KR20040090974A - 고밀도 지질단백질 검정 장치와 방법 - Google Patents

고밀도 지질단백질 검정 장치와 방법 Download PDF

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Abstract

혈액-체액 샘플에서 HDL-연관된 콜레스테롤의 농도를 측정하기 위한 검정 장치와 방법이 기술되어 있다. 검정 디자인은 샘플로부터 비-HDL 지질단백질의 제거와 샘플에서 HDL 콜레스테롤의 검정은 검정의 중단없이 이루어지도록 한다. 장치 는 또한 같은 샘플에서 수행되는 다른 검정과 함께 HDL 검정에 사용되는 시약에 의한 방해를 방지한다.

Description

고밀도 지질단백질 검정 장치와 방법{HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN ASSAY DEVICE AND METHOD}
혈액에 존재하는 콜레스테롤의 양은 심장 동맥 질병의 위험과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 콜레스테롤은 주로 단백질-결합된 형태로 혈액에서 순환한다. 콜레스테롤을 운송하는 단백질은 지질단백질로 밀도를 기준으로 3 가지 집단으로 하부분류된다. 과저밀도 지질단백질(VLDL)은 간에서 합성되고 궁극적으로 저밀도 지질단백질 (LDL)로 전환되며 인간에서 혈장 콜레스테롤의 대부분을 수송하는 트리글리세리드-풍부 지질단백질이다. 고밀도 지질단백질(HDL)은 트리글리세리드가 풍부한 지질단백질의 이화작용, 주변 조직으로부터 콜레스테롤의 제거 및 간으로 수송에 관련된 지질단백질이다. 혈청 HDL 수준과 심장 질병의 위험 사이에는 역 관계가 설정되었다. 특히, HDL과 관련된 혈청 콜레스테롤의 일부가 낮다면, 심장 질병의 위험은 증가한다.
죽종형성 질병의 위험 평가와 관리에서 상대적 혈청 콜레스테롤 수준의 중요성 관점에서, HDL, LDL의 혈청 수준 및 전체 콜레스테롤과 트리글리세리드에 대해 정상적 개인과 위험이 높은 개인의 큰 집단을 스크린 하는데 상당한 노력을 하였다. 위험이 높은 개인의 치료 유효성은 다양한 지질단백질 구획에서 콜레스테롤의 혈청 수준을 정기적으로 시험하여 조정되었다.
특이적 HDL 콜레스테롤 시험에 대한 한 방법은 Mg2+, Mn2+및 Ca2+와 같은 그룹-Ⅱ 양이온의 존재하에 덱스트란 설페이트, 헤파린, 및 인텅스텐산염와 같은 다가음이온 화합물에 의해 혈청에서 비-HDL 지질단백질의 선택적 침전에 기초한다. 침전의 특이성과 정도는 다가음이온/금속 시약의 유형과 농도를 포함한 다양한 인자에 의존한다. 일반적으로, 혈청 콜레스테롤 입자의 침전 순서는, 다가음이온의 농도가 증가하면서, VLDL, LDL, HDL 이다. HDL 의 소수 apoE 종이 저밀도 입자와 공동 침전해도 HDL은 대개 저밀도 입자를 완전히 침전시키는 헤파린 또는 덱스트란 설페이트의 농도에서 용해가능하게 남아있다. 저밀도 입자의 선택적 침전으로, HDL 혈청 콜레스테롤 수준을 결정할 수 있다.
전형적 지질 검정 과정에서, 적은 부피의 혈액을 꺼내고 원심분리하여 맑은 혈장 또는 혈청 샘플 체액를 형성한다. (a) 전체 혈청 콜레스테롤, (b) 트리글리세리드, 및 (c) HDL 콜레스테롤을 결정하기 위해서 샘플 체액를 여러 개의 검정 튜브로 일정 부분씩 나눈다. HDL 샘플을 상기와 같이 침전시키고, 콜레스테롤 검출 전에 여과 또는 원심분리로 저밀도 입자를 제거한다. 샘플을 콜레스테롤 에스터라아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 퍼옥시다아제 및 H202의 존재하에 뚜렷이 색을 띠는산물로 산화될 수 있는 염색약을 함유하는 효소 혼합물과 반응시킨다. 튜브를 분광학적으로 읽고, 원하는 전체, HDL 및 LDL 콜레스테롤 값을 결정한다.
기술된 액체 상 콜레스테롤 검정으로 달성될 수 있는 정확성과 신뢰성에도 불구하고, 검정은 광범위의 스크리닝에서 사용하는 데 많은 제한점을 가진다. 첫째로, 방법은 숙련된 기술자가 혈액 샘플을 얻고 분별하며, 처리된 혈액을 개별적 검정 튜브로 일정부분을 나누는 것이 필요한 정맥 혈액 샘플을 사용한다. 샘플 튜브 (HDL 결정을 위해서)의 적어도 하나는 침전제로 처리되어야 하고 침전된 물질을 제거하도록 더 공정되어야 한다. 이러한 과정의 일부는 자동화될 수 있지만, 이 목적을 위해 디자인된 분석적 기계는 비싸고 큰 병원 외에는 널리 유용하지 않다.
각각 여기에 참고문헌으로 통합된 공동 소유의 미국 특허 Nos. 5,213, 964,5, 213,965, 5,316, 196 및 5,451, 370은 혈청 콜레스테롤 수준을 측정하기 위한 액체-검정 과정과 관련된 많은 상기 언급된 문제를 상당히 극복하는 방법과 검정 장치를 개시한다. 한 구체예에서, 장치는 또한 LDL 과 VLDL 입자를 함유하는 혈액 샘플에서 HDL-관련된 콜레스테롤의 농도를 측정하기 위해 디자인되었다. 장치는 체액 샘플이 매트릭스를 통해 이동함에 따라 용해가능한 지질단백질과 침전된 지질단백질을 분리할 수 있는 체로 거르는 매트릭스를 포함한다. 매트릭스와 관련된 저장고는 체액 샘플이 매트릭스로 이동하고 통과하면서 선택적으로 LDL 과 VLDL 을 침전시키기 위한 침전제를 방출하기 위해 디자인되었다. 이는 체로 거르는 매트릭스를 통해 더 빠른 HDL 이동을 기초로 침전된 지질단백질로부터 HDL 분리를 허용한다. 비-HDL 지질단백질이 없는 체액 샘플은 콜레스테롤에 대해 검정되는 시험표면으로 이동한다.
혈액을 비-HDL 혈액 지질단백질을 선택적으로 침전시키는 데 사용되는 시약으로 처리하면 샘플에 존재하는 HDL의 일부를 코팅되지 않은 유리 섬유에 결합시키고 여과 또는 수송동안에 HDL을 유리 섬유에 결합시키면 가짜의 낮은 HDL 콜레스테롤 값을 초래한다. 이 문제는 침전/체로 거름 및 여과된 샘플을 친수성 폴리머 또는 실레이트화 시약으로 함께 수송에 사용되는 매트릭스에서 유리 섬유를 코팅하여 공동 소유의 미국 특허 No. 5,451, 370 에 언급되어 있다.
HDL 손실을 최소화하기 위한 그러한 코팅에 대한 필요에 추가로, 상기 인용된 장치는 또한 침전제로 흐름 수송 경로의 오염의 가능성을 제공한다. 그러한 시약은 다중 검정 장치의 다른 영역에서 수행되는 다른 검정 화학을 방해할 수 있다. 본 발명은 이러한 문제를 언급하고 극복한다.
