JPS62860A - 微生物診断用テスト方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は診断テストに関する。特に本発明は、血漿又は
血清の如き生物学的試料中で所与のウィルスに対する抗
体を検出することに基〈微生物、特にウィルス感染の診
断テスト及びこのようなテストに使用する製品に係る。

本発明は、例えばリッツＱ節障害関連ウィルス（ＬＡＶ
）のような、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因
となるウィルスについてのテストに特に利用できること
が判明しているが、成人型Ｔ−細胞白血病（ＡＴＬＶ／
ＨＴＬＶ）のテストにも使用しうる。ＬＡＶは（恐らく
誤りであるが）広＜ＨＴＬＶ−ｉｌｌ　　と指体されて
いる。

発明の背景 ＡＩＤＳ及びＡＴＬＶ／ＨＴＬＶのようなウィルスを含
む微生物に対する抗体の血液試料中での存在を検出する
ためのテストは公知である。公知のテストでは、例えば
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような
免疫測定法の基準として少くとも部分的ＶＣ＃ＩｊＩｌ
＋シた不活性化ウィルス又は抗原を使用する。例えばオ
ルガノンーテクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ　−Ｔｅｋｎｉｋ
ａ）間接ＥＬＩＳＡ〔ｒビロノスチカ（Ｖｉｒｏｎｏｓ
ｔｉｋａ　）　Ｊ抗−ＨＴＬＶ−ｍ）がある。

このような測定では、プラスチックのテストプレート中
のテストウェルを少くとも部分的に精製したウィルスで
コートしておき、テストする試料をそのウェルに加える
。ＬＡＶ又はＡＴＬＶ／ＨＴＬＶのようなその他の微生
物に対する抗体はいずれもウィルスに結合し、次に最初
の抗体に選択的に結合する第二のラベルした抗体を加え
ることにょシ結合した抗体の存在を測定する。抗体ラベ
ルは、例えば酵素ラベルの存在下で色を変化させる基質
を加えるといったような適尚な方法で検出する。

色の変化により試料中の抗体の存在を示す。

ＡＩＤＳウィルスの伝染は限定された経路で起るので、
保菌者を効果的にスクリーニングして多数の人々へのウ
ィルスの広がシをチェックできるはずである。しかしな
がら、公知のテストは完全に信頼できるものではないこ
とが判明している。即ち、それらのテストでは受容でき
ない程高率で偽陽性及び偽陰性の結果を示す傾向にある
。不正確さの可能性のある理由の一つとして、ウィルス
の純度の悪さ、即ち試料中の抗体が結合する他の抗原で
汚染されていることが挙げられる。テストプレートのプ
ラスチック材料の非特異的な［固着性（５ｔｉｃｋｉｎ
ｅｓａ　）　Ｊも、試薬との望ましくない結合を引き起
し得るものである。

ポポビック（Ｐｏｐｏｖｉｃ）等は、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）２２４（１９８４年５月２４日）４９７〜
５００に（及び米国特許第４５２０１１３号明細書実施
例３にも）、以下のテス）ＫよるＡＩＤＳ患者のウィル
スの検出を記載している。この方法では細胞をＨＴＬＶ
−■に感染させてスライＰ上にスポットし、ヒト血で再
度洗浄し、顕微鏡下で螢光を測定している。

対照としては非感染細胞を使用している。

カル、Ｑス（Ｋａｒｐａｓ）は、ＡＩＤＳ感染及び非感
染の同性愛者の血清中の抗体の存在について、アセトン
で固定した細胞を用いて免疫螢光法でスクリーニングす
ることを既に開示している。（モル。

パイオール、メゾ、　（Ｍｏｌ　、　Ｂｆｏｌ　１Ｍｅ
ｄ、）　１　（１９８３）４５７〜４５９）。カルパス
の開示の重要な結論は、血清はＡＴＬＶ（ＨＴＬＶ）Ｋ
対する抗体を持っておらず、ＡＩＤＳの進行にはもう１
つのウィルスが関与している可能性があるということで
あった。

偽陽性反応の発生を最小限にするか又は避けると共に、
免疫螢光法よυ安価で便利なＡＩＤＳのテストが提供さ
れることが非常に望まれている。

発明の要約 本発明の１つの形態は、例えばＡＩｂＳウィルス又は成
人型Ｔ−細胞白血病に対する抗体の存在について流体試
料をテストする方法である。その方法は、関連するウィ
ルスのような微生物に感染している細胞又は細胞断片に
試料を接触させ、抗体部位での可視の色の変化によシ細
胞随伴抗原に結合した抗体の存在を測定することからな
る。

