JPH01163665A - イムノアツセイおよびそれに使用される生物学的構築体 - Google Patents

イムノアツセイおよびそれに使用される生物学的構築体

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JPH01163665A
JPH01163665A JP63220305A JP22030588A JPH01163665A JP H01163665 A JPH01163665 A JP H01163665A JP 63220305 A JP63220305 A JP 63220305A JP 22030588 A JP22030588 A JP 22030588A JP H01163665 A JPH01163665 A JP H01163665A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗体のイムノアッセイおよびそのイムノアッセ
イに使用する試験キットに関する。
クローン化した抗原の最も一般的な発現系は、その抗原
を大腸菌内で発現させる系である。しかしながら、大腸
菌は、腸内菌叢のきわ立った部分を占めている。したが
って、ヒ1〜血清は大腸菌にλjJる抗体を含む場合が
多い。大腸菌内で生成させた抗原を、抗体の→ノンドイ
ツチイムノアツセイに使用すると、一部の固体は夾雑す
る細菌性物質と反応する可能性がある。このような反応
は、特定の固体において偽陽性の結果を与えることがあ
る。このJ:うな種類の偽陽性は、大腸菌からの物質を
試験サンプルと混合づることによって最小限に抑えるこ
とかできる。
本発明者らは、夾雑物質による問題を克服する新しい方
法を発明した。基本的には、免疫学的に同一の抗原を異
なる生物内に組込むものである。
す41わち、異なる生物からのクローン化抗原をサンド
イッチの両側に配する。試験サンプル中の検出を望んで
いない抗体はクローン化抗原の一方に会合した夾雑物質
と結合することはあっても、起源が異なるので両クロー
ン化抗原と会合した夾雑物質と結合づ−ることはない。
このようにして、偽陽性の問題は回避できる。確実に夾
雑蛋白質を完全に含まないようにクローン化抗原を調製
する必要がなくなることは重要である。アッセイの特異
性は著しく改善される。抗原の調製は簡単になる。
すなわち、本発明は、(i)抗体が結合できる抗原性配
列を提供する第1の組換えペプチドを固定化した固相を
試験サンプルと接触させ、(ii)上記抗原性配列を提
供し、標識されていて、かつ第1の組換えペプチドを発
現させた生物と属が異なる生物内で発現させた第2の組
換えペプチドを固相に接触させ、ついで(iii)試験
サンプルが上記抗体を含むか否かを決定する各工程から
なる抗体のイムノアッセイを提供するものである。
この方法により任意の抗体が検定できる。組換えペプチ
ドはいずれも同じ抗体結合部位をもつものでなければな
らない。検出は、抗体が少なくとも2個の抗原結合部位
をもつという事実によっている。IqG、ICIAおよ
びIQEは2個、IgMは5個の抗原結合部位をもって
いる。
JOGを例にとれば、抗原結合部位のひとつが固相上に
固定化された第1の組換えペプチドに結合する。標識さ
れた第2の組換えペプチドはJqGの第2の抗原結合部
位と結合する。
組換えペプチドは異なる属の生物内に組込まれる。両生
物は異なる科に属するものであることが好ましい。たと
えば、別の細菌性発現系を使用することができる。また
、一方の抗原を細菌性発現系にクローニングし、他方は
酵母、または昆虫もしくは哺乳動物細胞にクローニング
する。一方の抗原を原核生物に、他方の抗原を真核生物
システムにクローニングすることがとくに好ましい。ク
ローニングに適当な宿主としては、枯草菌、大腸菌、放
線菌、昆虫−細胞、酵母および哺乳動物細胞を挙げるこ
とができる。ペプチドを昆虫細胞および哺乳動物細胞中
で発現させる場合、それぞれバキュロウィルス発現系お
よびワクシニアウィルス発現系の利用が、好ましい真核
生物の別の使用法となる。原核生物宿主としては大腸菌
が好ましい。
第1および第2の両ペプチドは構造が同一である必要は
ない。一方が他方より長いことも許される。しかしなが
ら、両者とも、検出を所望の抗体が結合できる抗原性配
列を提供するものでな【プればならない。換言すれば、
それぞれが同じ抗体結合部位をもたねばならない。本明
