JPH01163665A - イムノアツセイおよびそれに使用される生物学的構築体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗体のイムノアッセイおよびそのイムノアッセ
イに使用する試験キットに関する。

クローン化した抗原の最も一般的な発現系は、その抗原
を大腸菌内で発現させる系である。しかしながら、大腸
菌は、腸内菌叢のきわ立った部分を占めている。したが
って、ヒ１〜血清は大腸菌にλｊＪる抗体を含む場合が
多い。大腸菌内で生成させた抗原を、抗体の→ノンドイ
ツチイムノアツセイに使用すると、一部の固体は夾雑す
る細菌性物質と反応する可能性がある。このような反応
は、特定の固体において偽陽性の結果を与えることがあ
る。このＪ：うな種類の偽陽性は、大腸菌からの物質を
試験サンプルと混合づることによって最小限に抑えるこ
とかできる。

本発明者らは、夾雑物質による問題を克服する新しい方
法を発明した。基本的には、免疫学的に同一の抗原を異
なる生物内に組込むものである。

す４１わち、異なる生物からのクローン化抗原をサンド
イッチの両側に配する。試験サンプル中の検出を望んで
いない抗体はクローン化抗原の一方に会合した夾雑物質
と結合することはあっても、起源が異なるので両クロー
ン化抗原と会合した夾雑物質と結合づ−ることはない。

このようにして、偽陽性の問題は回避できる。確実に夾
雑蛋白質を完全に含まないようにクローン化抗原を調製
する必要がなくなることは重要である。アッセイの特異
性は著しく改善される。抗原の調製は簡単になる。

すなわち、本発明は、（ｉ）抗体が結合できる抗原性配
列を提供する第１の組換えペプチドを固定化した固相を
試験サンプルと接触させ、（ｉｉ）上記抗原性配列を提
供し、標識されていて、かつ第１の組換えペプチドを発
現させた生物と属が異なる生物内で発現させた第２の組
換えペプチドを固相に接触させ、ついで（ｉｉｉ）試験
サンプルが上記抗体を含むか否かを決定する各工程から
なる抗体のイムノアッセイを提供するものである。

この方法により任意の抗体が検定できる。組換えペプチ
ドはいずれも同じ抗体結合部位をもつものでなければな
らない。検出は、抗体が少なくとも２個の抗原結合部位
をもつという事実によっている。ＩｑＧ、ＩＣＩＡおよ
びＩＱＥは２個、ＩｇＭは５個の抗原結合部位をもって
いる。

ＪＯＧを例にとれば、抗原結合部位のひとつが固相上に
固定化された第１の組換えペプチドに結合する。標識さ
れた第２の組換えペプチドはＪｑＧの第２の抗原結合部
位と結合する。

組換えペプチドは異なる属の生物内に組込まれる。両生
物は異なる科に属するものであることが好ましい。たと
えば、別の細菌性発現系を使用することができる。また
、一方の抗原を細菌性発現系にクローニングし、他方は
酵母、または昆虫もしくは哺乳動物細胞にクローニング
する。一方の抗原を原核生物に、他方の抗原を真核生物
システムにクローニングすることがとくに好ましい。ク
ローニングに適当な宿主としては、枯草菌、大腸菌、放
線菌、昆虫−細胞、酵母および哺乳動物細胞を挙げるこ
とができる。ペプチドを昆虫細胞および哺乳動物細胞中
で発現させる場合、それぞれバキュロウィルス発現系お
よびワクシニアウィルス発現系の利用が、好ましい真核
生物の別の使用法となる。原核生物宿主としては大腸菌
が好ましい。

第１および第２の両ペプチドは構造が同一である必要は
ない。一方が他方より長いことも許される。しかしなが
ら、両者とも、検出を所望の抗体が結合できる抗原性配
列を提供するものでな【プればならない。換言すれば、
それぞれが同じ抗体結合部位をもたねばならない。本明
細書においては、ペプチドの語は蛋白質を包含する。

第２の組換えペプチドには適当な任意の標識を付着させ
ることができる。標識は酵素でも、放射性同位元素でも
、また、比色もしくは蛍光法にＪ：る測定を可能にする
他の試薬でもよい。好ましい標識はアルカリホスファタ
ーゼである。標識を用いて循環増幅反応を開始させるこ
とができる。アルカリホスファターゼは基質、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェ−１〜（ＮＡＤ
Ｐ）と反応し、二］チンアミドアデニンジヌクレオヂド
（ＮＡＤ＞を生成する。ＮＡＤはアルコールデヒドロゲ
ナーゼ、ジアフオラーゼおよび着色生成物を導くヨード
ニトロテトラゾリウムの関与する循環反に利用される。

このイムノアッセイは、サンプル中のＨＩＶ抗体、とく
にｌ」Ｉ　Ｖ　−１抗体の存在の検定に使用するのにと
くに適当である。異なる起原のクローン化ＨＩＶ抗原を
準備する。抗原はｇａｇおよび／またはｅｎｖ配列でも
よい。ｌ−１１Ｖ　−１はとくに＝　１０− ２種の抗体を誘発する。Ｊなわち、ｑａｑ蛋白質に対す
る抗−ＩＩ）２４どｅｎｖ蛋白質に対する抗−ｇ＋）　
４．１である。

好ましいｇａｇ配列はアミノ酸１２１〜３５６に相当す
る。これはｐ２４の全配列を組込む。好ましいｅｎｖ配
列はアミノＭ５４２〜６７４に相当する。この０ｐ４１
配列の利点は、それが半溶解であること、およびｅｎｖ
遺伝子の主要なエビ１〜−ブを包含することである。番
号はＨｅｕｓｉｎＱら（Ｎａｔｕｒｅ、　３１３　：　
４５０〜４５８．１９８５）によるものである。

各配列はβ−ガラク１〜シダーゼ（β−ｇａｌ）に融合
しているが好ましい。これは、抗−ガラク１〜シダーゼ
アフイニティー力ラムまたは基質カラムを使用したアフ
ィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする
。また、両配列をたがいに融合して、（Ｊ　ａ　Ｑ　／
　ｅ　ｎ　ｖ融合蛋白質としてもよい。ｇａｑもしくは
ｅｎｖ蛋白質または両者に対して早期血清変換を行って
もない。すなわち、第一および第二の組換えペプチドは
ｇａｇおよびｅｎｖ両配列配列供することが望ましい。

これを達成するには、Ｃ１ａｎ／β−ｇａｌおよびｅｎ
ｖ／β−ｇａｌ融合蛋白質を使っても、またＱａｇ／ｅ
ｎ融合蛋白質をそのまま使ってもよい。

好ましいｇａｇ／ｅｎｖ融合蛋白質は配列二を有する蛋
白質、またはその１個もしくは２個以上のアミノ酸の置
換、挿入および／もしくは欠失、ならびに／または一方
の末端もしくは両末端の延長によって修飾された蛋白質
くただし、修飾配列を有する蛋白質も抗−ｐ２４および
抗−ｇｐ４．１の両者と結合可能であって、修飾および
非修飾配列問の小モロジーは少なくとも７５％である）
である。

非修飾配列は基本的に、ｌ−１１Ｖ　−１のＣＥＩ−１
単離体のｐ２４とＱｐ４１蛋白質の部分の融合体である
（Ｗ０８６１０４４２３）。これらの部分は、それぞれ
アミノ酸１２１〜３５６および５／１２〜６７４に相当
する。これらの部分の開始点は上に示したように、それ
ぞれアミノ酸１７および２４４である。上記アミノ酸５
〜１６は１）１８蛋白質から誘導される。上記アミノ酸
１〜４．２４１〜２４３および３７７〜３７９は、融合
構築体が１９られたベクターおよびＤＮＡ操作に由来す
るものである。

この配列は１個または２個以上のアミノ酸の置換、挿入
および／または欠失によって修飾されてもよい。これら
は配列のどこに起こってもよいが、とくにｐ２４および
０ｐ４１蛋白質に由来しない配列部分に行われる。置換
の場合、非修飾配列の１個または２個以上のアミノ酸が
、配列の物理化学的性質すなわち電荷密度、親水性／疎
水性、サイズおよび］ンフイギュレーションを維持する
１個または２個以上の他のアミノ酸で置換することがで
きる。たとえば、３ｅｒをＴｈｒにもしくはその逆、Ｇ
ｌｕをＡＳＤにもしくはその逆、ＧｌｎをＡＳｎにもし
くはその逆の置換を行うことができる。アミノ酸１０の
３ｅｒ残基はＡＳｎに置換できる。

配列を一方の末端でまたは両末端で延長することもでき
る。これは付加的カルボキシ末端Ｃｙｓ残基ではないこ
とが条件になる。しかしながら、配列は一方の末端また
は両末端に５０アミノ酸残基まで延長できる。４０個ま
でのアミノ酸、たとえば２０個までのアミノ酸を、非修
飾配列のアミノ酸末端および／またはカルボキシ末端に
付加できる。しかしながら、アミン末端アミノ酸は、そ
こから蛋白質が発現する核酸配列の翻訳開始］トンであ
るため、通常Ｍｅｔである。蛋白質が発現しない場合に
は、これをそのアミノ末端で担体蛋白質に融合し、融合
蛋白質を切断して本発明の蛋白質を遊離させる。