本発明のもう１つの形態は、２つの層からなるテストコ
ンポーネントであ夛、上層は開孔列を有してお〕そこを
通して下層の別々の部分を露出しているものであ）、下
層は少なくとも前記の別々の部分のいくつかに１微生物
に感染した固定細胞又は細胞断片を有している。

本発明は、問題とする微生物又はウィルスに感染し得る
細胞を使用する。ＡＴＬＶ／ＨＴＬＶの場合にはヒ）Ｔ
−細胞セルラインを使用するのが好オしいが、他のヒト
又は動物（例えばサル）のセルラインも使用し得る。カ
ル／Ｑス（ＫＡｒｐａｓ）　４５又はカルノ９ス（Ｋａ
ｒｐａｓ　）　Ｔ−細胞として知られていると）Ｔ−細
胞セルラインは、ＡＩＤＳ抗体をテストするのに特に好
ましい。何故ならば、ＡＩＤＳウィルスに感染したこの
ラインからの細胞は非常に大量のウィルス抗原を発現す
るからである。このセルラインの詳細Ｋ）いては、カル
／Ｑス（Ｋａｒｐａｓ）等が白血病研究（Ｌｅｕｋａｓ
ｍｉａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１　（１９７７）に述べ
ている。しかしながら、ＡＩＤＳ又は他の微生物に感染
し得る他のセルラインも使用できた。

本発明を実施するときｋは、所与のセルラインからの細
胞を、複製して感染細胞を産生ずる関連のウィルスに感
染させる。細ＩＩＫ加える試料中のウィルスに対する抗
体はいずれもウィルス抗原に選択的に結合する。次に１
結合した抗体の存在を比色測定する。例えば、結合抗体
に対する適当にラベルした抗体又はブドウ球菌プロティ
ンＡを加えることができ、これらは検出すべき結合抗体
に選択的に結合する。基質を加えると、肉眼で検出する
ことができ、ラベルが検出されるのは問題となる抗体が
存在することを示すものであシ、ラベルが検出されない
のは検出すべき抗体が存在しないことを示すものである
。

反応の特異性を制御するために、感染細胞と同様の方法
で、同じセルライン由来の非感染細胞を処理して対照標
準を作成しておくことが望ましい。

細胞中の任意の抗細胞抗体は同様の方法で感染及び非感
染細胞の両者と反応する。肉眼で観察した結果を確認す
るためにペンチ顕微鏡を適切に使用すると、このような
抗細胞性抗体の作用をモニターでき、考慮に入れること
ができる。

本発明は、細胞を例えば試料スライド形状のような適切
な七ｌア忙固定するか又はテストプレート上のテストフ
ェル内に位置させて実施するのが便利である。キャリア
は使用する試薬に影響を及ぼさないものであれば任意の
適切な材料からなるものでよい。所望の反応が色の変化
を伴なうものであるので、キャリア材料は透明又は白色
であるのが好ましい。ガラスは透明で、不活性で、安価
で容易に入手できるので、この目的のための特に好適な
材料の一つである。

本発明のテストコンポーネントではいわゆる力゛ラスプ
レートとマルチウェルプレートとを合せて使用し、その
機能を合せて利用している。細胞をスライドの１つの表
面上に不動態化し、複数の孔を有する上層を通して別々
の部分として露出する。

このスライドと上層が２＃コンポーネントを形成切であ
シ、非常に薄くてよい。即ち、この機能は単にキャリア
層上に別々の分離した部分を規定することであ）、例え
ば透明スライドに対しては白のように対照的な外観を有
しているのが好ましい。

本発明に使用する試験用コンポーネントは例えば３×５
又は８×１２列の別々の空間を有するテスト領域の配列
を有している。このような実施態様では、このような部
分の全部、あるいは例えば１つ以上の選択した横又は縦
の列のみのようＫ　一部に感染細胞を置いて前記の対照
の目的のために残った部分に非感染細胞を置くと便利で
ある。全部分（例えば８×１２の）に感染細胞を有する
比較的大きなプレートは基本的なスクリーニングに使用
Ｌｉる。陽性反応についてのチェックが必要な場合には
、感染細胞及び非感染細胞の列（例えば３×５の）を有
する比較的小さいプレートを用いて行うことができる。