細書においては、ペプチドの語は蛋白質を包含する。
第2の組換えペプチドには適当な任意の標識を付着させ
ることができる。標識は酵素でも、放射性同位元素でも
、また、比色もしくは蛍光法にJ:る測定を可能にする
他の試薬でもよい。好ましい標識はアルカリホスファタ
ーゼである。標識を用いて循環増幅反応を開始させるこ
とができる。アルカリホスファターゼは基質、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェ−1〜(NAD
P)と反応し、二]チンアミドアデニンジヌクレオヂド
(NAD>を生成する。NADはアルコールデヒドロゲ
ナーゼ、ジアフオラーゼおよび着色生成物を導くヨード
ニトロテトラゾリウムの関与する循環反に利用される。
このイムノアッセイは、サンプル中のHIV抗体、とく
にl」I V −1抗体の存在の検定に使用するのにと
くに適当である。異なる起原のクローン化HIV抗原を
準備する。抗原はgagおよび/またはenv配列でも
よい。l−11V −1はとくに= 10− 2種の抗体を誘発する。Jなわち、qaq蛋白質に対す
る抗−II)24どenv蛋白質に対する抗−g+) 
4.1である。
好ましいgag配列はアミノ酸121〜356に相当す
る。これはp24の全配列を組込む。好ましいenv配
列はアミノM542〜674に相当する。この0p41
配列の利点は、それが半溶解であること、およびenv
遺伝子の主要なエビ1〜−ブを包含することである。番
号はHeusinQら(Nature、 313 : 
450〜458.1985)によるものである。
各配列はβ−ガラク1〜シダーゼ(β−gal)に融合
しているが好ましい。これは、抗−ガラク1〜シダーゼ
アフイニティー力ラムまたは基質カラムを使用したアフ
ィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする
。また、両配列をたがいに融合して、(J a Q /
 e n v融合蛋白質としてもよい。gaqもしくは
env蛋白質または両者に対して早期血清変換を行って
もない。すなわち、第一および第二の組換えペプチドは
gagおよびenv両配列配列供することが望ましい。
これを達成するには、C1an/β−galおよびen
v/β−gal融合蛋白質を使っても、またQag/e
n融合蛋白質をそのまま使ってもよい。
好ましいgag/env融合蛋白質は配列二を有する蛋
白質、またはその1個もしくは2個以上のアミノ酸の置
換、挿入および/もしくは欠失、ならびに/または一方
の末端もしくは両末端の延長によって修飾された蛋白質
くただし、修飾配列を有する蛋白質も抗−p24および
抗−gp4.1の両者と結合可能であって、修飾および
非修飾配列問の小モロジーは少なくとも75%である)
である。
非修飾配列は基本的に、l−11V −1のCEI−1
単離体のp24とQp41蛋白質の部分の融合体である
(W086104423)。これらの部分は、それぞれ
アミノ酸121〜356および5/12〜674に相当
する。これらの部分の開始点は上に示したように、それ
ぞれアミノ酸17および244である。上記アミノ酸5
〜16は1)18蛋白質から誘導される。上記アミノ酸
1〜4.241〜243および377〜379は、融合
構築体が19られたベクターおよびDNA操作に由来す
るものである。
この配列は1個または2個以上のアミノ酸の置換、挿入
および/または欠失によって修飾されてもよい。これら
は配列のどこに起こってもよいが、とくにp24および
0p41蛋白質に由来しない配列部分に行われる。置換
の場合、非修飾配列の1個または2個以上のアミノ酸が
、配列の物理化学的性質すなわち電荷密度、親水性/疎
水性、サイズおよび]ンフイギュレーションを維持する
1個または2個以上の他のアミノ酸で置換することがで
きる。たとえば、3erをThrにもしくはその逆、G
luをASDにもしくはその逆、GlnをASnにもし
くはその逆の置換を行うことができる。アミノ酸10の
3er残基はASnに置換できる。
配列を一方の末端でまたは両末端で延長することもでき
る。これは付加的カルボキシ末端Cys残基ではないこ
とが条件になる。しかしながら、配列は一方の末端また
は両末端に50アミノ酸残基まで延長できる。40個ま
でのアミノ酸、たとえば20個までのアミノ酸を、非修
飾配列のアミノ酸末端および/またはカルボキシ末端に
付加できる。しかしながら、アミン末端アミノ酸は、そ