配列は、非修飾蛋白質をコードするＤＮＡ配ＪＩＪに相
当する変化を導入することによって修飾できる。これは
、エンドヌクレアーゼによる配列の制限、リンカ−の挿
入、■キソヌクレオーゼおよび／またはポリメラーゼの
使用ならびに特定部位の突然変異等を包含する適当な任
意の技術により達成できる。修飾されたＤＮＡが、抗−
ｐ２４および抗ｇｐ４１の両者を結合できる修飾蛋白質
をコードしているか否かは容易に決定できる。修飾され
た配列を適当なプラスミド中にクローニングし、このプ
ラスミドで宿主細胞を形質転換し、発現された蛋白質に
ついて抗−１）２４および抗−ｇｐ４１の結合能を調べ
る。また、修飾および非修飾蛋白質のアミノ酸配列間に
は少なくとも７５％だとえば８５％もしくはそれ以上ま
たは９０％もしくはそれ以上の小モロジーがなければな
らない。

融合蛋白質ｑａｑ／β−ｇａｌ、ｅｎＶ／β−ｇａｌお
よびＯａＱ／ｅｎｖは、大腸菌形質転換体で発現させる
ことができる。このようなｑａｇ／β−ｇａｌおよびｅ
ｎｖ／β−ｇａｌ融合蛋白質、まだＱａＱ／ｅｎｖ融合
蛋白質は、サンドインチの一方の側に置くことができる
。標識され、第２の組換えペプチドとするのは、これら
の融合蛋白質が好ましい。

サンドイッチの他の側に置＜ａａａおよびｅｎｖ抗原の
起原としては、任意の適当な発現システムを使用するこ
とができる。しかしながら、ポリヘトリン遺伝子の抗原
性Ωａｇおよび／またはｅｎｖ配列をコードするＤＮＡ
による挿入または置換を行ったバキュロウィルス発現系
を用いるのが好ましい。組換えペプチドは昆虫細胞内で
発現させる。宿主は通常、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒ
ｕｇｉ　ｅｒｄａである。少なくともアミノ酸５４２〜
６７４を組込んだより大きなｅｎｖ配列、たとえばアミ
ノ酸２４〜７５０に相当するｅｎｖ配列を発現させるこ
ともできる。バキュロウィルス発現系を用いてクローン
化されるペプチドは、固相に固定化するペプチドとして
好ましい。　　・ イムノアッセイの実施に際しては、第１の組換えペプチ
ドを固相に固定化する。固相はポリスチレンビーズ、プ
ラスチックマイクロウェル等であってよい。ペプチドは
固相上に吸着させるかまたは抗体によって固相に結合さ
せる。次に、試験サンプルを固相に接触させる。任意の
適当な生理的液体のサンプル、たとえば尿、血漿または
血清から試験サンプルが調製できる。固相に固定化した
ペプチドに特異的な、試験サンプル中の抗体がペプチド
に結合する。ペプチドをクローニングした宿主に由来す
る夾雑物質に特異的な、試験サンプル中の抗体も、この
夾雑物質に結合する可能性がある。

標識された第２の組換えペプチドも固相に接触さける。

これは、固相を試験サンプルに接触させたのちに行われ
る。別法として、この２工程を同時に行うこともできる
。第１のペプチドに結合する試験サンプル中の抗体は、
標識された第２のペプチドにも結合し、したがって検出
される。第１のペプチドに会合した宿主由来の夾雑物質
に結合した抗体は、第２のペプチドと会合した標識され
た宿主由来の夾雑物質には結合しないし、またその逆も
同様である。したがって、偽陽性の問題は回避される。

イムノアッセイは定性的に行うことができる。

すなわち、試験サンプル中の特定の抗体の存在または不
存在を単に検出する７ｊめに実施することができる。ま
た、定量的または半量的に実施し、サンプル中に存在す
る抗体の量の測定を行うこともできる。

このイムノアッセイに使用する材料は試験キットとして
提供することもできる。このような試験キットは通常、
（１）抗体が結合できる抗原性配列を提供する第１の組
換えペプチドを固定化した固相、および（ｉｉ）上記抗
原性配列を提供し、標識され、かつ第１の組換えペプチ
ドを発現させた生物と異なる属の生物中で発現された第
２の絹換えペプチドから構成されている。

キットにはまた、標識が酵素の場合、標識の基質が包含
される。さらに、洗浄液や対照を加えてもよい。また、
キットには、本イムノアッセイと一緒に、第２のイムノ
アッセイを実施するための材料を含有させてもよい。第
２のイムノアッセイは別の抗体についてのものであって
もよく、その場合は同様の方式で実施することができる
。

第２のイムノアッセイが、試験サンプル中に特定の抗原
も含まれるか否かを決定することを目的としている場合
には、さらにその抗原に結合できる第１の抗体を固相上
に固定化してもよい。第１の抗体に結合した抗原を検出
するための標識された第２の抗体も準備される。各抗体
はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。２種の
抗体は、抗原の異なる部位に結合するものであってもよ
い。

抗体が重合性の場合には、抗体は同じ部位に結合するこ
とができる。標識された第２の抗体は試験サンプルと同
時にまたは試験サンプルの後で、固相に接触させる。標
識は第二の組換えペプチドの場合と同じである。必要な
ことは、試験サンプルが試験すべき抗体および／または
抗原を含有するかどうかの指示である。

すなわち、ＨＩＶ抗体とくにＨＩＶ−１抗体とＢ型肝炎
表面抗原（ＨＢｓＡＱ）、両者のイムノアッセイを提供
することができる。ｌ−１１Ｖ抗体の検定はすでに述べ
た抗原を使用して実施できる。

１−Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ　ｇに対する２種の具なる抗体はＨ
Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｑの検定に使用できる。両抗体はこの抗原
の異なる部位にそれぞれ反応する。各抗体はモノクロー
ナルでもポリクローナルでもよい。固相を試験サンプル
および標識第２抗体と同時に接触させることができるよ
うに、各抗体はモノクロナールであることが好ましい。

この場合も、ＨＩＶ抗体の検出に用いる第２の組換えペ
プチド上の標識と第２のＨＢＳＡＱ特異性抗体上の標識
とは同一であることが好ましい。

１−１　Ｔ　Ｖ抗体に対するイムノアッセイは、予後診
断試験として使用することができる。ｌ−Ｉ　Ｉ　Ｖに
感染したｍ者は、ＡＩＤＳ症状のない初期には、かなり
一定な高力価の抗−ｐ２４抗体を有する。−方、抗−ｐ
２４抗体の低力価もしくは力価の低下は臨床的進行と有
意に関連し、ＡＩＤＳまたは△ＩＤｓＩＤ症候群（ＡＲ
Ｃ）の発症を示唆するも（Ｄ　Ｔ−アル。（Ｗｅｂｅｒ
　ホか：　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃ員、１９８７年１月１７日
）。したがって、予後診断を行うには、患者の抗−ｐ２
４抗体力価を長期にわたって追跡する必要がある。イム
ノアッセイは異なる生物から得られたクローン化ｐ２４
ペプチドを用いて実施することができる。好ましいペプ
チドは」−述のＩ）２４構築体である。抗−ｐ２４抗体
力価が低下したときは予後不良の徴候と考えることがで
きる。

本発明はまた、融合構築体、その製造方法、ならびにそ
の抗１−１１　Ｖ　−１抗体の検定におけるおよびワク
チンとしての使用に関する。

抗−ＨＩ　Ｖ−１抗体には、様々な検定法が提案されて
さた。しかしながら、それらは偽陽性または偽陰性の問
題を生じることがある。１」Ｉ　Ｖ−１はとくに２種の
抗体を誘発する。これらは０８ｇ蛋白質に対する抗−１
）２４とｅｎｖ蛋白質に対する抗−〇　〇　４．１であ
る。本発明においては、抗−１）２４および抗＝ｇｐ／
１．１の両者に結合する構築体が提供される。これは偽
陽性および偽陰性結果の危険を伴わず、正確かつ高感度
の検定の実施を可能にする。

したがって、本発明は、配列： 一　　２５　− 一　　２６　− を有する蛋白質、またはその１個もしくは２個以上のア
ミノ酸の置換、挿入および／もしくは欠失、ならびに／
または一方の末端もしくは両末端の延長によって修飾さ
れた蛋白質（ただし、修飾配列を有する蛋白質も抗−ｐ
２４および抗−ｇｐ４１の両者と結合可能であって、修
飾および非修飾配列問のホモロジーは少なくとも７５％
である）を提供づ−るものである。

非修飾配列は基本的に、ＨＩ　Ｖ−１のＣＥＬ−１単離
体のｐ２４とｇｐ４１蛋白質の部分の融合体である（Ｗ
０８６１０４１２３）。これらの部分は、それぞれアミ
ノ酸１２１〜３５６および５４２〜６７４に相当する。

これらの部分の開始点は上に示したように、それぞれア
ミノ１１１７および２４４である。上記アミノ酸５〜１
６は１）１８蛋白質から誘導される。上記アミノ酸１〜
４．２４１〜２４３および３７７〜３７９は、融合構築
体が得られたベクターおよびＤＮＡ操作に由来するもの
である。