本当の比較のためＫは、感染細胞と非感染細胞はもちろ
ん同じセルライン由来であるべきである。

使用するためのキャリアを製造するときに（適尚な感染
又は非感染）細胞を、例えばガラスキャリア上に置く。

細胞を空気乾燥させ、次に感染細胞中のウィルスを殺し
、ウィルス抗原を破壊することなく細胞を抗体に対し透
過性にするという２つの機能を持つ適切な固定剤を用い
て固定する。

アセトンは１つの好適な固定剤であるが、他の試薬も使
用し得る。

本発明を実施するときには、例えば血液（血清又は血漿
）又はその他の体液のようなテストすべき試料流体を少
量、固定した細胞に加える。次に、適切な温度（θ〜５
０Ｃ）で、適切な時間の間、試料をインキュイードする
。インキュイード時間は温度に依存する。例えば、３７
Ｃでは約１時間のインキュベートで充分であったが、Ｏ
Ｃでは５時間以上のインキュベート時間が必要であると
考えられる。インキュベートの後に、例えばスライドの
ような試料のキャリアを生理的食塩水のような適切な溶
液中で洗浄して、ウィルス抗原と化学的に結合している
抗体のみを残して全ての非結合抗体を除去する。

次に、適切な比色免疫測定法によシ結合した抗体の存在
を検出する。例えば、結合した抗体に対する、適切にラ
ベルした抗ヒト抗体を添加してもよい。又、適切にラベ
ルしたブドウ球菌プロ７４７人も使用し得る。このよう
な試薬はヒトＩｇＧ抗体に結合するので、はとんどの場
合に満足な結果が得られる。最も一般的に使用されてい
るマーカーラベルはホースラデイシュのペルオキシダー
ゼであるが、アルカリ性ホスファターゼ又はコロイド状
の金も使用し得る。

インキュベートの後に、全ての非結合マーカー物質を洗
浄して除去し、次に必要に応じて、結合したマーカーラ
ベルを可視化するだめの適切なステップを行う。例えば
、マーカーがホースラデイシュペルオキシダーゼの場合
には、ラベルの存在下に赤／茶色を「発色」するために
アミンエチルカルバゾールのような適切な試薬を使用す
る。発色した色の強度は試験すべき試料からの結合抗体
の量を示している。

可視の色の変化として発色されるので、結果は必要であ
る。更に、必要であれば、対照の標準と麿る、非感染細
胞を同様に処理して得た結果とラベルの発色した色とを
比較できる。

本発明のキットはテストコンポーネントからなと便利で
あり、適当であればラベルを発色するための試薬をも含
むものである。

本発明はウィルスに対する抗体のテス）Ｋ特に適応性を
有し、良好な、信頼度の高い正確な結果が得られること
が判明した。本発明は、測定が迅速であることと、従来
よりもはつきシと陽性及び陰性の結果を肉眼で判定し得
ることを両立したことに特に価値があり、これは感染細
胞を使用すると偽陽性又は偽陰性の判定を減少あるいは
防止するということの発見によるものである。従来の酵
素結合免疫吸着測定では、流体中で色の変化を検出する
が、本発明を使用すると、抗体の部位で沈殿が形成され
る。実際、テストコンポーネントは乾燥させ、測定まで
保存することができる。これらの特徴は技術的にそして
商業的に非常に重要である。

例示の丸めに、ＡＩＤ８ウィルスの抗体をテストするた
めの本発明の好適実施態様について記載する。

カルノＱｘＴ細胞セルライン由来の細胞をＡＩＤ８ウィ
ルスに感染させる。得られた感染細胞を、３×５の配列
のウェルを有するガラススライド中の選択したテストウ
ェルに固定する。例えば、感染細胞を配列の選択した横
の２列にのみ位置させる。

スライＰの残ったウェル、例えば配列の残った横の１列
に、同じセルライン由来の非感染細胞を固定する。

スライドを空気乾燥させた後、アセトンを加えて細胞を
固定する。アセトンはウィルス抗原を破壊することなく
ウィルスを殺し、細胞を抗体に対し透過性にするように
作用する。

