JPH0235259B2 - - Google Patents
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- JPH0235259B2 JPH0235259B2 JP56109553A JP10955381A JPH0235259B2 JP H0235259 B2 JPH0235259 B2 JP H0235259B2 JP 56109553 A JP56109553 A JP 56109553A JP 10955381 A JP10955381 A JP 10955381A JP H0235259 B2 JPH0235259 B2 JP H0235259B2
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Description
本発明は水性流体中の被検体測定用のマルチゾ
ーン(multizone)乾式化学分析要素に関する。
更に詳しくは、本発明は、このような要素内にお
いて指示薬が試薬ゾーンから反応ゾーンへ連続的
に放出することにより競合物質(もし存在するな
ら)からの妨害を除去又は低減することに関す
る。 尿、血清又は他の体液のような水性流体中の被
検体の分析測定において、このような被検体と反
応し、検出可能な応答、たとえば色又は螢光応答
を生ずる指示薬が頻繁に用いられる。次いで応答
を適当な標準又は検量体と比較し、流体中に存在
する被検体の量を決定する。 多くの場合に妨害物質は被検体に同伴し、そし
て指示薬と反応して、被検体と指示薬との反応に
より生ずるのと同じ色吸収特性を有する色応答を
生成する。被検体−指示薬及び妨害物−指示薬反
応は加法的であり、ずれ・・を含んだ全体的応答を生
ずるので、そこからは被検体−指示薬反応に関与
した成分を容易には分別することができない。 指示薬を用いた被検体分析における妨害作用を
減少せしめる試みが多くの分析に適用されてい
る。一例として、アルブミン分析に関する先行技
術及び背景を以下に述べる。 流体中のアルブミンの測定は、緩衝されたブロ
ムクレゾールグリーン(以後BCGと呼ぶ)溶液
又は米国特許第3533749号及び同第3485587号に記
載のような試験片を用いて広く実施されている。
BCGは、蛋白質との染料結合反応により色変化
を示すスルホンフタレイン種(species)の色原
体指示薬である。このような色応答は存在する蛋
白質、たとえばアルブミンに比例的に関連する。
前述のごとく、この指示薬は緩衝されており、こ
うすることにより、緩衝されていない場合は指示
薬が感応するPH変化に対する色応答が確実に回避
できる。 BCGのような指示薬はアルブミンに特異的で
ない。たとえば人間の体液中に通常存在するグロ
ブリン、トランスフエリン及び他の蛋白質は染料
結合を指示薬と競い、アルブミン分析を妨害す
る。この妨害は、低濃度レベルのアルブミンに関
して特に顕著である。たとえばアルブミン及びグ
ロブリンを含む人間の血清の正常な全蛋白質含量
は約6〜8g/dlの範囲である。この数値に関し
て約2.9g/dlがグロブリンであり、残りが主に
アルブミンである。正常な血清(即ち健康人から
の)においてはアルブミンとグロブリンの比は約
1.6:1であり、一方病気の状態ではこの比は約
0.7:1に低下する。それ故、有用な臨床分析に
においては、グロブリンとの結合を回避しなけれ
ばならず、そしてアルブミンとの選択的な結合を
生じさせなければならない。 幾人かの創始者は、BCGに基づくアルブミン
測定における非特異性の問題に対する解決を提案
した。グスタフソン(Gustafsson)は、血清ア
ルブミンとBCGとの反応は、BCGと他の蛋白質
との反応より速いと報告した(Gustafsson、J.E.
C.、Clin.Chem.、第22巻、第616頁、1976年)。従
つて、グスタフソンは、溶液の吸光度を、血清と
BCGとを混合した後2回、即ち混合直後及び60
分後の2回測定することを提唱した。零分と推定
する直後の読みを次いで用い、アルブミンの濃度
を測定する。(60分の読みは、アルブミンに加え
て血清蛋白質成分の測定に用いられる。)この方
法の成功は、意味のある読みが得られる前に1分
以上の固有の遅延時間を有する自動化系にとつて
は、非実際的な要求である“直後”の吸光度を読
むことができるか否かに基づく。更にグスタフソ
ンの零分操作は、たとえば血清10μをBCG試薬
2.0ml(2000μ)と反応させる(200倍希釈)溶
液分析へ適用することができる。しかしながら、
乾式化学分析要素の出現により、試料の希釈及び
空間を占める液状試薬の使用は最早必要ではな
い。使用の際、このような要素は未希釈体液と接
触し色応答を生成する。本発明者等はこのことに
関して、未希釈試料では全蛋白質−BCG色応答
(即ちアルブミン及びグロブリン両方からの応答)
は溶液分析におけるよりも明きらかに強いことを
決定した。従つてグスタフソンの操作を用いた乾
式要素におけるアルブミンの零分測定は非実際的
であるばかりでなく、溶液分析の場合よりもアル
ブミンに対する特異性は低い。 ウエブスター(Clin.Chem.、第23巻、第663
頁、1977年)は、BCGに基づくアルブミンの溶
液分析測定の非特異性を確認し、そして30秒以内
の読みは、得られた結果から3.0g/を差し引
く場合にアルブミンに対して特異的であると結論
した。グスタフソンの操作と同様に、ウエブスタ
ーの方法は、初期の読み時間及び希釈溶液分析
(試料流体の200倍希釈)に基づく。更に矯正因子
として不定の定数を用いることは、アルブミンの
結果が最初から誇張されており、そしてそれ故非
特異的分析を意味するように思われる。更に重大
なことはウエブスターの方法は、不定因子3.0
g/からの実際の変化を説明していない。 BCGに基づくアルブミン分析の非特異性に関
する問題は更に詳しくイングヴエルセン
(Ingwersen)及びラボー(Raabo)により開示
された(Clin、Chim、Octa、第88巻、第545頁、
1978年)。彼らは、グスタフソン及びウエブスタ
ーにより研究されたような希釈系において、試薬
溶液中のBCGの濃度を低くすることにより、試
薬添加後1分までに読みが得られるような程度に
までグロブリンの結合が抑えられると決定した。
この読みはほとんど完全にアルブミン−BCG複
合体によると報告された。 イングヴエルセン等による方法は溶液分析開始
後1分までに読みを得ることを可能にしている。
しかしながら、本発明者等は、BCG指示薬を慣
用の乾式分析要素にイングヴエルセンにより提案
された量で用いる時、グロブリンのような競合蛋
白質からのひどい妨害にぶつかると決定した。更
に妨害が即座に、即ち1分以内に見られるので、
このことは希釈溶液系と未希釈血清を用いた乾式
化学系との相違を強調している。 前述のグロブリンによる妨害を低減させる為
に、乾式分析要素中のBCG指示薬の量を更に低
くしようと考えるならば、そのことは一般に感度
のロス及び予期されるレベルのアルブミン、特に
高(たとえば5g/dl又はそれ以上)アルブミン
レベルに対する直線的な応答を損うことなく達成
することは不可能であろう。 蛋白質測定用の分析要素の使用はよく知られて
いる。米国特許第3485587号には、BCGのような
緩衝された指示薬を含浸した吸収性紙を含む単一
ゾーン要素が提唱されている。使用の際要素は体
液試料で飽和され、すべての指示薬と流体との接
触が即座に生じ色が発現し始める。このような要
素は全蛋白質量の測定又はその存在の検出に有用
である。しかしながらグロブリンが指示薬との反
応を競うので、それらによつてはグロブリンの存
在下においてアルブミンを正確に選択的に測定す
ることはできない。 被検体(アルブミンを含む)測定用のマルチゾ
ーン要素は米国特許第3992158号及び同第4042335
号に開示されている。前記米国特許第3992158号
では、第2図に、支持体上をおおう試薬層上に多
孔性拡散層を示している。ゼラチン、アガロー
ス、及び水溶性ビニルポリマーのような多数のマ
トリツクス材料が試薬層に有用なものとして開示
されている。使用の際、この特許に従つた要素の
拡散層は、拡散層全体にそして試薬層中に分布さ
れる水性試料と接触する。試薬層においては、あ
る材料が試料中の被検体に反応し、検出可能な変
化を生ずる。この特許には、更に、試験試薬又は
他の反応性物質の適当な選択により、要素をアル
ブミンのような被検体の分析に容易に適合できる
と開示されている。全蛋白質測定用のマルチゾー
ン要素は米国特許第4132528号に開示されている。
このような要素は、被検体含有流体を分布する為
の拡散ゾーンと、試薬、アルカリ性提供組成物及
びアルカリ性保護ポリマーから成る試薬ゾーンと
から構成されている。アルカリ性保護ポリマーに
は、ポリ−(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリル
アミド)、アガロース及びビニルピロリドンとア
クリルアミドとのコポリマーがある。全蛋白質を
定量的に測定する為に用いる試薬は、無差別的に
アルブミン及び他の蛋白質と反応する改質された
ビユレツト組成物である。 一態様において、蛋白質妨害物の存在下におい
てアルブミンを選択的に測定する本発明とは異な
り、前記米国特許第4132528号に開示の発明は、
用いる試薬の故に、全蛋白質の測定のみができ
る。 本発明では、被検体と被検体測定のおそらくは
妨害物質とを含む水性流体中の被検体の選択的測
定を、指示薬を含むマルチゾーン乾式分析要素に
おいて実施例する。指示薬は要素の試薬ゾーンか
ら、水性流体試料を含む反応ゾーンへ連続的に放
出される。指示薬が反応ゾーンへ連続的に放出さ
れる速度により、指示薬と被検体との選択的反応