この配列は１個または２個以上のアミノ酸の置換、挿入
および／または欠失によって修飾されてもよい。これら
は配列のどこに起こってもよいが、とくにＦ）２４およ
びｇｐ４１蛋白質に由来しない配列部分に行われる。置
換の場合、非修飾配列の１個または２個以上のアミノ酸
が、配列の物理化学的性質すなわち電荷密度、親木性／
疎水性、サイズおよびコンフィギユレーションを維持す
る１個または２個以上の他のアミノ酸で置換することが
できる。たとえば、ＳｅｐをＴｈｒにもしくはその逆、
ＧｌｕをＡＳＤにもしくはその逆、ＧｌｎをＡｓｎにも
しくはその逆の置換を行うことができる。アミノ酸１０
のｓｅｒ残基はＡＳｎに置換できる。

配列を一方の末端でまたは両末端で延長することもでき
る。これは付加的カルボキシ末端ＣｙＳ残基ではないこ
とが条件になる。しかしながら、配列は一方の末端また
は両末端に５０アミノ酸残基まで延長できる。４０個ま
でのアミノ酸、たとえば２０個までのアミノ酸を、非修
飾配列のアミノ酸末端および／またはカルボキシ末端に
付加できる。しかしながら、アミン末端アミノ酸は、そ
こから蛋白質が発現する核酸配列の翻訳開始コドンであ
るため、通常１ｙｌｅｔである。蛋白質が発現しない場
合には、これをそのアミン末端で担体蛋白質に融合し、
融合蛋白質を切断して本発明の蛋白質を遊離させる。

配列は、非修飾蛋白質をコードするＤＮＡ配列に相当す
る変化を導入することによって修飾できる。これは、エ
ンドヌクレアーゼによる配列の制限、リンカ−の挿入、
エンドヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼの使用
ならびに特定部位の突然変異等を包含する適当な任意の
技術により達成できる。修飾されたＤＮＡが、抗−ｐ２
４および抗ｇｐ　４１の両者を結合できる修飾蛋白質を
コードしているか否かは容易に決定できる。修飾された
配列を適当なプラスミド中にクローニングし、このプラ
スミドで宿主細胞を形質転換し、発現された蛋白質につ
いて抗−ｐ２４および抗−０ｐ４１の結合能を調べる。

また、修飾および非修飾蛋白質のアミノ酸配列間には少
なくとも７５％、たとえば８５％もしくはそれ以上また
は９０％もしくはそれ以上のホモロジーがなければなら
ない。

本発明の蛋白質は、（ｉ）この蛋白質をコードする遺伝
子を組込み、宿主細胞内でこの蛋白質を発現できるベク
ターにより宿主細胞を形質転換し、（ｉｉ）形質転換宿
主細胞を培養して蛋白質を発現させ、ついで（ｉｆｆ）
蛋白質を回収することからなる方法によって製造される
。

この蛋白質をコードする遺伝子は、ｐ２４のアミノ酸残
基をコードするＤＮＡ配列を組込んだアミン末端部分と
、Ｃ１１）４１アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を
組込んだカルボキシ末端部分の２部分に構築されること
が好ましい。ついで、この２部分を一緒に融合し、発現
ベクター内に挿入する。この遺伝子には適当な転写調節
配列および翻訳開始、停止］トンが与えられる。遺伝子
はＡＴＧコドンに対して正しい読み取り枠で、プロモー
ターの制御下に発現ベクター内に挿入される。

任意の発現ベクター、たとえばプラスミド、または組換
えバキュロウィルスもしくはワクシニア−３０＝ ウィルスのようなウィルスベクターが使用できる。

この発現ベクターで形質転換される宿主は真核生物ま１
＝は原核生物で、たとえば単細胞微生物または昭１乳動
物細胞である。単細胞原核生物宿主としては、ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。

ｓ、　ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＳ、　ｐｏｍｂ
ｅを挙げることができる。細菌、たとえば大腸菌、枯草
菌またはＢ、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは原核生物宿
主として使用できる。大腸菌が好ましい。形質転換され
た細胞を培養し、発現した蛋白質を回収する。

本発明の蛋白質は、抗−ＨＩＶ−１抗体とくに抗−ＩＩ
）２４および／または抗−ｇｐ４１の検定に使用できる
。検定には任意の適当な生理学的液体たとえば尿、血漿
、血液または血清の試験サンプルを使用できる。検定方
法は、試験サンプルを本発明の蛋白質と接触させ、抗−
ｐ２４および／または杭−Ｑｐ４１がこの蛋白と結合し
たかどうかを決定することからなる。この目的には、本
発明の蛋白質と、試験サンプル中に存在する可能性があ
る抗−ρ２４および／または抗−Ｃｌｐ４１がこの蛋白
質と結合するかどうかを決定するための手段からなる試
験キットを提供することもできる。

様々なアッセイフォーマットを採用することができる。

蛋白質は、抗−ｐ２４および／または抗−Ｑｌ）４１を
溶液から選択的に捕捉するように、すでに捕捉された抗
−Ｄ２４および／または抗−ｑｐ４１を選択的に標識す
るように、あるいは捕捉と標識の両者を行うように使用
できる。また、蛋白質は、蛋白質と反応する抗体が相分
離をすることなく溶液中で検出される様々な均一アッセ
イフォーマットに使用することもできる。この蛋白質は
ＨＩＶ−１抗原の検出にも使用できる。

蛋白質が溶液から抗体を捕捉するために用いられるタイ
プの検定では、固相への蛋白質の固定化が行われる。こ
の表面は何らかの方法で洗浄できる必要がある。使用で
きる表面としては、各種のポリマー（成型されたマイク
ロタイターウェル、ビーズ、各種のデイツプスティック
、吸引チップ、電極おにび光学デバイス）、粒子（たと
えばラテックス、安定化血液、細菌もしくは黴の細胞、
胞子、金もしくは他の金属のゾルおよび蛋白性コロ４１
４２粒子径ｔま通常０．１〜５ミクロン）、膜（たとえ
ばニトロセルロース、濾紙、セルロースアセテート、有
機もしくは無機材料の多孔性／高表面積膜）がある。

表面への蛋白質の付着は、界面活性剤、溶媒、塩、カ第
１・ロピックイオンを含有していてもよい至適組成の溶
液から受動吸着（その疎水性に基づく場合が理想的であ
る）により、または能動化学結合により行われる。能動
結合は、表面に付着している様々な反応性もしくは活性
化可能官能基を介して行われる（たとえば、縮合剤：活
性化エステル；ハライド、無水物；アミノ、ヒドロキシ
ルもしくはカルボキシル ルボニル基；ジアゾ基；不飽和基）。また、能動結合は
、伯の蛋白質（それ自体は表面に受能的にまたは能動結
合で付着している）、たとえば蛋白質にＪ：って提供さ
れるエピトープのいずれかまたはづ゛べてに対するポリ
クロナールまたはモノクロナール抗体を介する結合、あ
るいは、蛋白質に任意の様々な様式で結合し、その等電
点、電荷、親水性またはその他の物理学的性質による利
点を付与する担体蛋白質たとえばアルブミンもしくはカ
ゼインを介する結合であってもよい。蛋白質はまた、反
応混合物たとえば免疫沈降物の電気泳動分離後の表面（
通常は膜であるが必ずしもその必要はない）に付着して
いてもよい。

蛋白質を有する表面を問題の抗体を含有する溶液と反応
させ、必要に応じて任意の各種手段（洗浄、遠心分離、
濾過、磁化、毛細管作用）で過剰のサンプルを除去した
のち、捕捉した抗体を検出可能なシグナルを与える任意
の手段で検出する。

たとえば、これは、捕捉された抗体と反応する上述の標
識分子または粒子の使用によって達成される（たとえば
、プロティンＡまたはＧ蛋白質等；抗一種もしくは抗−
免疫グロブリン亜型；リウマトイド因子；蛋白質に含有
され、競合もしくは遮断様式で使用される任意のエピト
ープに対する抗体；または蛋白質自体ならびにＨＩＶ−
１から直接もしくは間接的に誘導される他の蛋白質およ
びペブヂドを包含する蛋白質のエピトープを含む分子）
。

検出可能なシグナルは、関係する分子を直接、たとえば
染料、放射性標識、電子活性種、磁気共鳴種もしくは蛍
光団で標識することにより得られる光学的もしくは放射
性またはその他の物理化学的シグナル、また分子もしく
は粒子の測定可能な任意の種類の変化を生成することが
できる酵素自体による間接的標識によって得られるシグ
ナルであってよい、また関係する表面が粒子である場合
には、シグナルはたとえば、凝集、回折効果または複屈
折効果によるものであってもよい。

すでに捕捉されている抗体を標識するために蛋白質を使
用するタイプの検定では、蛋白質を検出可能にするある
形式の標識が必要である。標識は、直接の化学的または
受働的付着、たとえば、蛋白質への放射性、磁気共鳴、
粒または酵素標識でもよく、また間接的に、それ自体蛋
白質と反応する分子、たとえば蛋白質の任意のエビ１〜
−プに対重る抗体に任意の形の標識を付着させ、ついで
標識分子を蛋白質と反応させて得られる標識であっても
よい。蛋白質に標識を結合させる化学的方法は、蛋白質
にすでに存在するアミンもしくはスルフヒドリル基を介
して直接行う方法、またはマレイミドのような挿入基を
介して行う方法がある。抗体の捕捉は既述の任意の表面
に、任意の試薬を用い、受動または活性化吸着によって
行われ、特異的抗体または免疫複合体の結合が生じる。

とくに抗体の捕捉には、抗一種もしくは抗−免疫グロブ
リン亜型、リウマ１〜イド因子、プロティンＡ、Ｇ等、
または上述の蛋白質の任意のエピトープを含有する分子
が使用される。