血漿又は血清のような、テストすべき体液の少量の試料
をテストウェルのそれぞれに加え、適切な温度で適当な
時間、例えば３７Ｃで１時間又は４Ｃで１２時間以上イ
ンキュベートする。次に、スライドを生理的食塩水で洗
って非結合抗体を全て除去する。

次に、ホースラディツシュペルオキシダーゼでラベルし
たヒト免疫グロブリンに対する抗ヒト抗体又はプドク球
菌プロティンＡをウェルに加え、インキュベートする。

非結合抗体を全て洗浄して除去し、次に、アミノエチに
力ｋＡゾールのような基質を加えることにより結合抗体
を「発色」させる。アミノエチルカルバゾールはペルオ
キシダーゼラベルの存在下に赤／茶色を発色する。他の
基質もまた使用することができる。発色した色の強度は
、問題とする試料からの結合ＡＩＤＳ抗体の量を示す。

発色しないときには、通常は問題の材料が問題の抗原に
対する抗体を持九ないことを意味している。従って、陰
性の血清は肉眼で識別できる。

感染細胞の部分で色が発色されるのと反対に１非感染細
胞の部分の反応は対照の標準を提供し、これを感染部分
からの結果と比較することができる。この結果は肉眼で
観察すること本できるし、よシ正確な情報が必要なとき
Ｋは顕微鏡下で観察するとともできる。

以下の特異的な実施例によ）本発明を説明する。

次の略号を用いる： ＰＢ８　　　リン酸塩緩衝塩溶液 ＨＲＰ　　　ホースラディツシュ−ｅｋオキシダーゼＩ
Ｐ　　　イムノペルオキシダーゼ ＩＰ　　免疫螢光 ＣＲＩＡ　　競合ラジオイムノアッセイＣ−ＬＡＹ　Ｌ
ＡＶのケンブリッジ単離体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉｓｏ
ｌａｔｅ　） 実施例 マルチウェルスライドの各ウェル内に約１０６個の細胞
を入れ、空気乾燥させ、室温においてアセトン中で１０
分間固定した。スライＰはウェルの３つの横の列を有す
るものであった。食塩水又はＰＢＳ中で１０分の１に希
釈したテスト用の血清又は血漿サンプルの１滴を、ウィ
ルス感染した細胞を含有するウェルの２列と、非感染細
胞を含有するウェルの１列とに加えた。この調製物を湿
潤チャンバー内で３７Ｃで少なくとも６０分間インキユ
ベートシ、食塩水又はＰＢＳで１０分間洗浄した。次に
ＨＲＰを付加したヒト免疫グロブリンに対する抗体の懸
濁液を加えた。

平行して同じスライドのセットを、フルオレセインを付
加した同様のヤギ抗体で処理した。従って、各血清／血
漿試料は２つの方法で、２種類についてテストした。各
々は対照も含んでいた。

湿潤チャンバー内でのインキュベートを行ない、食塩水
又はＰＢＳ中で１０分間洗浄した。フルオレセイン染色
した調製物は螢光顕微鏡で調べ、ＨＲＰ処理した細胞は
アミンエチルカルバゾール又は同等の基質で染色した。

ＩＰ反応の結果は肉眼ではつきシと識別でき、従来の低
倍率の顕微鏡による検査で確認できた。

ＩＰとＩＦの結果は同じであった。ＩＰの方が安いので
その方が好ましい。

比較のための血清学的スクリーニングの結果は下記の表
に示す。アデンプルツクス病院（Ａｄｄｅｎ−ｂｒｏｏ
ｋｇｓ　Ｈｏ５ｐｉ　ｔａｌ　）、ケンブリッジ（Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ　）及びウエストミンスター病院（Ｗｅ
ｓｔｍｉｎｓｔｅｒ　Ｈｏ５ｐｉ　ｔａｌ　）、ロンド
ン（Ｌｏｎｄｏｎ　）の両者からの１９０の血清を各各
個々に上記のＩＰテストと、ロンドンのノＱブリックヘ
ルスラボラトリ−サービス（Ｐｕｂｌ　１ｏＨｅａｌ　
ｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ　）　Ｉｃ
おけるＣＲＩＡとＫよシテストした。ＣＲＩＡはモルチ
マー（Ｍｏｒ　ｔ　ｉｍａｒ　）吟によシ、ブリティッ
シュメト、ジエー、　（ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄ、　Ｊ　
、　）　釘曵（１９８５）　１１７６〜７９に記載され
ている。後者では不明確な判定が高率（１２／１９０　
）で発生したが、ＩＰテストでは明確ではつき）とした
結果が得られた。