並びに指示薬と妨害物質との低減された(しばし
ば除かれた)反応に関与した検出可能な応答が特
徴的に生ずる。 以下に記載の本発明は、構成の一部分におい
て、反応ゾーンが試薬ゾーンをおおうか又はそれ
に隣接してなる要素に属する。同様の構成が米国
特許第3992158号及び同第4042335号に開示されて
いる。しかしながら、これら特許の開示とは対照
的に、本発明要素の試薬ゾーンはアルブミンのよ
うな被検体へ不浸透性である。それ故被検体は反
応ゾーンに保持され、一方試薬は、試料中の流体
の影響下において反応ゾーン中に泳動し検出可能
な変化を生成する。 本発明に従えば、(A)分析すべき水性流体を受容
する乾式反応ゾーン及び(B)乾式試薬ゾーンを含む
乾式分析要素において、乾式試薬ゾーンが (i) アルブミンに不浸透性であり、そして (ii) (a)アルブミン色原体指示薬及び(b)乾式分析要
素が水性流体と接触した場合に、アルブミン色
原体指示薬がアルブミン分析の間実質的にアル
ブミンのみと反応して分析妨害物質とは実質的
に反応しない速度で、試薬ゾーンから反応ゾー
ンへアルブミン色原体指示薬を連続的に放出す
るポリマーからなる放出手段 を含んでなる乾式分析要素が提供される。 指示薬は、好ましくは、色応答を生ずるもの
(即ち色原体指示薬)か、又は螢光応答を生ずる
もので、特に好ましくは、色原体指示薬である。 この明細書において使用する前記分析要素中の
反応ゾーン及び試薬ゾーン間の“流体接触”なる
用語は、このような要素中の反応ゾーン及び試薬
ゾーンの重なつた帯域又は隣接帯域間を流体が通
りうる能力をいう。流体接触する、これら二つの
流体接触ゾーンは接触しているのが好ましいが、
これらの流体接触ゾーンは、場合によつては、介
在ゾーンによつて分離することもできる。しかし
ながら要素中に含まれる介在ゾーン及び他の任意
的なゾーンは、反応ゾーン及び試薬ゾーン間の流
体の通過を妨げないように、それ自体互に流体接
触し、そして反応ゾーン及び試薬ゾーンと流体接
触する。 好ましい態様においては、アルブミンと、アル
ブミン分析に対する、おそらくは蛋白質妨害物質
とを含む水性流体中のアルブミンを選択的に測定
する為の分析要素を示す。 アルブミン選択的要素において、試薬はBCG
のような色原体指示薬を含み、そして要素は、た
とえば試薬ゾーン中に緩衝剤をも含む。本発明に
従つて、色原体指示薬が放出される速度は、色原
体指示薬とアルブミンとの反応及び色原体指示薬
と蛋白質妨害物質との低減された反応に対応する
アルブミン色応答を生ずるのに十分な速度であ
る。色原体指示薬の放出速度は、色原体指示薬と
実質的にアルブミンのみとの反応に対応するアル
ブミン応答を生ずるのに十分なものであるのが非
常に好ましい。即ち、この場合、色原体指示薬と
蛋白質妨害物質との反応は実質的に生じない。先
行技術とは異なり、特に未希釈体液のアルブミン
分析に関して、本発明要素は比較的長時間、たと
えば3分か又はそれより少し長い時間、アルブミ
ン選択性を示す。 試薬を連続的に放出させる好ましい手段は、試
薬ゾーンのバインダとして働くポリマーである。
このポリマーは、前記速度で指示薬を試薬ゾーン
から反応ゾーンへ連続的に放出させることによ
り、流体の要素への適用に応答する。 本発明は、マルチゾーン乾式分析要素の使用に
より、血清、尿及びその他の流体のような水性流
体中の被検体の選択的測定を容易にする。妨害物
質(もし存在するなら)によりずれ・・を生ずる測定
が有効に最小化又は除去される。この目的の為に
本発明者等は、指示薬、特に色原体指示薬のある
規定速度における要素の一つのゾーンから被検体
とおそらくは妨害物質とを含むもう一つのゾーン
への連続的な放出により適度な時間内に改良され
た被検体選択性が与えられると決定した。 指示薬の反応ゾーンへの連続的な放出の概念
は、種々の被検体の選択的測定に適用することが
できる。従つてマグネシウムは、妨害物質として
のカルシウムの存在のもとに、指示薬染料〔1−
(1−ヒドロキシ−2−ナフチルアゾ)−2−ヒド
ロキシ−5−ニトロ−4−ナフタレンスルホン酸
ナトリウム塩〕により選択的に測定することがで
きる。この染料はチバ−ガイギー社から商品名エ
リクロム ブラツクT(EBT)で市販されてい
る。別法としてはマグネシウムはチタンイエロー
染料を用いて測定することができる。本発明は、
アルブミン分析に対する蛋白質妨害物質のありう
る存在のもとにアルブミンを選択的に測定する為
にも使用することができる。アルブミン分析で
は、色原体指示薬を含む試薬組成物が用いられ
る。試薬は、以下に記載のごとく緩衝する。本発
明は種々の被検体及び蛋白質妨害物質の分析を意
図するものであるが、本発明を、単に例示の目的
で、アルブミン分析について以下に更に詳しく述
べる。その他の被検体用の対応する要素はアルブ
ミン分析の場合と同じ様式で働く。 本発明に係る要素はマルチゾーンから成る。反
応ゾーン及び試薬ゾーン並びに他の任意的なゾー
ンは互に相異する。このようなゾーンは、試料を
要素の側面から適用するか、又は上面から適用す
るかによつて、たとえば水平配置層であるか又は
垂直配置バンドである。これらのゾーンは、場合
によつては、連続反応ゾーン内の不連続試薬ゾー
ンとすることができる。これらのゾーンは層形状
であるのが好ましい。 前記要素の反応ゾーンはいくつかの機能を果た
す。先ず、反応ゾーンは、たとえば分析すべきア
ルブミンと蛋白質妨害物質とを含む流体試料を受
容し、そしてそれを含む。試薬ゾーンはアルブミ
ン及び蛋白質妨害物質に不浸透性であるので、前
記アルブミン及び蛋白質妨害物質は反応ゾーン中
に有効に保持される。しかしながら、試料中の液
状成分の一部は反応ゾーンから試薬ゾーンへ移行
し、色原体指示薬を試薬ゾーン中へ連続的に放出
する。色原体指示薬とアルブミンとの反応が起こ
り、アルブミン色応答を生成する。 反応ゾーンは場合によつては、流体試料が適用
されるか又は接触し、そして試料がその中に均一
に拡散する拡散ゾーンとして働くことができる。
別法としては、反応ゾーンと流体接触する独立し
た拡散ゾーンを用いて流体試料を受容し、そして
それを反応ゾーンへ均一に分布する方法があげら
れる。 適当な反応ゾーンには米国特許第3992158号に
記載のような等方的に多孔性の層が含まれる。こ
のような層は種々の方法により製造することがで
きる。ある態様では粒状材料を用いて、粒子間の
相互結合空間により等方的な多孔性が形成される
層を製造する。別法としてはこのような層は、等
方的多孔性ポリマー、たとえば米国特許第
3992158号に開示の“ブラツシユ(blush)”ポリ
マーを用いて製造することができる。しかしなが
ら本発明に関しては、TiO2のような顔料を反応
ゾーンに用いることは、このような顔料が反応ゾ
ーン中に生じる検出可能な応答をマスクする場合
には避けるべきである。 好ましい反応ゾーンは、天然又は合成ポリマー
に由来するコロイド性材料を含む等方的多孔性層
を含んで成る。アビセル という商品名でFMC
社から市販されている微結晶性セルロースは、本
発明に用いるのに好ましいコロイド性材料の一例
である。他の材料の例としては、シリカ及びケイ
ソウ土がある。 特開昭55−90859号公報に記載されているよう
なビーズ層を含む反応ゾーンも、本発明のマルチ
ゾーンの要素として用いるのに有益である。この
ようなビーズ層は、非常に接近している隣接粒子
間に特別に局在する少量の接着剤によつて一緒に
保持される粒子を含む。 本発明の試薬ゾーンは、使用前は、実質的に乾
燥している。即ち、試薬ゾーンには流体は含まれ
ず、このことにより、比較的小さな空間内への要
素の長期間の貯蔵が容易になる。試薬層も被検体
及び妨害物質に対しては不浸透性であるが、反応
ゾーンへ適用した流体試料中の残留液に対しては
浸透性である。従つて、流体試料を適用する時、
二つのゾーン間の流体接触が確立され、そして指
示薬は反応ゾーンへ連続的に放出されて被検体と
結合する。 試薬ゾーンは種々の手段により被検体及び妨害
物質に対して不浸透性にすることができる。たと
えばアルブミンの場合、直径がアルブミン及び蛋
白質妨害物質分子の直径より小さい細孔を有する
試薬ゾーンは、これら分子の試薬ゾーン中への通
過を妨げる。一方分子直径が非常に小さいカルシ
ウムの存在下において同様に分子直径が非常に小
さいマグネシウムを測定する場合、高分子量のキ
レート化剤又はバラスト化剤を用いるのが望まし
い。このような薬品はマグネシウム及びカルシウ
ムと反応して試薬ゾーン中の細孔より大きな直径
の分子を生成し、試薬ゾーンを被検体及び妨害物
質に対し効果的に不浸透性にする。マグネシウム
及びカルシウムの有用なキレート化剤には、ポリ
マー主鎖へ付いたキレート化基を有する付加ポリ
マーがある。 本発明に係る試薬ゾーンには、被検体及び妨害
物質と反応して検出可能な応答を生ずる指示薬を
含む試薬組成物が含まれる。このようなゾーンに
は指示薬が分布するマトリツクスが含まれる。マ
トリツクス材料の選択は、試薬を連続的に反応ゾ
ーン中へ放出する手段としてマトリツクスを選ぶ
場合以外は広い範囲にわたるものとすることがで
きる。しかしながら、そのように選択しない場合
には、マトリツクスには一般に天然及び合成物質
の両方を含む非蛋白質含有親水性材料が含まれ
る。このような材料の例としては、アガロースの
ような多糖類、ポリ(ビニルアルコール)のよう
なポリビニル化合物、及び親水性セルロース誘導
体がある。 指示薬、好ましくは色原体指示薬は試薬ゾーン
に用いて水性流体中の被検体を測定する。アルブ
ミンの適当な色原体指示薬には、溶液又は吸収性
の強いキヤリヤ中で用いてPHを比色測定により測
定することも知られているものが含まれる。この