サンプル中のｌ」■■−１抗原を測定するために蛋白質
を使用する検定では、蛋白質を上述の任意の方法で標識
し、上に例示した任意の表面上におｔプる特異的分子に
よるその結合が４ノーンプル中の抗原によって妨害され
る競合的結合様式、またはサンプル中の抗原が上述の任
意の表面に特異的もしくは非特異的に結合する場合には
引き続いて特異的な２価もしくは多価分子（たとえば抗
体）が結合し、その分子の残りの結合価が標識蛋白質の
捕捉に用いられる非競合的様式のいずれかが用いられる
。

一般に均一検定法においては、蛋白質と抗体を標識させ
、自由な溶液中で抗体が蛋白質と反応する場合、２種の
標識が相互作用してたとえば一方の標識によって捕捉さ
れたエネルギーの他の標識への非放散性転位を起こさせ
、励起した第２の標識または消失した第１の標識を適当
に検出することができる（たとえば蛍光、磁気共鳴、酸
素測定）。サンプル中の抗原または抗体が添加されると
、標識された対の相互作用が制限され、検出器にｄ３け
るシグナルのレベルが変化する。

本発明の蛋白質は、抗−ｐ２４または抗−ｇｐ４１のサ
ンドイッチイムノアッセイに使用できる。

この場合、同じ抗原性配列を提供するが別の生物内で発
現された組換え抗原をサンドイッチの各側に配置する。

抗原のクローニングに最も一般的な発現系は、抗原を大
胆菌内で発現させる系である。

しかしながら、大腸菌は腸内菌叢のきわ立った部分を占
めている。したがって、ヒトの血清は大腸菌に対する抗
体を含む場合が多い。大腸菌内で生成させた抗原を抗体
のサンドイッチイムノアッセイに使用すると、一部の固
体は夾雑する細菌性物質と反応する可能性がある。この
ような反応は、特定の固体において偽陽性の結果を与え
ることがある。このような種類の偽陽性は、大腸菌から
の物質を試験サンプルと混合することによって最小限に
抑えることができる。

本発明者らは、夾雑物質に対する抗体による偽陽性の問
題を克服する新しい方法を発明した。基本的には、免疫
学的に同一の抗原を異なる生物内に組込むものである。

すなわち、異なる生物からのクローン化抗原をサンドイ
ッチの各側に配する。

試験サンプル中の検出を望まない抗体は、クローン化抗
原の一方に会合した夾雑物質と結合することはあっても
、起源が異なるので両クローン化抗原と会合した夾雑物
質と結合することはない。このようにして、偽陽性の問
題は回避できる。確実に夾雑物質を完全に含まないよう
にクローン化抗原を調製する必要がなくなることはきわ
めて重要である。アッセイの特異性は著しく改善される
。

抗原の調製は簡単になる。

このフォーマツ１〜におりる抗−ｐ２４および／または
抗−ｑｐ４１抗体のイムノアッセイは、基本的には、（
ｉ）抗体が結合できる抗原性配列を提供する第１０組換
えペプチドを固定化した固相を試験ザンブルと接触させ
、（ｉｉ）上記抗原性配列を提供し、標識されていて、
かつ第１０組換えペプチドを発現させた生物と異なる生
物内で発現させた第２の組換えペプチドを固相に接触さ
せ、ついで（ｉｉｉｌ試験（ノンプルが上記抗体を含む
か否かを決定する各工程からなる。

第１の組換えペプチドおよび／または第２の組換えペプ
チドは、本発明の組換え蛋白質である。

第１および第２の両組換えペプチドは構造が同一である
必要はない。たとえば、一方が他方より長いことも許さ
れる。しかしながら両者とも、検出を所望の抗−ｐ２４
および／または抗−ｑｐ４１に結合できる抗原性配列を
提供するものでなければならない。換言すれば、それぞ
れは同じ抗体結合部位をもたねばならない。

したがって、本発明の異なる配列を有する２種の組換え
蛋白質または本発明の同一の配列を有する２種の組換え
蛋白質が使用できる。また、一方の組換えペプチドのみ
が本発明の蛋白質である場合もある。しかしながら、こ
の場合、他のペプチドと本発明の組換え蛋白質は共通の
エピトープをもっていなければならない。

抗−ｐ２４および／またば抗−ｇ￥：＋４１の検出は、
抗体が少なくとも２個の抗原結合部位をもつという事実
によっている。ＩｇＧ、ＩＣＩＡおよびＩＱＥは２個、
ＩＱＭは５個の抗原結合部位をもっている。ＩｑＧを例
にとれば、抗原結合部位のひとつが固相上に固定化され
た第１０粗換えペプチドに結合する。標識された第２の
組換えペプチドはＩｇＧの第２の抗原結合部位と結合す
る。

このアッセイフォーマットにおける組換えペプチドは、
異なる生物内で操作される。両生物は少なくとも属が異
なることが好ましい。両生物は科が異なることがさらに
好ましい。たとえば、異なる細菌性発現系が使用できる
。また、一方の抗原を細菌性発現系にクローニングし、
他方は酵母または昆虫もしくは哺乳動物細胞にクローニ
ングすることもできる。一方の抗原を原核生物に他方を
真核生物システムにクローニングすることがとくに好ま
しい。クローニングに適当な宿主の例には、枯草菌、大
腸菌、放線菌、昆虫細胞、酵母および哺乳動物細胞が包
含される。ペプチドを昆虫細胞または吐乳動物細胞中で
発現させる場合、それぞれバキュロウィルスまたはワク
シニアウィルスの発現系の利用が、好ましい真核生物の
別の利用法である。原核生物宿主としては大腸菌が好ま
しい。

本発明の蛋白質はまた、Ｉ」ＩＶ−１に対するワクチン
としても使用できる。この目的では、蛋白質を医薬的に
許容される担体または希釈剤とともに医薬組成物に処方
することができる。蛋白質は注射用製剤として提供する
ことができる。適当な希釈剤としては、注射用精製水お
よび等張性食塩溶液がある。この組成物は、非経口的に
、たとえ−４１＝ ば静脈内、筋肉内または皮下に投与される。ヒトに有効
量を投与する。通常、１０〜２００μｑの用量を非経口
的に投与する。

次に本発明を以下の実施例により、さらに詳細に説明す
る。

添付図面において、第１図は、例１において１）ＤＭ３
２２中に組込まれた好ましいｅｎｖ配列を示す。第２図
は、例１においてｐＤＭ６１４中に組込まれた好ましい
ｇａｑ配列を示す。第３図は、例１のＱａＱ／ｅｎＶ蛋
白質のＤＮＡ配列を示す。ベクター配列はボルト体で示
しである。第４図は、例３におけるＤＦＯ日Ｃの禍築を
示す図である。第５図は、シャトルベクター １）ＶＦＯＨＣ；を示す。この配列はＦＭＤＶＶＰｌ　
　１４２〜１６０配列と真正のＨＢプレ］ア配列の６個
のアミノ酸で分離された２個のインフェース間始］トン
を含有する。第６図は、例３のサンドイッチＥＬＩＳＡ
の結果を示す。第７図は、例３で行られたコア反応性物
質の蔗糖勾配像を示す。

＝　４２− 例１　大腸菌発現構築体 ラムダＱ　ｔ　１０　（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第１
巻、Ｄ。

Ｈ，ＧＩＯＶｅｒ編、ＩＲＩ　　Ｐｒｅｓｓ　、　１９
８５）ＣＤＮＡライブラリーを標準方法（Ｈ０１６ｃｕ
ｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ、　Ｈａｎｉａｔｉｓはが著、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、１９
８２）によって１−１１１−１１Ｖ（ＣＢの英国単離体
で感染させたＯＥＭ細胞のポリ（Ａ”　）−ＲＮＡから
構造した。ＣｃＲＦ−ＣＦＭと命名された白血病Ｔ−細
胞はＣＢＩ　−１に係留され、Ｆ　ＣＡ　ＣＣ、Ｐｏｒ
ｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　Ｇ、　Ｂ　ニ１９８５年１月１１
日、寄託番号第８５０１１１０１号として寄託されてい
る。

全エンベロープ遺伝子を含むラムダ組換え体を同定し、
ＥＣ０ＲＩ挿入フラグメントをプラスミドベクターｐｕ
ｃｓにサブクローニングしてプラスミドｐＤＰ４を製造
した。ｐＤＰ４内のエンベロープ遺伝子の正確な位置は
、制限酵素解析および部分ＤＮＡ配列決定後発表されて
いるデータと比較して決定した（Ｈｅｕｓｉｎｇほか：
　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３：４５０〜４．５８．１９８
５　：　１４ａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　ホか：　Ｃｅ１ｌ
、　４０　：　９〜１７．１９８５　；　５ａｎｃｈｅ
ｚ−ｐｅｓｃａｄｏｒら：５ｃｉｅｎｃｅ　、　　２２
７　：４８４〜４９２．１９８５）　　。

