JPH01125395A - 核酸浦獲試薬 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景コ （発明の分野） この発明は、複合した生物学的または臨床試料からの核
酸の分離および単離または精製の分野に関する。

（先行技術の簡単な記載） 液体生物学的試料からのデオキンリボ核酸（ＤＮＡ）の
様々な分離方法は当業界において公知であるが、非常な
時間の浪費または複雑で面倒なものである。

ＤＮＡがニトロセルロースに付着することは公知である
。ＤＮＡを含有する液体試料をニトロセルロース・フィ
ルターに適用すると、ＤＮＡはフィルターに付着または
結合する。問題となるのは、蛋白質もまたニトロセルロ
ースに結合することである。従って、この方法はＤＮＡ
だけに特異的なものではない。

試料からの別のＤＮＡ分離方法は、スクロースまたは塩
化セシウム密度勾配による超遠心分離である。この方法
では、浮遊密度または沈降係数に従い、ＤＮＡを他の巨
大分子、例えば蛋白質から分離する。生物学的試料を遠
心分離管において密度勾配により層状にし、非常に高速
で長期間回転させて密度勾配によりＤＮＡを浮遊させる
。この方法は、満足すべきものであるが、非常な時間の
浪費で骨の折れる方法である。遠心分離時間はＩ試料光
たり２０時間またはそれ以上であり得る。

さらに、試料を長く回転させ過ぎた場合、ＤＮＡは試料
から分離するが、試料中の他の成分と一緒に遠心分離管
の真底へ勾配を完全に通過してしまう。従って、この方
法もまた複合体試料からの迅速で容易なりＮＡ分離方法
として適当ではない。

液体試料からの化学的なりＮＡ分離方法もまた公知であ
る。フェノール抽出およびエタノール沈澱は標準的な実
験方法であるが、各々難点を有する。フェノールは毒性
物質であり、フェノール抽出の場合、続いて時間のかか
る処理、例えば他の有機試薬による抽出または透析を行
うことにより試料を精製する必要がある。さらに、複合
体混合物からのＤＮＡの分離は、核酸結合特性を有する
分子からの妨害を被る。エタノールはＤＮＡのみならず
多くの蛋白質を沈澱させるため、ＤＮＡをさらに試料中
の他の蛋白質全てから分離しなければならない。

最後の方法として、アガロースまたはポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動を用いて生物学的試料からＤＮＡを分
離する。この方法では、ゲルを含むガラスまたはプラス
チック・レセプタクルの一端に試料を適用し、電流をレ
セプタクルの全長に適用する。負に荷電している核酸分
子は陽極に向かって移動するが、分子が大きいきゆっく
りと移動する。分子の移動速度は、それらの分子量並び
にゲル材料中にお（プる架橋の濃度および程度に左右さ
れる。次いで、ＤＮＡが位置するゲルの部分を切り取り
、最後にＤＮＡを抽出することにより、ＤＮＡをゲルか
ら除去する。これもまた時間の浪＝７− 費で非常に骨の折れる方法であり、さらにＤＮＡをゲル
から分離しなければならない。

電気泳動ゲル法によりＤＮＡを分離する場合、ＤＮＡを
何等かの方法で染色して可視化する必要がある。一般的
に、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を染色剤として
使用する。エチジウムブロマイドは、ＤＮＡの二重螺旋
構造ＤＮＡ塩基対間の挿入（インターカレーション）に
よりＤＮＡに付着する。ＤＮＡ染色におけるエチジウム
ブロマイドの使用は、ノヤープ等、ｒデイテクション・
オブ・トウ・リストリクジョン・エンドヌクレアーゼ・
アクティビティーズ・イン・ヘモフィルス・パラインフ
ルエンザエ・ユージング・アナリテイカル・アガロース
−エチジウム・ブロマイド・エレクトロフォレシス」、
［バイオケミストリーｊ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、１２巻、３０５５−３０６３頁（１９７３年）に記載
されている。この参考文献は、エチジウムブロマイドが
ＤＮＡの染色に使用される制限酵素の急速な検定を開示
している。

染色剤としてのエチジウムブロマイドの幾分異なる適用
法には、エチジウムブロマイドを固体支持体に結合させ
る例がある。米国特許第４１１９５２１号（キリキャン
、■９７８年ＩＯ月ＩＯ日付）は、活性化多糖類の蛍光
ＤＮＡ挿入剤秀導体を開示している。この特許における
誘導体は、蛍光染料として機能し、短波長紫外放射線励
起下においてＤＮＡおよびそれらのフラクションの直接
的可視化を達成する。この特許で使用される挿入剤は、
エチジウムハライドであり、好ましい薬剤はエチジウム
ブロマイドである。この薬剤は活性化多糖類、例えばア
ガロースと共有結合する。

ダーバンおよびベラカー、「モレキュラー・レコグニン
ヨン・オブ・ＤＮＡ・パイ・スモール・モレキ、−ルズ
。シンセソス・才ブ・ビス（メチジウム）スペルミン、
ア・ＤＮＡ・ポリインターカレイティング・モレキュー
ル」、［ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル
・ソザエティーＪ（Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
５ｏｃｉｅｔｙ）、１００巻、１９６８−１９７０頁（
１９７８年）は、ビス（メチジウム）スペルミン（ＢＭ
ＳＩ））の合成および研究を開示している。この分子は
、スペルミン・リンカ−により連結された２つの別々の
メチジウム挿入剤の存在故にポリインターカレーターと
して記載された。スペルミンは、核酸に対するその公知
アフィニティーおよびその長さ故にインターカレーター
との結合に選択され、隣接排除結合モデルによる非隣接
挿入部位への到達に十分な結合構造を呈している。

さらにダーバンおよびベラカーの研究は、ＢＭｓｐおよ
びエチジウムブロマイドが同様に挿入することを示した
。しかしながら、ＢＭＳｐは、モノマー、エチジウムブ
ロマイドよりも数段階強力な結合定数を有する。

バヂエック等、［アナリティカル・バイオケミストリー
Ｊ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）、１２４巻、４１４−４２０頁（１９８２年）は、遊
離溶液並びにポリアクリルアミドおよびアガロース・ゲ
ルから核酸を回収するエチジウム−アクリルアミド・ア
フィニティー媒質を開示している。このアフィニティー
媒質は、エチジウムブロマイドが付着しているアクリル
アミド・マトリックスを成分とする。明らかに、核酸は
緩衝塩溶液によりこの媒質から溶離され、直接エタノー
ル沈澱により濃縮され得る。

エヂジウムーアクリルアミト・アフィニティー媒質は、
ポリアクリルアミド・マトリックスの存在下、適当な緩
衝液中、エチジウムブロマイド、ＢＴＳ（Ｎ、Ｎ−メチ
レンビスアクリルアミド）、ＴＥＭＥＤ（Ｎ、Ｎ、Ｎ”
、Ｎｏ−テトラメヂルエヂレンジアミン）および過硫酸
アンモニウムの反応により合成される。エチジウムブロ
マイドが存在する場合、それはメチレンビスアクリルア
ミド・スペイサ−・アームによるアクリルアミド・マト
リックスとの共有結合であると思われる。

この参考文献は、微粒子アクリルアミド・マトリックス
としてのバイオ−ゲルＰ−４の使用を開示している。メ
チレンビスアクリルアミドの架橋特性は、エチジウムと
バイオ−ゲルＰ−４の結合に明らかに重要である。この
ゲルとエチジウムとの結合はまた、ある程度反応におけ
る緩衝液の組成により異なる。著者は、アフィニティー
媒質との相互作用に十分な時間を与えること（すなイつ
ち、６靜スポイト中３ｖｒＱベツド容量および１５分平
衡において０．４４靜／分の流速）は定量的結合に不可
欠であると記している。しかしながら、カラムによる１
５分平衡直後のＲＮＡの溶離は、何等かの明白な不可逆
性結合の回避に必要であった。

トーツスおよびンエヘター、［アナリティカル・バイオ
ケミストリーＪ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）、９１巻、２０９−２２３頁（１，９７
８年）は、置換アガロース・ゲルに基づく直接的物理的
測定およびゲル結合エチジウムの転移ＲＮＡへの挿入の
証拠を開示している。この参考文献は、エチジウムブロ
マイド塩（３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フエニ
ルフエナントリジニウムブロミド）のカヂオンが中間体
３，３°−ジアミノジプロピルアミノスフノニル・スペ
ーサー・アームを介してアカロース・マトリックスと共
有結合していたことを報告している。

この文献はまた、分配結合およびゲル自体の直接スベク
トル測定から測定されたアガロース・ゲルと共有結合し
たエヂジウムカヂオンとｔＲＮＡの結合の化学量および
性質を開示している。様々な測定の実施によりエチジウ
ム−ｔ　ＲＮ　Ａ　相Ｍ　作用の研究を行った。蛍光増
大およびスペクトル赤方偏移を観察および測定すると、
ゲルに結合したｔＲＮＡＯ量？こ比例していた。また実
験により、ＮａＣＱ濃度を高めるとゲルに結合したｔＲ
ＮＡのパーセンテージは低下することが示された。約１
゜３またはそれより高いモル濃度の場合、０％の結合状
態であった。著者は、エチジウムブロマイドが挿入によ
りｔＲＮＡと結合しているという結論に達した。この参
考文献は、複合体未精製混合物、例えば臨床試料からＤ
ＮＡまたはＲＮＡを単離する捕獲試薬の現実的または推
論的使用法を全く証明していない。従って、未精製臨床
試料からの迅速で有効なりＮＡ分離方法に対する要望が
なお存続している。

［発明の要旨］ この発明の核酸捕獲試薬は、ＤＮＡ螺旋中に挿入可能な
分子を含む。分子リンカ−を介して固体支持体にインタ
ーカレーターを付着させる。挿入分子および場合により
リンカ−は、緩衝系または複合体生物流体に存在する核
酸に結合する。固体支持体の不活性特性により、単純な
手順、例えば短い遠心分離またはろ過手段による非結合
材料からのｎη記捕獲試薬−核酸複合体の分離が可能と
なる。−旦捕獲試薬−核酸複合体が試料の残りから分離
されると、結合した核酸は簡単に捕獲試薬から放出およ
び分離され得る。放出された核酸は例えば分子ハイブリ
ダイゼーション方法により特性証明および定電化され得
る。

この発明の捕獲試薬を用いて未精製生物試料、例えば血
清、頚管試料、糞試料、唾液痰）、血液、尿、体内組織
および体液から核酸を単離することができる。また捕獲
試薬を用いて、ハイブリダイゼーションされていない材
料の酵素消化から生成した小核酸フラグメントからハイ
ブリダイゼーションされた核酸を分離することもできる
。さらに、捕獲試薬を用いて、プラスミド試料において
直線状ＤＮＡおよび切り込み環状ＤＮＡがらスーパーコ
イル・プラスミドを分離することができる。また、この
発明の捕獲試薬を用いて可溶化アガロースまたはアクリ
ルアミド・ゲルから核酸を単離することもできる。ＤＮ
Ａを含有または成分とする他の試料もこの発明の捕獲試
薬および方法により使用され得る。この発明の捕獲試薬
および方法を用いる常用のスクリーニングによりこれら
の試料を試験して特定のＤＮＡおよび試料に対するこの
発明の有効性を確認することができる。

複合体生物学的溶液からの捕獲試薬の除去は、遠心分離
、ろ過、または磁気セルロースを固体支持体として使用
する場合は磁場の使用により達成され得る。

［好ましい具体例の記載コ この発明の核酸捕獲試薬は、リンカ−分子手段により固
体支持体に連結された、二重鎖核酸分子中に挿入可能な
挿入部分を含む。

具体的には、挿入部分はエチジウムまたはメチジウムま
たは他の挿入分子、例えばアクチノマインン、マラカイ
ト・グリーン、フェニル・ニュートラル・レットもしく
はアクリジンの誘導体であり得る。リンカ−分子は荷電
または非荷電状態でｎおよびｍ＞２ の形または２個より多いアミド結合により一緒に連結さ
れた他のメチレン基 （ＣＨ７）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｍ、ｎおよびｍ〉２゜およ
びポリアミン類、例えばスペルミジンおよびスペルミン
であり得る。リンカ−は最も好ましくはスペルミンであ
る。

固体支持体は、ビーズ材料、例えばセファロース、アガ
ロースもしくは磁気セルロースであり得、またはチュー
ブ、ディツプスティックもしくはマイクロタイター・プ
レートの形のプラスチック材料であり得、または膜（例
、ナイロン）の形であり得る。

まず、挿入部分および固体支持体がアミド、カルバメー
ト、尿素、エーテル、チオエーテル、アミンまたは固定
化に常用される他の結合（リンケージ）を介して一緒に
連結され得る形でそれらを修飾する［「アフィニティー
・クロマトグラフィー」（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ポフマンーオステルホフ編、
ペルガモン・プレス、１９７８年、「アフィニティー・
クロマトグラフィーＪ（Ａ４ｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズの発表］。例えば、カルボキシ基を含ませるべく
固体支持体を修飾する場合、リンカ−（例、スペルミン
またはジアミノアルカン）の付加により反応性アミンを
含ませるべくインターカレーターを修飾することができ
る。ジンクロヘギンル力ルポジイミドのような結合剤を
用いると、支持体およびインターカレーターはアミド結
合を介して一緒に連結され得る。別法として、カルボキ
ン基は反応性エステル（例えばＮ−ヒドロキンスフノン
イミドエステル）に変換され得、次いでアミンと反応す
る。逆に、支持体はアミンにより修飾され得、インター
カレーターはカルボキシ基を含ませるべく修飾され、２
つの部分は前記に従い−緒に結合され得る。

核酸を含有し得る臨床生物試料の前精製は必ずしも必要
ではない。この発明の捕獲試薬を脱イオン水に懸濁し、
生物学的試料に加え、十分な時間インキュベーションし
て捕獲試薬と核酸を結合させることにより、捕獲試薬−
核酸複合体を形成させる。インキュベーション時間は通
常室温で３０分である。遠心分離、ろ過または磁気分離
法により捕獲試薬−核酸複合体を単離する。

最後に、例えば捕獲試薬−核酸複合体を希アルカリで処
理することにより、核酸を単離された複合体から分離す
る。例えば、複合体をＮａＯＨと混合し、遠心分離を行
い得る。上清は捕獲試薬から分離されたばかりの核酸を
含む。粗試料、例えばひと血清は多量、例えば２ｍＱの
量で使用され得るものとする。

Ａ　捕獲試薬の合成 スペルミン・リンカ−を介してセファロースまたは磁気
セルロースと結合したメヂジウムを含む核酸捕獲試薬を
次の要領で合成した。ダーバンおよびベラカーの手順［
「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティーゴＯ，Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、）、＋０
０（６）巻、１９６８頁（１９７８年）、この内容を引
用して説明の一部とする］に従い、ｐ−カルボキシメチ
ノウムクロリドを。−アミノビフェニルから合成した。

まずカルホキン基をカルボニルジイミダゾールにより活
性化し、その結果形成されたイミダゾリデートを過剰の
スペルミンで処理することにより、スペルミンをｐ−カ
ルボキシメチノウムクロリドに結合させた。メヂノウム
スペルミン付加体をフラツシユ・クロマトクラフィーに
より精製し、Ｎ−ヒドロキノスクンンイミド活性化セフ
ァロースまたは過よう素酸活性化磁気セルロースと反応
させることにより、不活性支持体上に固定化した。別法
として、反応性アミンを含む磁気セルロースをジスクン
ンイミジルスベレート、次いでメチジウムスペルミンで
処理することにより、ＤＮＡ捕獲試薬を得る。

Ｂ、試薬の使用 放射性標識したＤＮＡを緩衝液または生物学的流体に加
え、溶液を捕獲試薬とインキュベーションし、生成した
ＤＮＡ−捕獲試薬複合体を遠心分離により試料から分離
する実験を実施した。希ＮａＯＨで処理することにより
ＤＮＡを捕獲試薬から放出させ、定量した。これらの実
験は、溶液中に最初に存在する放射性ＤＮＡが８０％を
越える比率で試薬により結合していること、および結合
したＤＮＡが９５％より大きい比率で水酸化ナトリウム
処理により放出されることを示した。試験される緩衝液
としては、（１）ＥＤＴＡおよび様々な濃度（０，１〜
３モル）のＮａＣ０，を含むトリス−ＨＣρ緩衝液、（
２）蛋白質変性原、例えば尿素およびグアニジン塩酸塩
を含むトリス−ＨＣσ緩衝液、並びに（３）０．５％ト
ライトンＸ−４００および緩衝液を含む細胞輸送媒質が
あった。

またこれらの実験は、比較的多量（例、０．５−１　、
０　ｍＱ）の試料中に存在する少量（例、ナノクラム単
位）のＤＮＡおよび少ｆｉ（１００μｇ未尚）の試料中
に存在する多量（マイクログラム単位）のＤＮＡの定量
的結合を示した。

捕獲試薬を用いて生物学的流体から臨床的に興味深い特
定のＤＮＡ配列を単離し得ること、希ＮａＯＨ溶液にお
けるインキュベーションにより試薬から放出されたＤＮ
Ａは固体支持体にトロセルロースまたはナイロン膜）と
結合し、分子ハイブリダイゼーション・プロトコル法に
より同定および定量され得ることを示す実験を実施した
。具体的には、頚管スワブ（綿棒で集めた試料）中に存
在する材料が懸濁および／または溶解している溶液から
ピコグラム量のひと乳頭腫ウィルスＤＮＡを単離した。

次いで、試薬により捕獲されたウィルス性ＤＮＡのパー
センテージをハイブリダイゼーションにより定量した。

同様に、この発明の捕獲試薬を用いてピコグラム量のＢ
型肝炎ウィルスＤＮＡをひと血清から単離し、ハイブリ
ダイゼーションにより定量した。

以−に、この発明の総括的記載を行ったが、さらに具体
的な実施例によりこの発明について説明を行う。ただし
、特記しない限り限定を意図するものではない。

［実施例］ Ａ、水溶液からの核酸の単離。

基本的プロトコル（下記実施例にお（ジる記載に従い変
更）。核酸溶液（通常３０−１００μＱの容量）をプラ
スデック製微量遠心分離管中に等分する。捕獲試薬の懸
濁液を個別の管において調製する。（まず捕獲試薬を臨
床用遠心分離器中３分間の遠心分離で沈澱させることに
よりこの懸濁液を調製する。３倍容量の脱イオン水を沈
澱物に加える。試薬が均一に＠濁するまで、水および捕
獲試薬を数秒間激しい渦巻状にして混合する）。懸澗し
た捕獲試薬（通常５０−１００μｇの容Ｍ）をＤＮＡ試
料に加え、管を渦巻状態にし、直ちに室温で３０分間回
転器」二に置く。管を回転器から除き、室温で３０分間
微量遠心分離器または臨床遠心分離型中最高速度で遠心
分離する。この遠心分離から得られた沈澱物は、捕獲試
薬およびそれに結合した核酸、ずなわち捕獲試薬−核酸
複合体を含有する。沈澱物を３００μρのＴＥ緩衝液で
洗浄し、前と同様に遠心分離する。０．５モルのＮａ０
Ｈ（通常５００μρの容量）を捕獲試薬沈澱物に加える
。

管を激しい渦巻状態にして捕獲試薬およびＮａＯＨを混
合し、直ぢに管を室温で１０分間回転器」二に置く。管
を前と同様に遠心分離する。液体シンチレーション計数
法（核酸が放射性である場合）または核酸と固体支持体
の結合、次いで適当な検出用プローブによるハイブリダ
イゼーションを行うプロッティング・プロトコルにより
、Ｊ−、清（試薬から放出された核酸を含有）の特性を
証明する。

実施例■ 核酸試料は、３０μｇのＴＥ緩衝液（ＴＥ緩衝液は１０
ミリモルのトリス−ＨＣρ、ｐＨ７，５，１ミリモルの
ＥＤＴＡ）中１１ｎ！ｉｊの放射性ＤＮＡを含有してい
た。放射性ＤＮＡは、ベゼスダ・リザーヂ・ラボラトリ
ーズにより販売されている「ＩＫｂラダー」であり、３
２Ｐで標識された、１キロへ−スの増加量で大きさの変
わる酵母ＤＮＡ配列のフラグメントを成分とする。様々
な実験において、標識ＤＮＡの７７−９５％が試薬によ
り結合した。

これらの同じ高水準の捕獲率は、３モル、０．１モルの
ＮａＣρを含有または追加のＮａＣρを含まないＴＥ緩
衝液、および５００ミリモルのＥＤＴＡを含むＴＥ緩衝
液中において達成された。これらの実験において、前記
と同様０．５モルのＮ　ａ　ＯＨで処理することにより
、７７ｉ００％の結合ＤＮＡが放出された。これらの実
験は、ＤＮＡが核酸の研究で常用の緩衝液から捕獲され
得ること、および捕獲は塩の濃度とは無関係であること
を示す。

実施例２ ニックトランスレーンヨンにより３２ｐでラベルされた
ファージ・ラムダＤＮＡを用いて実施例１の場合と同様
の実験を行った。同様の結果が得られた。すなわち、捕
獲は実験で使用されたＤＮＡ配列とは無関係である。（
肝炎および乳頭腫ウィルス配列の捕獲は後記実施例９−
１２に記載されている）。

実施例３ ＤＮＡ溶液の量および体積を変えて実施例Ｉの場合と同
様の実験を行った。これらの実験は、比較的少量のＤＮ
Ａが比較的多量の溶液から捕獲され得ること（例、ＴＥ
緩衝液０　、５　ｍＱからＩＯｎｇのＤＮＡの９５％捕
獲）、および比較的大量のＤＮＡが比較的少量の溶液か
ら捕獲され得ること（例、３０μＱのＴＥ緩衝液から１
μりのＤＮＡの９５％捕獲）を示した。全ての場合にお
いて、０５モルのＮａＯＨで処理すること？こより、捕
獲されたＤＮＡが８０％を越える割合で放出された。９
１℃ウィルス性ＤＮＡの捕獲、放出および検出を後記実
施例９−１２に示す。

実施例４ ＤＮＡが蛋白質変性原を含む水溶液中に存在する場合に
おいて、実施例１と同様の実験を行った。

全ての場合において、捕獲されたＤＮＡが８０％を越え
る割合で捕獲され、８０％より大きい割合で放出された
。試験溶液は、８モルの尿素、５％のドデシル硫酸すｌ
・リウムまたは６モルのグアニジン塩酸塩を含有した。

実施例５ 放射性ＲＮＡを用いて実施例１の場合と同様の実験を行
った。９０％を越えるＲＮＡが捕獲され、ＮａＯＨ処理
により９０％より多い放射能が放出された。ＲＮＡは、
ファージＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン
乳頭腫ウィルスＤＮＡ配列をコピーすることにより製造
された乳頭腫ウィルスＩ８ゲノムのコピーであった。こ
の実験は、捕獲試薬がＲＮＡと結合することを示す。

実施例６ 実験（実施例月の場合と同様のプロトコルを用いて、３
２Ｐで末端標識した、ファージ・ラムダＤＮＡのＨｉｎ
ｄｌｌｌフラグメントを捕獲し、ＮａＯＨにより放出さ
せた。ＤＮＡをアルカリ性アガロース・ゲル上で電気泳
動させ、ゲルをオートラジオグラフィーに掛けた。正確
な予想通りの大きさの非減成りＮＡ分子が、ＴＥ緩衝液
から捕獲されたＤＮＡ試料およびひと血清から捕獲され
たＤＮＡ試料中に存在した。また、ｒｌ　ＫＢラダー」
（酵母ＤＮＡフラグメントを成分とし、ベセスダ・リザ
ーチ・ラボラトリーズにより販売）を実験で使用すると
、非減成りＮＡ分子が得られた。すなわち、僅か約３０
０ｂｐないし＋ｏｏｏｏｂｐを越える範囲の大きさのＤ
ＮＡ分子は、捕獲試薬を用いてインタクト（３ｎｔａｃ
ｔ）形態で単離され得る。

Ｂ、ひと血清からのＤＮＡの単離。

実施例７ 健康な男性から採取した５０μρの血清（シグマ・ケミ
カル・カンパニーから購入）を処理してウィルス粒子を
崩壊し、ウィルスＤＮＡを遊離させ、１μａの３２ｐ標
識フアージ・ラムダＤＮＡ（ｌｏｎｇ）を加えた。この
試料を１時間６５℃でインキ、ベーションした。（この
処理はウィルス粒子の崩壊および蛋白質除去に常用され
る）。５０μνの懸洞捕獲試薬を血清試料に加え、室温
で３０分間回転器上に置いた。捕獲試薬（および結合Ｄ
ＮＡ）を実施例１と同様遠心分離により単離し、０．５
−ＮａＯＨで処理することにより結合ＤＮＡを放出させ
、−２７＝ 液体シンヂレーンヨン計数管で計数した。代表的実験で
は、標識ＤＮＡの８０％が捕獲試薬により結合し、結合
ＤＮＡの９５％が放出された。この実験は、ＤＮＡが血
清から単離され得ることを示している。前記実施例６に
記載された実験は、血清から単離されたＤＮＡが捕獲後
に非減成状態であることを示している。

実施例８ ２ｙ、ｉ２の血清を使用して（これは通常、捕獲試薬を
用いたこの明細書記載の方法と同程度に単純な方法によ
っては分析され得ない血清景である）、実施例７の場合
と同様の実験を行った。５００μρの捕獲試薬と室温で
１５時間インキュベーションを行った。Ｉ４０ｎｇまた
は＋００ｐｆの標識ファージ・ラムダＤＮＡを使用する
代表的実験の場合、９０％を越えるＤＮＡが試薬により
結合し、９５％の結合ＤＮＡがＮ’ａＯＨ処理により放
出された。

この実験は、ＤＮＡが比較的大量（１１のの血清から有
効に捕獲され得ること、すなわちこの試薬の診断用途の
可能性が、血清中のウィルスまたはＤＮＡ濃度が非常に
低い状況にまで広がり得ることを示している。

実施例９ 非放射性ＤＮＡが血清から単離され、プロッティング・
プロトコルにより定量され得るか否かを決定するために
、次の実験を実施した。健康な男性から得られた血清５
０μρのアリコートをＯ〜１００ｐ７の範囲の量の非標
識ＤＮＡにより「スパイク」して実施例７の場合と同様
の実験を行った。

ＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウィルス・ゲノムのコピーを含むク
ローニングされたプラスミドＤＮＡであった。実施例７
と同様にＤＮＡを捕獲および放出させた。真空ポンプに
取り付けた「ドツト・プロットヨ装置（ベゼスダ・リザ
ーヂ・ラボラ）・リーズ）を用いて試料をナイロン膜（
バイオダイン、ポール・コーホレイテッド）に適用した
。また、陽性対照および濃度標準として０．５Ｎ−Ｎａ
ＯＨ中５００μａアリコートのプラスミドＤＮＡも同様
に適用した。また、０．５Ｎ−ＮａＯＨのみを成分とす
る陰性対照も適用した。ナイロン・フィルターをＢ型肝
炎ウィルスＤＮＡと相同性の放射性ＲＮＡとハイブリダ
イゼーションし、洗浄し、標準プロトコルによりオート
ラジオグラフィーに掛けた。

オートラジオグラフィー検査は、血清中にスパイクされ
た０　、　５９９のＤＮＡが検出され得ることを示した
。スパイクされたＤＮＡを含まない血清試料から得られ
た試料は、オートラジオグラフにおいてシグナルを与え
なかった。捕獲されたＤＮＡ試料から得られたオートラ
ジオグラフィー・シグナルおよび非捕獲の陽性対照試料
から得られたソゲナルの比較結果は、検出有効性が約５
０％であることを示している。この実験は、捕獲試薬を
用いて非常に低レベルの非特異的基底値シグナルを伴う
血清中に存在するウィルスＤＮＡ配列を単離および検出
し得ることを示した。

実施例１０ 以下の実験を行うことにより、ウィルス粒子中に存在す
るＤＮＡが血清から単離され、定量され得るか否かを決
定した。肝炎の臨床徴候があり、血液検査の結果、Ｂ型
肝炎ウィルス、ＨＢｅおよびＨＢｓ抗原に関して陽性で
あり、以前に血清が５０μρ当たり５００ｐ９を越える
Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡを含むものと測定された患者か
ら血清試料を得た。この血清の一連の系列希釈を正常（
非感染）血清中へ行い、５０μ（のアリコートを実施例
７と同様捕獲試薬により処理した。実施例９と同様、捕
獲試薬により放出されたＤＮＡをナイロン・フィルター
に結合させ、ハイブリダイゼーションにより定量した。

この実験結果は、患者の血清が５０μρ当たり約６００
ｐｇのＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを含むこと、およびＩ／
＋２００の希釈率のＤＮＡ（約０　、５１）ｇのウィル
スＤＮＡを含有）が基底値を越えて明白に検出され得る
ことを示していた。

実施例１１ 肝炎（ただし、必ずしもＢ型肝炎ではない）の臨床徴候
を呈する患者から得られた１７の血清試料のパネルを実
施例１０と同様？こ試験した。Ｂ型肝炎つィルスＨＢｅ
およびＨＢｓ抗原を共に含む全試料においてＢ型肝炎ウ
ィルスＤＮＡが検出された。

＝３１− 捕獲試薬を用いる検定は、個々の試料が血清５０μσ当
たり５〜ｓｏｏｐｇのウィルスＤＮＡを含むことを示し
た。Ｂ型肝炎つィルスＨＢｅおよびＨＢｓ抗原を含まな
い血清試料ではＢ型肝炎ウィルスＤＮＡは検出されなか
った。この実験（実施例１０の場合と共に）は、この捕
獲試薬を診断試験で用いることにより、高感度でひと血
清にお（プるウィルスＤＮＡの存在を検出し得ることを
示している。

Ｃひと頚管試料からのＤＮＡの単離。

嚢胞例１２ 乳頭腫ウィルスの存在に関して陰性の試験結果であった
女性から得られた頚管上皮細胞を含むスワブを試薬溶液
中でインキュベーションすることにより、頚管試料中の
ウィルス粒子を全て崩壊した。スワブを溶液から除去後
、約２００μＱの溶液を得た。この溶液を２つの１００
μｇアリコートに分けた。第１のアリコートには、クロ
ーン乳頭腫ウィルス１８配列□を含む所定量のプラスミ
ドを加えた。第２のアリコートには追加のＤＮＡを加え
なかった。頚管試料の第１アリコートに加えられたＤＮ
Ａの量は、それぞれ１００．１０またはｌｐｇのプラス
ミドＤＮＡであった。各ＤＮＡ６度を有する３つの同じ
試料を調製した。すなわち、全部で１８試料（９スワブ
、各々２種のアリコートに分割、一方のアリコートは追
加のＤＮＡを含有させない）を調製した。１８試料の各
々に３０μρの懸濁捕獲試薬を加え、本質的に実施例Ｉ
の記載と同様、核酸を捕獲させ、０．５ＮのＮａＯＨに
より放出させた。実施例９と同様ドツト・プロッティン
グにより、放出されたＤＮＡ試料をナイロン膜に固定化
した。また同様の方法で、陽性対照および検出濃度標準
として０．５モルのＮａＯＨ中乳頭腫ウィルスＤＮＡ含
有プラスミドＤＮＡの５００μρアリコートおよびＤＮ
Ａを含まない０．５モルＮａＯＨのアリコート（陰性対
照として）もフィルターに適用した。

フィルターを放射性乳頭腫ウィルスＲＮＡ（Ｔ７フアー
ジＲＮＡポリメラーゼを用いて乳頭腫ウィルス・ゲノム
のコピーを含むクローン・プラスミドＤＮＡをコピーす
ることにより製造）とハイブリダイゼーションした。ナ
イロン・フィルター」二における乳頭腫ウィルスＤＮＡ
検出の標準方法を用いて、フィルターのハイブリダイゼ
ーションおよびポスト・ハイブリダイゼーション洗浄を
行った。フィルターをオートラジオグラフィーに掛けた
。オートラジオグラフは、４２時間のオートラジオグラ
フ曝露後に頚管試料中に１スパイクされた」乳頭腫ＤＮ
Ａのアリコートが検出され得ることを示した。さらに、
乳頭腫ＤＮＡを加えなかった各頚管試料のアリコートは
、オートラジオグラフにおいてシグナルを発さず、捕獲
試薬により処理された試料中で非特異的シグナルが得ら
れなかったことを示している。レーザー・デンシトメー
ター（エルケーピー・インスツルメンツ、インコーホレ
イチット）を用いて頚管試料から得られたオートラジオ
グラフィーのシグナルおよび陽性対照標準から得られた
シグナルをスキャンし、これらを比較することにより、
捕獲されたＤＮＡの検出効率を測定した。ｌ０ｐｙスポ
ツトの場合、この値は２５−３１％であった。この実験
は、捕獲試薬を用いることにより、非常に低い非特異的
基底値を有するひと頚管試料に存在する乳頭腫ウィルス
配列の単離および定量が可能であることを示している。

ずなわぢ、捕獲試薬を臨床試験で用いて頚管試料に存在
するウィルス性核酸を検出するこ七ができる。

Ｄ、ひとの尿からのＤＮＡの単離。

実施例Ｉ３ 健康な男性から尿を採取した。１００ピコグラムの放射
性ファージ・ラムダＤＮＡを５０μρまたは５００μρ
アリコートの尿に加えた。尿を実施例７と同様１時間６
５℃でインキユベーシヨンした。１００μρの懸濁捕獲
試薬を各アリコートに加え、ＤＮＡを１５時間捕獲させ
、実施例１と同様に放出させた。尿中に最初から［スパ
イクされたＪＤＮＡに対する放出ＤＮＡの全体的収率は
、各々５０μρアリコートの尿の場合５４％および５０
０μρの尿の場合５５％であった。すなわち、捕獲試薬
を用いて尿からＤＮＡを単離することができる。

Ｅ、本発明のメチジウム−スペルミン捕獲試薬およびア
クリルアミド−エチジウム試薬の比較。

バヂエック等、「アナリティカル・バイオケミストリー
Ｊ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）、１２４巻、４　］　４．−４２０頁（１９８２年）
に記載されたアクリルアミド−エチジウム試薬の２種の
製剤を合成した。それらのＤＮＡ捕獲能をこの発明によ
るメヂジウムースペルミンーセファロース捕獲試薬の２
製剤の場合と比較した。

アクリルアミド−エチジウム試薬の場合、ひと血清、蛋
白質変性原で処理されたひと血清およびひと尿に各々存
在するＤＮＡに対するアフィニティーが非常に低かった
。逆に、メチジウム−スペルミン試薬はこれらの溶液中
に存在するＤＮＡの９０％を捕獲した。すなイつち、こ
の発明の試薬は、アクリルアミド−エチジウム試薬の使
用を排除する臨床適用例において使用され得る。

また、イオン強度の異なる緩衝液における２つのタイプ
の試薬の相対的なりＮＡ結合能力を検査した。この発明
のメチジウム−スペルミン試薬は、３モルＮａＣｆ）と
同じ高さの塩濃度で８０％を越えるＤＮＡと結合した。

対照的に、アクリルアミド−エチジウム試薬は、１モル
またはそれを越えるＮａＣ（！濃度で著しく低いＤＮＡ
結合能力を呈した。

この特徴によりアクリルアミド−エチジウム試薬は、イ
オン強度において変化の可能性があり得るか、または１
モルを越える塩を含む試料の分析において、この発明に
よる試薬よりも有用性の面でかなり劣ることになる。

Ａ、実験の詳細 １．試験製剤。

「好ましい具体例の記載−八、捕獲試薬の合成」の項に
従い、メチジウム−スペルミン−セファロース試薬の２
種の製剤（製剤＃４および＃５）を合成した。

アクリルアミド−エチジウム試薬の２種の製剤をバチニ
ック等の記載に従い正確に調製した（製剤＃１および＃
２）。

所定量の懸濁試薬が各製剤において等重量の試薬を含有
するように、４種の試薬製剤全部を蒸留水に懸濁した。

２　試薬反応。

反応を次の要領で行った。試料を１００μρの容量にし
た。試料は、（ａ）蛋白質変性片で処理したひと血清（
肝炎ウィルスＤＮＡ検出の標準プロトコル）、（ｂ）未
処理ひと血清、５０μρのひと血清に５０ｐｇのＴＥ緩
衝液（１０ミリモルのトリスＨＣＣ，］ミリモルのＥＤ
ＴＡ、ｐＨ７，５）を加えたもの、および（ｃ）ひと尿
（健康な男性から採取した１００μρの尿を使用）であ
った。

これらの溶液（全容量１００μのの各々に、５μ（ｌの
ＴＥ緩衝液中８ｎｉ？の３２ｐ−標識ＤＮＡ（ヒーアー
ルエル、ＩＫＢラダー）を加えた。５０μρの懸濁捕獲
試薬を加え、管を室温で３０分間回転器」二に置いた。

管を３分間微量遠心分離器中で回転させ、上清をマイク
ロピペットで除去し、５％ｌ・リクロロ酢酸（ＴＣＡ）
の溶液中に放出させた（未捕獲放射性ＤＮＡがあれば全
て沈澱させるため）。

捕獲試薬沈澱物を３００μρのＴＥ緩衝液で洗浄し、前
と同様に回転させ、」−清を５％ＴＣＡ溶液に加えた。

ＴＣＡ溶液をグラスファイバー・ディスクでろ過し、液
体シンチレーション計数管で計数した。捕獲されなかっ
たＤＮＡの量を測定し、差により捕獲されたＤＮＡの量
を計算した。全試料を３回ずつ試験した。

捕獲に対する塩濃度の影響を検査する実験のために、８
μｇの３２ｐ標識ＤＮＡおよび所定モル量のＮａＣＣを
含むＴＥ緩衝液の１００μρ試料を５０μＱの懸濁捕獲
試薬とインキユベーシヨンし、さらに前述の血清試料の
場合と同様に分析した。

Ｂ、結果。

血清および尿捕獲実験の結果を下記第１表、Ａ部に示す
。この発明のメチジウム−スペルミン試薬の両型剤は処
理された血清、未処理血清または尿に存在するＤＮＡの
〉９０％を捕獲した。対照的に、アクリルアミド−エチ
ジウム試薬の製剤はいずれも血清から検出可能量のＤＮ
Ａを一切捕獲せず、少量のＤＮＡＬか尿から捕獲されな
かった。

すなわち、これらの試料には捕獲を抑制する成分が存在
することになる。この抑制の化学作用についてはそれ以
上分析しなかった。さらに、血清はアクリルアミド−エ
チジウム試薬から結合エチジウムの大部分を放出させる
と思われ、エチジウムはこれらの溶液中のアクリルアミ
ド・マトリックスと安定した結合状態にはないことを示
している。

反対に、この発明のメチノウムースペルミン試薬におけ
るメチジウムは、これらの実験においてセファロース・
マトリックスと安定した結合状態にあった。

異なる濃度のＮａＣＣで実施された捕獲実験の結果を第
１表、Ｂ部に要約する。この発明の試薬によるＤＮＡの
結合は、０ないし３モルのＮａＣｌ２塩濃度に対して比
較的影響を受けにくい。反対に、アクリルアミド−エチ
ジウム試薬によるＤＮＡの結合は１モルのＮａＣＣで低
下し、３モルのＮａＣＣにおける結合能は、試薬製剤の
１つにおけるＮａ−Ｃａの非存在下での値の１２％程度
の低さである。

第１表 メチノウムースペルミンおよびアクリルアミド−エチジ
ウム核酸捕獲試薬の非核 Ａ、ＤＮＡ捕獲に対する面直ｑ影響　　　　−処理血清
　未処理血清　尿 （捕獲ＤＮＡの解Σ札 メヂジウムースペル ミン製剤＃４　　　　　９６　　　　９５　　　　ＮＤ
メヂジウムースペル ミン製剤＃５　　　　９６　　　９３　　　９２アクリ
ルアミドーエ チンラム製剤＃１　　０　　　０　　　８アクリルアミ
ド−エ チンラム製剤＃２　　　０　　　　０　　　　８＊３回
の試料の平均。

ＮＤ−測定せず。

Ｂ、ＤＮＡの捕獲に対するＮａＣ（！濃度の影響凡１利
（２）天１　　　す　東）Ｌ瓜　影舌　Ｕ（捕獲ＤＮＡ
％）＊ メヂンウムースペル ミン製剤＃４　　　　　９５　８８　９３　８２　９３
メヂジウムースペル ミン製剤＃５　　　　９７　９７　９９　９９　９９ア
クリルアミド−エ チンラム製剤＃Ｉ　　　９８　９３　５９　４９　３９
アクリルアミドーエ チンラム製剤＃２　　９８　９０　３６　２０　１２＊
３回の試料の平均。

この発明は、前述の適用方法および具体例に限定される
訳ではない。挿入手段によりこの発明の捕獲試薬と核酸
を結合させ得る修正も全て包含される。これらの均等内
容事項も特許請求の範囲内に含まれるものとする。

特許出願人　ライフ・チクノロシーズ・インコーボレイ
テソド

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. （１）挿入（インターカレーティング）部分およびリン
   カー分子により前記部分に連結された固体支持体を含み
   、前記部分を試料中の核酸分子と結合させる方式で試料
   から核酸を分離する核酸捕獲試薬。
2. （２）リンカーが荷電状態である、請求項１記載の核酸
   捕獲試薬。
3. （３）リンカーが非荷電状態である、請求項１記載の核
   酸捕獲試薬。
4. （４）リンカー分子がポリアミンである、請求項１記載
   の核酸捕獲試薬。
5. （５）ポリアミンが、スペルミジンおよびスペルミンか
   ら成る群から選ばれる、請求項４記載の核酸捕獲試薬。
6. （６）固体支持体がビーズ材料である、請求項１記載の
   核酸捕獲試薬。
7. （７）ビーズ材料がセファロース、アガロースまたは磁
   気ビーズを含む、請求項６記載の核酸捕獲試薬。
8. （８）固体支持体がポリマー性である、請求項１記載の
   核酸捕獲試薬。
9. （９）ポリマー固体支持体の形態が、チューブ、ディッ
   プスティックまたはマイクロタイター・プレートから成
   る群から選ばれる、請求項８記載の核酸捕獲試薬。
10. （１０）固体支持体が膜である、請求項１記載の核酸捕
    獲試薬。
11. （１１）膜がナイロンから成る、請求項１０記載の核酸
    捕獲試薬。
12. （１２）試料が、血清、頚管組織、糞、唾液、血液、尿
    、体内組織および体液から成る群から選ばれた生物学的
    試料である、請求項１記載の核酸捕獲試薬。
13. （１３）挿入部分が、エチジウム、メチジウム、アクチ
    ノマイシン、マラカイト・グリーン、フェニル・ニュー
    トラル・レッドまたはアクリジンの誘導体から成る群か
    ら選ばれる、請求項１記載の核酸捕獲試薬。
14. （１４）挿入部分がメチジウムである、請求項１３記載
    の核酸捕獲試薬。
15. （１５）挿入部分がエチジウムである、請求項１３記載
    の核酸捕獲試薬。
16. （１６）メチジウムを含む挿入部分、およびポリアミン
    を含むリンカー分子により前記メチジウム部分に連結さ
    れた固体支持体を含み、前記メチジウム部分を試料中の
    核酸分子と結合させる方式で試料から核酸を分離する核
    酸捕獲試薬。
17. （１７）試料が、血液、尿、頚管組織から成る群から選
    ばれた生物学的試料である、請求項１６記載の核酸捕獲
    試薬。
18. （１８）固体支持体が、セファロース、アガロースまた
    は磁気セルロースから成る群から選ばれたビーズ材料で
    ある、請求項１６記載の核酸捕獲試薬。
19. （１９）固体支持体がセファロースである、請求項１８
    記載の核酸捕獲試薬。
20. （２０）固体支持体が磁気セルロースである、請求項１
    ６記載の核酸捕獲試薬。
21. （２１）ポリアミンがスペルミジンまたはスペルミンで
    ある、請求項１６記載の核酸捕獲試薬。
22. （２２）ポリアミンがスペルミンである、請求項１６記
    載の核酸捕獲試薬。
23. （２３）メチジウム部分、およびスペルミンを含むリン
    カー分子により前記メチジウム部分に連結されたビーズ
    状材料から成る固体支持体を含み、前記メチジウム部分
    を試料中の核酸と結合させる方式で生物学的試料から核
    酸を分離する核酸捕獲試薬。
24. （２４）ビーズ材料が、セファロース、アガロースまた
    は磁気セルロースから成る群から選ばれる、請求項２３
    記載の核酸捕獲試薬。
25. （２５）請求項１記載の捕獲試薬を試料と接触させ、試
    料−捕獲試薬混合物を十分な時間インキュベーションす
    ることにより、捕獲試薬を試料中の核酸と結合させて捕
    獲試薬−核酸複合体を形成させ、試料から前記複合体を
    単離することから成る、試料から核酸を分離する方法。
26. （２６）試料を処理することにより、そこからＤＮＡを
    放出させる、請求項２５記載の方法。
27. （２７）接触させる前に、十分量の試薬により試料を処
    理して試料中のウィルス粒子があればそれらを崩壊およ
    び除蛋白質する、請求項２６記載の方法。
28. （２８）単離された複合体から核酸を分離する、請求項
    ２５記載の方法。
29. （２９）単離段階が遠心分離を含む、請求項２５記載の
    方法。
30. （３０）単離段階がろ過を含む、請求項２５記載の方法
    。
31. （３１）単離段階が磁気分離を含む、請求項２５記載の
    方法。
32. （３２）分離段階が捕獲試薬−核酸複合体の希アルカリ
    処理を含む、請求項２８記載の方法。
33. （３３）試料が前精製されていない臨床試料である、請
    求項２９記載の方法。
34. （３４）インキュベーションが約１モルより高い塩濃度
    で行なわれる、請求項２５記載の方法。
35. （３５）試料が核酸を含有するゲルである、請求項２９
    記載の方法。
36. （３６）試料が、血清、頚管組織、糞、唾液、血液、尿
    、体内組織および体液から成る群から選ばれた生物学的
    試料である、請求項２５記載の方法。