JPS6275266A - Ｈｔｌｖ−３抗原用免疫検定法 - Google Patents

Ｈｔｌｖ−３抗原用免疫検定法

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JPS6275266A
JPS6275266A JP61225051A JP22505186A JPS6275266A JP S6275266 A JPS6275266 A JP S6275266A JP 61225051 A JP61225051 A JP 61225051A JP 22505186 A JP22505186 A JP 22505186A JP S6275266 A JPS6275266 A JP S6275266A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ吸立１上 獲得免疫不全症候群（エイズ）の蓋然的な病因剤として
のヒトＴ細胞内リンパウィルス−１ｔ（ＨＴＬＶ−１）
の同定は、血清又は血しょう中ＨＴＬＶ−］［に対する
抗体の検出のための診断検定法の開発をもたらした。米
国特許第４．５２０．１１３号においては、このような
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−［抗体に対する免疫検定法が記載され
ている。その後、ガロら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：　
５００〜５０３（１９８４）は、抗ＨＴＬＶ−■陽性の
固体の大部分からＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスの検出を報
告した。
以前には、リンパ球の単離、続いてこれらのリンパ球の
組織培養及びＨＴＬＶ−ＩＩＩによる感染に対して感受
性のＨＴ−９のようなヒトＴ細胞ラインとの共培養によ
って、ＨＴＬＶ−７１抗原が試験管内で検出された。次
にＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＩＩ抗原の存在は、逆転写酵素活性
に対する試験によるか又は免疫螢光抗体又はサンドイッ
チ酵素免疫検定技術によって細胞培養巾検出されている
。この方法の場合の問題は、それが極端に技術に敏感、
労力集約型モあり、かつ特別の実験設備及び結果を得る
のに２〜８週の２１！置期間を必要とすることである。
マクドゴールら、Ｊ、　　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、　７６：　１７１〜１８３（１９８５）は、Ｌ
ＡＶ感染ヒ）！Ｊンパ球培養の上清液中リンパ線症随伴
ウィルス（ＬＡＶ）の検出法を記載した。ＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉと同様に、ＬＡＶは、エイズの原因剤であると考えら
れているヒトのレトロウィルスのプロトタイプ種と考え
られている。
マクドゴールの方法においては、ＬＡＶば、リンパ芽球
中生長し、直接免疫螢光、酵素連結型免疫吸収（ＥＬＩ
ＳＡ）捕獲検定法（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｍｍ
ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ｃａｐｔｕｒｅ　ａｓｓａｙ）
によって、培養上清がウィルス感染についてモニターさ
れろ。ＬＡＶ−ＥＬＩＳＡ捕獲検定法においては、ミク
ロタイタープレート反応ウェルをヒトの抗ＬＡＶＴｇＧ
で被覆し、ウェルに試験される培養上清を添加し、温置
し、そして洗浄し、次ζζワサビのパーオキシダーゼ複
合型ヒトＬＡＶＩｇＧをウェルに添加する。
温置及び洗浄後、０−フ二二レンジアミン（０ＰＤ）／
　Ｈ２０□溶液を添加し、発色させ、そして４．９０　
ｎｍにおける自動ミクロタイタープレートリーダー中反
応つェル中の光学密度を読む。
マクドゴールらの方法についての問題は、それが組織培
養上清の検定のみに応用でき、誤りの陽性を検出する可
能性があるため、ヒトの生物試料について行うことがで
きないことである。マクドゴールらの操作中誤りの陽性
がおこる理由は、反応ウェルの被覆のため及び複合体中
使用されるヒトの抗体が、リウマチ因子のようなヒトの
試料中の他の抗体と反応することである。
試料から直接ＨＴＬＶ−ＩＮウィルス抗体を検出する比
較的容易な方法が望まれる。しかし、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
ウィルス抗体は、若干の生物試料中、どの点から見ても
、非常に低い濃度で存在しているので、容易には検出可