本発明者らは、ＨＩＶゲノムの部分を、ｌ　ａｃＺ遺伝
子に対する融合フラグメントにより大腸菌に発現させた
。選択された発現ベクターはｐ　Ｘ　Ｙ　４６０であっ
た。これは、読み取り枠ベクターで、強力なｔａｃプロ
モーターは、開始ＡＴＧとβ−ガラクトシダーゼの暗号
配列が、フレーム外になっている突然変異ｌ　ａｃＺ遺
伝子に由来する。このベクターはｐＸＹ４１０から誘導
される（Ｗｉｎｔｅｒら：Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、１３
６　：　１８３５〜１８４０，１９８６）。１ａｃＺ３
！伝子の開始部分に［：ｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢ　
ａ　ｍ　ｌ−１■の制限部位がある。ここに挿入された
ＤＮＡフラグメンｌ〜は読み取り枠を元戻りにできれば
、挿入体がコードする配列にβ−ガラク１〜シダーゼの
付着した融合蛋白質が産生される。

ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　　Ｂｃ１ｍＨ工大腸菌
ＨＢＩＯＩ内に係留したベクターｐＸＹ４６０はＮｃＩ
ＭＢ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＧＢに１９８８年７月２６日
、登録番号ＮＣｌ８４００３９号として寄託されている
。

ａ）エンベロープ アミノ酸５４２〜６７４をコードするＨＩＶ−１ｅｎ■
遺伝子の領域をｐＸＹ４６０中に次の方法でクローン化
した。ＢａｍＨＩ制限部位を含有するＤＮＡ配列を、そ
の遺伝子のヌクレオチド８２７６番目に挿入した。これ
により、２個のアミノ酸（Ｇｌｙ−Ａｓｐ）が６７４番
目に付加され、ｐＸＹ４６０ベクターとインフレームに
ＢａｍＨＩ部位が導入される。

７８７５番目の位置（アミノ酸５４１）には酵素Ｈａｅ
Ｉ［ｌの部位があり、これはＩ）ＸＹ４６０のＳｍａ■
部位とインフレームである。４０３　ｂｐのＨａｅＩ［
［／ＢａｍＨＩフラグメン］へをアガロースゲルスライ
スから溶出し、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＸＹ４６０
とリゲーションした。リゲーションしたＤＮＡで大腸菌
株ＴＧＩを形質転換し、組換え体をし−Ａｍｐ−Ｘｇａ
　ｌアガール板上、青色コロニーとして選択した。個々
の形質転換体を制限酵素消化で調べ、予想されたパター
ンのフラグメントを有する形質転換体をｐＤＭ３２２と
命名した。ｐＤＭ３２２に組込まれたｅｎｖ配列を第１
図に示す。

ｂ）Ｇａｑ（コア） アミノ酸１２１〜３５６をコードする１−ＩＩＶ−ｉ　
　ｇａｑ遺伝子の領域を次の方法でｐＸＹ４６０内にク
ローン化した。

ＱａＱ遺伝子内の１１８０番目（アミノ酸３５６）には
酵素Ｎｃ　ｉ　Ｉ　［ＣＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＧ）の制限部位
がある。

−４６＝ この酵素によって発生した５′オーバーハングをｄＣＴ
Ｐのみの存在下に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノ
ウフラグメントとインキュベーションして充填した。こ
の末端はｐＸＹ４６０の３ｍａＩ部位とインフレームに
なった。同様に４６８番目（アミノ酸１２１）のｐｖｕ
■部位は１）ＸＹ４６０内の３ｍａＩ部位とインフレー
ムなプラント末端を与えた。

Ａｌａ　Ａ　ｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ ＰｖｕＩＩ／Ｎｃ　ｉ　工（プラント末端）フラグメン
ト（７１０ｂｐ）をアガロース電気泳動、ゲルスライス
からの溶出によって精製し、３ｍａＩ消化、ホスファタ
ーゼ処理ｐＸＹ６４０とリゲーションさせた。このＤＮ
Ａで大腸菌株ＴＧ１を形質転換し、形質転換体をＬ−Ａ
ｒｒ＋ｐ−Ｘｑａ　ｌプレート上前色コロニーとして選
択した。個々の形質転換体を制限酵素消化によって調べ
、予想されたパターンのフラグメントを有する形質転換
体をｐＤＭ６１４と命名した。形質転換体はＡＩＤＳ患
者からの血清に対する免疫活性によっても調べた。

１）ＤＭ６１４内に組込まれたｐａｃｔ配列を第２図に
示す。

Ｃ）　　Ｇａ（ｉｔ／ｅｎＶ ｐＤＭ３２２およびｌ）ＤＭ６１４で個々に発現された
ＨＩＶ−１配列を、次の方法で合した。

１）ＤＭ６１４中、ｃｏａｃ＋挿入体の３′末端には、
充填したＮｃｉｌ：部位がＳｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ
　）の半分を与えるので、ＳｍａＩ部位が残っていた。

ｐＤＭ３２２のＥＣｏＲＩ部位を大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ■のフレノウフラグメントを用いて充填した場合、
生成したプラント末端ばＩ）ＤＭ６１４の３ｍａＩ部位
とインフレームになった。

プラスミドＤＭ３２２をＥＣ０ＲＩで消化し、充填し、
ついで３ａｍＨＩで消化し、生成した４１０ｂ１１フラ
グメントをゲル精製した。プラスミド１）ＤＭ６１４は
Ｓｍａ工と３ａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。２種の
フラグメントをたがいにリゲーションし、大腸菌ＴＧ１
に形質転換した。

Ｌ−Ａｍｐ−ＸＱａｌプレート上で選択した青色コロニ
ーを制限酵素消化で解析した。予想された消化フラグメ
ントのパターンを有する形質転換体をｐＤＭ６２４と命
名した。Ｉ）ＤＭ６２４からの１１２０ｂｐ　　ＥＣ０
ＲＩ／ＢａｎＨＩ７ラグメントも、１）ＸＹ４６０から
全ｌ　ａｃＺ遺伝子を欠失させ３　ａ　ｍ　ｔ−Ｉ　Ｉ
の次にインフレームな停止］トンを挿入して誘導したプ
ラスミド１）ＸＹ４６Ｘに移し、ｌ）ＤＭ６２６を作成
した。ｐＤＭ６２６のｇａｇ／ｅｎ■融合ＤＮＡ配列を
第３図に示す。

ｄ）抗原製造 組換え大腸菌株を選択メジウム（Ｌ−Ａｍｐまたはｌ−
−Ａｍｐ−Ｘｇ　ａ　ｌ　）上で平板培養し、単一のコ
ロニーを接種して一夜培養した（＜３００威）。これら
の種の一部を発酵槽中、大量のメジウム（３℃まで）に
加えた。培養物の生育を監視し、ｏＤ６ｏｏが２．０〜
２．５に達したとき、インデューサーＩＰＴＧ（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度
５μ９／ｄになるように加えた。細菌をさらに２〜４時
間生育させ、組換え蛋白質を誘導した。

細胞を遠心分離によって収穫し、緩衝液（２５ｍＨＴｒ
　ｉ　５−Ｃｊ！、　ｐＨ８，０，１ｍＨＥＤＴＡ。

０．２％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　　Ｐ　４０　）中に最終濃度
１０００Ｄ６ｏｏになるように再懸濁した。細胞から抽
出液を次の２法の一方で調製した。

（ｉ）　　再懸濁した細胞にリゾチームおよびＰＭＳＦ
をそれぞれ最終濃度１■／ｄおよび１ｍｍｏ　ｌになる
ように加え、−夜４℃でインキュベーションした。１ｖ
ｌＱｓｏ４　（２ｎｌＨ）とＤＮａｓｅＩ（４０μＣｊ
／ｄ）を加え、４℃でインキュベーションを続けた。さ
らにＰＭＳＦを加えて２ｎ＋Ｈとし、ＥＤＴＡを５１１
ＩＨに調整した。抽出液を１５．０００９で２０分間遠
心分離して澄明化した。上澄液を傾瀉し、−７０℃に保
持した。

（ｉｉ）　　再懸濁した細胞を、操作圧１２〜１５００
０　ｐＳｉでフレンチ−プレッシャーセルに通した。

分解液にＰ　Ｍ　Ｓ　ＦとＥＤＴＡをそれぞれ最終濃度
が２ｍＭおよび５ｍＭになるように加えた。抽出液を１
５．０ＯＯｙで２０分間遠心分離して澄明化した。上澄
液を傾瀉して一７０℃に保存した。プレッシャーセルの
通過を反復すると細胞からの抗原の放出を増大させるこ
とができる。

ｅｎｖ／β−ｇａｌおよびｑａｑ／β−ｇａｌ融合蛋白
質は、それらに組込んだβ−ガラクトシダーゼ酊素蛋白
質を使用したアフィニティークロマ１〜グラフイーによ
り、抗−ガラクトシダーゼアフィニティーカラム上また
は基質アフィニティーカラム上で精製した。この操作の
のちに、抗原はさらにサイズ排除カラムで精製すると分
析ゲル電気法ＩＪ＋により均一である。

ｇａｇ／ｅｎｖ融合蛋白質は分解細胞の不溶性分画から
、カオトロピック剤（尿素）で分画抽出することにより
精製し１：０３〜８Ｍの尿素に溶解した分画を、フェニ
ルセファロースカラム上、８Ｍ尿素で溶出するクロマト
グラフィーによってさらに精製した。総数率は、抗原活
性で７０％以上、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および
ウェスタンブロッティング後融合蛋白質として免疫学的
に反応するバンドの蛋白質の８０％以上であった。

