DE69805649T2 - Isolierung von nukleinsäuren - Google Patents

Isolierung von nukleinsäuren

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von Nucleinsäuren aus biologischem Material, insbesondere Blut.
  • Es besteht eine starke Nachfrage nach DNA-Analysen für eine Reihe von Anwendungsgebieten, was die Entwicklung rascher, sicherer, leistungsstarker Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DNA und anderen Nucleinsäuren notwendig machte.
  • Proben zur Verwendung in der DNA-Identifikation oder -Analyse können aus einer Vielzahl von Quellen gezogen werden, z. B. aus biologischem Material wie etwa Tier- und Pflanzenzellen, Fäkalien, Gewebe usw., aber auch aus dem Boden, Nahrungsmitteln, Wasser usw.
  • Bestehende Verfahren zur Extraktion von DNA umfassen beispielsweise die Anwendung von Phenol/Chloroform-Aussalzen, der Einsatz chaotroper Salze und Kieselsäureharze, die Nutzung von Affinitätsharzen, Ionenaustausch-Chromatographie und die Verwendung von Magnetperlen. Verfahren werden in den US-Patenten 5.057.426, 4.923.978, den EP-Patenten 0512767A1 und 0515484B sowie der WO 95/13368, WO 97/10331 und WO 96/18731 beschrieben. Diese Patente und Patentanmeldungen offenbaren Verfahren zum Adsorbieren von Nucleinsäuren an einen festen Träger und anschließenden Isolieren der Nucleinsäuren. Die bekannten Verfahren verwenden Lösungsmittel, um die Nucleinsäuren zu isolieren, und diese Lösungsmittel sind entflammbar, brennbar oder toxisch.
  • EP 0.707.077 A beschreibt das Einfangen und die selektive Freisetzung von Nucleinsäure aus einem Lysat durch ein wasserlösliches, schwach basisches Polymer, um einen Niederschlag mit dem Polymer zu bilden. Der Niederschlag wird dann abgetrennt und die Nucleinsäure aus dem Polymer unter extrem salzreichen Bedingungen sowie unter Einsatz von starken Basen oder Erhitzen freigesetzt.
  • Blut ist eine der in den größten Mengen verfügbaren Quellen für DNA-Analysen, da Blutproben routinemäßig aus den unterschiedlichsten Gründen gezogen werden. Aufgrund der viskosen und proteinhältigen Beschaffenheit von Blut stellte es sich aber bei der Anwendung bekannter DNA-Extraktionsverfahren als schwierig heraus, Automatisierung zu erreichen, da sich bei der Handhabung großer Volumina, die relativ geringe DNA-Mengen enthalten, Probleme einstellen. Bislang konnte die Nucleinsäure-Extraktion nur durch Verwendung gefährlicher Reagenzien und langsamer Verarbeitungszeiten teilweise automatisiert werden.
  • Die Anmelder entwickelten nun ein verbessertes Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und anderer Biomoleküle aus Blut und anderen biologischen Materialien.
  • Demzufolge bietet die Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren von Nucleinsäure aus einem biologischen Material wie in Anspruch 1 dargelegt.
  • Das Verfahren ist besonders dann geeignet, wenn das biologische Material Blut ist, doch es kann auch für eine Reihe unterschiedlicher Anwendungszwecke und Substanzen herangezogen werden, wie z. B. Plasmid- und Vektorisolierung sowie Pflanzen-DNA-Extraktion.
  • Vorzugsweise werden die Zellen im Blut lysiert, um Nucleinsäuren freizusetzen; es können bekannte Lysiermittel und Verfahren angewendet werden, z. B. In-Kontakt-Bringen mit ionischen und nichtionogenen Detergenzien, hypotonischen Lösungen von Salzen, Proteasen, chaotropen Mitteln, Lösungsmitteln, durch pH-Wert-Änderungen oder Wärme. Ein Verfahren zum Lysieren von Zellen zwecks Isolieren von Nucleinsäure ist in WO 96/00228 beschrieben.
