CN100425990C - 血液检测微阵列制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液检测微阵列的制备方法，该方法采取以下步骤：先制作多孔二氧化硅薄膜覆盖的基片，再制作探针微阵列，最后封装血液检测微阵列，采用本发明方法可用于制作包含任意蛋白探针的检测微阵列/蛋白芯片，工艺简单，成本低。

Description

血液检测微阵列制备方法
技术领域
本发明涉及一种医疗卫生用品的制备方法，特别涉及一种血液检测微阵列制备方法。
背景技术
血型鉴定和输血传播相关病原体检测是保证输血安全的关键环节。目前，献血工作中主要使用血凝技术进行血型鉴定，使用酶联免疫测定技术(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和金标免疫层析技术进行输血传播相关病原体检测。近年来，也有采用生物芯片技术来进行检测的研究报道。
血凝技术是血型鉴定的经典方法，实现条件简单，但是其检测体系开放，对环境有较大的污染，对试验人员构成暴露危险。进行ELISA需要多次温育、洗涤并进行吸光度测定，需要较长的实验时间(不低于120分钟)和专用实验设备，不适合装备简单、需要快速报告结果的场合，如街头无偿献血的检验。胶体金免疫层析产品很好地解决了ELISA对设备的依赖、速度也很快，但是胶体金免疫层析技术对每一个检测靶抗原都需要两个特异性的抗体，开发难度较大，也难以实现多靶标联合检测，目前的胶体金免疫层析产品都是单项检测试纸条/卡，每增加一个检测项目，就要增加一次检测操作，也难以形成统一的质控。
目前新兴的生物芯片技术，特别是蛋白芯片技术，提供了一种多指标检验并行处理的方法，有效地克服了胶体金免疫层析技术的缺点。但是，目前报道的蛋白芯片主要使用戊二醛处理的玻璃等作为固相支持物，戊二醛处理的玻璃等固相支持物对核酸探针有较好的吸附能力，对作为芯片探针的蛋白质则吸附能力不佳，以此制作的蛋白芯片均一性不好，检验结果难以保证。
发明内容
为克服上述现有技术存在的缺陷与不足，本发明的目的之一在于提供一种血液检测微阵列的制备方法，该方法所制作的检测微阵列将血型物质、血型抗原、病原体抗原、病原体抗体及其它检测目的物，有序地固定在覆盖有多孔二氧化硅薄膜的玻片、塑料片、陶瓷片等基片上，形成蛋白检测探针微阵列，可用于对献血者、患者进行快速血液检验，并且由于采用封闭式的检测体系，避免污染环境，本发明方法利用基片上刚性结合的多孔二氧化硅薄膜来吸附、固定检测探针的制作方法，还可用于制作其它生物芯片。
为实现上述发明目的，本发明的血液检测微阵列制备方法，包括以下步骤：
a制作多孔二氧化硅薄膜覆盖的基片
取普通载玻片、透明塑料片或陶瓷片，按常规方法清洁表面备用；并在该上载玻片覆盖质量比浓度为1-20％Na2SiO3100ul/cm2；迅速干燥后浸入0.05-0.5mol/L盐酸溶液中5-60min；去离子水浸泡3min以上3次；在180℃-300℃的条件下反应10-60min，该载玻片表面上形成一层10-500nm的多孔二氧化硅微薄膜层，即获得微阵列基片；
b制作探针微阵列
将检测探针、阳性对照和阴性对照，分别固定在制作好的微阵列基片上，形成有序的的微阵列，然后以小牛血清白蛋白或聚乙二醇封闭、干燥；
c封装血液检测微阵列
将盖片密封地扣盖在带有检测探针微阵列的基片上，盖片与检测微阵列之间保留0.1-1.0mm的间隙；
进一步，步骤b中的检测探针为将血型A物质、B物质、血型A抗体、B抗体、D抗体、抗HBsAg、HCV重组抗原、HCV抗体、HIVp24、HIVgp36、HIVp24抗体、HIVgp36抗体、TP重组抗原中的一种或多种；
进一步，步骤c中的盖片上可贴上标识该微阵列检测内容及探针排列方式的条码。
与现有技术相比，本发明方法所制作的血液检测微阵列，利用多孔二氧化硅薄膜对蛋白质的强吸附作用，可以固定任意种类的抗原、抗体作为微阵列的检测探针，并且这种强吸附作用与多孔二氧化硅层的厚度、孔径相关，多孔二氧化硅层的厚度、孔径容易通过其生成反应的化学物质浓度、反应时间和反应温度来控制，使得这种方法制作的微阵列基片的批间差异小，本发明的制备方法可用于制作包含任意蛋白探针的微阵列蛋白芯片，工艺简单，成本低。