例２．バキュロウィルス　環系 バキュロウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ核ポリへドロシスウィルス（ＡＣＮＰＶ）は、
有用なヘルパー非依存性真核生物発現ベクターとして開
発された（Ｒｏｈｒｎａｎｎ：　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、、６７：１４９９〜１５１３．１９８６　；に
ｕｒｏｄａほか；ＥＭＢＯＪ、　、旦：１３５９〜１３
６５．１９８６）。このベクターはウィルスのポリヘト
リン遺伝子の使用を可能にし、２つの魅力的な性質をも
っている。これは、ウィルスの生命ザイクルの後期に高
度に発現される。これは、ウィルスの生育を必要としな
い。異種遺伝子はポリヘトリン遺伝子内に、そのプロモ
ーターおよび他の調節要素の制御下に発現され、ポリヘ
トリン遺伝子自体は不活性化されるように導入される。

ＡＣＮＰＶのゲノムはきわめて大きく、直接のクローニ
ングには使用できない。代わりに転移ベクターを使用し
なければならない。転移ベクターはポリヘトリン遺伝子
と、大腸菌プラスミドたとえばｐｕｃｓにおける、遺伝
子内に導入された便利な制限部位をもつ隣接配列を含有
する。ＡＣＮＰＶでも感染させた昆虫細胞（たとえば５
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｑｉｐｅｒｄａ。

ＦＰ９）に転移ベクターを導入すると組換えを起こすこ
とができる。１％未満の頻度で生じる組換え体では、野
生型ポリヘトリン遺伝子が異種遺伝子を発現Ｊ−る配列
で置換されている。このようなウィルスはポリヘトリン
マイナスで、そのプラークの形態によって同定できる。

本発明者らは、この系で、ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白
質とｑａｇ／ｅｎｖ蛋白質を切端型として発現させた。

ａ）エンベロープ 位置６１９０における［）ｒａ■部位（＾＾■＾ＴＴ）
はＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子のＩＩＪｆ３点から６５ｂｐ
上流にある。この部位はベクターｐＵｃ９へのクロ−ニ
ングによりｐＤＮＡｌ　００を作成するとＢａｍ）ｌＩ
に変換された。

、、、　　ＴＡＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＧＡＣＡ　　
、、、、→ｒａ１ 、、、、ＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡ、、、、
、、。

ＢａｍＨＩ ｅｎｖ遺伝子内の位置８５０５にはＢａｍＨＩ部位があ
り、これがアミノ酸７５２における暗号配列の先端を切
る。

７５０　　ＢａｍＨＩ ｐＤＮＡｌｏｏからの２．３２ｋｂフラグメントを上述
のようにアガロースゲル電子泳動で精製し、いわゆるバ
キュロウィルス転移ベクターｐＡＣ３７３（にｕｒｏｄ
ａはか）とリゲーションし、大腸菌株ＨＢ１０１に形質
転換した。ポリへドリンプロモーターからの発現に正し
い方向でのｅｎｖ挿人体をもつ形質転換体を、制限酵素
マツピングで同定した。これを次に、ＡＣＮＰＸで感染
させたＳＰ９細胞にトランスフェクションした。ポリヘ
ドリンマイナスのウィルスを同定し、プラークを標準方
法で精製した（Ｓｕｍｅｒｓ　＆　Ｓｍ１ｔｈ：　”Ｍ
ａｎｕａｌ　ｆｏｒＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＰｒｏ
ｃｅｓｕｒｅｓ”　　、　　Ｔｅｘａｓ　　Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒｅ　　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　５ｔａ
ｔｉｏｎ、　１９８６　：　”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏρ
１ｃｓｉｎ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＩＩ
ＩＩＩＩＩＬＪＩＩＯＩＯ（ＩＶ”　、Ｎｏ、　１３１
、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ
　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、　１９８６年、Ｗ、Ｄ
ｏｅｒｆｌｅｒ　＆　Ｐ、Ｂｏｈｍ編、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｖｅｒｌａｇ刊）。

ｂ）Ｇａｑ／ｅｎｖ ｐＤＮＡ６２６の１１２０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／１３ａｍ
ＨＩフラグメントはｐＡＣ３７３ベクターを使用して直
接発現させることはできない。それ自身の開始ＡＴＧコ
ドンをもたないからである。

このフラグメントの５′末端におけるＥＣｏＲＩ部位を
、ＡＴＧを与えＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位をＢＣＩＩＩＩに
変換させる合成オリゴヌクレチドの添加によって修飾し
た。

５’　　　ＡＡＴＴＣＡＴ　ＡＧＡＴＣＴ　ＡＴＧ　　
３’ＱａＣ１／ｅｎＶ　　暗号配列はＢａｍＨ工消化ｐ
ＡＣ３７３にＢＣＩ　Ｉ　Ｉ［／ＢａｍＨＩフラグメン
トとしてクローン化し、上３爪のようにして組換えＡｃ
ＮＰＶを発生させた。

Ｃ）抗原の調製 ＳＰ９細胞の新鮮な培養液を、感染多重度１〜１０で組
換えＡｃＮＰＶにより感染させた。感染細胞を撹拌した
フラスコ内に２８℃で３６〜７２時間保持したのち、細
胞を収穫し、２〜５×１０７細胞／戒において１％　Ｎ
ｏｎ１ｄｅｔ　Ｎ　Ｐ　４０で分解し、抗原を放出させ
た。抗原を４℃において、１５，０００ｇで２０分間遠
心分離し、透明化した。上澄液を一７０℃に使用時まで
保存した。

抗原は、レンズ味豆レクチンのカラム上アフィニティー
クロマドグフィーで精製できる。この方式で調製した抗
原は１１１胞分解液から有意に精製されているが、分析
的に純粋ではない。

例３．　ワクシニアウィルス発現系 口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）の主要抗原エピトープがＢ
型肝炎コア抗原（ＨＢＣＡｇ）に融合した融合蛋白質を
構築するために、２種のクローンを使用した。ＨＢｃＡ
ｇを提供するひとつのクローンはＰ、　Ｉｌｉｇｈｆｉ
ｅｌｄ博士から恵与された（ｐＷＲｌ−３１２３＞。こ
のクローンは、大腸菌蛋白質ＴＲＰＥに対する融合蛋白
質として細菌内で発現できるようにＮＨ２末端を修飾し
た。大腸菌１−Ｉ　Ｂ　１０１に係留して、ｐＷＲｌ−
３１２３は、Ｎ　ＣＩ　Ｂ　、、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　
Ｇ　Ｂに１９８７年３月６日、登録番号ＮＣｌＢ１２４
２３として寄託されている。

β−ガラクトシダーゼのアミノ末端に連結された０１　
ＫａｕｒｂｅｕｒｅｎからのＦＭＤＶ　　ＶＰｌ　　１
４２〜１６０配列を提供する第２のクローンは、Ｈ１ｎ
ｔｈｅｒ博士から恵与された（　ｐＷＲＬ　２０１、Ｗ
ｉｎｔｈｅｒら：Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．．１３６　：
　１８３５．１９８６）。各クローンの制限酵素地図は
第４図に示す。第４図から明らかなように、ＦＭＤＶ配
列とβ−ガラクトシダーゼの間の接合部はＢａｍＨＩ部
位からなる。したがって、採用した方法は、ＦＭＤＶ配
列とＨＢＣＡＱ配列の融合をこのＢａｍＨＩ部位で行う
ものである。

したがって、構築の第１段階は、ｐＷＲＬ３１２３のＨ
Ｂ　ＣＡ　ｇの５′末端における３　ａｍＨＩのための
合成オリゴヌクレオチドリンカーの挿入とした。このリ
ンカ−の挿入に用いた部位は位置２９０におけるＮａｒ
Ｉ部位である。しかしながら、このプラスミドには第２
のＮａｒ　１部位が位置１２３０にも存在した。そこで
、１個のＮａｒＩ部位のみで切断されたプラスミド分子
集団がアガロースゲル電気泳動で観察されるようにこの
プラスミドをＮａｒＩで部分消化し、精製した。、ＤＮ
Ａポリメラーゼ■のフレノウフラグメントを使用してＮ
ａｒＩを平滑化し、ＮａｒＩ部分消化物にＢ　ａ　ｍ　
ｌ−Ｉ　Ｉ部位をもつ合成オリゴヌクレオチドリンカー
をリゲーションし、生成したプラスミドを用いて大腸菌
を形質転換した。ついでクローンを制限酵マツピングに
伺して、正しいＮａｒ’ｌ：部位におりる３　ａ　ｍ　
ｌ−Ｉ　Ｉリンカ−の存在を解析した。

１）ＢＥ２０８と命名したこのクローンを単離し、ＤＮ
Ａを調製した。［３ａｍｈｌ　Ｉリンカ−の長さは、ｐ
ＷＲＬ２０１　（第４図）のＦＭＤＶ部位にリゲーショ
ンしたとき、翻訳読み取り枠が連続し、融合蛋白質が生
成されるようにとくに選択した。

ＢａｍＨＩの挿入と同時に、挿入が行われたＮａｒＩ部
位は破壊されている。したがって、Ｂａｍ１−ＩＩ−Ｎ
ａｒＩＷ化により１）ＢＥ２０８からＨＢＣＡｇ配列を
取り出すことが可能であった。