  • Wenn das biologische Material aus Blut besteht, können die Proben gegebenenfalls mit Wasser oder einem anderen Verdünner verdünnt werden, damit die Manipulation und Verarbeitung vereinfacht werden können.
  • Verdünnungen bis zum Zehnfachen sind möglich, und im Allgemeinen sind stärkere Verdünnungen besser, doch es ist auch ein Merkmal der Erfindung, schwache Verdünnungen von Blut zuzulassen.
  • Die feste Phase, mit der das Blut in Kontakt gebracht wird, kann aus einem Material bestehen, das natürliche Affinität für Nucleinsäuren aufweist, oder aus einem Material bestehen, dessen Oberfläche mit einem Mittel behandelt ist, das bewirkt, dass sich Nucleinsäuren daran binden, oder seine Affinität für Nucleinsäuren steigert. Geeignete Materialien sind Glas mit gesteuerter Porengröße, Polysaccharid (Agarose oder Cellulose), andere Arten von Silica/Glas, Keramikmaterialien, poröse Kunststoffmaterialien, wie z. B. poröse Kunststoffstöpsel (als einstückige Formteile oder als Einsatz in einem Standardröhrchen), Polystyrolperlen, paramagnetische Perlen usw. Die Größe und Porosität ist nicht entscheidend und kann je nach Anwendung variieren und ausgewählt werden.
  • Geeignete Mittel zur Behandlung der Oberfläche der festen Phase oder zu deren Derivatisierung sind die Behandlung mit einer Substanz, die eine Ladung, z. B. eine positive Ladung, auf der Oberfläche oder einer hydrophilen oder hydrophoben Oberfläche der Festphase einführen kann, wie z. B. Hydroxylgruppen, Nitratgruppen, autoreaktive Gruppen, Farbstoffe und andere aromatische Verbindungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bewirkt die feste Phase, dass sich DNA bei einem bestimmten pH-Wert gegenüber Verunreinigungen bevorzugt daran bindet, und sie ermöglicht es der gebundenen Nucleinsäure, freigesetzt zu werden, wenn sie mit einem Eluenten bei einem unterschiedlichen pH-Wert in Kontakt gebracht wird. Dieses System kann zusammen mit einer festen Phase verwendet werden, die Histidin oder ein Polyhistidin inkorporiert, die dazu neigen, Nucleinsäuren bei niedrigem pH von z. B. weniger als 6 zu binden und die gebundenen Nucleinsäuren freizusetzen, wenn der pH auf z. B. mehr als 8 erhöht wird. Alternativ dazu werden die Nucleinsäuren bei im Wesentlichen neutralem pH an eine aminierte Oberfläche gebunden und bei sehr hohem pH freigesetzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann ein Kunststoffformteil ein Bindemittel, z. B. in einem Napf in einer Platte usw., enthalten, so dass das Bindemittel in der Oberfläche inkorporiert ist. Die Blutprobe wird dann mit der Oberfläche in Kontakt gebracht damit sich Nucleinsäuren an die Oberfläche binden. Die Blutprobe wird dann entfernt und die Oberfläche mit einem Eluenten behandelt, um die gebundenen Nucleinsäuren freizusetzen. Wenn die Oberfläche Teil eines Napfes in einer Platte mit mehreren Näpfen ist, kann das gesamte System problemlos auf rasches und umfangreiches Probeziehen und Extraktionstechniken abgestimmt werden.
  • Geeignete Bindemittel sind Ionenaustauschharze mit umpolbarer Ladung unter Verwendung einer positiv geladenen festen Phase, die durch Änderung des pH über ihren pKa hinaus umgepolt oder neutralisiert werden kann, z. B. Nucleotide, Polyamine, Imidazolgruppen und andere ähnliche Reagenzen mit einem geeigneten pKa-Wert.
  • Nucleinsäuren können auch durch Interkalation unter Einsatz unterschiedlicher Einlagerungsverbindungen gebunden werden, die in die feste Phase inkorporiert sind, z. B. Actinomycin D, Ethidiumbromid usw.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Kunststoffoberfläche modifiziert sein, um funktionelle Gruppen zu enthalten. Der Kunststoff kann jeder Kunststoff sein, der Proben enthält, z. B. Polypropylen. Die funktionellen Gruppen können positiv oder negativ geladen sein, um die Nucleinsäuren in der korrekten Pufferlösung zu binden.