혈액 샘플에서 HDL 콜레스테롤을 측정하기 위한 추가 방법과 장치가 EP 0408223 과 EP 0415298 (Rittersdorf et al.)에 기술되어 있고, 이는 다음 단계와 대응하는 요소를 포함하는 시험 스트립에서 수행되는 지속적 검정 방법을 기술한다.
혈액 샘플은 세포의 혈액 성분을 분리하기 위해 분리층에 적용한다. 모세관 힘 또는 중력에 의해, 샘플은 혈청 샘플에 용해된 후 샘플에 함유된 비-HDL 지질단백질을 침전하는 용해가능한 침전제를 함유하는 추가 담체를 통해 흐른다.
추가 담체에서, 상기 침전된 성분은 혈청 샘플로부터 여과되어 후 HDL 정량화의 간섭을 방해한다. 같은 담체에서, 샘플은 HDL-정량화 담체에 인접한 위치로수송되고 HDL-정량화 단계가 시작할 때까지 저장된다. 최종적으로, 샘플은 HDL-정량화 층으로 수송되고, 혈청 샘플에 있는 HDL 콜레스테롤은 효소 반응에 의해 정량화된다.
HDL 정량화의 정확성에 영향을 줄 수 있는 이 검정 디자인의 단점은 저장고로 기능하는 담체가 침전된 성분을 HDL 정량화를 방해하는 샘플로 이동하게 하는 것이다. 추가로, 혈청 샘플의 저장 동안에, 담체 섬유에 부착하여 HDL 을 가둘 수 있고, 침전제는 추가로 원하지 않는 반응을 야기하고, 담체는 혈청 샘플을 건조하여 막히게 된다.
미국 특허 No. 5,135, 716 (Thakore)는 혈액 액체 샘플에서 HDL 정량화를 위한 추가 장치와 방법을 개시한다. 이러한 장치에서, 액체 샘플은 HDL 정량화를 위해서 입구 웰부터 담체까지 연속적 경로를 통해서 지속적으로 흐른다. 따라서, HDL 시험 담체로 들어가는 샘플 부피를 조정하고 HDL 검정을 위한 환경 조건을 조정하는 능력은 제한된다. 장치는 단일 액체 샘플로부터 다양한 분석물의 동시 검정을 제공하지 않는다.
따라서 본 발명의 목적은 상기 지적된 선행 기술문의 단점을 극복하는 HDL 검정 장치와 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 또한 저밀도 지질단백질 (LDL) 및/또는 과저밀도 지질단백질 (VLDL)을 함유하는 혈액 체액 샘플에서 고밀도 지질단백질(HDL)과 관련된 혈청 콜레스테롤을 측정하기 위한 검정 장치를 제공하며, 상기 장치는:
혈액 체액 샘플을 매트릭스 내의 샘플 적용 영역으로부터 매트릭스 내에 하나 또는 그 이상의 샘플 수집 영역으로 분포시키는 데 효과적인 샘플 분포 매트릭스;
샘플 분포 매트릭스로부터 멀리 위치하고 HDL 농도가 검정될 수 있는 HDL 검정 요소,
HDL 검정 요소와 샘플 분포 매트릭스 사이에 배치되어 있고 매트릭스로부터 멀리 위치하는 시약 패드로, 체액 샘플로부터 비-HDL 지질단백질을 선택적으로 제거하는 데 효과적인 시약을 함유하는 시약 패드,
(a) HDL 검정 요소와 시약 패드가 매트릭스와 분리하여 위치한 샘플-분포 위치에서 장치를 유지, (b) HDL 검정 요소는 시약 패드와 접촉하여 위치하거나 유지되고 시약 패드는 접촉과 동시발생 또는 후속하여 매트릭스와 접촉하게 되는 시험 위치로 장치를 전달하는 데 효과적인 장착 수단을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 장착 수단은 (c)시험 위치로부터 HDL 검정 요소와 시약 패드가 매트릭스와 멀리 위치하는 위치로 장치를 전달하는 데 효과적이다.
바람직하게는, HDL 검정 요소의 하부 표면은 시약 패드의 상부 표면에 부착하여 이 두 개는 영속적으로 접촉한다.
한 구체예에서, 장치는 추가로 샘플 분포 매트릭스가 부착된 카세트 본체와 HDL 검정 요소가 부착된 반응 막대를 포함한다. 장착 수단은 상기 기술된 바와 같이 반응 막대를 카세트 본체에 부착하고 샘플-분포 위치와 시험 위치 사이에 반응 막대와 카세트 본체의 상대적 위치를 조절하는데 효과적이다. 전형적으로, 카세트본체는 추가로 샘플 적용 영역과 체액 소통되어서 체액이 체로 거르는 패드를 통과하여 샘플 매트릭스로 이동하도록 혈액 체액 샘플을 함유하는 웰과 혈액 체액 샘플로부터 세포의 혈액 성분을 제거하기 위한 체로 거름 패드를 추가로 포함한다.
HDL 검정 요소는 전형적으로 HDL 콜레스테롤의 존재하에, 시각적으로 검출될 수 있는 검정 요소에서 변화를 생성하는 시약을 함유한다. 단일 샘플에서 다중 분석물의 동시 검정을 수행할 때 사용하기 위해서, 장치는 바람직하게는 장치가 시험 위치로 전달되었을 때 이러한 요소가 샘플 수집 영역과 접촉하도록 하는 반응 막대에 부착하는 추가 검정 요소를 포함한다. 바람직하게는, 반응 막대는 시각적으로 투명하거나 검정 요소가 가시적인 윈도우를 포함한다.
다른 구체예에서, HDL 검정 요소는 바이오센서를 포함한다. 바람직하게는, 바이오센서는 샘플 체액 내 HDL-관련된 콜레스테롤 농도에 의존하는 산소 또는 과산화수소의 생산을 전기화학적으로 측정하는 데 효과적이다. 추가 검정 요소는 또한 샘플 체액 내 분석물 농도에 의존하는 산소 또는 과산화수소의 생산을 전기화학적으로 측정하는 데 효과적인 바이오센서를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 저밀도 지질단백질 (LDL) 및/또는 과저밀도 지질단백질 (VLDL)을 함유하는 혈액 체액 샘플에서 고밀도 지질단백질 (HDL)과 관련된 혈청 콜레스테롤을 측정하는 관련된 방법을 제공한다. 방법은 다음 작동을 포함한다:
(a) 샘플을 샘플이 하나 또는 그 이상의 샘플 수집 부위로 분포되는 흡수 샘플 분포 매트릭스과 접촉하는 단계;
(b) 샘플 수집 부위 즉 샘플 체액이 전달되고 체액로부터 선택적으로 비-HDL 지질단백질을 제거하는 데 효과적인 시약을 함유하고 시약 패드의 첫번째 표면과 접촉시키는 단계로,
여기서 시약 패드의 반대 표면은 HDL 콜레스테롤 농도를 나타내는 데 효과적인 검정 시약을 함유하는 HDL 검정 요소와 동시에 접촉하여 연속적인 샘플 부피가 시약 패드로부터 HDL 검정 요소로 진행하도록 하고,
(c) HDL 검정 요소에서 검출에 의해 샘플에서 HDL 콜레스테롤의 수준을 결정하는 단계.