これより９４０塩基のＤＮＡフラグメントが生成された
。同様に、ｐＷＲ１２０１から約３，５ｋｂのＢａｍ１
−ＩＩ−ＮａｒＩフラグメントが精製された。これら２
つのフラグメントをたがいにリゲーションさせ、正しい
クローン（ｐＦＯト１ｃ）を制限酵素マツピングで同定
した。

第４図から明らかなように、ｐＦＯＨｃはｔａｃプロモ
ーターの制限下に細菌細胞から発現させることかできる
。しかしながら、ハイブリツド遺伝子のワクシニアウィ
ルス（■Ｖ）シャ１〜ルベクターへの転移を容易にする
ために、プラスミドｐＦＯＨｃを１個のＮａｒ■部位で
切断し、合成リンカ−として第２のＥｃｏＲＩ部位を導
入した。これにより全ハイブリッド遺伝子をＥｃｏＲＩ
フラグメントとして単離することが可能となった。

■Ｖラシャルベクターは、ベクターｐ１１３Ｊ△Ｒ１Ａ
　（Ｎｅｗｔｏｎら：　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　　Ｂ　６　
：　Ｎｅｗ＾ｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ｉｍｍｕｎｉｓａ
ｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　３０３〜３０９頁、１９８６
）から外来の■■配列を欠失させて誘導した１）Ｖｐｌ
ｌにとした。このシャトルベクターはＶＶチミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入されたＶＶプロモーター（こ
の場合ｐ１１Ｋ）を有する。このベクターはＶＶｐＨに
プロモーターとＡＵＧの直後に唯一のＥＣｏＲＩ部位を
もっていル（Ｂｅｒｔｌ′１Ｏ１ｅｔら：ＰＮＡＳ、８
２：　２０９６．１９８５）。このＥＣｏＲＩ部位とＡ
ＵＧは、７１）ＦＯＨｃ中のハイブリッド遺伝子のアミ
ン末端ＥｃｏＲＩ部位と同じ読み取り枠にある。したが
って、Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖ−ｌ−Ｉ　Ｂ　ｃ　Ａ　ｏ遺伝子
はＥｃｏＲＩ切断脱リン酸化すＶｐ１１　ｋ中にＥＣ０
ＲＩフラグメントとして挿入した。このハイブリッド遺
伝子をｐｌｌにプロモーターに対して正しい方向に有す
るクローンを制限酵素地図マツピングで同定した。この
クローンは１）ＶＦＯＨｃと命名したく第５図）。

このシャトルプラスミドを次に、隣接ＴＫ配列を用いた
同種組換えにより、ｐＨにプロモーターの制御下、■■
のＷｙｅｔｈ　　（Ｕ　Ｓワクチン）株のゲノムに挿入
した。ＴＫ−表現型の個々の子孫プラークについて、ド
ツトプロットハイブリダイゼーションにより、ＦＭＤＶ
−ＨＢＣＡＧ　　ＤＮＡの存在をスクリーニングした。

野生型Ｂｙｅｔｈ　）および組換え体（ｖＦＯＨｃ）感
染細胞からのｃｖ−ｉ細胞分解物について、コア抗原の
存在およびＦＭＤＶ配列をサンドイッチＥＬＩＳＡでス
クリーニングした。感染細胞からの抗原は、ＦＭＤウィ
ルス粒子（１４６３）またはウサギにおいて励起したＦ
ＭＤ　　ＶＰｌ　　１４１〜１６０抗血清を用い、ＦＬ
ＩＳＡプレートに結合させた。捕捉された各抗原につい
て、次に、各モルモット抗血清との結合および抗モルモ
ットペルオキシダーゼ抱合体の生成によって、ＨＢｃ、
ＦＭＤ１４６ＳまたはＦＭＤ　　ＶＰｌ　　１４２〜１
６０エビ１−−プの存在を調べた。結果は第６図に示す
。第６図から明らかなように、ＶＦＯ日Ｃ日東感染細胞
分解物の蛋白質組換え体は抗−ＦＭＤＶ１４１〜１６０
抗血清に捕捉され、ついでこの蛋白質はサンドイッチＥ
ＩＩＳＡにおいて抗ＨＢＧ、抗ＦＭＤＶ１４１〜１６０
およびＦＭＤＶ抗ピリオン血清と反応できた。

さらに、この蛋白質は超遠心で精製することが可能で、
このことはそれが粒子の性質をもつことを示している。

これは、遠心分離生成物を蔗糖密度勾配で沈降させ、分
画についてコア抗原の存在をＥＬＩＳＡで再び評価する
ことによりさらに明確に示された。組換え（ＶＦ’０Ｈ
Ｃ）ワクシニアウィルス感染細胞からの細胞分解物また
は細菌発現天然コア抗原を１５〜４５％蔗糖勾配上で分
画した。分画を、捕捉抗体としてヒト抗コア抗血清、検
出にはモルモットｌ−Ｉ　Ｂ　ｃ抗原抗血清を用いた間
接サンドイッチＥＬＩＳＡによりコア反応性物質の存在
を検定した。結果は第７図に示す。ＦＭＤウィルスが沈
降する位置も示す。第７図は、１−Ｉ　Ｂ　ＣＡ　０反
応性物質のピークが、細菌で発現させたコア粒子を平行
して遠心分離した場合に観察されるのと類似の位置に観
察されることを示している。ずなわち、ＦＭＤＶ　　Ｖ
Ｐｌ　　１４２〜１６０配列の存在はコア粒子の粒子性
を妨害しないことがわかる。

融合蛋白質が、通常の２７ｎｍコア様粒子に自己集合す
る能力をもつことは、蔗糖勾配精製物質で形成された免
疫複合体の電子顕微鏡による観察でも確認された。この
複合体はＦＭＤＶ−１−Ｉ　Ｂ　ＣＡ　ｇ粒子を正常口
蹄疫ウィルスによって誘発された抗血清と反応させるこ
とにより形成された。この複合体は吸着されて表面被覆
グリッドを形成し、リンタングステン酸で染色されなか
った。

第６図に示したデータから期待されたように、この粒子
をＨＢｃＡｑまたは合成ＦＭＤＶペプチド１４１〜１６
０に対する抗血清と反応させたのちにも、免疫複合体が
認められた。

例２において昆虫細胞から得られた抗原を予め定められ
た至適濃度で、１）Ｈ８のアミン含有緩衝液からの受動
吸着により、マイクロウェル上に被覆した。次にウェル
を高レベルのウシ蛋白質を含む溶液で表面をコーティン
グし、残った疎水性部位が完全に占拠されていることを
確認した。

ｂ）抱合体の調製 （ｉ）　　例１において大腸菌から得た精製抗原をアル
カリホスファターゼで標識した。アルカリホスファター
ゼは、確立されたマレイミド−スルフヒドリル化学を用
い、β−ガラクトシダーゼのスルフヒドリル基に付着さ
せた。

（ｉｉ）抱合体は糖アルコールのマトリックス中、血清
蛋白質添加物とともに凍結乾燥し、使用前にアルカリホ
スファターゼの金属補因子を含有する希釈液で再構成し
た。

Ｃ）検定の実施 （ｉ）　　手順フォーマツ１〜：抗−ＨＩＶ抗体の存在
を検定するサンプルをマイクロウェルに加え、４５℃の
温度で３０分間インキュベーションした。

残留物をマイクロウェルから洗い流し、抱合体をウェル
に加えて４５℃の温度で３０分間インキュベーションし
た。過剰の抱合体を洗浄して除いた。

次に、アルカリホスファターゼの存在を、前述の循環増
幅系を用いて検出した。ウェルに有意な量の酵素が結合
していれば、サンプル中におけるＨ　Ｉ　Ｖのエンベロ
ープ蛋白質に対する抗体の存在を示ず。

この検定を、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質に対する抗体
を含まないことがわかっている１６６２個の血清とこの
抗体を含む６個の血清を用いて試験した。結果（昆虫培
養抗原）は、第１表に、大腸菌から抱合体および被覆蛋
白質の両者として誘導した抗原（大腸菌培養抗原）につ
いて実施した検定結果と比較して示す。バックグラウン
ドの着色は後者の方が高く、また真性の抗−ＨＩＶ抗体
の存在によるものでなく、抗原プレバレージョンにおけ
る不純物に帰することができるシグナルを生じるサンプ
ルのあることを示している。これらのサンプルは異なる
起源から調製されたコーティング抱合抗原を用いた検定
ではシグナルを生じない。

第１表 ａ）バックグラウンド 昆虫培養抗原：検定バックグラウンド ０．１５±０．０３　０．Ｄ、単位 大腸菌培養抗原：検定バックグラウンド０．２６±０．
０５　０．Ｄ、単位 ｂ）偽陽性データ（抗−ｃｏｌｉ活性による）大腸菌培
養抗原：　１６６２サンプル中２個に２個の偽陽性シグ
ナル 昆虫培養抗原：反応せず Ｃ）昆虫培養抗原を用いて陽性とされた陽性例６／６ の検出 古典的な競合的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ＞＝　６７
− を使用した。例１で得られた、６２６と命名したｇａｇ
／ｎｅ■融合蛋白質を、ｐ２４に対するモノクローナル
抗体（ＴｌＯ２）を介して捕捉することによりマイクロ
ウェル上に被覆した。調整したウェルにサンプルを加え
、直ちに抱合抗−ＨＩ　Ｖを加えた。サンプルは供血者
からの血清および血漿サンプル、ならびにＡ　Ｉ　ＤＳ
、ＡＩＤＳ関連症状および他の疾患の患者からの血清サ
ンプルであった。抱合に用いる酵素はペルオキシダーゼ
とした。約１時間インキュベーションしたのち、ウェル
を洗浄して、酵素に対する基質を添加した。