  • Alternativ dazu können die funktionellen Gruppen chemische Gruppen sein, die zu kovalenter Bindung an andere Liganden oder Polymere fähig sind.
  • Wenn der Kunststoff in einem Kunststoffformkörper verwendet wird, z. B. in einem Napf einer Platte oder als PCR-Röhrchen, können die Oberflächeneigenschaften des Kunststoffs entsprechend an die Verwendung in der Erfindung angepasst werden, indem die geeigneten Chemikalien der Formungsverbindung zugesetzt werden, z. B. wie im Fall einer Verbindung zum Spritzgussformen.
  • Wenn der Kunststoff in einem PCR-Röhrchen oder einer Tiefnapfplatte verwendet wird, können die Röhrchen oder Näpfe dazu dienen, kleine Mengen an DNA oder RNA zu isolieren und zu immobilisieren, wodurch ein reines Templat für anschließende PCR oder andere Genanalysen und -manipulationen entsteht.
  • Wenn der Kunststoff Polypropylen ist, z. B. in Form eines dünnwandigen PCR-Röhrchens vorliegt, kann die Polypropylen-Oberfläche modifiziert werden, indem sie mit einem Oxidationsmittel, wie z. B. Kaliumpermanganat und Schwefelsäure, oxidiert wird, um eine carboxylierte Oberfläche (COOH-Gruppen) zu schaffen. Dieses Röhrchen kann dann dazu dienen, die Isolierung von DNA aus Lösungen oder aus Rohproben, wie z. B. Blut, zu verbessern. Durch Einstellen von pH-Wert, Dielektrizitätskonstante, Löslichkeit oder Ionenstärke kann die DNA oder RNA auf den Wänden des Röhrchens immobilisiert, von Verunreinigungen befreit und auf PCR oder andere analytische Techniken vorbereitet werden.
  • Die Nucleinsäuren können in einem salzarmen Puffer eluiert werden, so dass sie auf PCR oder andere Analysen vorbereitet werden können.
  • Die Festphase kann mit einer Blutprobe in Kontakt gebracht werden, indem sie mit der Festphase in einer Misch/Rührvorrichtung vermischt und über die Festphase geleitet wird; die Festphase kann auch paramagnetisch und durch ein Magnetfeld manipuliert sein. Obwohl sich die Erfindung nicht besonders für die Trennung oder Isolierung von Nucleinsäuren aus Blut eignet, kann sie für eine Reihe von Biomolekülen verwendet werden - insbesondere für jene, die die Entfernung von Zellwandbruchstücken oder unlöslichen Teilchen erfordern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Festphase in Granularform in einer Säule vor, und die Blutprobe wird mittels eines Druckunterschieds, das über die Säule angelegt wird, durch die Säule hochgezogen. Die Blutprobe wird mit Luft hochgezogen und das granulare feste Material kann verflüssigt werden, wodurch die Mischung und Kontaktraten verbessert und ein Verstopfen minimiert wird.
  • Das Verfahren der Erfindung eignet sich für ein Mehrfachnapf-Format, worin eine Reihe von Extraktionen aus unterschiedlichen Proben im Wesentlichen gleichzeitig stattfinden kann, wobei dies die Automatisierung des Extraktionsverfahrens erleichtert, eine Extraktion mit hohem Durchsatz ermöglicht und die Durchführung von Kombinationschemie erlaubt. Auf diese Weise wird der Durchsatz in einer herkömmlichen Napfanordnung, z. B. mit 8 · 12 Näpfen, erhöht, sodass viele Probentypen gleichzeitig und automatisiert behandelt werden können.
  • Es folgt eine Erklärung der Erfindung anhand von Beispielen.