ような色原体指示薬は、試料溶液のPHに相当する
色応答を生ぜしめることができる。しかしなが
ら、色原体指示薬を緩衝することによつてPH変化
による色応答を回避することができる。緩衝剤は
反応ゾーン、試薬ゾーン、これら両ゾーン、又は
ある別のゾーンのいずれかに含まれる。好ましく
は緩衝剤は試薬ゾーンの一部として含まれる。緩
衝剤を用いることによつて、分析下の試料のPHは
一定に保持されるか又は、少なくとも色原体指示
薬がPH変化に対し通常応答する範囲外のPHに保持
される。広い範囲にわたる本発明の実施において
緩衝剤の使用は任意的である。アルブミン分析の
際色原体指示薬を緩衝することは好ましい。 本発明要素の試薬ゾーンに好都合に用いられる
色原体指示薬は、I.M.KolthoffによるAcid−
Base Indicators、MacMillan社出版、ニユーヨ
ーク、1937年の特に第350〜353頁に開示されてい
るような蛋白質誤差(protein error)を示すも
のである。このような指示薬の例としては、ブロ
ムクレゾールグリーン、メチルレツド、ブロムフ
エノールブルー、ブロムクレゾールパープル、ブ
ロムチモールブルー、フエノールレツド、クレゾ
ールレツド、チモールブルー、クレゾールフタレ
イン、及び米国特許第3438737号、欄3及び4に
記載の指示薬がある。インジゴカルミンのような
インジゴ染料も本発明の実施に有用に用いられ
る。これら指示薬のうち、ブロムクレゾールグリ
ーン及びブロムクレゾールパープルのようなスル
ホンフタレイン指示薬はアルブミン分析に好まし
い。アルブミン以外の被検体の分析、たとえばマ
グネシウムの分析では、エリクロムブラツク 又
はトライトンイエローのような指示薬が使用に適
する。 試薬ゾーンに用いる指示薬の量は、試験すべき
水性流体試料中の被検体の予期される最大量と反
応するのに十分な量である。アルブミンの分析で
は、試薬ゾーンが、10g/dl又はそれより少し高
濃度のアルブミンと反応して直線的色応答を生ず
るのに十分な色原体指示薬を含むことが好まし
い。この明細書で用いる“直線的色応答”なる用
語は、試料適用後所定の時間の間、時間とともに
直線的に増大する色応答を意味する。たとえばア
ルブミン分析では、このような期間は試料適用後
約1分〜約3分である。またアルブミン分析で
は、BCG指示薬を好ましくは0.2g/m2〜3.0g/
m2、より好ましくは0.5g/m2〜1.5g/m2の濃度
範囲で試薬ゾーンに用いる。これら濃度範囲は、
アルブミン5g/dlを含む流体試料10μを用い
た場合に、直線的な応答を適度に生成することが
決定された範囲である。これに関しては約1.0
g/m2の濃度が非常によく用いられ、そしてそれ
は、このような流体1あたり約15ミリモルの
BCG濃度に相当する。従つて種々の試料体積に
対して、試薬ゾーンにおける適用量を1.0g/m2
より高くか又は低く調節して1あたり15ミリモ
ルの好ましい量を保持することが望ましい。 種々の緩衝剤は、アルブミン分析を実質的に一
定PHに保持することにより色応答におけるPH効果
を回避するのに有用である。緩衝剤の量及び型
は、試験される流体の性質及び用いる色原体指示
薬の型に依存する。非アルカリ性PHに緩衝するこ
とも好ましい。従つてPH感受性範囲がわかつてい
る所定の色原体指示薬に対して、指示薬のPH感受
性範囲より低い実質的に一定のPHを分析にもたら
す緩衝組成物を選ぶことが好ましい。この場合こ
のような緩衝組成物は酸又は酸と共にそれらの塩
を含む。単独もしくはそれ自身の塩又は例示した
他の酸と共に用いる適当な酸には、りんご酸、乳
酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸及び酒石酸の
ような低分子量のカルボン酸がある。他の酸緩衝
剤は米国特許第3438737号に開示されている。り
んご酸は好ましい緩衝剤である。 BCGはアルブミン分析にとつて好ましい色原
体指示薬である。BCGを用いることによる未希
釈血清中のアルブミン測定に関して、緩衝剤の量
は、血清試料のPHを好ましくは2.0〜4.0の範囲内
に、より好ましくは3.2に保持する量である。血
清試料の体積が10μの場合、約10.8g/m2のり
んご酸緩衝剤が3.2のPHを与えることが決定され
た。 試薬組成物は場合によつては、被検体と反応す
る指示薬の能力に悪影響を及ぼさない成分をも含
む。このような成分は非イオン性界面活性剤であ
る。代表的な界面活性剤には、たとえばロームア
ンドハース社により、トライトンX−100 及び
トライトンX−405 のようらトライトン シリ
ーズの商品名で市販されているアルキルフエノキ
シポリエトキシエタノール;アトラスケミカルイ
ンダストリーズによつて販売されているBrij98
のようなポリオキシエチレンオレイルエーテル;
アトラスケミカルインダストリーズによつて販売
されているトウイーン20 のようなポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート;及びオリーン
マチエソン社により商品名サーフアクタント10G
で販売されている(p−ノニルフエノキシ)グ
リセリンがある。 本発明の要素は指示薬を試薬ゾーンから反応ゾ
ーンへ連続的に放出する手段(以下放出手段と称
す)を更に含む。このような連続的放出は要素と
流体試料との接触に応じて生じる。試薬放出速度
は、指示薬と被検体との反応及び指示薬と妨害物
質との低減された反応に対応する検出可能な応答
が反応ゾーン中に生ずるように選ぶ。 放出手段の例にはいくつかの代りの態様が含ま
れる。好ましい様式では放出手段は、同時に指示
薬に対し親和力を持つ試薬層のポリマーバインダ
であり、この親和力は、流体試料の適用に応答し
て徐々に破壊され、連続的な放出をもたらす。こ
のような特性を示す好ましいポリマーには水溶性
付加ポリマー、特に好ましくはビニルポリマーが
あり、たとえばアクリルアミド及び/又はビニル
ピロリドン反復単位から成るポリマー、特にビニ
ルピロリドン20〜80重量%及びこれに対応してア
クリルアミド80〜20重量%とを含むポリ(ビニル
ピロリドン−コ−アクリルアミド)がある。特に
好ましいものは、等重量のアクリルアミドとビニ
ルピロリドンとから成るモノマーブレンドから製
造したアクリルアミドとビニルピロリドンとのコ
ポリマーである。 有用な連続放出はヒドロキシエチルセルロース
のようなセルロース系のポリマーによつても達成
された。 放出手段として用いる為の潜在的なポリマーを
選別する操作により必然的に、支持体によつて支
持される試薬層上をおおう反応層を有する多層分
析要素の製造が課せられる。試薬層には、ポリマ
ー中に分散した指示薬に関して潜在的に有用なポ
リマーが含まれる。要素の反応層は次いで既知量
のアルブミンを含む水性対照流体と接触する。別
法としては、対照流体を、NaCl0.9%(重量)、
CaCl20.033%及びKCl0.3%で残りが水から成る溶
液試料(この溶液は普通リンゲル液と呼ばれる)
とすることができる。反射濃度(DR)として測
定する反応層中に発現する色応答を次いでDRが
最大に達するまで時間に対してモニターする。
DRが即座に、即ち30秒以内に最大値に達する場
合、選別中のポリマーは放出手段として有用であ
るとは考えられない。しかしながらDRが最大に
達するのに30秒以上、好ましくは1〜10分かかる
場合、そのポリマーは有用である。本発明に従つ
て測定を実施する際、たとえばアガロースのよう
なポリマーはこのような連続的放出を果たしえな
いことが証明されている。即ちその分散試薬はす
べて対照流体適用の際実質的に瞬間的(即ち30秒
以内)に放出する。 この明細書で用いる連続放出の原理は、試薬の
分析要素の反応ゾーンへの緩徐な添加を意味す
る。それは、流体試料を適用した後すべての利用
しうる試薬が直ちに試料流体へ放出されるまでの
期間を意図する試薬の遅延放出とは区別すべきで
ある。貯蔵器全体を即座に供給するのに対して、
物質の一部が制御量及び制御速度においてこのよ
うな物質の大貯蔵器(即ち試薬ゾーン)から供給
されるという意味において、連続放出は実質的に
“計量供給(metering)”と同義である。更に本
発明に従つた測定実施の際、あるポリマーは、試
薬ゾーンのマトリツクスとして用いる場合、連続
放出を示すばかりでなく、試料流体適用後すぐに
いわゆる遅延相を示すことが見い出された。即ち
試薬の連続放出が遅延したか又は少なくとも放出
速度が試料適用後最初の30〜45秒間かなり低下し
た。“連続放出”なる語は、遅延相とその後の指
示薬の連続放出との組み合せを含んだ意味を持
つ。 好ましい態様において試薬ゾーンのあるポリマ
ーマトリツクスから成る放出手段については既に
述べた。同じ目的を達する為の他の態様にはたと
えば、アルブミン及び蛋白質妨害物質に不浸透性
であつて、反応ゾーンと試薬ゾーンとの間に介在
し両者の流体接触を保持する連続放出ゾーンがあ
る。このような連続放出ゾーンを含む要素を流体
試料と接触させる時、放出ゾーンは試薬ゾーンと
協働して指示薬を連続的に反応ゾーンへ放出す
る。連続放出ゾーンはたとえば、試薬ゾーンに用
いる為の前記連続放出ポリマーから成るマトリツ
クスを含む。従つてこのようなポリマーにはたと
えば水溶性付加ポリマー、好ましくは、ビニルピ
ロリドン及び/又はアクリルアミド反復単位を含
むポリマーのようなビニルポリマーがある。連続
放出ゾーンに潜在的に用いる為のポリマーの選別
には必然的に、試薬ゾーンマトリツクスに有用な
連続放出ポリマーを選別するのに用いるのと実質
的に同じ操作を用いることが必要である。しかし
ながら、この場合、本発明要素には、反応ゾーン
と試薬ゾーンとの間にはさまれた連続的放出ゾー