혈액 체액 샘플은 일반적으로 예를 들어 세포의 혈액 성분을 제거하기 위해서 샘플 분포 매트릭스의 상류인 체로 거름 매트릭스를 통해서 여과된다. 상기 단계 (b)는 상기 기술된 바와 같이 샘플-분포 위치로부터 시험 위치로 장치를 조정하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 방법은 또한 원하는 양의 샘플 체액이 전달될 때, 샘플 수집 부위와 시약 패드의 첫번째 표면 사이의 접촉을 단절하기 위한 단계를 포함한다. 체액 접촉은 따라서 샘플 매트릭스와 HDL 검정 요소로 연결된 시약 패드 사이에 선택적으로 설정가능하다. 상기 방법으로, 효과적인 샘플 분포와 부피 조정이 인지되고, 대응하는 패드/시험 요소의 샘플 과적이 방지된다.
결합 또는 침전에 의해 체액 샘플로부터 비-HDL 지질단백질을 선택적으로 제거하는 데 효과적인 시약은 예를 들어, 덱스트란 설페이트와 같은 설포네이트 다당류를 포함한다. 한 구체예에서, 시약 패드는 체액 샘플에서 용해가능한 형태로 시약으로 내포되어 있고, 시약 패드 내에 침전된 비-HDL 지질단백질을 가두는 데 효과적인 물질이다. 다른 구체예에서, 시약은 시약 패드에 고정되어 있고, 비-HDL 지질단백질은 고정된 시약에 결합하여 샘플로부터 제거된다.
바람직한 구체예에서, 시약 패드는 다공성 폴리머 막을 포함한다. 막은 작은 구멍난 표면과 반대 큰 구멍난 표면을 가진 비대칭적 폴리머 막이다. 이 경우에, 바람직하게는 작은 구멍난 표면이 HDL 검정 요소로 향하도록 위치한다.
HDL 검정 요소는 또한, 바람직하게는 큰 구멍난 표면이 시약 패드로 향하도록 위치하는 비대칭 폴리머 막과 같은 다공성 폴리머 막이다. 한 구체예에서, HDL 검정 요소와 시약 패드 각각은 비대칭 폴리머 막이고, 막은 시약 패드의 작은 구멍난 표면이 HDL 검정 요소의 큰 구멍난 표면과 접촉하도록 적층되어 있다.
다른 구체예에서, HDL 검정 요소 및/또는 다른 검정 요소는 상기 기술된 바와 같이 바이오센서를 포함한다.
본 발명은 상기 기술된 선행기술문에 대해 여러가지 잇점을 제공한다. 예를 들어, 침전제 또는 결합제를 함유하는 시약 패드가 샘플 체액와 접촉할 때, 이는 HDL 검정 요소와 직접 접촉하여, HDL 검정 반응 전에 혈액 샘플이 이러한 시약과 일시적 접촉하는 것을 제한한다.
원하면, 시험 방법은 또한 필요한 환경 조건을 충족하도록 변경될 수 있다. 따라서, 샘플 응용과 세포의 성분 제거 후, 그러나 결합제 또는 침전제와 접촉하기 전에 원하는 시간 동안, 예를 들어 시험을 보조하기 위해 주위 기압에 맞게 조정되 거나 주위 온도에 적응하기 위해서 검정은 중단될 수 있다. 이는 샘플-분포 위치로 장치를 유지하여 달성된다. 이 목적을 위해서, 샘플 분포 매트릭스는 필요하면추가적으로 저장고로 기능하도록 디자인된다.
본 방법에서, 샘플 제조와 HDL 평가는 개별적 단계에서 수행된다. 샘플 제조는 예를 들어, 세포의 혈액 성분의 여과와, 선택적으로, 혈액 샘플의 일시적 저장 및 혈액 샘플을 온도, 압력 및 환경 기압과 같은 시험 요건 또는 시험 조건에 맞게 변경을 포함한다. HDL 평가 단계는 비-HDL 성분의 시간-효율적인 제거와 신뢰할만한 HDL 정량화를 포함한다. 이 측정으로, 혈액 샘플과 다른 시약이 일시적으로 접촉하는 것이 감소하고, HDL 평가를 화학적으로 간섭하는 것은 방지된다. 추가로, HDL 평가 단계가 짧은 기간동안 수행되기 때문에 혈액 샘플은 작은 구멍난 담체에 널리 저장되지 않는다.
본 발명의 다음 상세 기술을 첨부 도면과 함께 읽으면 본 발명의 목적과 특징은 완전히 명백해진다.
본 발명은 혈액-체액 샘플에서 고밀도 지질단백질 (HDL)- 연관된 콜레스테롤의 농도를 결정하기 위한 방법과 그 방법을 수행하기 위한 진단 검정 장치와 관련된다.
도 1 은 본 발명의 한 구체예에 따라 제조된 다중-분석물 검정 장치의 측면이다;
도 2 는 본 발명의 한 구체예에 따라 제조된 다중-분석물 검정 장치의 확정된 형태로 원근 관점이다;
도 3 은 본 발명의 한 구체예에서 시약 패드와 HDL 검정 요소로 사용하기 위한 2 개의 접촉 비대칭 막의 바람직한 방향에서 횡단면이다.
I.정의
하기 용어는 다르게 지시되지 않으면 다음 의미를 가진다.
체액이 모세관 작용 및/또는 중력을 통해서 하나의 요소로부터 다른 요소로 이동할 수 있을 때 요소는 다른 요소와 "체액 소통"한다. 요소는 직접 접촉하지만, 직접 접촉할 필요는 없다; 즉, 상기 체액이 통과할 수 있는 다른 요소가 방해할 수 있다. 체액이 모세관 작용 및/또는 중력을 통해 한 요소로부터 다른 요소로 이동할 수 없을 때 요소는 다른 요소와 "체액 소통하지 않는다". 전형적으로, 요소는 물리적으로 분리, 즉 따로 위치한다.
여기에서 사용된 바와 같이 시약 패드 또는 검정 패드와 같은 "패드"는 내포된 또는 고정된 시약을 함유할 수 있고 이를 통해 체액이 모세관 작용 및/또는 중력으로 이동할 수 있는 다공성 막 또는 섬유질 스트립과 같은 물질을 포함한다.
II.검정 장치
도 1 과 2 는 본 발명에 따라 제조된 다중-분석물 검정 장치(14)의 2 개의 구체예를 예시하고 도 2 는 확대된 형태로 제시되었다. 장치는 특히 전형적으로 10-50 ㎕ 의 혈액 사이인 적은 부피의 혈액 샘플을 사용하여 HDL (또한 HDL-관련된 콜레스테롤 또는 단순히 HDL 콜레스테롤이라 불리는)과 관련된 혈청 콜레스테롤을 결정하기 위해 고안되었다. 전체 콜레스테롤 또는 트리글리세리드 수준과 같은 다른 검정은 같은 샘플로부터 동시에 결정될 수 있다. HDL-관련된 콜레스테롤의 결정은 단순히 HDL 또는 HDL 검정의 결정으로 언급된다.
장치는 전형적으로 약 25-50 ㎕ 사이인 일정량의 혈액 샘플을 받을 수 있는 치수로 제작되고 크기가 정해진 웰(16)을 정의하는 본체 또는 지지체(15)를 포함한다. 웰은 지지체의 상부 모서리에 형성된 금이 새겨진 영역(20)에서 운반되는 체로 거름 패드(22) 와 접촉하는 체액에 있다. 체액 접촉은 도 1에 제시된 장치에서처럼 웰의 기저에서 플레이트에 형성된 모세관 도관 (18) 에 의해 제공되어 직접적이다. 지지체는 바람직하게는 플라스틱 플레이트이고, 웰, 금이 간 영역 및/또는 모세관은 표준 몰딩 또는 기계 가공 방법으로 형성된다.