附图说明
图1是本发明血液检测微阵列的结构示意图；
图2是本发明血液检测微阵列基片的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步说明。
如图1、图2所示，本发明方法所制作的血液检测微阵列，包括由基片及扣盖在该基片上的盖片组成，所述基片1上有检测微阵列，由牢固吸附在基片上的蛋白探针组成的有序点阵3，所述盖片2的顶面上设置有加样孔4、微阵列阅读窗5，盖片2密封地扣盖在基片1上。检测人员可以通过盖片2顶面上的阅读窗5观察蛋白探针点阵的颜色变化，也可以使用芯片扫描仪读片判断结果。
实施例1
目视血液检测微阵列的制作及检测
a制作多孔二氧化硅薄膜覆盖的玻璃基片
取普通载玻片，按常规方法清洁表面备用；并在该上载玻片覆盖质量比浓度为1％Na2SiO3100ul/cm2；迅速干燥后浸入0.05mol/L盐酸溶液中5min；去离子水浸泡3min以上3次；在180℃的条件下反应10min，该载玻片表面上形成一层10-500nm的多孔二氧化硅微薄膜层，即获得微阵列基片；
b制作微阵列蛋白探针
以抗A抗体、抗B抗体、抗HBsAg、HCV重组抗原、HIV P24、HIV gp36和梅毒重组抗原作为检测探针，以羊抗人IgG作为阳性对照，以胎牛血清白蛋白作为阴性对照，分别固定在制作好的微阵列基片上，形成3×3的微阵列，阵列内每个点直径1mm，间隔2mm，然后以小牛血清白蛋白封闭、干燥；
c封装血液检测微阵列
将盖片密封地扣盖在带有检测探针微阵列的基片上，即制得血液检测微阵列；
d血液检测与结果判读
检测操作：取20ul献血者血液，溶于180ul含1％SDS和0.1-5mmol/L金标Clq的0.1mol/L pH 7.4PBS中，将溶血液加入到微阵列表面，5min后，用1％SDS的0.1mol/L pH 7.4PBS洗涤微阵列。结果判读：羊抗人IgG位点呈色表明检测结果有效，否则应更换检测阵列再次检测；抗A位点呈色而抗B位点不呈色，表明献血者为A型；抗B位点呈色而抗A位点不呈色，表明献血者为B型；抗A位点呈色且抗B位点呈色，表明献血者为AB型；抗A位点和抗B位点都不呈色，表明献血者为O型；血型A物质位点呈色，表明献血者可能是B型或O型；血型B物质位点呈色，表明献血者可能是A型或O型；血型A物质、B物质位点都呈色，献血者为O型；血型A物质、B物质位点都不呈色，献血者为AB型；抗D位点呈色，表明献血者Rh(D)阳性，不呈色为阴性；抗HBsAg呈色表明献血者HBsAg阳性；HCVAb抗抗体位点呈色表明献血者HCVAb阳性；HIV P24/gp36嵌合抗原位点呈色表明献血者HIV抗体阳性；抗HIV p24位点呈色表明献血者HIV-1病毒阳性；抗HIV gp36位点呈色表明献血者HIV病毒阳性；抗HCMV位点呈色表明献血者HCMV病毒阳性；抗EBV位点呈色表明献血者HCMV病毒阳性；梅毒抗抗体位点呈色表明献血者梅毒抗体阳性。
实施例2
自动血液检测微阵列制作与检测
a制作多孔二氧化硅薄膜覆盖的透明塑料基片
取普通透明塑料片，按常规方法清洁表面备用；并在该上载玻片覆盖质量比浓度为13％Na2SiO3100ul/cm2；迅速干燥后浸入0.3mol/L盐酸溶液中30min；去离子水浸泡3min以上3次；在240℃的条件下反应40min，该载玻片表面上形成一层10-500nm的多孔二氧化硅微薄膜层，即获得微阵列基片；
b制作探针微阵列
将血型A物质、B物质、血型A抗体、B抗体、D抗体、抗HBsAg、HCV重组抗原、HCV抗体、HIVp24、HIVgp36、HIVp24抗体、HIVgp36抗体、TP重组抗原作为检测探针，以羊抗人IgG作为阳性对照，以胎牛血清白蛋白作为阴性对照，分别固定在制作好的微阵列基片上，形成5×3的微阵列，阵列内每个点直径0.2mm，间隔0.5mm，然后以小牛血清白蛋白封闭、干燥；
c封装血液检测微阵列
将盖片密封地扣盖在带有检测探针微阵列的基片上，在盖片的条形码区域印上或贴上标识该微阵列检测内容、探针排列方式的信息的条码，即制得血液检测微阵列；
d血液检测与结果判断