ンが含まれる。 放出手段には、指示薬と被検体との反応及び指
示薬と妨害物質との低減された反応に対応する検
出可能な被検体応答を生ずる放出速度を示すこと
も特徴とする。本発明の分析要素におけるこのよ
うな検出可能な被検体応答は、実質的に放出手段
を含まない他の点では同一の要素(以下対照要素
と呼ぶ)と比較することにより容易に実証され
る。この比較においては、対照要素二つと本発明
要素二つとを用いる。第一の対照要素を、被検体
を含む未希釈血清のような流体試料と接触せしめ
て、第一の検出可能な応答を生ぜしめ、これを時
間に対して記録する。第二の対照要素を、任意で
はあるが通常5重量%の妨害物質(アルブミン分
析においてはγ−グロブリン)が添加されている
同じ流体試料と接触させて第二の検出可能な応答
を生ぜしめ、これも時間に対して記録する。任意
の選定時間におけるこれら二つの応答間の相違
は、添加妨害物質の存在に起因する。前述のごと
く、本発明によつてこの相違は低減、そして多く
の場合に除去される。従つて、二つの本発明要素
をそれぞれ被検体流体試料及び妨害物質添加被検
体流体試料と接触させ時間に対する二つの応答曲
線を作製する。本発明に従つて、本発明要素の応
答曲線間の相違は、対照要素と比べて流体試料適
用後長時間の間本来的に少ないことが判明した。
成分及び被覆レベルの適当な選択により、本発明
要素を用いた場合の応答間の相違は、好ましくは
1分間、非常に好ましくは3分までの時間実質的
に除くことができる。これらの時間の後は、相違
は有利に低減はされるが除去されない。最終的に
は、本発明要素の応答差が対照要素の差と実質的
に同じである転移点に達する。それ故、本発明要
素使用の際、転移点、好ましくは前記測定のごと
く差が生じない点より前に生成する検出可能な応
答を選ぶ。このような応答はその後被検体測定に
用いる。 試薬の放出速度は、たとえば選んだポリマー、
試薬ゾーンの厚さ(一定レベルの指示薬に対し
て)、指示薬レベル及び緩衝剤レベル(緩衝剤を
試薬ゾーンに含める場合)を含む種々の要因によ
り影響される。これら変数をいかに扱うかは当業
者の選択の問題である。たとえばある場合には、
アクリルアミド付加ホモポリマーの放出速度は、
このホモポリマーを含む試薬ゾーン中の緩衝剤レ
ベルを変えることにより重大に影響されることが
わかつた。更に詳しくは緩衝剤レベルを低くする
ことによりこのような試薬ゾーンからの放出速度
は速くなる。 分析要素は自己支持性であるか又は支持体上に
支持される。有用な支持体材料には、酢酸セルロ
ース、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリカ
ーボネート及びポリビニル化合物(たとえばポリ
スチレン)のような種々のポリマーが含まれる。
特定要素の為に選んだ支持体は、被検体検出の目
的とする様式と適合する。好ましい支持体には、
200nm〜900nmの範囲内の波長(単数又は複数)
の電磁輻射線を透過する輻射線透過性支持体材料
が含まれる。要素が支持体を含む場合、試薬ゾー
ンは通常支持体と反応ゾーンとの間にはさまれ
る。 分析方法に依存して種々の異なる要素を本発明
に従つて製造することができる。要素は、所望の
巾の伸長テープ、シート、又はスライドを含む
種々の形状に構成することができる。 本発明要素は分析下の液状試料を要素へ適用す
ることによつて用いられる。適用試料は試薬ゾー
ンと接触する前に反応ゾーンと接触し、そしてゾ
ーンが層形状の場合には、先ず試薬ゾーンから遠
い表面で反応ゾーンと接触する。本発明要素の分
析精度は、適用試料の体積を変化させることによ
つては実質的に低くならないので、手又は機械に
より試料を適用することができる。しかしながら
分析結果検出の便宜上、試料体積は適度に一貫し
ていることが望ましい。 本発明要素を用いた分析操作において、要素を
供給ロール、スライドパケツト(slide packet)
又は他の源から採取し、そしてたとえば適当な分
配器からの放出滴、接触スポツト又は他の形状の
液状試料を受容するように位置させる。試料適用
後、そして望ましくは液状試料が反応ゾーンに吸
収された後、要素に、場合によつては温度又は加
熱のようなコンデイシヨニングを行い試験結果を
得易くすることができる。 被検体色応答の測定は通常、要素を、反射又は
透過分光測光測定用の適当な装置が備えられてい
る帯域に通すことによつて行われる。このような
装置は、光のようなエネルギーのビームを支持体
及び試薬ゾーンにあて、そして反応ゾーン中に導
く働きをする。次いで光は反応ゾーンから反射さ
れて検出手段に達するか、又は透過検出の場合に
は要素を通過して検出器に達する。別法としては
同様の方法で、エネルギーのビームを最初に反射
又は透過検出用の反応ゾーン中へ導くことができ
る。反射分光測光測定を行うことが好ましい。要
素が浸透可能であり、そして反応ゾーンにおける
被検体色応答を定量しうる任意の輻射線を用いる
ことができるけれども、一般に200〜900nmの範
囲の電磁輻射線がこのような測定に有用であるこ
とが見い出された。分析の検量線を与えるのに
種々の公知の検量方法を用いることができる。 例 以下の製造及び例を実施するに際し、次の物質
及び操作を用いた。 人間の血清は病院から供給した。すぐに使用し
ない試料は−80℃で凍結状態とした。 人間のペンテツクス(pentex)アルブミン、
人間のペンテツクスα−及びγ−グロブリン画分
は、インジアナ州、エルクハールトのマイルスラ
ボラトリー社から入手した。 ポリ(アクリルアミド−コ−N−ビニル−2−
ピロリドン)(モノマー重量比50:50)は米国特
許第4132528号の例1のごとく製造した(以下ポ
リマー1と称す)。 ポリ(アクリルアミド)はニユーヨーク州、ロ
チエスターのイーストマンオーガニツクケミカル
ズにより販売されたものであつた(以下ポリマー
2と称す)。 シープラツク(sea plaque)アガロースはマ
リーンコロイド社により販売されたものであつ
た。 微結晶性セルロースはFMC社からアビセル
として販売されたものであつた。 (p−ノニルフエノキシ)グリセリンはオリー
ンマチエソン社からサーフアクタント10G とし
て販売されたものであつた。 他のすべての化学薬品はイーストマンコダツク
社から入手したものであり、そして特記しないか
ぎり試薬グレードであつた。 分光測光測定はカーリー(Cary)118又はベツ
クマン25装置を用いて行つた。反射測定は、ジプ
ロトン化BCGをモニターする時は630nmに、そ
してモノプロトン化BCGをモニターする時には
420nmに妨害フイルターを備えた適当な反射計
を用いて行つた。これらの装置は、例に記載の要
素を透過し、そして要素中の層によつて反射され
る光線の反射濃度、DRを測定する為に用いた。 要素製造 以下の組成の要素41〜46と呼ぶ要素を製造し、
そして例に用いた。被覆レベルは表示物質をg/
m2で表わす。
ーン(multizone)乾式化学分析要素に関する。
更に詳しくは、本発明は、このような要素内にお
いて指示薬が試薬ゾーンから反応ゾーンへ連続的
に放出することにより競合物質(もし存在するな
ら)からの妨害を除去又は低減することに関す
る。 尿、血清又は他の体液のような水性流体中の被
検体の分析測定において、このような被検体と反
応し、検出可能な応答、たとえば色又は螢光応答
を生ずる指示薬が頻繁に用いられる。次いで応答
を適当な標準又は検量体と比較し、流体中に存在
する被検体の量を決定する。 多くの場合に妨害物質は被検体に同伴し、そし
て指示薬と反応して、被検体と指示薬との反応に
より生ずるのと同じ色吸収特性を有する色応答を
生成する。被検体−指示薬及び妨害物−指示薬反
応は加法的であり、ずれ・・を含んだ全体的応答を生
ずるので、そこからは被検体−指示薬反応に関与
した成分を容易には分別することができない。 指示薬を用いた被検体分析における妨害作用を
減少せしめる試みが多くの分析に適用されてい
る。一例として、アルブミン分析に関する先行技
術及び背景を以下に述べる。 流体中のアルブミンの測定は、緩衝されたブロ
ムクレゾールグリーン(以後BCGと呼ぶ)溶液
又は米国特許第3533749号及び同第3485587号に記
載のような試験片を用いて広く実施されている。
BCGは、蛋白質との染料結合反応により色変化
を示すスルホンフタレイン種(species)の色原
体指示薬である。このような色応答は存在する蛋
白質、たとえばアルブミンに比例的に関連する。
前述のごとく、この指示薬は緩衝されており、こ
うすることにより、緩衝されていない場合は指示
薬が感応するPH変化に対する色応答が確実に回避
できる。 BCGのような指示薬はアルブミンに特異的で
ない。たとえば人間の体液中に通常存在するグロ
ブリン、トランスフエリン及び他の蛋白質は染料
結合を指示薬と競い、アルブミン分析を妨害す
る。この妨害は、低濃度レベルのアルブミンに関
して特に顕著である。たとえばアルブミン及びグ
ロブリンを含む人間の血清の正常な全蛋白質含量
は約6〜8g/dlの範囲である。この数値に関し
て約2.9g/dlがグロブリンであり、残りが主に
アルブミンである。正常な血清(即ち健康人から
の)においてはアルブミンとグロブリンの比は約
1.6:1であり、一方病気の状態ではこの比は約
0.7:1に低下する。それ故、有用な臨床分析に
においては、グロブリンとの結合を回避しなけれ
ばならず、そしてアルブミンとの選択的な結合を
生じさせなければならない。 幾人かの創始者は、BCGに基づくアルブミン
測定における非特異性の問題に対する解決を提案
した。グスタフソン(Gustafsson)は、血清ア
ルブミンとBCGとの反応は、BCGと他の蛋白質
との反応より速いと報告した(Gustafsson、J.E.