ＣＲＩＡ 十　　−士 ＩＰテスト＋　４７　　３　７ 他のヒトＴ−細胞セルライン中の他のウィルス単離物と
は異なシ、Ｃ−ＬＡＶ〔カル、ｐＱｘ　（Ｋａｒｐａｓ
）、ツル、パイオール、メト、　（Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ
　、　Ｍｅｄ、）　１（１９８３）　４５７とランセッ
ト（Ｌａｎｃｅｔ）　２　（１９８５）６９５参照〕は
カルパスニー細胞の完全な細胞溶解を起す。しかしなが
ら、関連するＴ−細胞セルラインがインビトロ（ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ）で非常に良く増殖し、実際には限定されな
い量を与えるので、ウィルス感染した細胞を持続的に供
給することができ、とが可能になる。

１つの実験では、０．１−の血清試料を１０’個の感染
性Ｃ−ＬＡＶ粒子と１時間インキュベートして得た血清
／ウィルス混合物をカルノ９スＴ−細胞に感染させた。

９つの血清をテストした。ＡＩＤｆＳ患者からの２つの
血清はウィルスの溶解作用を阻止しなかったが、健康な
抗体陽性の同性患者からの７つの血清のうち５つは１０
日間に亘り溶解作用を阻止した。

細胞中に蓄積するウィルス抗原が高濃度であると、ＩＰ
染色の結果を肉眼で識別できるようにな抗体と抗細胞性
抗体を識別するこの能力は、普通いくつかの抗細胞性抗
体を持っている同性患者や輸血を受けた人の場合に非常
に重要である。

肉眼で陽性反応を検出し、顕微鏡で確認することにより
、放射活性又はＥＬＩＳＡカウンターに伴う誤った読み
を排除することができる。特別な専門的技術も、複雑な
装置も必要ではなく、冷蔵庫テスト１く〆同じスライド
を使用することもできる。

スライドをアセトンで固定することによりウィルスを殺
すので、スライドは取り扱いにおいても全く安全である
。３ケ月に亘、９＋４Ｃで保存したスライドは充分に使
用することができた。

本発明の方法は信頼性が高く安全なテストであり、容易
に実施できる。本発明の方法は、抗−ＬＡＶ抗体に対す
る血液の大規模なスクリーニング用の簡単で安価な方法
を提供し、２時間以内に正確々結果を与えることができ
る。更に１陽性の血清について上記の簡単な手順により
、ウィルスの中和抗体も識別することができ、従って、
中和抗体が高い力価である血清をＡＩＤｆ９患者に行な
う免疫療法試験用に選択することができる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物に対する抗体の存在についての流体試料の
   テスト方法であつて、微生物で感染した固定細胞又は固
   定細胞断片に試料を接触させ、細胞随伴抗原に結合した
   抗体の存在を測定することからなり、該測定は抗体部位
   の可視の色の変化により行う前記方法。
2. （２）測定の間の対照として、感染細胞と同じセルライ
   ン由来の非感染細胞又は細胞断片とも試料を接触させる
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）微生物がウィルスである特許請求の範囲第１項又
   は第２項に記載の方法。
4. （４）ウィルスがＡＩＤＳウィルス又は成人型Ｔ−細胞
   白血病ウィルスである特許請求の範囲第３項に記載の方
   法。
5. （５）上層と下層からなり、上層が開孔の列を有し、そ
   れを通して下層の別々の部分が露出しており、下層の前
   記別々の部分の少なくともいくつかに微生物に感染した
   細胞又は細胞断片が固定されているテストコンポーネン
   ト。
6. （６）下層がガラスである特許請求の範囲第５項に記載
   のテストコンポーネント。
7. （７）微生物が特許請求の範囲第３項又は第４項に規定
   したものである特許請求の範囲第５項に記載のテストコ
   ンポーネント。
8. （８）特許請求の範囲第５項から第７項のいずれかに記
   載のテストコンポーネントと試料を接触させる特許請求
   の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
9. （９）特許請求の範囲第５項から第７項のいずれかに記
   載のテストコンポーネントと、抗体と結合し得、肉眼で
   識別し得るラベルした物質とからなるテスト用キット。
10. （１０）更にラベルを発色するための試薬を含む特許請
    求の範囲第９項に記載のテスト用キット。