こから蛋白質が発現する核酸配列の翻訳開始]トンであ
るため、通常Metである。蛋白質が発現しない場合に
は、これをそのアミノ末端で担体蛋白質に融合し、融合
蛋白質を切断して本発明の蛋白質を遊離させる。
配列は、非修飾蛋白質をコードするDNA配JIJに相
当する変化を導入することによって修飾できる。これは
、エンドヌクレアーゼによる配列の制限、リンカ−の挿
入、■キソヌクレオーゼおよび/またはポリメラーゼの
使用ならびに特定部位の突然変異等を包含する適当な任
意の技術により達成できる。修飾されたDNAが、抗−
p24および抗gp41の両者を結合できる修飾蛋白質
をコードしているか否かは容易に決定できる。修飾され
た配列を適当なプラスミド中にクローニングし、このプ
ラスミドで宿主細胞を形質転換し、発現された蛋白質に
ついて抗−1)24および抗−gp41の結合能を調べ
る。また、修飾および非修飾蛋白質のアミノ酸配列間に
は少なくとも75%だとえば85%もしくはそれ以上ま
たは90%もしくはそれ以上の小モロジーがなければな
らない。
融合蛋白質qaq/β−gal、enV/β−galお
よびOaQ/envは、大腸菌形質転換体で発現させる
ことができる。このようなqag/β−galおよびe
nv/β−gal融合蛋白質、まだQaQ/env融合
蛋白質は、サンドインチの一方の側に置くことができる
。標識され、第2の組換えペプチドとするのは、これら
の融合蛋白質が好ましい。
サンドイッチの他の側に置<aaaおよびenv抗原の
起原としては、任意の適当な発現システムを使用するこ
とができる。しかしながら、ポリヘトリン遺伝子の抗原
性Ωagおよび/またはenv配列をコードするDNA
による挿入または置換を行ったバキュロウィルス発現系
を用いるのが好ましい。組換えペプチドは昆虫細胞内で
発現させる。宿主は通常、5podoptera fr
ugi erdaである。少なくともアミノ酸542〜
674を組込んだより大きなenv配列、たとえばアミ
ノ酸24〜750に相当するenv配列を発現させるこ
ともできる。バキュロウィルス発現系を用いてクローン
化されるペプチドは、固相に固定化するペプチドとして
好ましい。  ・ イムノアッセイの実施に際しては、第1の組換えペプチ
ドを固相に固定化する。固相はポリスチレンビーズ、プ
ラスチックマイクロウェル等であってよい。ペプチドは
固相上に吸着させるかまたは抗体によって固相に結合さ
せる。次に、試験サンプルを固相に接触させる。任意の
適当な生理的液体のサンプル、たとえば尿、血漿または
血清から試験サンプルが調製できる。固相に固定化した
ペプチドに特異的な、試験サンプル中の抗体がペプチド
に結合する。ペプチドをクローニングした宿主に由来す
る夾雑物質に特異的な、試験サンプル中の抗体も、この
夾雑物質に結合する可能性がある。
標識された第2の組換えペプチドも固相に接触さける。
これは、固相を試験サンプルに接触させたのちに行われ
る。別法として、この2工程を同時に行うこともできる
。第1のペプチドに結合する試験サンプル中の抗体は、
標識された第2のペプチドにも結合し、したがって検出
される。第1のペプチドに会合した宿主由来の夾雑物質
に結合した抗体は、第2のペプチドと会合した標識され
た宿主由来の夾雑物質には結合しないし、またその逆も
同様である。したがって、偽陽性の問題は回避される。
イムノアッセイは定性的に行うことができる。
すなわち、試験サンプル中の特定の抗体の存在または不
存在を単に検出する7jめに実施することができる。ま
た、定量的または半量的に実施し、サンプル中に存在す
る抗体の量の測定を行うこともできる。
このイムノアッセイに使用する材料は試験キットとして
提供することもできる。このような試験キットは通常、
(1)抗体が結合できる抗原性配列を提供する第1の組
換えペプチドを固定化した固相、および(ii)上記抗
原性配列を提供し、標識され、かつ第1の組換えペプチ
ドを発現させた生物と異なる属の生物中で発現された第
2の絹換えペプチドから構成されている。
キットにはまた、標識が酵素の場合、標識の基質が包含
される。さらに、洗浄液や対照を加えてもよい。また、
キットには、本イムノアッセイと一緒に、第2のイムノ
アッセイを実施するための材料を含有させてもよい。第
2のイムノアッセイは別の抗体についてのものであって
もよく、その場合は同様の方式で実施することができる