영역 (20) 에서 이송되는 체로 거름 패드(22)는 도에 제시된 바와 같이 샘플이 바닥에서 상부 방향으로 패드 매트릭스를 통해서 이동함에 따라 큰 미립자 물질(혈액 세포를 포함하여)을 부분적으로 제거하기 위해 기능한다. 패드(22)는 바람직하게는 혈액 샘플을 매트릭스를 통해 꺼냄에 따라 표면 습윤에 의해 수용성 체액를 꺼내고, 혈액 세포의 움직임을 완화하도록 디자인 된 물질의 유리 섬유질 매트릭스로 형성된다. 즉, 패드는 배지를 통해 다른 이동 비율을 기초로 용해가능한 혈청 성분으로부터 세포-크기 입자를 분리하기 위한 크로마토그래피 배지로서 기능한다. 한 대표적인 패드는 약 0.16g/cm3의 포장 밀도를 가진 Whatman 에 의해 공급된 GF/D 또는 PD008 필터와 같은 유리 섬유 필터이다. 패드는 약 3 × 8 mm 의 측면 치수와 약 1 mm 의 두께로 절단된다. 패드는 바람직하게는 약 15-25 ㎕ 사이의 샘플 체액의 정의된 부피를 흡수하도록 치수가 표시되어 제작되었다. 체로 거름 패드(22)는 추가적으로 렉틴과 적혈구 세포 표면 막 단백질, 트롬빈, 또는 이온 교환 시약에 특이적인 항체와 같은 적혈구 세포 포착제를 함유한다.
체로 거르는 패드(22)는 차례로, 플레이트 (15) 의 상부 모서리를 따라 확장하는 신장 스트립 또는 샘플 분포 매트릭스 (26) 와 접촉한다. 이 스트립은 또한 도 2에 제시된 바와 같이 거품 쿠션 (27) 또는 다른 지지체에 의해 지지된다. 매트릭스 (26)는 패드 (22) 와 체액 접촉하는 스트립의 중심 샘플-응용 영역(28)으로부터 매트릭스의 말단에 인접한 반대 샘플-수집 영역 (30,32) 까지 샘플 체액를 분배하는 기능을 한다. 매트릭스은 바람직하게는 유리 섬유로 형성된다. 매트릭스의 충전 밀도와 두께는 샘플 체액의 부피, 예를 들어, 스트립의 샘플-응용 영역으로 제공된 10-25 ㎕를 흡수하고 분배하도록 된다. 매트릭스는 약 0.16g/cm3과 4.0 g/cm3사이의 바람직한 충전 밀도를 가진다. 대표적인 스트립 물질은 약 0.2 gm/cm3의 충전 밀도와 약 0.12 mm 의 두께를 가지는 Whatman으로부터 입수가능한 F-165-25A 유리 섬유 필터이다.
샘플은 침전제 또는 결합제의 존재 하에 체로 거르는 패드와 샘플 분포 매트릭스에 사용되는 유리 섬유와 접촉하지 않기 때문에, 미국 특허 No. 5,451, 370 에 기술된 코팅은 HDL의 부착을 막는 데 필요하지 않다. 하지만, 원하면, 유리 섬유는 예를 들어 중량으로 5% 폴리비닐 알코올로 코팅된다.
장치 (14)는 또한 제시된 위치에서 지지체의 하부 표면에서 이송되는 연장된 지지체 (62) 와 다중 습윤성 검정 요소 (64,66,68 및 70)로 구성된 반응 막대(60) 를 포함한다. 지지체 (62)는 바람직하게는 투명하거나, 지지체에서는 단지 개구부이고, 패드가 지지체를 통해 보이도록 하는 윈도우, 예를 들어 윈도우(76)를 가진다(Fig. 2). 반응 막대에서 검정 요소는 투명 또는 반투명 접착 재료, 또는 음파용접 또는 다른 적절한 결합 방법에 의해 지지체에 부착될 수 있다. 특정 검정에서 사용되는 각 패드는 하기 추가로 기술된 바와 같이 시각적으로, 가시적으로 또는 검출기에 의해, 또는 바이오센서에 의해 검출될 수 있는 패드에서 분석물-의존적 변화를 생성하는 데 효과적인 분석물-의존적 시약을 함유한다. 패드의 모든 또는 어떠한 필요 서브세트는 특정 검정에서 사용된다.
바람직하게는, 검정 요소는 바람직하게는 약 100-150 ㎛ 의 두께와 약 3 mm 의 측면 부피를 가지는 다공성 폴리머 막이다. 각 요소의 흡수 부피는 바람직하게는 약 0.5-1.0 ㎕ 사이이다. 한 구체예에서, 특히 HDL 검정에 사용되는 검정 요소는 비대칭 막; 즉, 하기 추가로 기술된 바와 같이, 막의 두께에 역으로 다공성 구배를 가지는 막이다. 검정 요소는 또한 하기 기술된 바와 같이 바이오센서를 포함한다.
반응 막대는 (a) 검정 요소와 시약 패드가 매트릭스와 멀리 위치하는 샘플-분포 위치에서 장치를 유지하고, (b) HDL 검정 요소가 시약 패드와 접촉하여 위치(또는 2개의 패드가 함께 부착되어 있으면 유지되는)하고, 시약 패드는 샘플 수집 부위에서 매트릭스 (26)와 동시에 또는 후속하여 접촉하는 시험 위치로 장치를 전달하는 데 효과적인 수단을 장착하여 지지체 (15) 에 장착된다. 장착 수단은 또한 원하는 양의 샘플이 검정 요소에 들어간 후 및/또는 결정된 접촉 시간 후 시험 위치로부터 검정 요소와 시약 패드가 매트릭스("샘플-분포" 위치와 동일한)와 분리하여 놓인 위치로 장치를 전달하여 그러한 접촉을 깨는 데 사용된다. 그러한 전달은 공동 소유의 미국 특허 No. 5,114, 350 에 기술된 바와 같이 습윤의 정도를 나타내는 검정 요소의 상부 표면에서 반사율을 조정하여 조정될 수 있다. 대안적으로, 습윤성 물질의 흡수 용량과 샘플 흡수 비율이 알려져 있으면, 샘플의 양은 미리결정된 접촉 시간을 사용하여 충분히 정확하게 조정될 수 있다.
장착 수단은 예를 들어, 비-전달 또는, 패드가 전형적으로 약 0.5 내지 1.0 mm의 간격으로 샘플 분포 매트릭스로부터 멀리 위치하는 샘플 분포 위치로 패드를치우치도록 기능하는 엘라스토머 블락 (71,72) 과 같은 한 쌍의 탄성 부재를 포함할 수 있다. 탄성 부재를 압축 또는 방출하여, 샘플 분포 매트릭스(26)와 시약 패드 (74) 와 HDL 검정 요소 (64) 사이의 접촉은 선택적으로 설정되고 분리될 수 있다. 지지체 블락은 스프링 또는 피스톤 유사 작용에 의해 압축될 수 있다. 대안적으로, 외부 기계 장치는 본체 (15) 및/또는 지지체(62)를 맞물리게 할 수 있고 하나를 다른 것 쪽으로 이동시킬 수 있다. 그러한 장치는 클램프, 피스톤, 스텝 모터, 워엄 기어, 또는 그 유사물과 같은 통상적인 성분을 포함한다. 대표적인 시스템은 Cholestech LDX® Analyzer로, 여기 기술된 것과 같은 검정 장치와 함께 사용하기에 유용한 자가-함유된, 자동화된 분석기이다.