基質は３，３，５．５’−テトラメチルベンチジンであ
る。サンプル中の抗−ＨＩＶは同時に操作した標準との
比較によって確認した。結果は第２表および第３表に示
す。

第２表：供血者の血清および血漿サンプル中のＨＩＶに
対する抗体の検出 ター　ンプル　せず　反応 番号　数 １　　１６９９　　１６９６　　３　　１　　（０，０
６％）２　　１７８３　　１７８０　　３　　２　　（
０，１１％）３　　２０３７　　２０３４　　３　　１
　　（０，０５％）４　　１９０８　　１９０４　　　
４　　　２＊（０，１０−０，１６％）計　　　８４０
２　　　８３８８　　　１４　　　　６（０，１７％）
　（０，０７％） 第３表：ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群および他疾患患
者からの血清の反応性 Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　　　　　５９　　　　５９　　　　　
５９ｂＡＩＤＳ関連　　６２　　　　６２　　　　　６
２症候群 高危険群ｄ４２６　　　２７２　　　　２７１ＡＩＤＳ
非関　　６７　　　　１　＋＋０連疾患０ その（ｌ！１ｆ８０　　　　０　　　　　０ａ　確認は
ウェスタンプロットおよび／または少なくとも２種の異
なるイムノアッセイ（以下のｂを除く） ｂ　　ＡＩＤＳ患者からの３０個のサンプルは１種の別
のイムノアッセイで確認した。

Ｃ持続性−膜性リンパ腺腫、カポシ腫瘍、日和見感染お
よびＨＩＶ抗体陽性既知の患者ｄ　確立された危険群の
患者 ｅ　急性ウィルス疾患、自己免疫疾患、腫瘍患者 ｆ　健康者および診断が確定していない患者゛　矛盾の
あるサンプル（■薬剤耽溺患者）はウェスターンプロッ
トで解釈不能の結果を与えた４４　　矛盾のあるサンプ
ルは肉眼的に溶血が認められた これはｌ−１１Ｖに対する抗体検出の標準方法である。

例１からの６２６をマイクロウェルに受動吸着で被覆さ
ぜた。予め１／１００に希釈し１＝血清５０ｕｆｌのサ
ンプルをウールに加えた。約３０分間インキュベーショ
ンしたのちウェルからサンプルを洗い流し、抱合抗−ヒ
トゲロブリン５０μ夕を加えた。抱合に用いる酵素はペ
ルオキシダーゼとした。さらに約３０分間インキュベー
ションしたのち、ウェルを再び洗浄し、酵素基質を加え
た。

抗−１−１１Ｖの存在は、同時に操作した標準との比較
によって検出した。結果は第４表に示す。

第４表：間接抗グロブリン試験 試験数　　　　　　　　試験数 の検出 例１からの６２６を、例６と同様にしてマイクロウェル
に受動被覆した。調整したウェルに非希釈サンプル２５
０μ（を添加した。抱合６２６（５０ｕＡ）をサンプル
についで直ちに添加した。

約１時間インキュベーションしたのち、ウェルを洗浄し
、基質を加えた。酵素にはアルカリホスファターゼを使
用した。結果は第５表に示す。

第５表：直接サンドインチ試験 試験数　　　　　　　　試験数 血清８１０＊８０９　　　　５８　　　　　５８血漿１
７５＊１６９ ＊１個の偽陽性血清、６個の偽陽性血漿があった（すべ
てが繰り返し偽陽性ではない）標準凝集試験を行った。

直径０．２μのプレコーティングラテックス粒子を、例
１で得られた６２６により受動被覆した。血清または血
漿サンプルを、装置を用いるかまたは表面上で撹拌して
、ラテックスと混合し１こ。日ＩＶに対する抗体の存在
（粒子の凝集を生じる）は肉眼で検査するかまたは適当
な装置を用いて、試薬混合数分後に確認した。結果は第
６表に示す。

第６表ニラテックス凝集検定 試験数　　　　　　　　試験数 血清４８０　　　４７９　　　　８０　　　　　８０血
漿　５０５０ 抗−ヒトゲロブリンをマイクロウェルに受動被覆した。

非希釈血清各５０μ夕のサンプルを調製したウェルに添
加した。アルカリホスファターゼで標識した例１からの
６２６を直ちに加えた。約１時間インキュベーションし
たのち、ウェルを洗浄し、基質を加えた。抗−ＨＩＶ抗
体の存在は標準との比較によって確認した。結果は第７
表および第８表に示す。

第７表：抗−ヒト捕捉検定 試験数　　　　　　　　試験数 １６　　　　　１６　　　　１５＊１２８弱い陽性３検
体、検出されず 第８表：抗−ヒト捕捉検定 試験数　　　　　　　　試験数 １３８　　　　１３７　　　　４６＊＊４５

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＤＭ３２２中に組込まれた好ましいｅｎｖ
配列を示す。 第２図は、ｐＤＭ６１／ｌ中に組込まれた好ましいｇａ
ｇ配列を示す。 第３図は（］ａｇ／ｅｎｖ蛋白質のＤＮＡ配列を示す。 第４図はＤＦＯＨｃの構築を示す図である。 第５図はシャ１−ルベクターｐＶ　Ｆ　Ｏｌ−Ｉ　Ｃを
示す図でいる。 第６図は、本発明の蛋白質を用いたザンドイッヂＥＬＩ
ＳＡの結果を示す図である。 第７図は、コア反応性物質の蔗糖勾配分画の結果を示す
図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ）抗体が結合できる抗原性配列を提供する第
   １の組換えペプチドを固定化した固相を試験サンプルと
   接触させ、（ｉｉ）上記抗原性配列を提供し、かつ標識
   されている第２の組換えペプチドを固相に接触させ、（
   ｉｉｉ）試験サンプルが上記抗体を含むか否かを決定す
   る各工程からなるイムノアツセイにおいて、第２の組換
   え抗原は第１の組換え抗原を発現させた生物と属が異な
   る生物内で発現させたことを特徴とする抗体のイムノア
   ツセイ。
2. （２）組換えペプチドの一方は原核生物内で発現させ、
   他方は真核生物内で発現させた特許請求の範囲第１項に
   記載のイムノアツセイ。
3. （３）組換えペプチドの一方は大腸菌内で発現させ、他
   方はバキユロウィルスまたはワクシニアウイルス発現系
   をそれぞれ用いて昆虫細胞または哺乳類動物細胞内で発
   現させた特許請求の範囲第２項に記載のイムノアツセイ
   。
4. （４）組換えペプチドはＨＩＶｇａｇおよび／またはｅ
   ｎｖ配列である特許請求の範囲第１項から第３項までの
   いずれかに記載のイムノアツセイ。
5. （５）（ｉ）抗体が結合できる抗原性配列を提供する第
   １の組換えペプチドを固定化した固相と（ｉｉ）上記抗
   原性配列を提供し、かつ標識されている第２の組換えペ
   プチドからなるキッドにおいて、第２の組換え抗原は第
   １の組換え抗原を発現させた生物と属が異なる生物内で
   発現させたことを特徴とする抗体のイムノアツセイ用試
   験キット。
6. （６）配列： 【遺伝子配列があります。】 を有する蛋白質、またはその１個もしくは２個以上のア
   ミノ酸の置換、挿入および／もしくは欠失、ならびに／
   または一方の末端もしくは両末端の延長によつて修飾さ
   れた蛋白質（ただし、修飾配列を有する蛋白質も抗−ｐ
   ２４および抗ｇｐ−４１の両者と結合可能であつて、修
   飾および非修飾配列問のホモロジーは少なくとも７５％
   である）。
7. （７）（ｉ）蛋白質コードする遺伝子が組込まれ、宿主
   細胞内でその蛋白質を発現できるベクターによつて宿主
   細胞を形質転換し、（ｉｉ）形質転換宿主細胞を培養し
   て上記蛋白質を発現させ、（ｉｉｉ）その蛋白質を回収
   することによる組換え蛋白質の製造方法において、遺伝
   子は特許請求の範囲第６項に記載の蛋白質をコードする
   ことを特徴とする製造方法。
8. （８）試験サンプルを抗−Ｐ２４および／または抗ｇｐ
   −４１　ＨＩＶ−１抗体に結合できる蛋白質と接触させ
   、抗体が蛋白質に結合したか否かを決定する抗−Ｐ２４
   および／または抗−ｇｐ４１ＨＩＶ−１抗体のアツセイ
   において、蛋白質は特許請求の範囲第６項に記載の蛋白
   質であることを特徴とするアツセイ。
9. （９）抗−ｐ２４および／または抗−ｇｐ４１ＨＩＶ−
   抗体に結合可能な蛋白質、および試験サンプル中の抗体
   がその蛋白質に結合したか否かを決定するための手段か
   らなる抗−ｐ２４および／または抗−ｇｐ４１　ＨＩＶ
   −１抗体のアツセイ用キットにおいて、その蛋白質は特
   許請求の範囲第６項に記載の蛋白質であることを特徴と
   するキット。
10. （１０）医薬的に許容される担体または希釈剤と、活性
    成分として特許請求の範囲第６項に記載の蛋白質を含有
    することを特徴とする医薬組成物。