    • Beispiel 1 Extraktion von Nucleinsäuren aus Vollblut
  • Ein Ionenaustauscher mit umpolbarer Ladung wurde durch kovalentes Binden von Polyhistidin an 100 (m Glasperlen unter Einsatz von Glutaldehyd mittels Vermischen von 1 g der aminierten Glasperlen mit 0,01 Vol.-% Glutaldehyd in 0,1 M Natriumbicarbonat bei pH 8, umfassend 20 mg Polyhistidin, hergestellt. Nach Inkubation über Nacht wurden die Perlen ausgiebig gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen, und in 10 mM MES, pH 5, umfassend 0,1 Vol.-% Tween 20, gelagert.
  • Etwa 300 mg der 100 (m derivatisierten Glasperlen wurden einer an beiden Enden verschlossenen 1 ml-Kunststoffsäule zugesetzt.
  • Eine Blutprobe wurde mit demselben Volumen an 10 mM MES, pH 5, umfassend 1% Tween 20, Proteasen (200 g/ml) und 1 mM EDTA, inkubiert. Nach Beendigung der Spaltung wurde das Blut über die die Glasperlen enthaltende Säule nach oben gesaugt und die DNA immobilisiert, wodurch verunreinigende Proteine hindurchtreten konnten und verworfen wurden.
  • Die Glasperlen mit der immobilisierten DNA wurden mit einem Puffer, umfassend 10 mM MES, pH 5, 1% Tween 20 und 1 mM EDTA, gewaschen, wobei dieser Vorgang wiederholt wurde, bis die Waschlösung farblos war.
  • Nach dem Waschen wurden die Perlen mit Luft getrocknet und DNA mit einer geringen Menge an 10 mM Tris HCl, pH 8,5, eluiert und in einem für die Analyse verwendbaren sterilen Röhrchen gesammelt. Somit war DNA vom Blut getrennt.
  • Für unterschiedliche Biomoleküle kann der Puffer usw. entsprechend modifiziert sein.
    • Beispiel 2
  • 1 g carboxylierte paramagnetische Perlen wurden in 50 mM Imidazolpuffer, pH 6, gewaschen und dann mit 100 mg Polyhistidin in 50 ml 50 mM Imidazolpuffer, pH 6, vermischt. Ein chemischer Haftvermittler (EDC) wurde in einer Endkonzentration von 5 mg/ml zugesetzt und über Nacht vermischt. Die Perlen wurden in Wasser, 0,5 M Natriumchlorid, 1% Tween 20, 100 mM Tris HCl, pH 8, gewaschen und in 10 mM MES, 0,1% Tween 20, pH 5, gelagert.
  • Um DNA aus Blut zu extrahieren, wurde 1 mg Perlen mit Blut vermischt (verdünnt in 10% Tween 20 mit 25 mM MES, 1 mM EDTA, pH 5). Die Perlen wurden mit einem Magneten abgetrennt und durch erneutes Suspendieren in 1 mM MES; 0,1% Tween 20 gewaschen. Um die DNA zu eluieren, wurden die Perlen in 10 mM Tris HCl, pH 8,5, resuspendiert und mit einem Magneten abgetrennt, so dass die DNA in Lösung zurückblieb.

Claims (25)

1. Verfahren zum Extrahieren von Nucleinsäure aus einem Nucleinsäure-hältigen biologischen Material, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
das In-Kontakt-Bringen des biologischen Materials mit einer Festphase bei einem ersten pH, bei dem die Festphase eine positive Ladung aufweist, so dass sich die Nucleinsäure gegenüber Verunreinigungen bevorzugt im biologischen Material an die Festphase bindet;
das Freisetzen der Nucleinsäure bei einem zweiten, höheren pH, der über dem pKa der Festphase liegt, um die positive Ladung umzupolen oder zu neutralisieren, um die gebundene Nucleinsäure aus der Festphase freizusetzen;
worin die Festphase aus einem Glas mit regulierter Porengröße, einem Polysaccharid, einem Keramikmaterial, einem porösen Kunststoffmaterial, einem Kunststoffmaterial, Polystyrolperlen, paramagnetischen Perlen oder einem porösen Kunststoff-Pfropfen besteht, der ein einzelner Formteil oder ein Einsatz für einen Behälter ist; und
worin die Nucleinsäure unter Einsatz eines salzarmen Puffers freigesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kunststoffmaterial in Form einer Pipettenspitze, einer Napfplatte oder einer Tiefnapfplatte oder in Form eines PCR-Röhrchens vorliegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die eluierte Nucleinsäure zur Analyse oder Amplifizierung unter Einsatz von PCR bereit ist, ohne dass weitere Reinigung erforderlich ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der salzarme Puffer 10 mM Tris-HCl mit pH 8,5 ist.