바람직한 구체예에서, HDL을 검정하는 데 사용되는 검정 요소의 적어도 하나는 도에 제시된 바와 같이 또한 시약 패드(74)를 부착한다. 대안적으로, 그러한 시약 패드(74)는 접촉 또는 접촉하지 않는 HDL 검정 요소와 매트릭스 (26) 의 샘플 수집 영역 사이에 실질적으로 동일평면상 위치에서 지지된다. 예를 들어, 압축성 지지체 요소는 매트릭스 위의 시약 패드를 지지할 수 있고, 본체 쪽으로 반응 막대의 움직임은 (또는 반대로) 첫째로 검정 요소 (64) 를 시약 패드 (74) 의 상부 표면과 접촉하게 하고, 시약 패드의 하부 표면을 샘플 분포 매트릭스와 접촉하게 한다. 시약 패드는 바람직하게는 약 100-150 ㎛의 두께, 약 3 mm의 측면 치수, 및 약 0.5-1.0 ㎕ 의 흡수 부피를 가진다.
도에서 검정 요소 (64) 와 같은 HDL 측정에 사용되는 선택된 검정 요소와 접촉하는 시약 패드 (74)는 바람직하게는 체액 샘플로부터 선택적으로 LDL 과 VLDL 입자를 제거하는 데 사용되는 시약을 함유한다. 그러한 시약은 당업계에 침전제로서 알려져 있다; 예를 들어 PS Bachorik et al.이 쓴 review,Methods in Enzymology78-100 (1986)참조. 이들은 Mg2+, Mn2+, 및 Ca2+와 같은 그룹-Ⅱ 양이온이 존재하면 설포네이트 다당류, 헤파린 또는 인텅스텐산염과 같은 다가음이온 화합물을 포함한다. 바람직한 시약은 초산 마그네슘 또는 염화 마그네슘과 조합하여 중성 pH를 유지하도록 버퍼된 50,000 내지 500,000 달톤의 전형적 분자량을 가진 덱스트란 설페이트와 같은 설포네이트 다당류이다.
시약 패드는 시약 패드 내에 결합된 또는 침전된 비-HDL 지질단백질을 가두고 HDL 검정 요소 (64) 에 들어가는 것을 막는데 효과적이다. 유리 섬유 필터는 그러한 목적으로 사용될 수 있고, 이 유리 섬유는 상기 인용된 미국 특허 No. 5,451, 370 에 기술된 것과 같은 시약의 존재 하에 HDL 의 결합을 방해하도록 코팅되어야 한다. 바람직한 구체예에서, 시약 패드(74)는 하기 추가로 기술된 바와 같이, 다공성 폴리머 막으로 구성되어 있다.
시약 패드는 상기 기술된 바와 같이 비-HDL 지질단백질의 선택적 제거를 위한 시약을 함유한다. 한 구체예에서, 막은 그러한 시약으로 내포되어 있다. 예를 들어, 하기 기술된 바와 같이, 폴리술폰 비대칭 막은 덱스트란 설페이트와 초산 마그네슘과 같은 마그네슘 염을 함유하는 수용성 용액으로 내포되어 있고 건조된다. 장치로 통합하기 위해 그러한 막을 제조하기 위한 대표적인 공정은 실시예1에 기술되어 있다. 이 경우에, 샘플 용액이 막을 침투함에 따라 용해가능한 침전제는 샘플 용액으로 방출된다.
다른 구체예에서, 시약은 막에 고정된다. 바람직하게는, 음으로 하전된 시약, 예를 들어 덱스트란 설페이트는 정전기 힘에 의해 고정되고/또는 양으로 하전된 표면 그룹을 가진 막에 공유적으로 고정된다. 이 목적을 위한 대표적인 물질 은 Cuno Corp. (Meridian, CT)에 의해 제공된 AM080 막과 같은 표면 4차 암모늄 그룹을 가지는 나일론 막이다.
이 경우에, 막은 친화 분리 배지로 기능하여, 비-HDL 지질단백질은 침전되기 보다는 막에 고정된 시약에 결합하여 샘플 체액로부터 분리된다. 양이온 표면을 가진 다른 상업적 폴리머 막은 Immobilon-Ny+TM(Millipore Corp., Bedford, MA), Zetabind® (또한 Cuno Corp.으로부터), GeneScreen®(NEN/DuPont, Boston, MA), Hybond N+ (Amersham, Piscataway, NJ) 및 Posidyne® (Pall Corp., Glen Cove, NY)을 포함한다. 미국 특허 No. 5,543, 054 (Charkoudian et al.)는 표면에 양으로 하전된 부분에 근접하여 반응성 부분을 가진 막에 음으로 하전된 탄수화물을 공유적으로 결합시키기 위한 방법을 기술한다. 막은 예를 들어 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리딘 플루오라이드, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리술폰, 또는 Hercules R-4308TM, 폴리아미도 -폴리아민 에피클로로히드린 레진,으로 코팅된 폴리스티렌과 같은 다공성 폴리머이다.
한 구체예에서, 시약 패드 (74)는 비대칭 막; 즉, 두께에 역으로 구멍 크기 구배를 가진 막으로 구성되어 있다. 비대칭 막은 침전물을 최적으로 가두기 위해 용해가능한 형태로 막에 통합된 침전제와 함께 사용하기에 특히 바람직하다.
비대칭 막의 제조는 예를 들어, 미국 특허 Nos. 4,629,563, 5,171,445, 5,886,059, 5,536,408, 5,562,826, 및 4,774,192; D. R. Lloyd, "Materials Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269: 1-21 (1985)에 기술되어 있다. 이들은 다양한 구멍 크기와 구멍 크기 비율로 상업적으로 구매가능하다. 제조 물질은 폴리술폰, 폴리에테르설폰, 폴리아미드, 폴리에테르 아미드, 폴리우레탄 , 셀룰로오스 아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리스티렌과 변경된 폴리스티렌 그리고 블렌드, 코폴리머, 및 엷은 판 조성분을 포함한다. 대표적인 비대칭 막은 폴리술폰 또는 USF Filtration and Separation에 의해 제공된 FILTERITETM막과 같은 폴리에테르술폰막(San Diego, CA)이다. 최소 구멍 크기는 전형적으로 0.01 내지 1.0 ㎛ 범위이고, 최대/최소 구멍 크기 비율은 100 또는 그 이상까지이다. 두께는 전형적으로 100-150 ㎛ 이다.
비대칭 막은 바람직하게는 큰 구멍난 표면이 샘플 응용 영역에 향하도록; 즉, 도 1 과 2 에서 아래쪽으로 향하도록, 그리고 작은 구멍난 표면이 하기 추가로 기술된 바와 같이 HDL 수준을 검정하기 위한 시약을 함유하는 검정 요소, 예를 들어 검정 요소 (64) 에 향하도록 그리고 바람직하게는 접하도록 위치한다. 이 방향성으로 샘플을 큰 구멍을 통해 패드로 자유롭게 접근할 수 있고, 용액이 지름이 일반적으로 1 ㎛ 또는 그 이하인 작은 구멍을 통해 용해가능한 침전제와 접촉하면서 형성된 침전된 물질의 통과를 막는다. 이 구멍 크기는 또한 비-비대칭 막에 대해 바람직하다.
한 구체예에서, 시약 패드 (74) 는 단일 막으로 구성되어 있다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 막과 바람직하게는 각 막은 시약 패드 (74)에 대한 비-HDL 지질단백질의 결합 또는 침전에 대한 시약을 함유하는 즉 약 6 개 까지 다중으로 쌓인 막의 사용을 의도한다. 이들은 상기 기술된 바와 같이 고정된 시약을 함유하거나 용해가능한 시약으로 내포된다. 후자의 경우에, 비대칭 막이 바람직하고, 바람직하게는 가장 상층 막의 작은 구멍난 표면이 검정 요소 (64)에 향하고, 가장 낮은 막의 큰 구멍난 표면이 샘플 응용 영역에 향하도록 위치한다.