C.、Clin.Chem.、第22巻、第616頁、1976年)。従
つて、グスタフソンは、溶液の吸光度を、血清と
BCGとを混合した後2回、即ち混合直後及び60
分後の2回測定することを提唱した。零分と推定
する直後の読みを次いで用い、アルブミンの濃度
を測定する。(60分の読みは、アルブミンに加え
て血清蛋白質成分の測定に用いられる。)この方
法の成功は、意味のある読みが得られる前に1分
以上の固有の遅延時間を有する自動化系にとつて
は、非実際的な要求である“直後”の吸光度を読
むことができるか否かに基づく。更にグスタフソ
ンの零分操作は、たとえば血清10μをBCG試薬
2.0ml(2000μ)と反応させる(200倍希釈)溶
液分析へ適用することができる。しかしながら、
乾式化学分析要素の出現により、試料の希釈及び
空間を占める液状試薬の使用は最早必要ではな
い。使用の際、このような要素は未希釈体液と接
触し色応答を生成する。本発明者等はこのことに
関して、未希釈試料では全蛋白質−BCG色応答
(即ちアルブミン及びグロブリン両方からの応答)
は溶液分析におけるよりも明きらかに強いことを
決定した。従つてグスタフソンの操作を用いた乾
式要素におけるアルブミンの零分測定は非実際的
であるばかりでなく、溶液分析の場合よりもアル
ブミンに対する特異性は低い。 ウエブスター(Clin.Chem.、第23巻、第663
頁、1977年)は、BCGに基づくアルブミンの溶
液分析測定の非特異性を確認し、そして30秒以内
の読みは、得られた結果から3.0g/を差し引
く場合にアルブミンに対して特異的であると結論
した。グスタフソンの操作と同様に、ウエブスタ
ーの方法は、初期の読み時間及び希釈溶液分析
(試料流体の200倍希釈)に基づく。更に矯正因子
として不定の定数を用いることは、アルブミンの
結果が最初から誇張されており、そしてそれ故非
特異的分析を意味するように思われる。更に重大
なことはウエブスターの方法は、不定因子3.0
g/からの実際の変化を説明していない。 BCGに基づくアルブミン分析の非特異性に関
する問題は更に詳しくイングヴエルセン
(Ingwersen)及びラボー(Raabo)により開示
された(Clin、Chim、Octa、第88巻、第545頁、
1978年)。彼らは、グスタフソン及びウエブスタ
ーにより研究されたような希釈系において、試薬
溶液中のBCGの濃度を低くすることにより、試
薬添加後1分までに読みが得られるような程度に
までグロブリンの結合が抑えられると決定した。
この読みはほとんど完全にアルブミン−BCG複
合体によると報告された。 イングヴエルセン等による方法は溶液分析開始
後1分までに読みを得ることを可能にしている。
しかしながら、本発明者等は、BCG指示薬を慣
用の乾式分析要素にイングヴエルセンにより提案
された量で用いる時、グロブリンのような競合蛋
白質からのひどい妨害にぶつかると決定した。更
に妨害が即座に、即ち1分以内に見られるので、
このことは希釈溶液系と未希釈血清を用いた乾式
化学系との相違を強調している。 前述のグロブリンによる妨害を低減させる為
に、乾式分析要素中のBCG指示薬の量を更に低
くしようと考えるならば、そのことは一般に感度
のロス及び予期されるレベルのアルブミン、特に
高(たとえば5g/dl又はそれ以上)アルブミン
レベルに対する直線的な応答を損うことなく達成
することは不可能であろう。 蛋白質測定用の分析要素の使用はよく知られて
いる。米国特許第3485587号には、BCGのような
緩衝された指示薬を含浸した吸収性紙を含む単一
ゾーン要素が提唱されている。使用の際要素は体
液試料で飽和され、すべての指示薬と流体との接
触が即座に生じ色が発現し始める。このような要
素は全蛋白質量の測定又はその存在の検出に有用
である。しかしながらグロブリンが指示薬との反
応を競うので、それらによつてはグロブリンの存
在下においてアルブミンを正確に選択的に測定す
ることはできない。 被検体(アルブミンを含む)測定用のマルチゾ
ーン要素は米国特許第3992158号及び同第4042335
号に開示されている。前記米国特許第3992158号
では、第2図に、支持体上をおおう試薬層上に多
孔性拡散層を示している。ゼラチン、アガロー
ス、及び水溶性ビニルポリマーのような多数のマ
トリツクス材料が試薬層に有用なものとして開示
されている。使用の際、この特許に従つた要素の
拡散層は、拡散層全体にそして試薬層中に分布さ
れる水性試料と接触する。試薬層においては、あ
る材料が試料中の被検体に反応し、検出可能な変
化を生ずる。この特許には、更に、試験試薬又は
他の反応性物質の適当な選択により、要素をアル
ブミンのような被検体の分析に容易に適合できる
と開示されている。全蛋白質測定用のマルチゾー
ン要素は米国特許第4132528号に開示されている。
このような要素は、被検体含有流体を分布する為
の拡散ゾーンと、試薬、アルカリ性提供組成物及
びアルカリ性保護ポリマーから成る試薬ゾーンと
から構成されている。アルカリ性保護ポリマーに
は、ポリ−(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリル
アミド)、アガロース及びビニルピロリドンとア
クリルアミドとのコポリマーがある。全蛋白質を
定量的に測定する為に用いる試薬は、無差別的に
アルブミン及び他の蛋白質と反応する改質された
ビユレツト組成物である。 一態様において、蛋白質妨害物の存在下におい
てアルブミンを選択的に測定する本発明とは異な
り、前記米国特許第4132528号に開示の発明は、
用いる試薬の故に、全蛋白質の測定のみができ
る。 本発明では、被検体と被検体測定のおそらくは
妨害物質とを含む水性流体中の被検体の選択的測
定を、指示薬を含むマルチゾーン乾式分析要素に
おいて実施例する。指示薬は要素の試薬ゾーンか
ら、水性流体試料を含む反応ゾーンへ連続的に放
出される。指示薬が反応ゾーンへ連続的に放出さ
れる速度により、指示薬と被検体との選択的反応
並びに指示薬と妨害物質との低減された(しばし
ば除かれた)反応に関与した検出可能な応答が特
徴的に生ずる。 以下に記載の本発明は、構成の一部分におい
て、反応ゾーンが試薬ゾーンをおおうか又はそれ
に隣接してなる要素に属する。同様の構成が米国
特許第3992158号及び同第4042335号に開示されて
いる。しかしながら、これら特許の開示とは対照
的に、本発明要素の試薬ゾーンはアルブミンのよ
うな被検体へ不浸透性である。それ故被検体は反
応ゾーンに保持され、一方試薬は、試料中の流体
の影響下において反応ゾーン中に泳動し検出可能
な変化を生成する。 本発明に従えば、(A)分析すべき水性流体を受容
する乾式反応ゾーン及び(B)乾式試薬ゾーンを含む
乾式分析要素において、乾式試薬ゾーンが (i) アルブミンに不浸透性であり、そして (ii) (a)アルブミン色原体指示薬及び(b)乾式分析要
素が水性流体と接触した場合に、アルブミン色
原体指示薬がアルブミン分析の間実質的にアル
ブミンのみと反応して分析妨害物質とは実質的
に反応しない速度で、試薬ゾーンから反応ゾー
ンへアルブミン色原体指示薬を連続的に放出す
るポリマーからなる放出手段 を含んでなる乾式分析要素が提供される。 指示薬は、好ましくは、色応答を生ずるもの
(即ち色原体指示薬)か、又は螢光応答を生ずる
もので、特に好ましくは、色原体指示薬である。 この明細書において使用する前記分析要素中の
反応ゾーン及び試薬ゾーン間の“流体接触”なる
用語は、このような要素中の反応ゾーン及び試薬
ゾーンの重なつた帯域又は隣接帯域間を流体が通
りうる能力をいう。流体接触する、これら二つの
流体接触ゾーンは接触しているのが好ましいが、
これらの流体接触ゾーンは、場合によつては、介
在ゾーンによつて分離することもできる。しかし
ながら要素中に含まれる介在ゾーン及び他の任意
的なゾーンは、反応ゾーン及び試薬ゾーン間の流
体の通過を妨げないように、それ自体互に流体接
触し、そして反応ゾーン及び試薬ゾーンと流体接
触する。 好ましい態様においては、アルブミンと、アル
ブミン分析に対する、おそらくは蛋白質妨害物質
とを含む水性流体中のアルブミンを選択的に測定
する為の分析要素を示す。 アルブミン選択的要素において、試薬はBCG
のような色原体指示薬を含み、そして要素は、た