能でないことが示唆されている。従って、有効にウィル
ス抗原を検出するために：よ、リンパ球分離の後溶菌、
或いは小規模リンパ球培養のような全血試料の何れかの
加工が必要なことがある。生物試料中ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
ウィルス抗原の検出におけろ他の潜在的な問題は、抗Ｈ
ＴＬＶ−ＩＮの同時の存在、その結果免疫コンプレック
スの形成及び）（ＴＬＶ−ＩＮ抗原の可能性のあるマス
キングである。免疫コンプレックスからＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉ抗原を解離させろ方法は、抗原の検出を可能にするが
、試料の追加処理を必要とする。
笈胛曵１乃 本発明は、生物試料中ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原の検出のた
めの直接免疫検定操作である。この検定法は、ｍ識され
た第２の抗体を利用して低い水準のＨＴＬＶ−ＩＩＩウ
ィルス抗原の検出のために必要な感度を達成する。この
検定法は次の工程よりなる：１）　　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
に対する抗体で固形支持体を被覆する； ２）被覆された固体支持体を生物試料と接触させる； ３）　工程ａ中利用されたものと異なる動物種からのＨ
ＴＬＶ−ＩＩＩに対する抗体と固体支持体を接触させる
； ４）工程Ｃの抗体に特異的であり、かつ酵素、放射性同
位元素及び螢光標識よりなる群からの１標識に複合され
ている抗体と固体支持体を接触させ；そして ５）　試料中ＨＴＬＶ−［ウィルス抗体の存在の尺度と
して標識を検出する。
本発明の方法によって容易に試験される生物試料は、ヒ
ト及び動物の体液及び組織、組織培養借地及び遺伝子組
替えＤＮＡ材料を含む。本発明の免疫検定法中使用され
る固形支持体は、反応トレーのウェル、試鉄管、ビーズ
、ストリップその他の当該技術熟練者に周知である固形
支持体を含む。
ポリクロナール及びモノクロナール抗体は共に、本発明
中試剤として有用である。又、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を
使用することができろ。
及吸立！！皇ＩＩＩ 次の実施例は、本発明の免疫検定法を例示する。
例　　工 本例；ま、ヒトの生物試料中ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原につ
いての免疫検定法を示す。
ｆ、　　ヒ）抗ＨＴＬＶ−ＩＮ　Ｉｇａｃ被ｒｎされｈ
１／＜インチのポリスチレンビーズを、２〜２４時間、
好適には約１４〜１８時間、２０℃〜４５℃の範囲の温
度、好適には室温において２００μｌの血清、血しょう
その他の生物溶液のような試料と接触させろ。次にビー
ズを５ｒｍｌの蒸留水で３回洗浄して非結合試料を除く
。
２、　洗浄したビーズを、２００μＩのウサギ抗ＨＴＬ
Ｖ−ＩＩＩＩｇＧと接触サセ、２〜２４時間、好適には
約２時間、約２０℃〜４５℃の範囲の温度、好適には約
４０℃〜４５℃において温度する。次にビーズを、工程
１中説明したとおり洗浄して非結合試剤を除く。
３、　洗浄したビーズを、ワサビのパーオキシダーゼに
複合されているヤギ抗ウサギＩ　ｇＧ　２０　Ｇμ−と
接触させ、１〜４時間、好適には２時間、２０℃〜４５
℃の範囲の温度、好適には４０℃〜４５℃において温度
する。ビーズを再び工程１中説明したとおり洗浄する。
４　洗浄したビーズを、３００μＩの０−フェニレンジ
アミン過酸化水素溶液と接触させ、それはワサビのパー
オキシダーゼの存在下に黄色の生成物を生成し、約３０
分間室温において装置して後、ｌＮＨ２Ｓ０４１１１１
を添加する。
５　標準分光光度計を使用して４９２ｎ■において吸光
度を読む。
例Ｉの検定法の工程２及び３は、随意には組み合わせて
１工程とし、検定操作を容易にすることができろ。又、
ＩｇＭ抗体を、工程１及び３のＩｇＧ抗体の代わりに用
いることができる。
例　　■ エイズ患者、エイズ関連コンプレックス（ＡＲＣ）、エ
イズ患者の無症候性の性接触、並びにエイズの危険性の
ない他の基礎疾患患者からの血清を、例Ｉ中記載された
検定法、並びにＨＴ、ＬＶ−■に対する抗体のための市
販の検定法（アボットラボラトリーズ、ノース　シカゴ
　イリノイ州）を用いて試験した（表１）。２６名のエ
イズ患者からの７０コの血清試料の９１％は抗体陽性で
あり、６７％は抗原陽性であった。２６名のエイズ患者
のうち１８名からの少なくとも１コの血清試料中抗原が
検出され、この人の範囲では６９％の抗原陽性率が得ら
れた。エイズ患者からの７０コの血清のうち６コ（８，