한 구체예에서, 검정 요소(64)는 또한 HDL 수준을 검정하기 위한 시약을 함유하는 폴리머 막이고 상기 기술된 바와 같이 비대칭 막이다. 시각적 스캐닝과 검정 결과의 정량화를 위한 더 균일한 표면을 제공하기 위해서, 검정 요소(64) 에 대해 사용된 비대칭 막은 작은 구멍난 표면이 위로 향하고, 큰 구멍난 표면은 시약 패드 (74) 에 향하도록 위치한다.
대안적으로, 검정 요소 (64) 에 사용된 비대칭 막은 큰 구멍난 표면은 위로향하고 작은 구멍난 표면은 시약 패드 (74) 로 향하도록 위치한다. 이 위치는 가시적, 질적인 리딩을 상부 표면으로부터 하는 검정에 더 적절하다.
원하면, 퍼옥시다아제와 같은 HDL 검정 시약은 효소 고정에 대해 잘 알려진 방법에 따라 검정 요소 막에 고정된다(예를 들어 미국 특허 No. 4,999, 287; 미국 특허 No. 5,419, 902; Blum, L. J. et al.,Anal. Lett .20 (2): 317-26 (1987); Kiang, S. W. et al., Clin. Chem. 22 (8): 1378-82 (1976); Guilbault,G. G. , Ed., Modern Monographs in Analytical Chemistry, Vol. 2 :Analytical Uses of Immobilized Enzymes(1984); Torchilin, V. P., Progressin Clinical Biochemistry and Medicine, Vol.11:Immobilized Enzymes in Medicine(1991).참조). 다른 구체예에서, 검정 요소 (64) 로부터 아래쪽으로 확산하는 생성된 과산화수소를 분해하는 데 효과적인 카탈라아제와 같은 시약은 시약 패드 (74)에 포함된다.
2 개의 부착된 폴리머 막이 각각 검정 요소 (64)와 시약 패드 (74)에 사용되는 바람직한 구체예에서, 적절한 시약이 내포 또는 고정되고 막은 제조하는 동안 검정 장치로 통합하기 위해서 2개의 막 층으로서 공정된다. 2개의 비대칭 막을 포함하는 대표적인 2개의 막 층은 큰 구멍은 78 에 그리고 작은 구멍은 80 에 있는, 제시된 바람직한 위치로 도 3에 횡단면으로 제시되어 있다.
추가 구체예에서, HDL 검정 요소는, 예를 들어, 여기에 참고문헌으로 통합된 PCT Pubn. No. WO 9958966 (Dobson et al.)에 기술된 바와 같이 바이오센서를 포함한다. 이 문서는 전도 표면, 전도 표면 위에 있는 유전체 물질의 층 및 유전체 층을 통해 확장하는 복수의 구멍을 포함하는 미세규모 바이오센서 장치를 개시한다. 각각의 구멍은 전도 표면과 접촉하여 구멍 내에 바이오폴리머에 의해 화학 반응을 전기 신호로 전환하는 마이크로전극으로서 기능할 수 있다. 사용할 때, 검정될 분석물을 함유하는 체액를 구멍에 적용하여서 바이오폴리머와 접촉하도록 한다. 현재 HDL 검정 장치에서, 이는 체액에 있는 시약 패드 (74) 를 HDL 검정 요소 즉, 바이오센서의 표면을 함유하는 구멍과 접촉하도록 하여 달성될 수 있다.
샘플 체액를 통해서 전도 표면과 전기 접촉하는 카운터 전극이 제공된다. 전압은 카운터 전극과 전도 표면 사이에 적용되고 이들 사이에 흐르는 전류를 측정한다. 측정된 전류는 검정된 체액에서 선택된 분석물 양을 표시한다.
마이크로전극은 바람직하게는 암페어측정 바이오센서로 기능한다. 간략하게, 암페어측정 바이오센서는 2개의 전극 사이에 전위를 적용할 때 전류를 생산하여 기능한다. 예는 산소의 환원 또는 과산화수소의 산화에 의해 생산된 전류를 측정하는 Clark 산소 전극이다.
그러한 바이오센서가 용해된 산소 농도에 의존하는 것은 산소 공동 매트릭스의 환원을 회피하면서 전자를 전극에 직접 전달하는 '매개체'를 사용하여 극복할 수 있다. 페로센은 보편적으로 사용되는 매개체의 집단을 대표한다.
마이크로전극 구멍 내의 바이오폴리머는 전형적으로 HDL-관련된 콜레스테롤의 측정을 위한 콜레스테롤 옥시다아제와 같은 효소이다. 콜레스테롤은 콜레스테롤 옥시다아제에 의해 산화되어 대응하는 케톤이 되고, 과산화수소를 방출하며 대응하는 케톤은 효소 퍼옥시다아제에 의해 물과 산소로 전환될 수 있다. 산소 또는수소 퍼옥시다아제는 바이오센서에서 전기화학적으로 측정된다.
III. 검정 방법
작동에서, 혈액 샘플은 웰 (16)에 위치하고, 모세관 작용에 의해, 적혈구 세포를 포함한 큰 미립자가 제거되고 샘플 분포 매트릭스 (26) 으로 이동하는 체로 거름 매트릭스 22 을 통해 흡수된다. 이러한 단계는 장치가 "샘플-분포"위치에 있을 때 발생하고 샘플 분포 매트릭스는 시약 또는 검정 요소와 접촉하지 않는다. 혈청 샘플이 매트릭스 (26)의 말단에 인접한 부위 (30 와 32) 와 같은 샘플-수집 부위에 도달하면, 매트릭스와 접촉하여 검정 요소 (66,68,70) 및 시약 패드/검정 요소 (74/64)(도에 제시된 구체예에서)를 놓기 위해서 바람직하게는 반응 막대 (60)을 이동하여 장치는 시험 위치로 조정된다. 이 위치에서, 패드 표면에 정상인 방향으로 발생하는 체액의 움직임과 함께 매트릭스에 있는 샘플 체액는 모세관 흐름에 의해 접촉 패드 각각으로 이동한다. 패드를 원하는 정도로 적실 때까지 플레이트는 이 위치에 고정된다. 플레이트는 원하면, 원하는 양의 샘플 체액이 검정 요소에 들어갈 때/또는 적절한 접촉 시간 후에, 예를 들어 하기 실시예 2 에 기술된 바와 같이 샘플 분포 매트릭스와 검정 요소와 시약 패드 사이의 접촉을 깨도록 이동한다.
시약 패드 (74) 가 검정 요소 (64)에 고정되지 않은 장치의 구체예에서, 서로를 향한 반응 막대와 본체의 각 움직임은 전형적으로 반응 막대를 아래쪽으로 움직여서 첫째로 시약 패드 (74) 와 접촉하여 검정 요소 (64)를 도에 제시된 요소의 배열에 적절하게 놓고, 추가 작동은 샘플 분포 매트릭스와 접촉하여 시약 패드를놓는다. 상기 기술된 바와 같이, 원하는 정도의 습윤이 달성될 때까지 접촉은 유지된다. 시약 패드 (74) 에 들어가는 샘플 혈청은 막에 함유된 침전제 또는 결합제와 접촉하여, 비-HDL 지질단백질은 용해가능한 시약의 경우에 여과에 의해 선택적으로 침전되고 유지되거나 고정된 시약의 경우에 막에 결합한다. 막은 비-HDL 지질단백질을 가두는 데 효과적이고, 액체 상 HDL 을 함유하는 혈청이 HDL 검정 요소 (64) 로 통과를 허용한다. HDL 검정 요소는 HDL-관련된 콜레스테롤의 정량화를 위한 시약을 함유한다. 바람직하게는, 이들은 HDL로부터 유리 콜레스테롤의 방출을 위한 콜레스테롤 에스터라아제; 유리 콜레스테롤과 반응에 의해 H2O2를 생산하기 위한 콜레스테롤 옥시다아제; H202를 산소와 물로 전환하는 퍼옥시다아제; 및 퍼옥시다아제와 H202의 존재하에 뚜렷히 착색된 신호 반응 산물로 전환되는 커플된 염색약 시스템을 포함한다. 대안적으로, 생성된 산소 또는 H202는 상기 기술된 바와 같이 바이오센서를 사용하여 측정된다.
작동하는 동안, 샘플 체액이 패드 (74 와 64) 를 포함하는 HDL 검정 경로를 통과하면서, HDL-관련된 콜레스테롤을 측정하기 위해서 이것의 선도 모서리는 위쪽 방향으로 비-HDL 지질단백질이 반응하고 갇힌 패드 (74)를 통과하고, HDL이 검정 시약과 반응하는 인접한 검정 요소 (64)로 직접 통과한다. 샘플의 추가 부분은 이 시간동안 패드 (74) 와 계속 접촉하고, 흡수 용량에 도달할 때까지 유사한 방식으로 패드 (74) 부터 패드 (64) 로 진행한다. 따라서, 검정 요소 (64) 에서 HDL-관련된 콜레스테롤의 정량화는 시약 패드 (74) 에서 발생하는 침전 또는 결합 반응과동시에 이루어진다. 바람직하게는, 샘플 분포 매트릭스로부터 HDL 검정 경로(요소 (74 와 64)를 포함하는) 로 전달되는 샘플 체액의 부피는 검정 요소 (64) 의 흡수 용량과 같거나 그 이상이고 검정 요소 (64) 와 시약 패드(74) 의 결합된 흡수 용량 이하이거나 같다.
현재 장치와 방법의 한가지 잇점은 샘플 분포 경로가 비-HDL 침전제 또는 결합제를 함유하지 않는 것이다; 그러한 시약은 시약 패드 (74)에만 존재한다. 따라서, HDL 과 다른 분석물의 검정에서 이러한 시약으로부터 간섭의 가능성은 제거된다.
바람직하게는, 검정 요소 각각은 효소와 분석물의 반응을 통해 H202를 생산하기 위한 시약 성분을 함유한다; H202는 후속하여 매트릭스 시약을 착색된 신호 반응 산물로 전환하거나, 상기 기술된 바와 같이 전기화학적으로 측정된다. 그러한 성분은 예를 들어, 퍼옥시다아제와, H202의 존재하에 퍼옥시다아제에 의해 현저하게 착색된 신호 반응 산물로 전환되는 커플된 염색약 시스템을 포함한다. H202의 효소적 생산을 위한 다양한 매트릭스-특이적 옥시다아제를 사용하는 효소적 착색 반응과 착색된 반응 산물을 형성하기 위한 염색약의 후속하는 산화는 잘 알려져 있다.
4개 혹은 그 이상의 반응 패드를 가지는 장치는 HDL 콜레스테롤 (HDL), 글루코스, 전체 콜레스테롤 (TCh), 및 트리글리세리드 지질 (TG)을 동시에 측정하는 데 사용될 수 있다. 각 패드는 상기-기술된 보편적 경로 성분 (퍼옥시다아제와 커플된 염색약 시스템)을 함유하여 생성된 H202는 측정될 수 있거나 뚜렷하게 착색된 신호 반응 산물을 생성한다. 침전제 또는 결합제에 노출되지 않고 혈청에 노출된 전체 콜레스테롤 검정 요소와 HDL 검정 요소 각각은 상기 기술된 바와 같이 보편적 경로 성분에 추가로, 혈청 지질단백질로부터 유리-콜레스테롤 형태로 HDL, LDL, 및 VLDL 입자를 포함한 에스테르화된 콜레스테롤을 방출하기 위한 콜레스테롤 에스터라아제와 샘플 체액에서 유리 콜레스테롤과 반응하여 H202를 생성하기 위한 콜레스테롤 옥시다아제를 포함한다. 글루코스 검정 패드는 보편적-경로 성분에 추가로 글루코스 옥시다아제를 포함한다. 트리글리세리드 패드는 보편적-경로 성분에 추가로, 중간체 L-글리세롤-3-포스페이트를 통해서 트리글리세리드로부터 H202를 생성하기 위한 리파아제, L-글리세롤 키나아제 및 L-글리세롤-3-포스페이트 옥시다아제를 포함한다. TG 패드로 이동한 혈청 샘플은 침전제 또는 결합제에 노출되지 않고 , 따라서 모든 혈청 지질단백질을 포함하여 TG 신호는 전체 혈청 트리글리세리드를 대표한다.
참조 표준 패드도 또한 사용된다; 예를 들어, 여기에 참고문헌으로 통합된 공동 소유의 미국 특허 No. 5,114, 350 에 기술된 시스템을 참조.
상기 지적한 바와 같이, 현 장치와 방법의 한가지 잇점은 샘플 분포 매트릭스가 비-HDL 침전제 또는 결합제를 함유하지 않는 것이다; 그러한 시약은 시약 패드 (74) 에만 존재한다. 따라서, 전체 혈청 콜레스테롤과 전체 트리글리세리드와 같은 분석물의 검정에서 이러한 시약에 의한 간섭의 가능성은 제거된다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1: 용해가능한 침전물과 HDL 시험 막으로 시약 막의 제조
용해가능한 침전물로 시약 막을 제조하기 위해서, 1 mg/ml 덱스트란 설페이트 (500,000 MW) 와 12.5 mM Mg (OAc)2를 함유하는 수용성 용액은 폭이 0.22 인치인 폴리술폰 비대칭 막에 분배된다. 막 두께는 85 +/-5 psi 의 기포 지점과 함께 127+/-5m 이다. 시약은 16.6 ㎕/인치의 비율로 분배되고, 막은 지속적인 롤 공정에서 50 ℃ 에서 20분동안 건조된다. 예를 들어 100 피트의 길이는 이러한 방식으로 제조되고 검정 장치에 맞도록 절단된다.
HDL 반응 막을 제조하기 위해서, 유사한 비대칭 폴리술폰 막은 다음 수용성 제제로 내포된다: 콜레스테롤 옥시다아제 36.5 Units/ml, 콜레스테롤 에스터라아제 215 Units/ml, 퍼옥시다아제 200 Units/ml, 4-아미노항피린 1.88 ㎛/ml 및 TOOS (3-[에틸(3-메틸페닐)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산)12.05 ㎛/ml. 분배 비율과 건조 시간은 상기 시약 막에 대한 것과 같다.
2 개의 막은 초음파 용접에 의해 반응 막대에 개별적으로(연속적으로) 부착되거나 단일 초음파 용접 단계와 동시에 부착된다.
실시예 2. 검정 과정
다음 검정은 실시예 1 에 기술된 바와 같이 본질적으로 제조된 시약 막과HDL 검정 요소를 사용하여 LDX® 분석기에서 수행된다. 샘플(35 ㎕ 의 혈청 또는 전체 혈액)을 샘플 웰에 적용하고 2분 동안 샘플 분포 매트릭스를 통해서 분포하도록 허용된다. 반응 막대는 시약 패드와 검정 요소(약 1.5 ㎕의 조합된 용량)를 채우는데 충분한 혈청을 전달하기에 충분한 시간인 3초동안 매트릭스와 접촉하고, 그 후에 막대는 원래 위치로 되돌아온다. HDL 검정 반응의 진행을 조정하기 위해서 150 초동안 3초 간격으로 HDL 검정 요소의 상부 표면으로부터 반사율 값을 얻는다. 획득한 최소 반사율 값은 이전에 획득한 측정 커브에 따라서 HDL 콜레스테롤의 mg/dL로 전환된다.
우수한 상관 관계를 보이는 하기 농도 값(mg/dL)은 상기 기술된 바와 같이 분석된 다섯개 혈청 샘플과 Beckman 참조 분석기로부터 얻는다.
샘플 No. HDL 검정 Beckman 참조
A010904 23.8 24.5
10906 43.0 41.9
10502 61.5 59.6
10801 80.6 78.7
10805 92.4 87.2

Claims (28)

  1. 저밀도 지질단백질 (LDL) 또는 과저밀도 지질단백질 (VLDL)을 함유하는 혈액 체액 샘플에서 고밀도 지질단백질(HDL)과 연관된 혈청 콜레스테롤을 측정하기 위한 검정 장치로, 상기 장치는:
    혈액 체액 샘플을 매트릭스 내의 샘플 응용 영역으로부터 매트릭스 내에 하나 또는 그 이상의 샘플 수집 영역으로 분포시키는 데 효과적인 샘플 분포 매트릭스;
    HDL 농도가 검정될 수 있는 상기 샘플 분포 매트릭스로부터 멀리 위치하는 HDL 검정 요소,
    상기 HDL 검정 요소와 상기 샘플 분포 매트릭스 사이에 배치되어 있고 상기 매트릭스로부터 멀리 위치하는 시약 패드로, 체액 샘플로부터 비-HDL 지질단백질을 선택적으로 제거하는 데 효과적인 시약을 함유하는 시약 패드,
    (a) 상기 HDL 검정 요소와 시약 패드가 상기 매트릭스와 분리하여 위치한 샘플-분포 위치로 상기 장치를 유지, (b) HDL 검정 요소는 시약 패드와 접촉하여 위치하거나 유지되고 시약 패드는 상기 접촉과 동시발생 또는 후속하여 상기 매트릭스와 접촉함으로써 시험 위치로 상기 장치를 전달하는 데 효과적인 장착 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 검정 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, HDL 검정 요소의 하부 표면은 시약 패드의 상부 표면에부착되는 것을 특징으로 하는 장치.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플 분포 매트릭스가 부착된 카세트 본체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 HDL 검정 요소가 부착된 반응 막대를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 장착 수단은 상기 반응 막대를 상기 카세트 본체에 부착하고 샘플-분포 위치와 상기 시험 위치 사이에 반응 막대와 카세트 본체의 상대적 위치를 조절하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 장치.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 카세트 본체는 추가로 샘플 응용 영역과 체액 소통되어 있는 상기 혈액 체액 샘플을 함유하는 웰과 상기 혈액 체액 샘플로부터 세포의 혈액 성분을 제거하기 위한 체로 거름 패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  7. 제 4 항에 있어서, 장치가 시험 위치로 전달되었을 때 상기 패드가 상기 샘플 수집 영역과 접촉하도록 상기 반응 막대에 부착되는 추가 검정 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 장착 수단은 (c) 상기 시험 위치로부터, 상기 HDL 검정 요소와 시약 패드가 상기 메트릭스로부터 멀리 놓인 위치로 장치를 전달하는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 장치.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 막대는 시각적으로 투명하거나 상기 검정 요소가 가시적인 윈도우를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 시약은 설포네이트 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 시약 패드는 상기 체액 샘플에서 용해가능한 형태의 상기 시약으로 내포되고, 시약 패드 내에 침전된 비-HDL 지질단백질을 가두는 데 효과적인 물질인 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 시약은 상기 시약 패드에 고정되는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 HDL 검정 요소는 HDL 콜레스테롤의 존재하에, 시각적으로 검출될 수 있는 검정 요소에서 변화를 생성하는 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 HDL 검정 요소는 바이오센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 바이오센서는 상기 요소 내 HDL-연관된 콜레스테롤 농도에 의존하는 산소 또는 과산화수소의 생산을 측정하는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 시약 패드는 다공성 폴리머 막을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 시약 패드는 작은 구멍난 표면과 반대의 큰 구멍난 표면을 가지는 비대칭 폴리머 막인 것을 특징으로 하는 장치.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 막은 작은 구멍난 표면이 HDL 검정 요소에 향하도록 위치하는 것을 특징으로 하는 장치.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 HDL 검정 요소와 상기 시약 패드 각각은 비대칭 폴리머 막이고, 상기 막은 시약 패드의 작은 구멍난 표면이 HDL 검정 요소의 큰 구멍난 표면과 접촉하도록 적층되는 것을 특징으로 하는 장치.
  20. 저밀도 지질단백질 (LDL) 또는 과저밀도 지질단백질 (VLDL)을 함유하는 혈액 체액 샘플에서 고밀도 지질단백질 (HDL)과 연관된 혈청 콜레스테롤을 측정하는 방법으로
    (a) 샘플을, 상기 샘플이 하나 또는 그 이상의 샘플 수집 부위로 분포하는 흡수 샘플 분포 매트릭스와 접촉시키는 단계;
    (b) 샘플 수집 부위 즉 체액 샘플로부터 선택적으로 비-HDL 지질단백질을 제거하는 데 효과적인 시약을 함유하고 상기 샘플이 전달되는 시약 패드의 첫번째 표면과 접촉시키는 단계로,
    여기서 상기 시약 패드의 반대 표면은 HDL 콜레스테롤 농도를 나타내는 데 효과적인 검정 시약을 함유하는 HDL 검정 요소와 동시에 접촉하여 연속적인 샘플 부피가 상기 시약 패드로부터 상기 HDL 검정 요소로 진행하도록 하고,
    (c) 상기 HDL 검정 요소에서 검출에 의해 상기 샘플에서 HDL 콜레스테롤의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 원하는 양의 샘플 체액이 전달될 때, 샘플 수집 부위와 시약 패드의 첫번째 표면 사이의 접촉을 단절하기 위한 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 시약 패드는 상기 체액 샘플에서 용해가능한 형태로 상기 시약으로 내포되어 있고, 시약 패드 내에 침전된 비-HDL 지질단백질을 가두는 데 효과적인 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 비-HDL 지질단백질을 선택적으로 제거하는 데 효과적인 상기 시약은 상기 시약 패드에 고정된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 시약 패드는 작은 구멍난 표면과 반대 큰 구멍난 표면을 가진 비대칭적 폴리머 막을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 막은 작은 구멍난 표면이 상기 HDL 검정 요소로 향하도록 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 20 항에 있어서, 상기 HDL 검정 요소는 바이오센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 바이오센서는 상기 요소 내 HDL-관련된 콜레스테롤 농도에 의존하는 산소 또는 과산화수소의 생산을 측정하는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, HDL 검정 요소와 상기 시약 패드 각각은 비대칭 폴리머 막이고, 상기 막은 시약 패드의 작은 구멍난 표면이 HDL 검정 요소의 큰 구멍난 표면과 접촉하도록 적층된 것을 특징으로 하는 방법.
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