とえば試薬ゾーン中に緩衝剤をも含む。本発明に
従つて、色原体指示薬が放出される速度は、色原
体指示薬とアルブミンとの反応及び色原体指示薬
と蛋白質妨害物質との低減された反応に対応する
アルブミン色応答を生ずるのに十分な速度であ
る。色原体指示薬の放出速度は、色原体指示薬と
実質的にアルブミンのみとの反応に対応するアル
ブミン応答を生ずるのに十分なものであるのが非
常に好ましい。即ち、この場合、色原体指示薬と
蛋白質妨害物質との反応は実質的に生じない。先
行技術とは異なり、特に未希釈体液のアルブミン
分析に関して、本発明要素は比較的長時間、たと
えば3分か又はそれより少し長い時間、アルブミ
ン選択性を示す。 試薬を連続的に放出させる好ましい手段は、試
薬ゾーンのバインダとして働くポリマーである。
このポリマーは、前記速度で指示薬を試薬ゾーン
から反応ゾーンへ連続的に放出させることによ
り、流体の要素への適用に応答する。 本発明は、マルチゾーン乾式分析要素の使用に
より、血清、尿及びその他の流体のような水性流
体中の被検体の選択的測定を容易にする。妨害物
質(もし存在するなら)によりずれ・・を生ずる測定
が有効に最小化又は除去される。この目的の為に
本発明者等は、指示薬、特に色原体指示薬のある
規定速度における要素の一つのゾーンから被検体
とおそらくは妨害物質とを含むもう一つのゾーン
への連続的な放出により適度な時間内に改良され
た被検体選択性が与えられると決定した。 指示薬の反応ゾーンへの連続的な放出の概念
は、種々の被検体の選択的測定に適用することが
できる。従つてマグネシウムは、妨害物質として
のカルシウムの存在のもとに、指示薬染料〔1−
(1−ヒドロキシ−2−ナフチルアゾ)−2−ヒド
ロキシ−5−ニトロ−4−ナフタレンスルホン酸
ナトリウム塩〕により選択的に測定することがで
きる。この染料はチバ−ガイギー社から商品名エ
リクロム ブラツクT(EBT)で市販されてい
る。別法としてはマグネシウムはチタンイエロー
染料を用いて測定することができる。本発明は、
アルブミン分析に対する蛋白質妨害物質のありう
る存在のもとにアルブミンを選択的に測定する為
にも使用することができる。アルブミン分析で
は、色原体指示薬を含む試薬組成物が用いられ
る。試薬は、以下に記載のごとく緩衝する。本発
明は種々の被検体及び蛋白質妨害物質の分析を意
図するものであるが、本発明を、単に例示の目的
で、アルブミン分析について以下に更に詳しく述
べる。その他の被検体用の対応する要素はアルブ
ミン分析の場合と同じ様式で働く。 本発明に係る要素はマルチゾーンから成る。反
応ゾーン及び試薬ゾーン並びに他の任意的なゾー
ンは互に相異する。このようなゾーンは、試料を
要素の側面から適用するか、又は上面から適用す
るかによつて、たとえば水平配置層であるか又は
垂直配置バンドである。これらのゾーンは、場合
によつては、連続反応ゾーン内の不連続試薬ゾー
ンとすることができる。これらのゾーンは層形状
であるのが好ましい。 前記要素の反応ゾーンはいくつかの機能を果た
す。先ず、反応ゾーンは、たとえば分析すべきア
ルブミンと蛋白質妨害物質とを含む流体試料を受
容し、そしてそれを含む。試薬ゾーンはアルブミ
ン及び蛋白質妨害物質に不浸透性であるので、前
記アルブミン及び蛋白質妨害物質は反応ゾーン中
に有効に保持される。しかしながら、試料中の液
状成分の一部は反応ゾーンから試薬ゾーンへ移行
し、色原体指示薬を試薬ゾーン中へ連続的に放出
する。色原体指示薬とアルブミンとの反応が起こ
り、アルブミン色応答を生成する。 反応ゾーンは場合によつては、流体試料が適用
されるか又は接触し、そして試料がその中に均一
に拡散する拡散ゾーンとして働くことができる。
別法としては、反応ゾーンと流体接触する独立し
た拡散ゾーンを用いて流体試料を受容し、そして
それを反応ゾーンへ均一に分布する方法があげら
れる。 適当な反応ゾーンには米国特許第3992158号に
記載のような等方的に多孔性の層が含まれる。こ
のような層は種々の方法により製造することがで
きる。ある態様では粒状材料を用いて、粒子間の
相互結合空間により等方的な多孔性が形成される
層を製造する。別法としてはこのような層は、等
方的多孔性ポリマー、たとえば米国特許第
3992158号に開示の“ブラツシユ(blush)”ポリ
マーを用いて製造することができる。しかしなが
ら本発明に関しては、TiO2のような顔料を反応
ゾーンに用いることは、このような顔料が反応ゾ
ーン中に生じる検出可能な応答をマスクする場合
には避けるべきである。 好ましい反応ゾーンは、天然又は合成ポリマー
に由来するコロイド性材料を含む等方的多孔性層
を含んで成る。アビセル という商品名でFMC
社から市販されている微結晶性セルロースは、本
発明に用いるのに好ましいコロイド性材料の一例
である。他の材料の例としては、シリカ及びケイ
ソウ土がある。 特開昭55−90859号公報に記載されているよう
なビーズ層を含む反応ゾーンも、本発明のマルチ
ゾーンの要素として用いるのに有益である。この
ようなビーズ層は、非常に接近している隣接粒子
間に特別に局在する少量の接着剤によつて一緒に
保持される粒子を含む。 本発明の試薬ゾーンは、使用前は、実質的に乾
燥している。即ち、試薬ゾーンには流体は含まれ
ず、このことにより、比較的小さな空間内への要
素の長期間の貯蔵が容易になる。試薬層も被検体
及び妨害物質に対しては不浸透性であるが、反応
ゾーンへ適用した流体試料中の残留液に対しては
浸透性である。従つて、流体試料を適用する時、
二つのゾーン間の流体接触が確立され、そして指
示薬は反応ゾーンへ連続的に放出されて被検体と
結合する。 試薬ゾーンは種々の手段により被検体及び妨害
物質に対して不浸透性にすることができる。たと
えばアルブミンの場合、直径がアルブミン及び蛋
白質妨害物質分子の直径より小さい細孔を有する
試薬ゾーンは、これら分子の試薬ゾーン中への通
過を妨げる。一方分子直径が非常に小さいカルシ
ウムの存在下において同様に分子直径が非常に小
さいマグネシウムを測定する場合、高分子量のキ
レート化剤又はバラスト化剤を用いるのが望まし
い。このような薬品はマグネシウム及びカルシウ
ムと反応して試薬ゾーン中の細孔より大きな直径
の分子を生成し、試薬ゾーンを被検体及び妨害物
質に対し効果的に不浸透性にする。マグネシウム
及びカルシウムの有用なキレート化剤には、ポリ
マー主鎖へ付いたキレート化基を有する付加ポリ
マーがある。 本発明に係る試薬ゾーンには、被検体及び妨害
物質と反応して検出可能な応答を生ずる指示薬を
含む試薬組成物が含まれる。このようなゾーンに
は指示薬が分布するマトリツクスが含まれる。マ
トリツクス材料の選択は、試薬を連続的に反応ゾ
ーン中へ放出する手段としてマトリツクスを選ぶ
場合以外は広い範囲にわたるものとすることがで
きる。しかしながら、そのように選択しない場合
には、マトリツクスには一般に天然及び合成物質
の両方を含む非蛋白質含有親水性材料が含まれ
る。このような材料の例としては、アガロースの
ような多糖類、ポリ(ビニルアルコール)のよう
なポリビニル化合物、及び親水性セルロース誘導
体がある。 指示薬、好ましくは色原体指示薬は試薬ゾーン
に用いて水性流体中の被検体を測定する。アルブ
ミンの適当な色原体指示薬には、溶液又は吸収性
の強いキヤリヤ中で用いてPHを比色測定により測
定することも知られているものが含まれる。この
ような色原体指示薬は、試料溶液のPHに相当する
色応答を生ぜしめることができる。しかしなが
ら、色原体指示薬を緩衝することによつてPH変化
による色応答を回避することができる。緩衝剤は
反応ゾーン、試薬ゾーン、これら両ゾーン、又は
ある別のゾーンのいずれかに含まれる。好ましく
は緩衝剤は試薬ゾーンの一部として含まれる。緩
衝剤を用いることによつて、分析下の試料のPHは
一定に保持されるか又は、少なくとも色原体指示
薬がPH変化に対し通常応答する範囲外のPHに保持
される。広い範囲にわたる本発明の実施において
緩衝剤の使用は任意的である。アルブミン分析の
際色原体指示薬を緩衝することは好ましい。 本発明要素の試薬ゾーンに好都合に用いられる
色原体指示薬は、I.M.KolthoffによるAcid−
Base Indicators、MacMillan社出版、ニユーヨ
ーク、1937年の特に第350〜353頁に開示されてい
