种从直肠癌石蜡切片中快速提取DNA的方法，只通过较少的步骤即可获得足够纯度和数量的DNA，可有效用于PCR扩增和DNA测序。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种安全、简易、快速和高效的、并适于普通实验室应用和工业化生产的从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法。
本发明的技术方案概述如下：
从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
(1)脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为5-10μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入125-250μLpH为8.0-8.5的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热1-2min，取出后迅速离心，离心速度为14000-20000r/min，离心时间为8-12min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
(2)消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管，加入占样品A1倍体积的裂解缓冲液，56-60℃水浴恒定温加热30min-3h，加热期间分次或一次性添加20mg/mL蛋白酶K溶液5-10μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸8-15min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为14000-20000r/min，离心时间为8-12min，得上清液B；
(3)沉淀：将步骤②所得的上清液B转移到另一Eppendorf管，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
优选的，所述的提取缓冲液pH为8.0-8.5，由50mmol/LTris-HCL，1mmol/LEDTA，0.5％Tween-20组成，体积比为5:1:0.8。
优选的，所述的裂解缓冲液pH为8.0-8.5，由10mmol/LTris-HCL，0.5％Tween-20，450g/mL蛋白酶K组成，体积比为100:200:1。
优选的，所述的TE缓冲液pH为8.0-8.5，由10mMTris碱，1mMEDTA组成，体积比为5:1。
优选的，所述的石蜡包埋组织切片标本储存时间为24小时-10年。
本发明的有益效果是：
实验证明本发明的方法分离提取步骤短，能够高效剥离直肠癌组织中的DNA上的蛋白质以及RNA物质，获得较长片段DNA产品，避免了现有技术存在难以提取乳腺等患恶性肿瘤软组织中DNA的问题；
本发明所用试剂为低毒化合物，对环境和人体的危害小；由于不易被分解，所获得的产品可方便于远途运输和室温存贮；
本发明可以从存档病理蜡块中提取出高质量的DNA，进行肿瘤分子生物学的相关研究，使DNA研究不再依赖于新鲜或冰冻的组织，这在临床诊断、鉴别诊断和评估患者预后等方面均具有重要价值；
本发明操作简便、操作人员不需专业的技术便可操作，设备简单、成本低廉，所得到的DNA得率和纯度都极高；
本发明经过消化处理的DNA可直接用于PCR扩增和测序；
该发明适于普通实验室应用和工业化生产。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域的技术人员能够理解本发明，但并不对本发明做任何限制。
实施例1
一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
第一步：取样，样品储存时间为24小时
第二步：分离提取DNA
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为5μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入125μLpH为8.0的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热1min，取出后迅速离心，离心速度为14000r/min，离心时间为8min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管100μL，加入裂解缓冲液100μL，56℃水浴恒定温加热30min，加热期间分次添加20mg/mL蛋白酶K溶液5μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸8min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为14000r/min，离心时间为8min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B200μL转移到另一Eppendorf管，加入20μL3mol/L醋酸钠和400μL冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽干，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
其中提取缓冲液pH为8.0，由50mmol/LTris-HCL91.9μL，1mmol/LEDTA18.4μL，0.5％Tween-2014.7μL组成；裂解缓冲液pH为8.0，由10mmol/LTris-HCL33μL，0.5％Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL组成；TE缓冲液pH为8.0，由10mMTris碱5mL，1mMEDTA组成1mL。
实施例2
一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
第一步：取样，样品储存时间为10年
第二步：分离提取DNA
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为10μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入250μLpH为8.5的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热2min，取出后迅速离心，离心速度为20000r/min，离心时间为12min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管100μL，加入裂解缓冲液100μL，60℃水浴恒定温加热3h，加热期间分次或一次性添加20mg/mL蛋白酶K溶液10μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸15min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为20000r/min，离心时间为12min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B200μL转移到另一Eppendorf管，加入20μL的3mol/L醋酸钠和400μL冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
其中提取缓冲液pH为8.5，由50mmol/LTris-HCL91.9μL，1mmol/LEDTA18.4μL，0.5％Tween-2014.7μL组成；裂解缓冲液pH为8.5，由10mmol/LTris-HCL33μL，0.5％Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL组成；TE缓冲液pH为8.5，由10mmol/LTris碱5mL，1mmol/LEDTA1mL组成。
实施例3
一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
第一步：取样，样品储存时间为8年
第二步：分离提取DNA
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为8μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入200μLpH为8.3的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热1min，取出后迅速离心，离心速度为16000r/min，离心时间为10min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A100μL转至新收集管，加入裂解缓冲液100μL，60℃水浴恒定温加热2h，加热期间分次添加20mg/mL蛋白酶K溶液8μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸10min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为16000r/min，离心时间为10min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B200μL转移到另一Eppendorf管加入20μL的3mol/L醋酸钠和400μL冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
其中提取缓冲液pH为8.3，由50mmol/LTris-HCL91.9μL，1mmol/LEDTA18.4μL，0.5％Tween-2014.7μL组成；裂解缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris-HCL33μL，0.5％Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL组成；TE缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris碱5mL，1mmol/LEDTA1mL组成。
实施例4
一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
第一步：取样，样品储存时间为2年
第二步：分离提取DNA