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin sich die Nucleinsäure bei einem pH unter 6 an die Festphase bindet und bei einem pH über 8 von der Festphase freigesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin sich die Nucleinsäure bei einem im Wesentlichen neutralen pH an die Festphase bindet und bei einem pH über 10 von der Festphase freigesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase aus einem Material besteht, das eine natürliche Affinität für Nucleinsäuren aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase aus einem Material besteht, dessen Oberfläche mit einem Mittel behandelt ist, das eine positive Ladung einführt, um zu bewirken, dass sich Nucleinsäuren daran binden, oder um seine Affinität für Nucleinsäuren zu erhöhen.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die zur Bindung von Nucleinsäure fähige Festphase einen Ionenaustauschharz mit veränderbarer Ladung ist, das eine positive Ladung aufweist, die durch Änderung des pH über seinen pKa umgepolt oder neutralisiert werden kann.
10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Ionenaustauschharz ein Nucleotid, ein Polyamin oder eine Verbindung umfasst, die eine Imidazolgruppe enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Oberfläche des festen Materials mit Histidin oder einem Polyhistidin behandelt ist.
12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase eine Kunststoffoberfläche umfasst, die so modifiziert ist, dass sie funktionelle Gruppen enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin das Kunststoffmaterial Polypropylen ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Polypropylenoberfläche durch Oxidieren der Oberfläche mit einem Oxidationsmittel modifiziert wird, um ein carboxylierte Oberfläche zu schaffen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Carboxylgruppen weiters durch kovalente Bindung einer Anionenaustauschgruppe modifiziert werden, um die Bindung von Nucleinsäuren durch Ladungswechselwirkung zu ermöglichen.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Anionenaustauschgruppe Imidazol, Polyhistidin oder ein starker oder schwacher Ionenaustauscher ist.
17. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase ein PCR-Röhrchen oder eine Napfplatte ist, die verwendet wird, um geringe Mengen an Nucleinsäure zu isolieren und zu immobilisieren, wodurch ein Templat für nachfolgende PCR oder andere genetische Analyse und Manipulation erzeugt wird.
18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase eine Mehrnapfplatte ist, wodurch es ermöglicht wird, dass eine Reihe von Nucleinsäureextraktionen aus verschiedenen Proben im Wesentlichen gleichzeitig erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase mit einer Blutprobe in Kontakt gebracht wird, indem sie in einer Misch/Rühr-Vorrichtung mit dem festen Material vermischt wird, indem die Blutprobe über die Festphase geschickt wird oder indem die Festphase auf einem magnetisierbaren Träger manipuliert wird.
20. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Festphase eine Säule ist und die Blutprobe durch die Säule aufgezogen wird, indem ein Druckunterschied durch die Säule angelegt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Blutprobe mit Luft aufgezogen wird und die Festphase fließfähig gemacht wird.
22. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Probe eine Blutprobe ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, worin Zellen im Blut lysiert werden, um die Nucleinsäure freizusetzen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die Zellen lysiert werden, indem sie mit einem ionischen oder nichtionischen Detergens, hypotonischen Lösungen eines Salzes, einer Protease oder einem chaotropen Mittel in Kontakt gebracht werden, oder unter Einsatz von pH-Änderungen oder Wärme.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, umfassend das Verdünnen der Blutprobe mit Wasser oder anderen Verdünnern, so dass sie leichter manipulierbar und fließfähig ist.
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