るような蛋白質誤差(protein error)を示すも
のである。このような指示薬の例としては、ブロ
ムクレゾールグリーン、メチルレツド、ブロムフ
エノールブルー、ブロムクレゾールパープル、ブ
ロムチモールブルー、フエノールレツド、クレゾ
ールレツド、チモールブルー、クレゾールフタレ
イン、及び米国特許第3438737号、欄3及び4に
記載の指示薬がある。インジゴカルミンのような
インジゴ染料も本発明の実施に有用に用いられ
る。これら指示薬のうち、ブロムクレゾールグリ
ーン及びブロムクレゾールパープルのようなスル
ホンフタレイン指示薬はアルブミン分析に好まし
い。アルブミン以外の被検体の分析、たとえばマ
グネシウムの分析では、エリクロムブラツク 又
はトライトンイエローのような指示薬が使用に適
する。 試薬ゾーンに用いる指示薬の量は、試験すべき
水性流体試料中の被検体の予期される最大量と反
応するのに十分な量である。アルブミンの分析で
は、試薬ゾーンが、10g/dl又はそれより少し高
濃度のアルブミンと反応して直線的色応答を生ず
るのに十分な色原体指示薬を含むことが好まし
い。この明細書で用いる“直線的色応答”なる用
語は、試料適用後所定の時間の間、時間とともに
直線的に増大する色応答を意味する。たとえばア
ルブミン分析では、このような期間は試料適用後
約1分〜約3分である。またアルブミン分析で
は、BCG指示薬を好ましくは0.2g/m2〜3.0g/
m2、より好ましくは0.5g/m2〜1.5g/m2の濃度
範囲で試薬ゾーンに用いる。これら濃度範囲は、
アルブミン5g/dlを含む流体試料10μを用い
た場合に、直線的な応答を適度に生成することが
決定された範囲である。これに関しては約1.0
g/m2の濃度が非常によく用いられ、そしてそれ
は、このような流体1あたり約15ミリモルの
BCG濃度に相当する。従つて種々の試料体積に
対して、試薬ゾーンにおける適用量を1.0g/m2
より高くか又は低く調節して1あたり15ミリモ
ルの好ましい量を保持することが望ましい。 種々の緩衝剤は、アルブミン分析を実質的に一
定PHに保持することにより色応答におけるPH効果
を回避するのに有用である。緩衝剤の量及び型
は、試験される流体の性質及び用いる色原体指示
薬の型に依存する。非アルカリ性PHに緩衝するこ
とも好ましい。従つてPH感受性範囲がわかつてい
る所定の色原体指示薬に対して、指示薬のPH感受
性範囲より低い実質的に一定のPHを分析にもたら
す緩衝組成物を選ぶことが好ましい。この場合こ
のような緩衝組成物は酸又は酸と共にそれらの塩
を含む。単独もしくはそれ自身の塩又は例示した
他の酸と共に用いる適当な酸には、りんご酸、乳
酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸及び酒石酸の
ような低分子量のカルボン酸がある。他の酸緩衝
剤は米国特許第3438737号に開示されている。り
んご酸は好ましい緩衝剤である。 BCGはアルブミン分析にとつて好ましい色原
体指示薬である。BCGを用いることによる未希
釈血清中のアルブミン測定に関して、緩衝剤の量
は、血清試料のPHを好ましくは2.0〜4.0の範囲内
に、より好ましくは3.2に保持する量である。血
清試料の体積が10μの場合、約10.8g/m2のり
んご酸緩衝剤が3.2のPHを与えることが決定され
た。 試薬組成物は場合によつては、被検体と反応す
る指示薬の能力に悪影響を及ぼさない成分をも含
む。このような成分は非イオン性界面活性剤であ
る。代表的な界面活性剤には、たとえばロームア
ンドハース社により、トライトンX−100 及び
トライトンX−405 のようらトライトン シリ
ーズの商品名で市販されているアルキルフエノキ
シポリエトキシエタノール;アトラスケミカルイ
ンダストリーズによつて販売されているBrij98
のようなポリオキシエチレンオレイルエーテル;
アトラスケミカルインダストリーズによつて販売
されているトウイーン20 のようなポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート;及びオリーン
マチエソン社により商品名サーフアクタント10G
で販売されている(p−ノニルフエノキシ)グ
リセリンがある。 本発明の要素は指示薬を試薬ゾーンから反応ゾ
ーンへ連続的に放出する手段(以下放出手段と称
す)を更に含む。このような連続的放出は要素と
流体試料との接触に応じて生じる。試薬放出速度
は、指示薬と被検体との反応及び指示薬と妨害物
質との低減された反応に対応する検出可能な応答
が反応ゾーン中に生ずるように選ぶ。 放出手段の例にはいくつかの代りの態様が含ま
れる。好ましい様式では放出手段は、同時に指示
薬に対し親和力を持つ試薬層のポリマーバインダ
であり、この親和力は、流体試料の適用に応答し
て徐々に破壊され、連続的な放出をもたらす。こ
のような特性を示す好ましいポリマーには水溶性
付加ポリマー、特に好ましくはビニルポリマーが
あり、たとえばアクリルアミド及び/又はビニル
ピロリドン反復単位から成るポリマー、特にビニ
ルピロリドン20〜80重量%及びこれに対応してア
クリルアミド80〜20重量%とを含むポリ(ビニル
ピロリドン−コ−アクリルアミド)がある。特に
好ましいものは、等重量のアクリルアミドとビニ
ルピロリドンとから成るモノマーブレンドから製
造したアクリルアミドとビニルピロリドンとのコ
ポリマーである。 有用な連続放出はヒドロキシエチルセルロース
のようなセルロース系のポリマーによつても達成
された。 放出手段として用いる為の潜在的なポリマーを
選別する操作により必然的に、支持体によつて支
持される試薬層上をおおう反応層を有する多層分
析要素の製造が課せられる。試薬層には、ポリマ
ー中に分散した指示薬に関して潜在的に有用なポ
リマーが含まれる。要素の反応層は次いで既知量
のアルブミンを含む水性対照流体と接触する。別
法としては、対照流体を、NaCl0.9%(重量)、
CaCl20.033%及びKCl0.3%で残りが水から成る溶
液試料(この溶液は普通リンゲル液と呼ばれる)
とすることができる。反射濃度(DR)として測
定する反応層中に発現する色応答を次いでDRが
最大に達するまで時間に対してモニターする。
DRが即座に、即ち30秒以内に最大値に達する場
合、選別中のポリマーは放出手段として有用であ
るとは考えられない。しかしながらDRが最大に
達するのに30秒以上、好ましくは1〜10分かかる
場合、そのポリマーは有用である。本発明に従つ
て測定を実施する際、たとえばアガロースのよう
なポリマーはこのような連続的放出を果たしえな
いことが証明されている。即ちその分散試薬はす
べて対照流体適用の際実質的に瞬間的(即ち30秒
以内)に放出する。 この明細書で用いる連続放出の原理は、試薬の
分析要素の反応ゾーンへの緩徐な添加を意味す
る。それは、流体試料を適用した後すべての利用
しうる試薬が直ちに試料流体へ放出されるまでの
期間を意図する試薬の遅延放出とは区別すべきで
ある。貯蔵器全体を即座に供給するのに対して、
物質の一部が制御量及び制御速度においてこのよ
うな物質の大貯蔵器(即ち試薬ゾーン)から供給
されるという意味において、連続放出は実質的に
“計量供給(metering)”と同義である。更に本
発明に従つた測定実施の際、あるポリマーは、試
薬ゾーンのマトリツクスとして用いる場合、連続
放出を示すばかりでなく、試料流体適用後すぐに
いわゆる遅延相を示すことが見い出された。即ち
試薬の連続放出が遅延したか又は少なくとも放出
速度が試料適用後最初の30〜45秒間かなり低下し
た。“連続放出”なる語は、遅延相とその後の指
示薬の連続放出との組み合せを含んだ意味を持
つ。 好ましい態様において試薬ゾーンのあるポリマ
ーマトリツクスから成る放出手段については既に
述べた。同じ目的を達する為の他の態様にはたと
えば、アルブミン及び蛋白質妨害物質に不浸透性
であつて、反応ゾーンと試薬ゾーンとの間に介在
し両者の流体接触を保持する連続放出ゾーンがあ
る。このような連続放出ゾーンを含む要素を流体
試料と接触させる時、放出ゾーンは試薬ゾーンと
協働して指示薬を連続的に反応ゾーンへ放出す
る。連続放出ゾーンはたとえば、試薬ゾーンに用
いる為の前記連続放出ポリマーから成るマトリツ
クスを含む。従つてこのようなポリマーにはたと
えば水溶性付加ポリマー、好ましくは、ビニルピ
ロリドン及び/又はアクリルアミド反復単位を含
むポリマーのようなビニルポリマーがある。連続
放出ゾーンに潜在的に用いる為のポリマーの選別
には必然的に、試薬ゾーンマトリツクスに有用な
連続放出ポリマーを選別するのに用いるのと実質
的に同じ操作を用いることが必要である。しかし
ながら、この場合、本発明要素には、反応ゾーン
と試薬ゾーンとの間にはさまれた連続的放出ゾー
ンが含まれる。 放出手段には、指示薬と被検体との反応及び指
示薬と妨害物質との低減された反応に対応する検
出可能な被検体応答を生ずる放出速度を示すこと
も特徴とする。本発明の分析要素におけるこのよ
うな検出可能な被検体応答は、実質的に放出手段
を含まない他の点では同一の要素(以下対照要素
と呼ぶ)と比較することにより容易に実証され
る。この比較においては、対照要素二つと本発明
要素二つとを用いる。第一の対照要素を、被検体
を含む未希釈血清のような流体試料と接触せしめ
て、第一の検出可能な応答を生ぜしめ、これを時
間に対して記録する。第二の対照要素を、任意で
はあるが通常5重量%の妨害物質(アルブミン分
析においてはγ−グロブリン)が添加されている
同じ流体試料と接触させて第二の検出可能な応答
を生ぜしめ、これも時間に対して記録する。任意
の選定時間におけるこれら二つの応答間の相違
は、添加妨害物質の存在に起因する。前述のごと
く、本発明によつてこの相違は低減、そして多く
の場合に除去される。従つて、二つの本発明要素
をそれぞれ被検体流体試料及び妨害物質添加被検
体流体試料と接触させ時間に対する二つの応答曲
線を作製する。本発明に従つて、本発明要素の応
答曲線間の相違は、対照要素と比べて流体試料適
用後長時間の間本来的に少ないことが判明した。
成分及び被覆レベルの適当な選択により、本発明
要素を用いた場合の応答間の相違は、好ましくは
1分間、非常に好ましくは3分までの時間実質的
に除くことができる。これらの時間の後は、相違
は有利に低減はされるが除去されない。最終的に
は、本発明要素の応答差が対照要素の差と実質的
に同じである転移点に達する。それ故、本発明要
素使用の際、転移点、好ましくは前記測定のごと
く差が生じない点より前に生成する検出可能な応
答を選ぶ。このような応答はその後被検体測定に
用いる。 試薬の放出速度は、たとえば選んだポリマー、
試薬ゾーンの厚さ(一定レベルの指示薬に対し
て)、指示薬レベル及び緩衝剤レベル(緩衝剤を
試薬ゾーンに含める場合)を含む種々の要因によ
り影響される。これら変数をいかに扱うかは当業
者の選択の問題である。たとえばある場合には、
アクリルアミド付加ホモポリマーの放出速度は、
このホモポリマーを含む試薬ゾーン中の緩衝剤レ
ベルを変えることにより重大に影響されることが
わかつた。更に詳しくは緩衝剤レベルを低くする
ことによりこのような試薬ゾーンからの放出速度
は速くなる。 分析要素は自己支持性であるか又は支持体上に
支持される。有用な支持体材料には、酢酸セルロ
ース、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリカ
ーボネート及びポリビニル化合物(たとえばポリ
スチレン)のような種々のポリマーが含まれる。
特定要素の為に選んだ支持体は、被検体検出の目
的とする様式と適合する。好ましい支持体には、
200nm〜900nmの範囲内の波長(単数又は複数)
の電磁輻射線を透過する輻射線透過性支持体材料
が含まれる。要素が支持体を含む場合、試薬ゾー
ンは通常支持体と反応ゾーンとの間にはさまれ
る。 分析方法に依存して種々の異なる要素を本発明
に従つて製造することができる。要素は、所望の
巾の伸長テープ、シート、又はスライドを含む
種々の形状に構成することができる。 本発明要素は分析下の液状試料を要素へ適用す
ることによつて用いられる。適用試料は試薬ゾー
ンと接触する前に反応ゾーンと接触し、そしてゾ
ーンが層形状の場合には、先ず試薬ゾーンから遠
い表面で反応ゾーンと接触する。本発明要素の分
析精度は、適用試料の体積を変化させることによ
つては実質的に低くならないので、手又は機械に
より試料を適用することができる。しかしながら
分析結果検出の便宜上、試料体積は適度に一貫し
ていることが望ましい。 本発明要素を用いた分析操作において、要素を
供給ロール、スライドパケツト(slide packet)
又は他の源から採取し、そしてたとえば適当な分
配器からの放出滴、接触スポツト又は他の形状の
液状試料を受容するように位置させる。試料適用
後、そして望ましくは液状試料が反応ゾーンに吸
収された後、要素に、場合によつては温度又は加
熱のようなコンデイシヨニングを行い試験結果を
得易くすることができる。 被検体色応答の測定は通常、要素を、反射又は
透過分光測光測定用の適当な装置が備えられてい
る帯域に通すことによつて行われる。このような
装置は、光のようなエネルギーのビームを支持体
及び試薬ゾーンにあて、そして反応ゾーン中に導
く働きをする。次いで光は反応ゾーンから反射さ
れて検出手段に達するか、又は透過検出の場合に
は要素を通過して検出器に達する。別法としては
同様の方法で、エネルギーのビームを最初に反射
又は透過検出用の反応ゾーン中へ導くことができ
る。反射分光測光測定を行うことが好ましい。要
素が浸透可能であり、そして反応ゾーンにおける
被検体色応答を定量しうる任意の輻射線を用いる
ことができるけれども、一般に200〜900nmの範
囲の電磁輻射線がこのような測定に有用であるこ
とが見い出された。分析の検量線を与えるのに
種々の公知の検量方法を用いることができる。 例 以下の製造及び例を実施するに際し、次の物質
及び操作を用いた。 人間の血清は病院から供給した。すぐに使用し
ない試料は−80℃で凍結状態とした。 人間のペンテツクス(pentex)アルブミン、
人間のペンテツクスα−及びγ−グロブリン画分
は、インジアナ州、エルクハールトのマイルスラ
ボラトリー社から入手した。 ポリ(アクリルアミド−コ−N−ビニル−2−
ピロリドン)(モノマー重量比50:50)は米国特
許第4132528号の例1のごとく製造した(以下ポ
リマー1と称す)。 ポリ(アクリルアミド)はニユーヨーク州、ロ
チエスターのイーストマンオーガニツクケミカル
ズにより販売されたものであつた(以下ポリマー
2と称す)。 シープラツク(sea plaque)アガロースはマ
リーンコロイド社により販売されたものであつ
た。 微結晶性セルロースはFMC社からアビセル
として販売されたものであつた。 (p−ノニルフエノキシ)グリセリンはオリー
ンマチエソン社からサーフアクタント10G とし
て販売されたものであつた。 他のすべての化学薬品はイーストマンコダツク
社から入手したものであり、そして特記しないか
ぎり試薬グレードであつた。 分光測光測定はカーリー(Cary)118又はベツ
クマン25装置を用いて行つた。反射測定は、ジプ
ロトン化BCGをモニターする時は630nmに、そ
してモノプロトン化BCGをモニターする時には
420nmに妨害フイルターを備えた適当な反射計
を用いて行つた。これらの装置は、例に記載の要
素を透過し、そして要素中の層によつて反射され
る光線の反射濃度、DRを測定する為に用いた。 要素製造 以下の組成の要素41〜46と呼ぶ要素を製造し、
そして例に用いた。被覆レベルは表示物質をg/
m2で表わす。
【表】
支持体 ///ポリエチレンテレ
フタレートフイルム///
フタレートフイルム///
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 (A)分析すべき水性流体を受容する乾式反応ゾ
ーン及び(B)乾式試薬ゾーンを含む乾式分析要素に
おいて、乾式試薬ゾーンが (i) アルブミンに不浸透性であり、そして (ii) (a)アルブミン色原体指示薬及び(b)乾式分析要
素が水性流体と接触した場合に、アルブミン色
原体指示薬がアルブミン分析の間実質的にアル
ブミンのみと反応して分析妨害物質とは実質的
に反応しない速度で、試薬ゾーンから反応ゾー
ンへアルブミン色原体指示薬を連続的に放出す
るポリマーからなる放出手段 を含んでなることを特徴とする乾式分析要素。
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