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为9μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入225μLpH为8.3的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热2min，取出后迅速离心，离心速度为18000r/min，离心时间为10min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A100μL转至新收集管，加入裂解缓冲液100μL，56-60℃水浴恒定温加热2.8h，加热期间一次性添加20mg/mL蛋白酶K溶液9μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸8-15min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为18000r/min，离心时间为11min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B200μL转移到另一Eppendorf管，加入20μL的3mol/L醋酸钠和400μL积冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
其中提取缓冲液pH为8.3，由50mmol/LTris-HCL91.9μL，1mmol/LEDTA18.4μL，0.5％Tween-2014.7μL组成；裂解缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris-HCL33μL，0.5％Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL组成；TE缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris碱5mL，1mmol/LEDTA1mL组成。
实施例5
一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
第一步：取样，样品储存时间为3年
第二步：分离提取DNA
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为7μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入175μLpH为8.4的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热1min，取出后迅速离心，离心速度为16000r/min，离心时间为8min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A100μL转至新收集管，加入100μL裂解缓冲液，58℃水浴恒定温加热2h，加热期间一次性添加20mg/mL蛋白酶K溶液7μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸9min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为16000r/min，离心时间为8min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B200μL转移到另一Eppendorf管，加入20μL的3mol/L醋酸钠和400μL冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
其中提取缓冲液pH为8.3，由50mmol/LTris-HCL91.9μL，1mmol/LEDTA18.4μL，0.5％Tween-2014.7μL组成；裂解缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris-HCL33μL，0.5％Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL组成；TE缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris碱5mL，1mmol/LEDTA1mL组成。
实施例6
一种从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
第一步：取样，样品储存时间为5年
第二步：分离提取DNA
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为6μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入200μLpH为8.4的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热1.5min，取出后迅速离心，离心速度为15000r/min，离心时间为9min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A100μL转至新收集管，加入100μL裂解缓冲液，56℃水浴恒定温加热1.5h，加热期间分次或一次性添加20mg/mL蛋白酶K溶液6μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸9min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为15000r/min，离心时间为9min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B200μL转移到另一Eppendorf管，加入20μL的3mol/L醋酸钠和400μL冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
其中提取缓冲液pH为8.3，由50mmol/LTris-HCL91.9μL，1mmol/LEDTA18.4μL，0.5％Tween-2014.7μL组成；裂解缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris-HCL33μL，0.5％Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL组成；TE缓冲液pH为8.3，由10mmol/LTris碱5mL，1mmol/LEDTA1mL组成。
发明相关提取方法比较试验：
分别采用下列2种方法对来自同一个蜡块的石蜡切片进行基因组DNA的提取，以比较不同方法间的提取效率。首先将该蜡块切成厚10μm切片，分别放入2mL无菌离心管中，之后按下面步骤进行提取，并将每个实验重复3次。
实验组1采用实施例2中所述DNA提取方法，实施例2按照下述试剂盒法提取DNA。
试剂盒法提取过程如下：
提取按照QIAmpDNAminikit(QIAGENLtd，英国)的说明书进行。向装有切片的离心管中加入1mL二甲苯剧烈涡旋振荡，16000r/min离心5分钟后弃上清，加入1mL乙醇颠倒洗涤，16000r/min离心5分钟后，弃上清。重复脱蜡-洗涤1次。室温干燥后用ATL缓冲液180μL重悬组织并加入20μLProteinaseK，涡振混合，56℃孵育至组织完全裂解，大约8h，消化过程中每0.5h涡振混合1次。加入AL缓冲液圆200μL，涡振15s，70℃孵育10min。加入200μL乙醇，涡振15s。将混合物加入吸附柱中，8000r/min离心员1min后分别用500μL缓冲液AW1和AW2离心洗涤2次。最后向吸附膜加入100μL双蒸水，室温放置2min，8000r/min离心1min，洗脱液冻存于-20℃。
提取结果比较：
表1四种DNA提取方法结果的比较
上述参照实施例对该从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，其特征是包括如下步骤：
①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为5-10μm的组织片，取3片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入125-250μLpH为8.0-8.5的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中高火加热1-2min，取出后迅速离心，离心速度为14000-20000r/min，离心时间为8-12min，取出置-20℃条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A；
②消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管，加入占样品A1倍体积的裂解缓冲液，56-60℃水浴恒定温加热30min-3h，加热期间分次或一次性添加20mg/mL蛋白酶K溶液5-10μL，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸8-15min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为14000-20000r/min，离心时间为8-12min，得上清液B；
③沉淀：将步骤②所得的上清液B转移到另一Eppendorf管，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70％冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，其特征在于，所述的提取缓冲液pH为8.0-8.5，由50mmol/LTris-HCL，1mmol/LEDTA，0.5％Tween-20组成，体积比为5:1:0.8。
3.根据权利要求1所述的从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，其特征在于，所述的裂解缓冲液pH为8.0-8.5，由10mmol/LTris-HCL，0.5％Tween-20，450g/mL蛋白酶K组成，体积比为100:200:1。
4.根据权利要求1所述的从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，其特征在于，所述的TE缓冲液pH为8.0-8.5，由10mMTris碱，1mMEDTA组成，体积比为5:1。
5.根据权利要求1所述的从直肠癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，其特征在于，所述的石蜡包埋组织切片标本储存时间为24小时-10年。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160323 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |