JPS6222100B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ビリルビンはヘモグロビンの減成生成物であ
る。 毎日６〜７ｇのヘモグロビンが損傷あるいは老
化した赤血球から生じていると考えられている。
肝臓、脾臓、骨髄内で急速に破壊されるこのよう
なヘモグロビンのプールから、正常な成人におい
て１日あたりほぼ200〜230mgのビリルビン及びそ
の誘導体が生成される。次いで正常な人間の代謝
の一部として、このような日々生成するビリルビ
ンの大部分が排泄されたり他の誘導体に変化した
りする。 しかしながらある場合には、過度の溶血現象に
より、或いは例えば肝臓不全によるビリルビンの
停滞のため、ビリルビンが過度に生成されること
によつて人体内にビリルビンが過大量生じること
がある。 ビリルビンが人体内に過度に生じる結果は、い
ずれの場合でも黄疽である。この広範囲にわたる
病変状態は、血清ビリルビン値の著しい上昇を特
徴とする。この値は、例えば正常な成人の場合に
おいて血清１デシリツトルあたりビリルビンが
0.1〜約１ミリグラムの範囲であるのに対し、血
清１デシリツトルあたりたとえばビリルビンが10
ミリグラムあるいはそれ以上である。また殆んど
の場合、皮膚、鞏膜、或いは粘膜が褐色を帯びた
黄色に変る。更に血液中にビリルビンが過大量生
ずることによつて、生体内のビリルビン濃度が増
大するという望ましくない現象を生じ、そして
種々の細胞学的反応を妨害することを示す証拠が
多数提出されている。例えば、ビリルビンは、細
胞に活力を与えるエネルギーを生ずる多くの酵素
反応の強力な抑制因子として広く知られている。
このような背景を考えるならば、肝臓その他の関
連する器官の機能の試験におけるビリルビンの臨
床学的重要性は自明である。 ビリルビン分析方法に関する文献は多数存在す
る。種々のビリルビン測定技法の多くを概括的に
みた好適な文献としては、“臨床化学―原理と技
術（Clinical Chemistry―Principles and
Tehnics）”、R.J.Henry，D.C.Cannon、及びJ.W.
Winkelman編、Harper and Row Publishers
社、第２版、1042〜1079ページ、1974年、が挙げ
られる。ビリルビン測定に関する別の文献として
は“臨床化学の基礎（Fundamentals of Clinical
Chemistry）”、N.W.Tietz編、W.B.Saunders
社、743〜762ページ、1970年、がある。ビリルビ
ン分析に関するもつとも広く採用されている分析
手順は、おそらくいわゆるジアゾ法と呼ばれるも
のであろう。 ジアゾ法は、ビリルビンをジアゾニウム塩、例
えばジアゾスルフアニリル酸とカツプリング反応
させて、ビリルビンそれ自体（黄色である）より
も高い吸光率を有する色素を生成する方法であ
る。典型的には、ビリルビン分析のためのジアゾ
反応手順は二つの活動相を含む。第一はいわゆる
“直接反応”であつて、着色が極めて急速に行わ
れる。次は“間接反応”であつて、この相におい
ては着色はメタノール添加後になつてはじめて行
われる。上述した文献、特にWinkelman等の文
献に要約されているように、これら二つの活動相
が具体的に何を意味するかについて、業界では若
干の混乱がある。ある人々は上記直接反応は結合
されていないは又は遊離しているビリルビンの量
であり、一方間接反応はアルブミンと結合してい
るビリルビンの量であると考えている。他の人々
は、直接反応は共役ビリルビンを測定するもので
あり、一方間接反応はビリルビンの非共役形を測
定する方法であると考えている。 ビリルビン分析のためのジアゾ反応に関する前
記混乱に加え、Winkelman等は、ジアゾ法批判
の文献のなかでジアゾ法には多くの変法がありそ
してジアゾ反応それ自体が複雑であることから、
得られる分析結果がしばしば相違していると結論
している。更に、このようなジアゾ測定法は、測
定直前に混合せねばならないいくつかの異なる試
薬を用いる必要があるため一般的にかなり長時間
を要し、また、ジアゾ化に応答する他の成分が血
清及びそ他の体液中に存在するために正確を期し
難い。 ビリルビン分析のための前記ジアゾ分析法及び
その変法のほか、種々のビリルビン分析法が提案
され、採用されている。なかでも、ビリルビンに
固有のモル吸光率を利用した、種々の間接的な、
ビリルビンの分光測光（即ち比色測定）分析法が
挙げられる。即ち、遊離のビリルビンは、435nm
で測定した場合約５×10⁴のモル吸光率を有する
黄色顔料である。しかしながら、ビリルビンのモ
ル吸光率は種々の直接的な分光測光溶液方法に有
用であるのに十分高いけれども、“乾式化学”分
析試験要素、例えば1976年11月16日に発行された
米国特許第3992158号においてPryzbylowicz及び
Millikanにより開示された型の分析要素、を用い
てビリルビンの良好な定量分析を行うことができ
るほどに十分高くはない。かくして今日の直接的
なビリルビンの分光測光分析法は一般的には、溶
液分析法に限定されており、特に、正確な場合に
は定量的な結果が望まれる。更に、種々のビリル
ビン分析法を概括している前記文献（前記
Winkelman等の文献参照）からわかるように、
ビリルビンの直接的分光測分析法は、414、540及
び576nmで吸収ピークを示すヘモグロビンの存在
によりスペクトル妨害を受ける。更に、人間の血
清のようなビリルビン含有体液中に存在する他の
材料も、このような直接的分光測光分析法を行う
場合には、スペクトル妨害を引き起こすことがあ
る。例えば、カロテノイドはビリルビン分析を妨
害する。これは、カロテノイド主成分の一つであ
るβ―カロテンが約450nmで吸収ピークを示し、
これはビリルビンの吸収ピークに極めて近いスペ
クトル領域内であるからである。 直接的分光測光分析法を用いた場合のビリルビ
ンの前記スペクトル妨害に加えて、このような方
法は、アルブミンのような人間の血清の他の蛋白
質物質の存在による妨害も受けることがあること
が見い出された。ビリルビンはこのような他の蛋
白質物質に結合することができ、そしてこのよう
な結合の結果、ビリルビンの吸収強度及び吸収ピ
ークのシフトが起りうる。特に前記問題の故に、
当業者は実質的にビリルビンの前記ジアゾ分析
法、もしくは前記直接的分光測光法の種々の変法
に頼らなければならなかつた。例えば米国特許第
3569721号においては、ビリルビンの直接的分光
測光分析測定法が開示されているが、この方法で
は、要約すると流体試料をビリルビンの最大吸収
波長、及びヘモグロビンのみが吸収ピークを示す
ことが知られている第二波長で測定することによ
り、ヘモグロビンのスペクトル妨害は除去される
と主張している。この方法では、次に液体試料中
に存在する測定されるべきヘモグロビン量に等し
い量でビリルビン濃度の吸収ピークを調整しなけ
ればならない。 ビリルビン分析のために用いられてきた更に別
の方法は、トリクロロ酢酸或いは有機スルホン酸
等の有機酸もしくはその塩、及び第二鉄イオンを
含有する、ビリルビンの試薬組成物の使用に関す
る。この方法では、ビリルビンは第二鉄イオンの
存在下において有機酸もしくはその塩により酸化
されて反応生成物、例えばビリベルジン及び／又
はコレシアニンを生じ、このような反応生成物
は、もともと存在していたビリルビンの量に関連
する強度の特徴的な青もしくは青緑色を示す。こ
のようなビリルビン分析方法は、例えば米国特許
第3348920号、米国特許第3607093号、及びベルギ
ー国特許第816927号に記載されている。 しかしながらこの方法もまた、ジアゾ分析法及
び直接的な分光測光分析法に関する前述の数多く
の欠点をもつている。例えば、有機酸もしくは酸
塩を第二鉄イオンと共に使用するこの分析法を用
いる場合は、酸とビリルビンとの反応を完成させ
るために約10分間までの時間を要し、次いで最終
生成物を最初の反応媒質から分離し、それにより
最終生成物が分光測法により分析されるようにす
るためには更に時間を要するこの試験もまた、ヘ
モグロビン、種々のカロテノイド等のような青の
スペクトル域で最大吸収を示す種々スペクトル妨
害物の作用をうける。 本発明に従えば、 １(イ) 水性液体とビリルビン反応性媒染剤とを試
薬ゾーン中で接触せしめてビリルビンを媒染
させ、媒染されたビリルビンが遊離のビリル
ビンの吸収ピークから少なくとも約10nmシ
フトした吸収ピーク及び遊離のビリルビンの
モル吸光率よりも少なくとも約50％高いモル
吸光率を示すようになし、そして (ロ) 前記媒染されたビリルビンを比色測定によ
り検出する方法が提供される。前記反応性媒
染剤は、１個以上のビリルビンの結合サイト
を有し、そして疎水性有機マトリツクス及び
少くとも１個の荷電性カチオン基を有する、
式 （式中、Ａは有機基を示し、ＱはＭをＡに
結合するための化学結合もしくは化学基を示
し、Ｍは第四アンモニウムもしくはホスホ
ニウム基を示し、そしてＸは酸アニオンを
示す）の反覆単位を有するポリマー材料であ
る。本発明のある特に有用な態様に従つて、
好ましくは、媒染されたビリルビンの吸収ピ
ークは460nmの波長もしくはそれ以上にシフ
トし、そして媒染ビリルビンのモル吸光率は
7.5×10⁴もしくはそれ以上の値に増加する。 本発明方法は血液、血清、尿等のような体液中
のビリルビンの分析に有用であり、特に血清に有
用である。これは、本発明方法がヘモグロビン、
カロテノイド等のような多くの一般的なビリルビ
ン妨害物の効果を最少化するからである。このこ
とは、媒染ビリルビンのモル吸光率を著しく増大
させることにより一部達成され、そして媒染ビリ
ルビンの吸収ピークをシフトさせることにより一
部達成される。これら両方のスペクトル変化は、
本発明に用いる反応性媒染剤にビリルビンが結合
する結果として生ずる。もちろん、種々の生体液
のビリルビン含量を分析するために本発明分析法
を用いる場合には、ビリルビンが結合することの
できる種々の高分子量蛋白質妨害物、例えばアル
ブミンを除去及び解離（ビリルビンから）させ、
それにより試験液中に含まれる全ビリルビンの定
量分析を行いうるようにすることが望ましい。そ
れ故本発明の一つの態様に従つて、このようなビ
リルビン妨害物の分離及び除去のために試験液に
予備処理を施してもよい。このような予備処理に
は、例えば蛋白質沈殿、試料希釈等の、ビリルビ
ンの高分子量蛋白質妨害物を除去するために適用
した従来方法が含まれる。 あるいは本発明の特に好ましい態様に従つて、
前記ビリルビン分析を、液体中のビリルビン検出
のための本発明の分析要素を用いて実施する。こ
のような要素は、試薬ゾーン及び拡散ゾーン又は
層からなり、試薬ゾーンは、例えば、ビリルビン
の前記反応性媒染剤を含む層であり、拡散ゾーン
又は層は液体試験試料を試薬ゾーンへ分布させる
ことができる。所望の場合には、界面活性剤を拡
散ゾーンに組み入れてもよく、その量は、例えば
アルブミンなどの高分子量蛋白質妨害物が種々の
量で存在しているとしても、ビリルビンがこの拡
散ゾーンを経て正常に輸送されるのに有効な量で
ある。分析されるべき特定液体試料にビリルビン
の実質的にすべての蛋白質妨害物の除去のための
独立した予備処理（たとえば蛋白質沈殿又は試料
希釈等）を最初に施すならば、前記試薬ゾーンを
含む要素の使用のみに基づく、本発明に従つたビ
リルビンの分析要素を考案することができる。 本発明の別の態様に従つて、ビリルビン分析の
ための前記分析要素の試薬ゾーンは、分子量が約
60000あるいはそれ以上であるアルブミン及び他
の蛋白質のようなビリルビンの高分子量蛋白質妨
害物に不浸透性であつて、このような物質からの
妨害を更に減少させるのが好ましい。 本発明の別の態様に従つて、本発明の要素は、
拡散ゾーン及び試薬ゾーンが、それぞれ、“輻射
線透過性”支持体のような適当な支持体上に載置
された拡散層及び試薬層である。 本明細書で使用される“輻射線透過性”なる語
は、要素中に生ずる分析結果（検知可能変化）の
検出に使用される電磁輻射線を有効に通過可能
な、分析要素のゾーン及び支持体を意味する。こ
のような透過は、約300nm〜700nmの範囲内の波
長の電磁輻射線の透過を含む。本発明のこの態様
に従つて、別個の中間層を所望により試薬層と支
持体との間に、或いは拡散層と試薬層との間に組
み入れてもよい。このような中間層は例えば、分
析する水性液体試料から種々のありうる妨害物を
除去するために更に試薬を含んでいてもよい。ま
た所望の場合にはこのような中間層は液体試料の
本発明の多層試験要素を通る輸送を高めるための
ゼラチンのような親水性であつて水膨潤性の材料
を含んでいてもよい。 本発明に従つて、本明細書記載の分析要素の種
種のそれぞれのゾーンは、少なくとも使用条件下
において相互に流体接触する。このような流体接
触とは、分析要素の重ねあわされているか又は隣
接しているゾーン相互間を液体が通過する能力に
関係する。別のいいかたをすると、流体接触は、
流体接触するゾーン相互の間を液体成分が通過す
る能力をさす。流体接触するゾーンは隣接してい
てもよいけれども、介在するゾーンにより分離す
ることもできる。しかしながら相互に流体接触す
るゾーンに物理的に介在する要素のゾーンも前記
ゾーンと流体接触し、そしてこのようなゾーン間
の通過を妨げない。ゾーン間の流体接触は、もと
もと隣接しているか又は流体通過の為に有効に流
体接触するゾーンを有する要素を調製することに
より達成することができる。或いは、もともと隣
接しておらずそして例えば米国特許第3511608号
に記載されているようなそう入紙、又は米国特許
第3917453号及び同第3933594号に記載されている
ような弾性のある吸収剤材料もしくは変形可能な
支持体を使用することにより更に離れて位置させ
ることのできるゾーンを有する要素を調製するこ
とが適当な場合もある。もちろんのことである
が、要素が最初は接触していないゾーンを有する
場合は、要素使用時にゾーンが流体接触するよう
に、圧縮力を加えるか或いは他の適当な手段を適
用して分析結果を得ることが必要である。 本明細書及び特許請求の範囲で使用されている
“浸透性”なる語は、液体中に運搬される材料、
即ち液体中に溶解もしくは分散により分布する材
料が物質もしくはゾーンを有効に通り抜ける能力
をいう。 操作にあたつては、本発明の好ましい分析要素
は液体試料を受容することができ、液体試料はビ
リルビンが存在する場合には、試薬層中の反応性
媒染剤と反応して遊離のビリルビンの吸収ピーク
より少なくとも約10nmシフトし、また遊離のビ
リルビンのモル吸光率より約7.5×10⁴多い値に増
加させる（シフトした吸収ピークで測定）。本明
細書において使用される遊離ビリルビンは、血清
蛋白質と結合していない共役もしくは非共役ビリ
ルビンを含むと定義される。遊離ビリルビンは典
型的には、約435〜約440nmの範囲の波長で吸収
ピークを示し、22℃及び約7.4のPHの水溶液で測
定した場合約５×10⁴のモル吸光率（Ｅ_n）を示
す。特にことわらない限り、この明細書記載のす
べてのモル吸光率値は、約22℃、約7.4のPHの水
性媒質中で測定した値である。 拡散ゾーンが要素中に含まれる場合、適用試料
は通常試薬ゾーンに入る前にこの拡散ゾーンを通
過し、ビリルビンは拡散ゾーン中に分布されて試
薬ゾーンに面する拡散ゾーンの表面において見掛
上均一な濃度となる。要素へ適用する広範囲の試
料体積にわたつてこのような均一な見掛濃度を得
ることが可能である。拡散ゾーンと試薬ゾーンと
の間の流体接触により、そして拡散ゾーン内に拡
散したビリルビンに対する試薬ゾーンの好ましい
均一な浸透性により、均一に分布した成分が拡散
ゾーンから試薬ゾーンに提供され、どの段階で
も、試薬ゾーンにおいて実質的にビリルビンの見
掛け濃度に重要な変化をおこすことなく試薬ゾー
ンに浸入することができる。試薬ゾーンにおける
反応性媒染剤の存在により、また拡散ゾーンから
試薬ゾーンに提供するビリルビンの均一な見掛け
濃度により、要素中に均一な定量的に検出可能な
変化を生成することができる。このような変化は
輻射線方法により定量的に検出可能であり、そし
て所望の場合には光度計のような自動輻射感応装
置により検出することができる。 本発明のビリルビン分析法は、好ましくは“乾
式化学”を採用しそして拡散ゾーンを含む前記分
析要素を用いて実施される。これは、これら分析
要素がおどろくべきことにはビリルビン分析にお
ける極めてありふれた妨害物を効果的に除去する
ことがわかつたからである。この要素はカロテノ
イドやヘモグロビンからの妨害を除くばかりでな
く、塩化ナトリウム或いは所定液体試験試料中に
含まれている全蛋白質に対する妨害を殆んど又は
全く示さない。 しかしながら、本発明方法は種々の“湿式化
学”分析法又は溶液分析法を用いることによつて
好都合に実施することができる。この場合には適
当な液体媒質に組み入れられたビリルビンの反応
性媒染剤が、ビリルビンを含む液体試料と接触す
る。“湿式化学”分析又は溶液分析を用いる場
合、ビリルビン含有液体試験試料に予備処理工程
を施してビリルビンの高分子量蛋白質妨害物を除
去することが好ましい。これは、前記分離法のい
ずれかを用いて好都合に実施することができる。 本発明以前に、本明細書に記載されている分析
要素のあるものといくらか似通つた構成の、媒染
剤を含む種々の多層一体型分析要素が製造されて
いるか又は提案されている。このような分析要素
は、例えば、ベルギー国特許第831660号に記載さ
れている。この特許はしかしながらビリルビンの
検出あるいは試験を目的とする特定の試薬材料を
含む要素を記載したものではない。更に、媒染剤
が、これら要素が検出しようとしている選定した
被検体以外の材料を媒染する為に組み込まれてい
る。これと対照的に本明細書記載の一体型分析要
素は、試薬ゾーン又は試薬層中に、ビリルビン検
出の為の反応性媒染剤が組み入れられている。 添附の図面における第１図及び第２図はそれぞ
れ本発明の分析要素を示す好ましい態様の拡大断
面図を示す。第３図は、本発明の好ましい多層分
析要素においてビリルビンの濃度レベルを様々に
変化させた場合の分光測光応答を示すグラフであ
る。 以上に述べたように本発明の本質的特徴は、ビ
リルビンの１個もしくはそれ以上の結合サイトを
有する反応性媒染剤を用いることである。媒染剤
は、疎水性有機マトリツクス及び少くとも１個の
荷電性カチオン基を含む。本発明に従つて、前記
性質及び組成を有する材料がビリルビンと結合
し、そしてそれ故前記性質を有する材料はビリル
ビンの媒染剤として働くことが見い出された。し
かしながら、このような材料はビリルビンの媒染
剤の役割を果たすだけでなく、更に、このような
組成物とビリルビンとの反応の際、ビリルビンは
反応性媒染剤の結合サイトによつて媒染され、そ
の結果媒染されたビリルビンにおいて遊離のビリ
ルビンと比較した場合、スペクトル特性において
著しい変化が生じることが見い出された。詳しく
は、遊離ビリルビンの吸収ピークと比較して媒染
ビリルビンによつて示される吸収ピークに著しい
シフトが生じると共に、遊離ビリルビンに比して
媒染ビリルビンによつて示されるモル吸光率に実
質的な増加が生じる。 本発明のある好ましい態様に従つて、種々の写
真フイルム、紙及びその他の分野に従来より使用
されており、そして荷電性カチオン基を含むモノ
マー反復単量単位を有する組成物を含んでなり、
そして疎水性を付与する有機基を同じか又はその
他のモノマー単位上に有しているポリマー媒染剤
は、ビリルビンに対する特に有効な反応性媒染剤
を提供することが見い出された。勿論、前記性質
及び化学的組成を有するが、写真技術の面におい
て有用な写真媒染剤とは従来考えられていなかつ
た他のポリマー材料もまた、本発明の範囲内にお
いて使用することができる。 本発明に用いることができる特に有用なポリマ
ー反応性媒染剤は、ポリマー鎖中に下記式のモ
ノマー単位を有する材料を含む。 （式中、 Ａは有機基を示し、そしてポリマー主鎖の一部
を構成し； ＱはＭをＡに結合する化学結合もしくは化学
基を示し； Ｍは陽イオン基であつて好ましくは第四アン
モニウムもしくはホスホニウム基を示し；そして Ｘはハライドイオン、例えばクロリド又はブ
ロミド、ニトレート、メトサルフエート、ｐ―ト
ルエンスルホネートのような酸アニオンを示
す。） 本発明のある特に好ましい態様に従つて、Ｍ
は以下の式又はで表わされる第四アンモニウ
ム又はホスホニウム基を示す。 （式中、R¹、R²及びR³それぞれは同一であつても
異つていてもよく、炭素数が５〜約20未満のアリ
ール、アラルキルもしくはアルカリール基を示
す）。 好ましくは、式におけるＱは炭化水素基を示
し、好ましくはアリーレン、アリーレンアルキレ
ン、アルキレンアリーレン、アリーレンビスアル
キレン、もしくはアルキレンビスアリーレン基で
ある。典型的には、必ずしも絶対的ではないけれ
どもＱは約５〜約10個の炭素原子を含む。 もちろんのことであるが前記式におけるＡ
は、使用される特定のポリマー主鎖に依存して変
りうる。しかしながら特に良好な結果はＡがアル
キレン基である時に得られた。典型的にはこのよ
うなアルキレン基は２〜約10個の炭素原子を含
む。好ましい範囲は炭素原子数が２〜４個であ
る。 本発明に有用であることが見い出されたポリマ
ー反応性媒染剤はホモポリマーもしくはコポリマ
ーであつてよく、コポリマーが特に有用であるこ
とが見い出された。このようなコポリマーの代表
例の一部には、前記式の反復単位と更に非妨害
性モノマーの残渣を含む約75重量％までの別の反
復単位を含むポリマー反応性媒染剤が含まれる。
本発明において用いられる“非妨害性反復単位”
なる語には、ビリルビンの前記媒染を化学的もし
くは物理的に妨害しない化学単位が含まれる。こ
のような非妨害性反復単位を提供し、そして得ら
れる媒染ポリマーに疎水性を付与するモノマー前
駆体としては、オレフイン、置換オレフイン、ス
チレン及び置換スチレンのような脂肪族及び芳香
族炭化水素；アルキルアクリレート及びメタクリ
レート及びそれらの誘導体；このようなモノマー
前駆体の公知の均等物が挙げられる。更に、所望
なら、本発明に有用なポリマー反応性媒染剤を架
橋し、それによつて個々のポリマー鎖を例えばジ
ビニルベンゼン、エチレンジメタクリレートのよ
うな二官能性架橋基、並びに同等であつて種々の
その他の公知の二官能性架橋基により共有結合に
より架橋することができる。典型的にはこのよう
な二官能性架橋基が存在している場合には、これ
ら架橋基を、このような架橋ポリマーを調製する
ために使用するモノマーの共重合可能ブレンド中
に存在するモノマーの全重量の約５重量％までの
範囲、好ましくは約0.1〜約２重量％の範囲で本
発明のポリマー反応性媒染剤中に含有させる。典
型的には本発明において反応性媒染剤組成物とし
て有用な代表的なコポリマーは、（イ）前記式
で表わされる反復単位のモノマー前駆体約25〜90
重量％、（ロ）非妨害性反復単位のモノマー前駆
体約10〜約75重量％、及び（ハ）存在する場合に
は二官能性架橋剤０〜約５重量％を含むモノマー
ブレンドから共重合される。 本発明に使用されるある好ましい反応性媒染剤
をポリマー材料として前述したけれども、このほ
かにも、必要な疎水性及びビリルビンを媒染する
為のカチオン基を備えた非ポリマー材料を使用で
きることももちろんのことである。本発明におい
て“乾式化学”を利用する分析要素中にこのよう
な非ポリマー媒染剤材料が使用される場合には、
このような非ポリマー媒染剤は要素の試薬ゾーン
内に材料を固定できるように十分高い分子量を有
するか又は固定できるような分子構成をもつこと
が好ましい。 本発明に係るビリルビンの代表的な反応性ポリ
マー媒染剤の一部として以下の材料が挙げられ
る。

【表】

【表】 本発明に有用な反応性媒染剤は、写真技術の分
野で同一もしくは同様の材料の使用に関連して広
く記載されているよく知られた化学反応方法によ
り調製することができる。従つて本発明に使用す
る種々の媒染剤材料の調製に関して詳しく述べる
ことは不要である。しかしながらこのような材料
の調製について特に詳細が望まれる場合には、下
記特許を参照することができる。即ち英国特許第
1261925号；米国第3488706号；同第3557066号；
同第3625694号；同第3709690号；同第3770439
号；同第3758445号；同第3773509号；同第
3859096号；同第3898088号；同第3944424号；及
び同第3958995号。 本発明のビリルビン分析に必要なビリルビンの
前記反応性媒染剤の量は可変である。典型的に
は、所定の場合、このような反応性媒染剤の量は
ビリルビン含量の特定範囲、即ち特定のビリルビ
ン分析が有用であるように考案されている“動的
範囲（dynamic range）”に依存する。 １モルのビリルビンが１モル等量のビリルビン
の結合サイトを含む材料に結合もしくは媒染され
る本発明の種々の好ましい態様に従つて、十分な
量の反応性媒染剤が必要であり、それにより、要
素が意図するビリルビンの最大モル数に対して少
なくとも１モル当量の、反応性媒染剤中に存在す
るビリルビンの結合サイトが存在する。もちろん
のことであるが、ビリルビンの反応性媒染剤がポ
リマー材料を含む場合には、必要とされるこのよ
うなポリマー材料の量は、このような材料中に存
在するビリルビンの結合サイトを含む反復単位の
平均数、並びに前述のごとくこのようなポリマー
媒染剤を用いる特定のビリルビン分析が有用であ
ると考案されている動的範囲に依存する。前記ポ
リマー媒染剤１〜６のいずれかであるようなポリ
マー媒染剤材料が使用され、そしてこのようなポ
リマー媒染剤が固有粘度約0.15〜約1.0（0.25ｇ／
dlの濃度のベンゼン中で25℃で測定）である、ス
チレンと塩化ビニルベンジルとの中間体コポリマ
ーから製造する本発明の好ましい態様に従つて、
典型的には約0.1〜50mg．／dl．のビリル被検体
の動的範囲に対し、約0.01〜1.0ｇ．／dl．の範
囲にあるような媒染剤の量を用いる。一般に、本
発明分析要素の試薬ゾーン中に過剰量の反応性媒
染剤を存在させ、それにより媒染剤材料とビリル
ビンとの反応を促進し、媒染ビリルビンのスペク
トル特性に望ましい変化を起すことができること
が有用であることが見い出された。 即に述べたように本発明方法は溶液分析として
或いは例えば本発明の一体型分析要素を用いた
“乾式化学”の使用により本発明の好ましい態様
に従つて実施することができる。 本発明方法を溶液分析として実施する時には、
先ず、非妨害性液体媒質に溶解もしくは分散させ
た前述の適当な反応性媒染剤を輻射線透過性容器
のような適当な“湿式”反応ゾーン中に調製する
ことにより分析を実施する。このような非妨害性
液体には、使用条件下において、ビリルビンと媒
染剤との反応を実質的に妨害しないか又は、遊離
及び媒染ビリルビンの吸収ピークを実質的に妨害
しない液体材料が含まれる。このような非妨害性
液体には種々の水性及び有機液体の両方が含まれ
る。典型的には、本発明方法が体液の分析に適用
されるため、反応ゾーン中に使用される非妨害性
液体として、水などの水性液体或いは種々の同様
の極性有機溶媒、例えば低級アルキルアルカノー
ル等を選ぶことが有利である。所望の場合には、
特定の反応性媒染剤に依存して、反応性媒染剤に
加えて反応ゾーン中に更に種々の緩衝物質を含有
させることが有利である。 一般に、本発明に係る“湿式化学”法により実
施されるビリルビン分析は、温度約15〜約60℃、
好ましくは約22〜約50℃において、約6.8〜約9.5
のPH範囲を有する緩衝水性液体を用いて実施する
場合に有利な結果が得られることが見い出され
た。勿論選んだ特定の反応性媒染剤に依存して、
試薬ゾーンの前記PH及び温度を前記範囲よりも上
或いは下に変えることができるが、ビリルビン或
いは反応性媒染剤に不望の副反応或いは著しい減
成をもたらすようなPH値或いは温度は採用できな
いことはいうまでもない。更に、本発明方法を溶
液分析として実施する場合には、ビリルビンの光
による減成を防止するため分析を暗所か或いは黄
色安全光の条件下で行うことが望ましい。 本発明方法を“湿式”ビリルビン分析法により
実施する場合、前述のごとく、先ずビリルビンを
その結合している種々物質から解離するため、ビ
リルビン含有液体試験試料に予備処理を施すこと
が望ましい。例えば液体試験試料が血清である場
合、血清中の多量のビリルビンが、同じく血清中
に存在するアルブミンと結合していることが知ら
れている。例えばアルブミンのような物質からビ
リルビンを解離するため種々の方法が考案されて
おり、そしてこのような方法は本発明に従つた予
備処理工程として用いることができ、それにより
血清試料中に含まれる全ビリルビンを正確に測定
するための分析が行われるようにする。ビリルビ
ンを種々の血清蛋白質、特にアルブミンから解離
するこのような公知方法としては、種々の蛋白質
沈殿法、試料希釈法等がある。多くのこれら種々
の方法についての概括的なレビユーは、例えば先
述のWinkelman等による刊行物、即ちClinical
Chemistry―Principles and Technics、第二
版、1974年刊、1042乃至1079ページ、に見られ
る。 以上に述べたように、本発明のビリルビン分析
法は溶液及びいわゆる“乾式”化学分析法の両方
に適応される。取り扱いが容易であり、定量分析
結果を得ることができ、そしてその他全体的に便
利であるため、ビリルビンの“乾式”分析のため
の第１図及び第２図に図示した本発明の分析要素
を用いることが特に好ましい。 第１図に示すような要素は、前記反応性媒染剤
を含有する実質上乾式の試薬ゾーン７を含む。こ
の分析要素には実質的に乾式の拡散ゾーン６及
び／又は更に中間層も存在することができ、その
結果本発明の好ましい分析要素は、典型的には使
用条件下においては相互に流体接触する少くとも
二つの別個のゾーンを含む。好ましくは、本発明
の要素中には、種々のゾーンが重ねあわされた、
隣接した層の形で存在する。典型的にはこれら層
は、支持体８、好ましくは輻射線透過性支持体上
に被覆されている。しかしながら、本発明の好ま
しい分析要素は重ねあわされた、隣接する層から
なるけれども、異なる構造配置を有する他の要素
も本発明に従つて製造できることも当然のことで
ある。これは例えば第２図に示した要素であつ
て、二つの隣接して並置したゾーン、即ち拡散ゾ
ーン６と試薬ゾーン７が必要な場合或いは好まし
い場合には支持体８上に支持されている構成であ
る。便宜のためまた本発明の最もよい態様を説明
するため、以下の文においては、本発明の要素
を、種々のゾーンが輻射線透過性支持体上に支持
される重ねあわされた連続層として存在する多層
一体型分析要素に見られる構造及び特徴により記
載する。 本発明の一体型要素は、典型的には、拡散層と
試薬層とを含み、両層とも好ましくは輻射線透過
性である。このような要素は好ましくは輻射線透
過性である支持体上の層を有することができる
が、両層が適当な耐久性及び完全性を示す場合に
は、支持体は必要でない。 一つの好ましい態様においては、本発明の一体
型分析要素は、（１）少くともビリルビンに浸透
性であり、そして前記のようなビリルビンの反応
性媒染剤を含む試薬層と、（２）ビリルビンに浸
透性である拡散層とを載置した輻射線透過性支持
体を含む。試薬層は支持体と拡散層との間にはさ
む。また拡散層はビリルビンに対して実質的に均
一に浸透性であることが好ましい。試薬層はビリ
ルビンよりも実質的に大きい分子量を有する蛋白
質物質、例えばアルブミン及び分子量が60000
（ダルトン単位）もしくはこれより大きいその他
の蛋白質物質に対して、実質的に不浸透性である
のが好ましい。 本発明の別の態様に従つて、試薬層及び拡散層
を載置した支持体を有する一体型分析要素が提供
され、前記拡散層は非繊維性であり、そして望ま
しくは等方的に多孔性である。この態様の一面に
おいては、要素の定量分析性を高めるためすべて
の層が非繊維性であることが好ましい。この明細
書で用いる“非繊維性”なる語は層及び／又は材
料に関して用い、このような層又は材料が繊維性
物質を含まないか又は実質的に含んでいないこ
と、即ち、このような層又は材料が、前述の試料
拡散を妨害しないか又は輻射線分析手段による分
析結果の検出を妨害しない程度にしか繊維性成分
を含んでいないことを示す。 拡散層と協働して使用する場合、本発明の要素
の試薬層はビリルビンには均一に浸透性である
が、高分子量蛋白質物質に対しては実質的に不浸
透性でかつ非多孔性であることが望ましい。本明
細書で使用する浸透性なる語は、多孔性であるこ
とから生じる浸透性、膨潤性又はその他の特徴を
含む。試薬層は、反応性媒染剤が分布、即ち溶解
又は分散するマトリツクスを含んでもよい。しか
しながら本発明においてしばしばそうであるよう
に、反応性媒染剤がポリマー状でありそしてそれ
自体フイルム形成性であるか或いは均一層又はゾ
ーンとして容易に被覆されうるような場合には、
更にこのようなマトリツクス材料は必要でない。
もちろんマトリツクス材料の選択は、それが分布
する反応性媒染剤の成分に依存する。どの場合も
マトリツクス材料は媒染剤に対して“非妨害性”
でなければならない。即ちマトリツクス材料はそ
れ自体反応性媒染剤に結合又は媒染しえないもの
でなければならない。拡散層と協働する試薬層の
望ましいマトリツクス材料は非繊維性で非妨害性
親水性材料を含まなければならない。このような
材料には、約9.1の等電点を有する加水分解ゼラ
チン（例えば粗ゲル）及びその誘導体、親水性セ
ルロース誘導体、多糖類例えばデキストラン、ア
ラビアゴム、アガロース等、並びに合成物質例え
ばポリ（ビニルアルコール）及びポリ（ビニルピ
ロリドン）のような水溶性ポリビニル化合物；ア
クリルアミドポリマー等が挙げられる。非妨害性
親油性材料、例えばセルロースエステル等もまた
有用でありえる。多孔性でない場合には、試薬層
の浸透性を高めるために、分析下の液体の溶媒又
は分散媒質中で膨潤性であるマトリツクス材料を
使用することがしばしば有用である。また、要素
製造に際しては例えば被覆手段による隣接層の適
用と両立しうる材料を選ぶことも必要である。例
えば別個の隣接した層の形成が望まれ、そして目
的とする分析が水性液体についてである場合は、
試薬層には実質的に水溶性のマトリツクスを、拡
散層のような隣接層には実質的に有機溶媒可溶性
もしくは有機溶媒分散性の成分を選ぶことが適当
である。このようにして、相互の溶媒作用が最少
にされ、そして、明瞭に境界のある層構造体を形
成することができる。多くの場合、高分子量の蛋
白質物質（潜在的なビリルビン妨害物）が試薬層
中に拡散するのを防止するために、拡散層それ自
体よりも試薬層の浸透性が低いことが望ましい。
このことは、試薬層の有効な孔径を小さくするこ
とによつて容易に達成することができる。相対的
な浸透性或いは孔径はよく知られた方法により決
定することができる。 試薬層中には、ビリルビンの反応性媒染剤が分
布される。反応性組成物は、これを用いている場
合にはマトリツクス材料に溶解又は分散させるこ
とによつて分布させることができる。均一な分布
がしばしば好ましいけれども、必要というわけで
はない。 本明細書記載のビリルビンの反応性媒染剤を用
いた“湿式化学”又は溶液分析の場合には、本発
明の“乾式化学”分析要素に、適当なPH緩衝組成
物をも含めることができる。緩衝組成物は要素の
使用条件下において試薬層に溶液分析に用いたPH
と実質的に等しいPHを付与するのに有効な量で本
発明の特定分析要素に存在する試薬層、或いは一
つ又はそれ以上の他の層に組み入れることができ
る。リン酸塩緩衝剤及びGoodにより
Biochemistry第５巻、第467ページ（1966年）に
記載されているような他の緩衝剤を含む種種の緩
衝組成物を使用することができる。 前述のごとく、本発明の一体型要素には拡散層
が含まれる。拡散層は液体試料を受容しうる層で
あつて、この試料は拡散層に直接適用するか又
は、拡散層と流体接触する層もしくは数層から拡
散層へ提供するかのいずれかである。そしてこの
拡散層に試料及びビリルビンの溶媒又は分散媒質
が、要素の試薬層に面する拡散層の表面にビリル
ビンの均一な見掛け濃度が提供されるように分布
する。もちろんのことであるがこのような見掛け
濃度は、拡散層中に或いはその厚さ全体にわたつ
て存在する濃度勾配によつて達成される。このよ
うな勾配は、定量試験結果を得るのになんらの困
難を呈することもなく、公知の較正方法を用いて
調節できる。 拡散機構は完全には解明されていないが、拡散
は、液体試料の静水圧、拡散層内の毛管作用、試
料の表面張力、拡散層と流体接触する層の燈心作
用等のような力の組み合せから生じ、そしてそれ
らに制限されると考えられる。もちろんのことで
あるが、拡散の程度は、拡散さるべき液体の体積
に幾分依存する。しかしながら、拡散により得ら
れる均一な見掛け濃度は実質的に液体試料体積に
依存せず、そして拡散の種々の程度により得られ
ることを強調せねばならない。その結果、本発明
の要素は正確な試料適用技術を必要としない。し
かしながら、好ましい拡散時間等の理由により特
定の液体試料体積が望ましい。本発明の要素は拡
散層の好都合な寸法領域内（例えば一平方セン
チ）に完全に採取されうる非常に小体積の試料を
用いることによつて定量的結果を生成しうるの
で、液体試料を適用した後要素から過剰の水分を
除去する必要はない。更に、拡散が拡散層で生
じ、そして拡散物質が、流体接触している試薬層
に明きらかに実質的に側面の静水圧を生じること
なく提供されるため、先行技術の分析要素にしば
しばみられる“輪形成”問題が生じない。 拡散層は、これと流体接触する試薬層に面する
表面の単位面積あたりに拡散物質の均一な見掛け
濃度を生ぜしめることのみが必要であり、そして
拡散目的のために特定の層が適当であるうるかど
うか決定することは極めて好都合である。見掛け
濃度のこのような均一性は、デンシトメトリー又
はその他の分析法により決定でき、そして所望な
ら、この性質のための特殊な試験が前記米国特許
第3992158号に詳細に記載されている。 有用な拡散層は、好ましくは等方的に多孔性の
層である。等方的に多孔性なる語は、本明細書に
おいては、拡散層中においてあらゆる方向に向か
つて多孔性を有している状態をいう。このような
多孔性の程度については、例えば孔径、空隙率や
その容積その他によつて異なる。等方的多孔性な
る語についての更に詳しい内容については、前記
米国特許第3992158号に記載されている。 有用な拡散層は種々の成分を用いて調製するこ
とができ、更に詳しくは前記米国特許第3992158
号に記載されている。一つの態様においては、粒
状材料を用いてこのような層を形成することがで
き、このような層においては等方的な多孔性が粒
子間の相互連絡空隙により創成される。分析下の
試料成分に望ましくは化学的に不活性である種々
の型の粒状物質が有用である。例えば二酸化チタ
ン、硫酸バリウム、酸化鉛、酸化亜鉛等の顔料が
望ましい。他の望ましい粒子は、ケイソ土や天然
もしくは合成のポリマー、例えば微結晶セルロー
ズに由来する微結晶コロイド物質である。均一サ
イズの球状粒子、例えば樹脂ビーズ或いはガラス
ビーズもまた使用することもでき、これはたとえ
ば選択的過目的のために均一な多孔が有利であ
る場合には特に望ましい。ガラスビーズ等の場合
のように選んだ粒状材料に接着性がない場合に
は、接触点で相互に接着することのできる粒子を
得るように処理することができ、それにより等方
的に多孔性の層の形成が容易になる。 このような粒状材料の代りにか、或いはこれに
加えて、等方的に多孔性のポリマー組成物を用い
て拡散層を製造することができる。このようなポ
リマー組成物は、例えば米国特許第3555129号及
び前記米国特許第3992158号に記載されているよ
うなブラツシユ（blushed）ポリマーの製造に有
用な方法を用いて調製することができる。またこ
のような等方的に多孔性のポリマー組成物を調製
するのに有用な他の方法には、米国特許第
2960728号及び同第2946095号に記載されているよ
うな多孔を創成するためのガス又はその他の膨潤
性成分の使用に関する方法、或いは例えば米国特
許第3816575号に論じられているような溶解して
多孔を提供する溶解性固体のポリマー相内におけ
る使用に関する方法が挙げられる。本発明に使用
する等方的多孔性ブラツシユポリマー拡散層を調
製するために、単独或いは組合わせて多くの異な
るポリマーを用いることができる。その典型的な
例としては、ポリカーボネート、ポリアミド、ポ
リウレタン及びセルロースエステル例えば酢酸セ
ルロースが挙げられる。種種の微孔質フイルター
はブラシユポリマー組成物であるか、その一部が
ブラツシユポリマー組成物であり、例えばミリポ
ア社より市販されている種々の膜フイルターが挙
げられ、これらの米国特許第2783894号及び第
2772322号に記載されている。 拡散層の厚さは色々にすることができるが、そ
の厚さは幾分目的とする試料体積に依存し、この
体積は簡便さ及び清潔の観点から拡散層が吸収し
うる体積でなければならず、また層に吸収されう
る試料量にも影響する層の空隙体積に依存する。
乾繰厚が約50ミクロンから約300ミクロンの範囲
である拡散層は特に有用である。しかしながら、
この範囲外の厚さであつても許容することがで
き、そして特定の要素にとつては望ましいことが
ある。 等方的に多孔性の拡散層を調製する時空隙体積
が層全体の体積の少くとも約25％を占めることが
有用であり、そして50〜95％の空隙体積が望まし
い。多孔性拡散層の空隙体積を種々に変えること
により要素の特徴、例えば拡散層の全体的な浸透
性、又は試料の拡散に必要な時間等を有利に改質
することができる。もちろんのことであるが層内
の空隙体積は、たとえば適当なサイズの粒状材料
を選ぶことによつてか、又は拡散層に等方的に多
孔性のブラツシユポリマーを使用する場合溶媒或
いは乾燥条件を色々に変えることにより制御する
ことができる。拡散層の空隙体積並びに空隙体積
の計算方法については、米国特許第3992158号に
更に詳しく記載されている。 本発明の一体型分析要素を調製するにあたつて
は、層のそれぞれは別々の層として予め形成し、
その後使用する前に積層するか、或いは要素使用
時に流体接触させるまで別々の層として保持する
ことができる。別々の部材として予備形成した層
は、被覆可能である場合典型的には層が乾燥時に
物理的に剥離されうる表面に、溶液もしくは分散
液から被覆する。しかしながら隣接層が望まれる
場合には、何度もの剥離及び積層工程問題を回避
しうる便利な方法は、剥離面又は支持体上に最初
の層を被覆し、次に既に被覆した層上に順次層を
直接被覆してなる。このような被覆は、前記米国
特許第3992158号に詳しく記載されているような
種々のよく知られた被覆法により達成することが
できる。中間層の接着問題は、例えば写真フイル
ムに使用される下塗材料を極めて薄く適用するこ
とを含む表面処理により、有害な影響を受けるこ
となく克服することができる。 被覆することができる試薬層のために、マトリ
ツクス材料を含む被覆溶液或いは分散液をその一
つが必要な場合に用いそして反応性媒染剤を調製
することができる。前記溶液或いは分散液は前述
のごとく被覆し、乾燥して寸法的に安定な層を形
成する。試薬層の厚さ及びその浸透性の程度は広
い範囲にわたつて変えることができ、そしてこれ
は実際の使用に依存する。ある場合にはもつと広
い範囲にわたつた厚さが有利であることもあるけ
れども約10ミクロン〜約100ミクロンの厚さが好
都合であつた。繊維性試薬層は、よく知られた方
法に従つて繊維性マトリツクスを含浸させるによ
り形成することができる。 前述のごとく、本発明の分析要素は自己支持性
であつてもよくまた支持体に支持されていてもよ
い。有用な支持体材料には様々のポリマー材料が
含まれ、例えば酢酸セルローズ、ポリ（エチレン
テレフタレート）、ポリカーボネート及びポリス
チレンのようなポリビニル化合物等があげられ
る。特定要素に対して選んだ支持体は結果検出の
目的とする様式に支障にならないものでなければ
ならない。好ましい支持体は約300mm〜約700mmの
領域の波長を有する電磁輻射線を透過する輻射線
透過性支持体が含まれる。一つ又はそれ以上の狭
い波長バンドを透過し隣りあう波長バンドを通さ
ない支持体を有することも望ましい。このこと
は、たとえば適当な吸収特性を有する一つ又はそ
れ以上の着色剤を支持体に含浸させるか又は被覆
することにより達成しうる。 本発明の要素の特定層の成分及び層構成は色々
に変えることができる。前述のごとく拡散層の孔
サイズは、層が望ましくない試料成分を去でき
るように選ぶことができる。前記望ましくない試
料成分は例えばビリルビンよりも高分子量の蛋白
質であつて、例えば分析置換反応或いは要素中に
生成する試験結果の検出を妨害するような物質で
ある。全血液分析のためには、１〜約５ミクロン
の孔サイズを有する多孔性層が、典型的には約７
〜約30ミクロンのサイズを有する血球をスクリー
ニングするために特に有用である。所望の場合に
は、要素にそれぞれ拡散能及び過能が異なる多
数の拡散層を含めることができる。 アニオン性及び非イオン性界面活性剤材料のよ
うな一つ又はそれ以上の界面活性剤材料を要素の
層に組み入れることは有利でありえる。このよう
にすることにより層調製物の被覆力を向上するこ
とができ、そして界面活性剤のような助けがなけ
れば液体試料により容易にぬれない拡散層におけ
る拡散の程度及び速度を高めることができる。特
に比較的大量の非イオン性界面活性剤のような界
面活性剤を本発明の要素の拡散層に組み入れ、水
性蛋白質含有液体試料に含まれるビリルビンの、
要素の拡散層内及びこの層を通つての輸送を正常
化することが望ましい。このような正常化とは、
このような試料間における蛋白質濃度のバラつき
にもかかわらず適用される水性蛋白質含有液体試
料中に含まれる溶媒媒質及びビリルビンが拡散層
内に等しく浸透することを言う。更に、ビリルビ
ンがしばしば結合状態、例えば血清アルブミンな
どの他の蛋白質に結合している場合、本発明の全
ビリルビン分析をする場合にはビリルビンの輸送
を正常化するための前記のような界面活性剤の使
用によつて、前記のような蛋白質に結合されてい
るビリルビンが解離することが有利にも明らかで
ある。正常なビリルビンの輸送を行うために有用
な界面活性剤の好ましい量は、典型的には層の乾
燥重量の約１〜約15重量％である。 本発明の分析要素は臨床化学の分野に用いるこ
とができるばかりでなく、化学研究所及び化学方
法制御研究所においても利用することができる。
本発明の分析要素は体液、例えば血液、血清、尿
の臨床試験に用いるのに十分適している。これは
このような試験においては大量の反復試験が頻繁
に行なわれ、そして試料を採取した後非常に短時
間の間に試験結果が必要なことが多いからであ
る。本発明の分析要素を用いて血液を分析する場
合、血球は先ず遠心分離などの手段により血清か
ら分離し、そして血清を分析要素に適用する。し
かしながら、例えば反射分光測光分析法を用いて
媒染ビリルビンの定量分析又はその他の分析を行
う場合には、このような分離を行うことは必要で
はない。全血液を要素へ直接適用することがで
き、そして血球は、過層として働く独立した中
間層（輻射線遮断層でもありえる）の作用により
試薬層から去及び排除される。要素上にこれら
血球が存在しても、反射法により分光測光分析が
実施される場合は、その分析を妨害することはな
い。反射法の場合には、光は支持体及び検出記録
層（registration layer）を通り、輻射線遮断層
又は他の反射層から反射され、検出輻射線は血球
を遮らない。本明細書記載の一体型分析要素の特
に重要な利点は、血清又は全血液いずれをも分析
する為に使用されるそれらの能力である。 既に述べたように本発明の要素は、好ましくは
試薬層と支持体との間にはさまれた輻射線遮断層
を含む。輻射線遮断層は、たとえば検出に用いる
波長における電磁輻射線の通過を妨害する働きを
する。このような層は、吸光度、反射等の性質に
より層に組み入れられた時輻射線妨害効果を提供
する乳白剤を含む。一つの態様において、輻射線
遮断層は炭素のような顔料又は二酸化チタン、酸
化亜鉛、硫酸バリウム等の金属塩のような無機顔
料のような乳白剤を有するマトリツクスを含むこ
とができる。その性質上一般に反射性であるブラ
ツシユポリマーは乳白剤を含んでおり、そして拡
散層において有用であるようなブラツシユポリマ
ーはまた輻射線遮断層としても使用することがで
きる。 一つの好ましい態様においてはブラツシユポリ
マー拡散層は拡散及び／又は反射を向上させるた
め、本明細書中の別の箇所に記載した高い反射性
を有する顔料のような反射性無機顔料を組み入れ
ることができる。一層中にブラツシユポリマーと
共に含めうる顔料の量は広い範囲で色々であつて
よく、ブラツシユポリマーの重量の５〜約1000重
量％の量が好ましく、また顔料濃度はブラツシユ
ポリマーの約100〜約600重量％であるのが非常に
好ましい。 本発明の一体型分析要素における任意の輻射線
遮断層の使用に加えて、所望により任意に他の中
間層を組み入れてもよい。例えば、分析下の液体
試料の溶媒又は分散媒質中で膨潤性の、別個の中
間層を使用することができる。好ましくは輻射線
透過性であるこのような膨潤性の中間層、たとえ
ば膨潤性ゲル層は試薬層と支持体との間にはさむ
ことができ、そして要素の拡散層から試薬層への
ビリルビン含有血清試料の浸透或いは拡散速度の
向上に用いることができる。別の例として、中間
層を本発明の分析要素の拡散層と試薬層の間に組
み入れることができる。このような層は勿論ビリ
ルビンに浸透性でなければならず、そしてビリル
ビンの種々の妨害物を不活性にしうるか又は過
する為に用い、このような不活性化又は過によ
り妨害物質を除き試薬材料を組み入れる為に使用
することができる。更に別の例として、このよう
な中間層はビリルビンと反応する為に使用しうる
試薬層を組み入れるために使用することができ
る。例えばグルクロニダーゼ酵素を含有するゼラ
チン中間層を拡散層と、反応性媒染剤を含む層と
の間に用いることができ、このことによりグルク
ロニダーゼの酵素作用によつて分析下の液体試料
中の共役ビリルビンはビリルビンの非共役型に転
化される。或いはグルクロニダーゼ酵素を本発明
の分析要素の拡散層中に組み入れ、酵素がビリル
ビンの共役型に対してより直接的でかつ有効な反
応を行うようにしてもよい。 もちろんのことであるが、種々の異なる要素を
本発明に従つて調製することができる。要素は種
種の形状にすることができ、例えば所望幅の長い
テープ、シート或いは小チツプの形にすることが
できる。 本発明の一体型要素は、液体試本を適用するこ
とにより使用する。典型的には、適用試料が試薬
層と接触する前に、試薬層に面しない側の拡散層
表面で拡散層と接触するように要素を形成する。
本発明要素の分析精度が適用試料の体積のバラつ
きによつて実質的に低下することはないので、試
料の適用は手でやつても機械でやつてもよい。し
かしながら分析結果の検出に便利であるよう、試
料体積に適当なコンシステンシーがあるのが望ま
しい。前述のごとく、溶解性反応性組成物を試薬
層に使用す場合輪の形成を最小限にとどめること
も極めて望ましい。 手によつて行うか、或いは自動化されてもよい
本発明の一体型要素を用いた典型的な分析操作に
おいて、要素を供給ロール、チツプポケツト又は
その他の供給源から採取し、例えば適当な分配器
からの遊離滴、接触スポツト又は他の形状の液体
試料を受けとるように位置させる。試料適用後、
そして望ましくは拡散層により液体試料が採取さ
れた後、試験結果を得るのを速めるか或いは容易
ならしめるのに望ましい加熱、増湿等のような調
湿を要素に施す。自動化操作を用いる場合、拡散
層は数秒間のうちにその機能を果たし、分散する
のに十分な時間が与えられることが望ましく、こ
のことは吸収剤繊維状紙の場合に見られるような
殆んど瞬間的な未制御拡散とは対照的である。こ
のことは、例えば層の厚さ、多孔性層の空隙体積
等の種々の要因を適当に選ぶことにより好都合に
達成することができる。 検出可能な変化として分析結果が得られた後、
その結果を通常反射もしくは透過分光測光のため
の適当な装置により測定する。このような装置
は、支持体及び試薬層に光のようなエネルギーの
ビームをあてる働きをする。光はたとえば要素の
拡散層又は輻射線遮断層中の乳白剤から検出手段
へ反射されるか、又は透過検出法の場合には要素
を通過して検出器に達する。好ましい態様におい
ては、分析結果は全くこのような結果の生ずる要
素の帯域内で検出される。要素が透過可能であり
そして試薬層内で生成する検出可能な変化を定量
しうるどのような輻射線も使用できるが、一般に
このような測定には約300〜約700nmの範囲内の
電磁輻射線が有用であることが見い出された。
種々の較正手段を用いて分析をコントロールする
ことができる。一つの例として、被検体標準溶液
試料を、試料滴の存在する場所に隣接して適用
し、その差を測定することができる。 以下の例は本発明を更に詳しく説明するために
掲げる。 例 １ ビリルビンの溶液分析 この例では、液体分析媒質中のビリルビンが前
記特定のある媒染剤の存在下において、自身のλ
_nax（最大吸収ピーク）を435〜440nmから460nm
にシフトし、この新らしい吸収ピークにおいてそ
のモル吸光率が著しく増大することを実証した。
このことを実証するために、吸収スペクトル（37
℃において分光光度計により360〜600nmで測
定）を以下４種（Ａ乃至Ｄ）の液体溶液試料につ
いて記録した。 Ａ PH7.4の0.05Mりん酸二水素ナトリウム緩衝
液； Ｂ PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液に第
１表の媒染剤６を0.012％（重量／容量）含む
もの； Ｃ PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液に１
mg．／dl．のビリルビンを含むもの； Ｄ PH7.4のりん酸二水素ナトリウムに１mg．／
dl．のビリルビンと第１表の媒染剤６を0.012
％（重量／容量）含むもの。； 得られた吸収スペクトルは次の結果を示した： １ 試験したレベルでは、りん酸塩緩衝液のみ
（溶液Ａ）及び媒染剤６のみ（溶液Ｂ）はいず
れも、このスペクトル帯域において吸収が著し
く変化することはない。 ２ ビリルビンのみ（溶液Ｃ）は、435〜440nm
において最大吸収（λ_nax）を有する。 ３ 第１表の媒染剤６の存在下におけるビリルビ
ンは、λ_naxが460nmにシフトし、新しいピー
クにおいてその吸収は２倍に増加した。即ち、 Ｅ_n46040×10³→Ｅ^ｉ _ｎ４６０80×10³ （Ｅ_n460はビリルビンのみのモル吸効率を示
す） （Ｅ^ｉ _ｎ４６０はビリルビン及び第１表の媒染剤６の
モル吸光率を示す）。 例 ２ 分析要素におけるビリルビンと媒染剤との反応
の適用 本発明の好ましい態様において、一体型分析要
素構造を次のように調製した。 透明なポリエチレンテレフタレートウエブ支持
体を、第１表の媒染剤４（0.54ｇ／m²）のみから
なる試薬層；ポリ（ｎ―アソプロピルアクリルア
ミド）（0.32ｇ／m²）を含む下塗層；及びTiO₂
（45.6ｇ／m²）、酢酸セルローズ（6.45ｇ／m²）、
トライトンＸ―405（即ち、ロームアンドハー
ス社より市販されているオクチルフエノキシポリ
エトキシエタノール2.51ｇ／m²）及びポリエチレ
ングリコールのオレイン酸エーテル（0.64ｇ／
m²）を含んでなるブラツシユポリマー拡散層；に
より被覆した。 次いでこの要素を次に下記の方法で評価した。 ７ｇ／dlの人間の血清アルブミン及び100mM
の食塩を含む一連のビリルビン溶液であつて、ビ
リルビンの量を溶液１デシリツトルあたり０から
20mgまで変化させたものを、前記被覆要素にスポ
ツトした（〜10マイクロリツトルずつ滴下するこ
とにより）。この例の分析要素における反射濃度
ΔＤ_Rの変化を７分間隔で記録した（37℃におい
て460nmにおいて測定）。第３図は、試験した０
〜20mg／dlのビリルビンに対するこの要素の応答
を示す。 曲線上の各点における垂直なバーによつて示さ
れるようにすぐれた再現性がこの要素から得られ
た。 例 ３ 媒染剤及びゼラチンを用いた分析要素における
ビリルビンと媒染剤との反応の適用 本発明のもう一つの態様において、ウエブ構造
を次のようにして調製した。 透明なポリエチレンテレフタレートウエブ支持
体を、第１表の媒染剤６（2.2ｇ／m²）及びゼラ
チン（4.1ｇ／m²）を含む試薬層、及び例２で用
いた拡散層と等しい拡散層で被覆した。 次いでこのウエブを例２に記載されたような方
法で評価した。PHが7.4でビリルビンの量を異に
した一連の水性溶液、及びPHが7.4であり７
ｇ．／dlのアルブミンを含有しビリルビンの量を
異にした一連の食塩溶液を液体試験試料として用
いた。その結果、この例の要素は、広い範囲にわ
たる異なるビリルビン濃度に応答する非常に直線
的な分光測光応答を示すことが見い出された。ま
た、この要素のアルブミンに対する非感受性は、
液体試験試料がアルブミンを含んでいるか否かに
かかわりなく、この要素から得られる果が良好に
一致していることによつて実証された。 例 ４ ゲルパツドを用いた分析要素にけるビリルビン
と媒染剤との反応 本発明の別の態様において分析要素構造を次の
ようにして調製した。 例２で用いた支持体を、牛の血清アルブミン
（1.1ｇ／m²）及びゼラチン（2.3ｇ／m²）を含む
ゲルパツド；第１表の媒染剤６（1.1ｇ／m²）及
びゼラチン（1.1ｇ／m²）を含む試薬層、及び例
２に記載の拡散層で被覆した。 次いでこのウエブを例２に記載の方法と同様の
方法で評価した。生理食塩水中に７ｇ．／dl．の
人間の血清アルブミンを含み、ビリルビンのレベ
ルを色々にした水性溶液（アメリカンモニター
社、米国インデイアナ州、インデイアナポリス）
を要素の較正体として用いた。次に既知の量のビ
リルビンを含む相異なる組成物からなるいくつか
の市販の人間の血清の代用物を試験するための較
正要素を使用した。この例の要素により測定した
ビリルビン値（ビリルビン濃度が0.5〜20.0mg／
dl）は、人間血清の代用物の製造者により特定さ
れた値と極めてよく一致していた。 例 ５ ヘモグロビンによるスペクトル妨害がないこと すべてではないにしてもほとんどの他の直接的
なビリルビンの分光測光分析は、血清中に20
mg．／dl．未満の量で存在するヘモグロビンによ
るスペクトル妨害をうける。本発明の多層分析要
素がヘモグロビンによるスペクトル妨害を実質的
にうけない、ということを実証するために、例２
のようにして調製したいくつかの同じ要素を、ビ
リルビン１mg／dl．もしくは15mg／dl．を含み、
ヘモグロビンの量を０〜150mg．／dl．の範囲で
色々とした液体試験試料をスポツトし、各要素の
460nmにおける反射濃度、Ｄ_Rを測定した。この
広い範囲にわたるヘモグロビン濃度に対して、要
素からの応答には変化はみられず、従つてヘモグ
ロビンは460nmにおいて、この分析の妨害物とな
つていないことが示された。 例 ６ PH値を色々とした場合の効果 血清のような試料に生ずるPHの変化によりこの
ビリルビン分析が影響を受けないことを示すため
に、０〜20mg／dlの範囲にわたる種々のビリルビ
ン濃度を有する二つの系のビリルビン標準であつ
て、一方はPH7.4でありそして他方はPH8.2であ
り、人間血清アルブミン７ｇ．／dl．、食塩及び
0.05Mりん酸二水素ナトリウム緩衝液を含む標準
を例２に記載のごとくして調製した分析要素上に
スポツトした。これらの要素を例２に記載の方法
と同様の方法で評価した。得られた結果は、試験
した範囲内において、PH値の変化の変化によつて
分析結果になんら影響がないことを示した。 例 ７ 温度変化の影響 例３に記載した方法で調製した分析要素を使用
して温度変化に対する要素の感受性を試験した。
PH7.4おける一連のビリルビン標準を用いた。27
℃においては要素の応答はかなり低かつたが、37
℃と42℃の間では実質的に変化はなかつた。 例 ８ 性質保持 例７記載の一連のビリルビン標準及び分析要素
を用いて、室温（20℃）で１カ月にわたつて要素
の安定性を試験した。その結果、特別な水分調整
を行わなくても、室温でこの期間を通じて要素は
極めて安定であることが見い出された。要素は較
正可能であつたばかりでなく、古くなつた要素の
応答は実質的に新しい要素のそれと区別できなか
つた。 例 ９ カロテノイイドの妨害がないこと。 成人の主なカロテイドであるβ―カロテンは
450nmで吸収するため、ビリルビンの直接的分光
測光分析の潜在的妨害物として引用されてきた。
この例においては、７ｇ／dl．のアルブミン、１
もしくは20mg／dl．のビリルビン、0.02もしくは
0.2mg／dl．のβ―カロテンを含有する４通りの
生理食塩液試験溶液に対する本発明の分析要素
（例２に記載の方法により調製）の分光測光応答
を記録した。このレベル（人間血清の正常なレベ
ル）におけるβ―カロテンの存在は、要素になん
ら証明しうる効果を与えないことが見い出され
た。 例 10 この例は、第１表の媒染剤１で染媒した時のビ
リルビンの吸収ピークのシフト及びモル吸光率の
増大を示す。 媒染剤１のメタノール75％及び水25％中の10％
溶液を調製した。 Ａ PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液中の
１mg／dlのビリルビンは435nmにおいて吸収ピ
ークを示した。460nmにおける吸光度は0.571
であつた。 Ｂ PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液１ml
中の50μの媒染剤１は400〜600nmにかけて
吸収ピークを示さなかつた。460nmにおける吸
光度は約0.006であつた。 Ｃ PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液１ml
中の100μの媒染剤１とビリルビン１mg／dl
は455nmにおいてピークを示し、そして吸光度
は0.902であつた。この値は1.58倍高い値であ
る。 例 11 媒染剤１のかわりに第１表の媒染剤２を用いた
以外は例10と同様にして別の実験を行つた。 この場合は吸収ピークは460nmにおいて見ら
れ、そして吸光度は1.95倍高くなつた。 例 12 ホスホニウム型ポリマー媒染剤がビリルビンを
媒染し、本発明の方法によつて水性液体中のビリ
ルビンを分析するのに有用であることを示すため
に以下の実験を行なつた。 塩化ビニルベンジルをトリフエニルホスフイン
と反応させることによつてＰ，Ｐ，Ｐ―トリフエ
ニル―Ｐ―ビニルベンジルホスホニウムトシレー
トモノマー（以下、第４級ホスホニウムモノマー
又はQPMという）を調製した。反応はｍ―ジニ
トロベンゼンを重合抑制剤として用いてＮ，Ｎ―
ジメチルホルムアミド中で実施した。得られた化
合物のトシレートは水―メタノール混合液中で化
合物の塩素イオンをナトリウムトシレートで交換
することによつて得た。 QPMのホモポリマーは開始剤として２，2′―
アゾビス（２―メチルプロピオニトリル）を用い
てDMF中でモノマーを重合することによつて得
た。このホモポリマーを以下「QPM100」とい
う。第二のポリマーはQPMのほかにスチレンコ
モノマーを用いた以外は同様にして製造した。こ
のポリマーは50モル％のQPMを含んでおり、以
下「QPM50」という。 第三のポリマーとして本発明の媒染剤ポリマー
であるポリ（スチレン―コ―Ｎ―ビニルベンジル
―Ｎ，Ｎ―ジメチル―Ｎ―ベンジルアンモニウム
クロリド―コ―ジビニルベンゼン）を得た。この
ポリマーは以下第４級アンモニウムモノマー含有
ポリマー又は「QPM」という。 次にりん酸二水素ナトリウムを0.05M濃度で含
むPH7.4の緩衝液を調製した。これを以下緩衝液
という。緩衝液の各サンプルに前記各媒染剤
0.012％（ｗ／ｖ）を添加し、次にこれらの各サ
ンプル溶液にビリルビン１mg／dlを添加した。こ
の各溶液の光学濃度を分光光計を用いて480nmで
測定した。結果は以下の表に示した通りである。

【表】 上表の結果から、ホスホニウム型媒染剤で媒染
されたビリルビンは光学特性が改良されているこ
とが明らかである。例えばビリルビン単独では緩
衝剤の光学濃度を0.25しか増大させないのに対
し、ホスホニウム型及びアンモニウム型媒染剤は
いずれも光学濃度を著るしく高めている。ホスホ
ニウム型媒染剤はアンモニウム型に比し、ピーク
濃度の増大はやや低いが、例えば480nmのような
長波長でピークの幅を広くした。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ、本発明の分析
要素の好ましい態様の斜視図である。第３図は、
本発明の分析要素においてビリルビンの濃度レベ
ル（人間血清アルブミン―生理食塩水溶液中のビ
リルビンmg／dl―横軸）を色々変えた場合の分光
測光応答（460nmにおける反射濃度―縦軸）を示
すグラフである。 第１図第２図において、番号６は拡散ゾーン、
７はビリルビンと反応する媒染剤を含有する試薬
ゾーン、８は支持体である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (イ) 水性液体とビリルビン反応性媒染剤とを
   試薬ゾーン中で接触せしめてビリルビンを媒染
   させ、媒染されたビリルビンが遊離のビリルビ
   ンの吸収ピークから少なくとも約10nmシフト
   した吸収ピーク及び遊離のビリルビンのモル吸
   光率よりも少なくとも約50％高いモル吸光率を
   示すようになし、そして (ロ) 前記媒染されたビリルビンを比色測定により
   検出する方法であつて、前記反応性媒染剤が、
   １個以上のビリルビンの結合サイトを有し、そ
   して疎水性有機マトリツクス及び少くとも１個
   の荷電性カチオン基を有する、式 （式中、Ａは有機基を示し、ＱはＭをＡに結
   合するための化学結合もしくは化学基を示し、
   Ｍは第四アンモニウムもしくはホスホニウム
   基を示し、そしてＸは酸アニオンを示す）の
   反覆単位を有するポリマー材料であることを特
   徴とする水性液体中のビリルビン比色測定法。