检测操作：取20ul献血者血液，溶于180ul含1％SDS和0.1-5mmol/L金标Clq的0.1mol/L pH 7.4PBS中，将溶血液加入到微阵列表面，5min后，用1％SDS的0.1mol/L pH 7.4PBS洗涤微阵列，将检测微阵列。结果判读：微阵列扫描仪对检测微阵列进行扫描，从阅读窗读取微阵列的杂交模式，从条码区读取微阵列检测内容与探针排列方式等信息，并据此调用内置软件对检测结果进行判断，检测结果可以打印也可以存入计算机。
实施例3
目视血液检测微阵列的制作及检测
a制作多孔二氧化硅薄膜覆盖的玻璃基片
取陶瓷片，按常规方法清洁表面备用；并在该上陶瓷片覆盖质量比浓度为20％Na2SiO3100ul/cm2；迅速干燥后浸入0.5mol/L盐酸溶液中60min；去离子水浸泡3min以上3次；在300℃的条件下反应60min，该陶瓷片表面上形成一层10-500nm的多孔二氧化硅微薄膜层，即获得微阵列基片；
b制作微阵列蛋白探针
以抗A抗体、抗B抗体、抗HBsAg、HCV重组抗原、HIV P24、HIV gp36和梅毒重组抗原作为检测探针，以羊抗人IgG作为阳性对照，以胎牛血清白蛋白作为阴性对照，分别固定在制作好的微阵列基片上，形成3×3的微阵列，阵列内每个点直径1mm，间隔2mm，然后以小牛血清白蛋白封闭、干燥；
c封装血液检测微阵列
将盖片密封地扣盖在带有检测探针微阵列的基片上，即制得血液检测微阵列；
d血液检测与结果判读
检测操作：取20ul献血者血液，溶于180ul含1％SDS和0.1-5mmol/L金标Clq的0.1mol/L pH 7.4PBS中，将溶血液加入到微阵列表面，5min后，用1％SDS的0.1mol/L pH 7.4PBS洗涤微阵列。结果判读：羊抗人IgG位点呈色表明检测结果有效，否则应更换检测阵列再次检测；抗A位点呈色而抗B位点不呈色，表明献血者为A型；抗B位点呈色而抗A位点不呈色，表明献血者为B型；抗A位点呈色且抗B位点呈色，表明献血者为AB型；抗A位点和抗B位点都不呈色，表明献血者为O型；血型A物质位点呈色，表明献血者可能是B型或O型；血型B物质位点呈色，表明献血者可能是A型或O型；血型A物质、B物质位点都呈色，献血者为O型；血型A物质、B物质位点都不呈色，献血者为AB型；抗D位点呈色，表明献血者Rh(D)阳性，不呈色为阴性；抗HBsAg呈色表明献血者HBsAg阳性；HCVAb抗抗体位点呈色表明献血者HCVAb阳性；HIV P24/gp36嵌合抗原位点呈色表明献血者HIV抗体阳性；抗HIV p24位点呈色表明献血者HIV-1病毒阳性；抗HIV gp36位点呈色表明献血者HIV病毒阳性；抗HCMV位点呈色表明献血者HCMV病毒阳性；抗EBV位点呈色表明献血者HCMV病毒阳性；梅毒抗抗体位点呈色表明献血者梅毒抗体阳性。

Claims (3)

1、一种血液检测微阵列的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a制作多孔二氧化硅薄膜覆盖的基片
取普通载玻片、塑料片或陶瓷片，按常规方法清洁表面备用；并在该上载玻片覆盖质量比浓度为1-20％Na2SiO3100ul/cm2；迅速干燥后浸入0.05-0.5mol/L盐酸溶液中5-60min；去离子水浸泡3min以上3次；在180℃-300℃的条件下反应10-60min，该载玻片表面上形成一层10-500nm的多孔二氧化硅微薄膜层，即获得微阵列基片；
b制作探针微阵列
将检测探针、阳性对照和阴性对照，分别固定在制作好的微阵列基片上，形成有序的微阵列，然后以小牛血清白蛋白或聚乙二醇封闭、干燥；
c封装血液检测微阵列
将盖片密封地扣盖在带有检测探针微阵列的基片上，盖片与检测微阵列之间保留0.1-1.0mm的间隙。
2、根据权利要求1所述的血液检测微阵列的制备方法，其特征在于：步骤b中的检测探针为将血型A物质、B物质、血型A抗体、B抗体、D抗体、抗HBsAg、HCV重组抗原、HCV抗体、HIVp24、HIVgp36、HIVp24抗体、HIVgp36抗体、TP重组抗原中的一种或多种。
3、根据权利要求1所述的血液检测微阵列的制备方法，其特征在于：步骤c中的盖片上可贴上标识该微阵列检测内容及探针排列方式的条码。
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