６％）は抗原陽性／抗体陰性であったが、６コはすべて
２６名のエイズ患者のうち１名（３，８％）からであっ
た。全体として、エイズ、ＡＲＣ及びエイズ接触よりな
る群において、５．３％は抗原陽性／抗体陰性であり、
これらの群において８６名中２名（２３％）に相当した
。同様に、サラフジンら、Ｌａｎｅｅｔ、　１９８４−
［：　１４１８〜１４２０（１９８４）は、抗ＨＴＬＶ
−ＩＩＩ陰性であった９６名のエイズ、ＡＲＣｊｌｉ者
、或いはエイズを獲得する危険性の高い無症候性固体の
うち４名（４，２％）のリンパ球からＨＴＬｖ−Ｉウィ
ルスを単離することができた。
匠−１ 肝炎マーカー及び抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ陰性の無差別の供
血者からの、２００コのヒト血しょう及び血清試料、並
びに４７コの対照患者試料を使用して検定の特異性を決
定した（表１）。抗原の誤りの陽性は見られなかった。
すべての負の値は、陰性の対照の平均の２標準帰差内で
あり、カットオフは、陰性の対照の平均の５標準補差で
あった。
エイズ　　　　　２６　　　７０　　　４７６４　　　
４１　　　　　　　６ＡＲＣ５０５３５２８４１ 工イズ判Ｕ嫁　　１０１０１５１　　　　　　　０対照
　４７４７０００　　０ ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原に対して陽性であるがＨＴＬｖ−
４に対して陰性である生物試料の同定は、ヒト供血者の
スクリーニング及び保護において重要である。この検定
法は、抗ＨＴＬＶ−１陰性であり、従って現在利用でき
る抗体スクリーニング試験によってＨＴＬＶ−Ｍ陽性と
して示されない、ＨＴＬ、：Ｖ−ＩＮウィルス感染固体
を検出する迅速スクリーニング操作を可能にする。又、
本発明の検定法によろＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ抗原の検
出は、エイズ患者たついて診断及び予後の価値を有する
ことができ、又抗ウイルス治療を受けている患者をモニ
ターするのに有用となることができろ。
特定の実施例を示して本発明を例示したが、当該技術熟
練者は、本発明の精神及び範囲から離れることなしに改
変を知ると理解されるべきである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次の工程よりなる生物試料中ＨＴＬＶ−IIIウィル
    ス抗原の検出のための免疫検定法： ａ、ＨＴＬＶ−IIIに対する抗体で固形支持体を被覆す
    る； ｂ、被覆された固体支持体を生物試料と接触させる； ｃ、工程ａ中利用されたものと異なる動物種からのＨＴ
    ＬＶ−IIIに対する抗体と固体支持体を接触させる； ｄ、工程ｃの抗体に特異的であり、かつ酵素、放射性同
    位元素及び螢光標識よりなる群からの１標識に複合され
    ている抗体と固体支持体を接触させ；そして ｅ、試料中ＨＴＬＶ−IIIウィルス抗体の存在の尺度と
    して標識を検出する。 ２、工程ｃ及びｄが同時に行われることよりなる特許請
    求の範囲第１項記載の免疫検定法。 ３、工程ａ及びｃの抗体がＩｇＧ又はＩｇＭ抗体である
    ことよりなる特許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。 ４、標識がワサビのパーオキシダーゼである特許請求の
    範囲第１項記載の免疫検定法。 ５、次の工程よりなるヒト生物試料中ＨＴＬＶ−IIIウ
    ィルス抗原の検出のための免疫検定法：ａ、ヒト抗ＨＴ
    ＬＶ−IIIＩｇＧでポリスチレンビーズで被覆する； ｂ、被覆されたビーズと試料を接触させ、温置し、そし
    て洗浄する； ｃ、ウサギ抗ＨＴＬＶ−IIIＩｇＧとビーズを接触させ
    、温置し、そして洗浄する； ｄ、ワサビのパーオキシダーゼに複合されているヤギ抗
    ウサギＩｇＧとビーズを接触させ、温置し、そして洗浄
    する； ｅ、ｏ−フェニレンジアミン−過酸化水素溶液とビーズ
    を接触させる；そして ｆ、４９２ｎｍにおいて生成した着色生成物の吸光度を
    測定して試料中ＨＴＬＶ−IIIウィルス抗原の存在を決
    定する。
JP61225051A 1985-09-25 1986-09-25 Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼抗原用免疫検定法 Expired - Lifetime JPH0692972B2 (ja)

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