第2のイムノアッセイが、試験サンプル中に特定の抗原
も含まれるか否かを決定することを目的としている場合
には、さらにその抗原に結合できる第1の抗体を固相上
に固定化してもよい。第1の抗体に結合した抗原を検出
するための標識された第2の抗体も準備される。各抗体
はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。2種の
抗体は、抗原の異なる部位に結合するものであってもよ
い。
抗体が重合性の場合には、抗体は同じ部位に結合するこ
とができる。標識された第2の抗体は試験サンプルと同
時にまたは試験サンプルの後で、固相に接触させる。標
識は第二の組換えペプチドの場合と同じである。必要な
ことは、試験サンプルが試験すべき抗体および/または
抗原を含有するかどうかの指示である。
すなわち、HIV抗体とくにHIV−1抗体とB型肝炎
表面抗原(HBsAQ)、両者のイムノアッセイを提供
することができる。l−11V抗体の検定はすでに述べ
た抗原を使用して実施できる。
1−I B S A gに対する2種の具なる抗体はH
B S A Qの検定に使用できる。両抗体はこの抗原
の異なる部位にそれぞれ反応する。各抗体はモノクロー
ナルでもポリクローナルでもよい。固相を試験サンプル
および標識第2抗体と同時に接触させることができるよ
うに、各抗体はモノクロナールであることが好ましい。
この場合も、HIV抗体の検出に用いる第2の組換えペ
プチド上の標識と第2のHBSAQ特異性抗体上の標識
とは同一であることが好ましい。
1−1 T V抗体に対するイムノアッセイは、予後診
断試験として使用することができる。l−I I Vに
感染したm者は、AIDS症状のない初期には、かなり
一定な高力価の抗−p24抗体を有する。−方、抗−p
24抗体の低力価もしくは力価の低下は臨床的進行と有
意に関連し、AIDSまたは△IDsID症候群(AR
C)の発症を示唆するも(D T−アル。(Weber
 ホか: The Lanc員、1987年1月17日
)。したがって、予後診断を行うには、患者の抗−p2
4抗体力価を長期にわたって追跡する必要がある。イム
ノアッセイは異なる生物から得られたクローン化p24
ペプチドを用いて実施することができる。好ましいペプ
チドは」−述のI)24構築体である。抗−p24抗体
力価が低下したときは予後不良の徴候と考えることがで
きる。
本発明はまた、融合構築体、その製造方法、ならびにそ
の抗1−11 V −1抗体の検定におけるおよびワク
チンとしての使用に関する。
抗−HI V−1抗体には、様々な検定法が提案されて
さた。しかしながら、それらは偽陽性または偽陰性の問
題を生じることがある。1」I V−1はとくに2種の
抗体を誘発する。これらは08g蛋白質に対する抗−1
)24とenv蛋白質に対する抗−〇 〇 4.1であ
る。本発明においては、抗−1)24および抗=gp/
1.1の両者に結合する構築体が提供される。これは偽
陽性および偽陰性結果の危険を伴わず、正確かつ高感度
の検定の実施を可能にする。
したがって、本発明は、配列: 一  25 − 一  26 − を有する蛋白質、またはその1個もしくは2個以上のア
ミノ酸の置換、挿入および/もしくは欠失、ならびに/
または一方の末端もしくは両末端の延長によって修飾さ
れた蛋白質(ただし、修飾配列を有する蛋白質も抗−p
24および抗−gp41の両者と結合可能であって、修
飾および非修飾配列問のホモロジーは少なくとも75%
である)を提供づ−るものである。
非修飾配列は基本的に、HI V−1のCEL−1単離
体のp24とgp41蛋白質の部分の融合体である(W
086104123)。これらの部分は、それぞれアミ
ノ酸121〜356および542〜674に相当する。
これらの部分の開始点は上に示したように、それぞれア
ミノ1117および244である。上記アミノ酸5〜1
6は1)18蛋白質から誘導される。上記アミノ酸1〜
4.241〜243および377〜379は、融合構築
体が得られたベクターおよびDNA操作に由来するもの
である。
この配列は1個または2個以上のアミノ酸の置換、挿入
および/または欠失によって修飾されてもよい。これら
は配列のどこに起こってもよいが、とくにF)24およ
びgp41蛋白質に由来しない配列部分に行われる。置
換の場合、非修飾配列の1個または2個以上のアミノ酸
が、配列の物理化学的性質すなわち電荷密度、親木性/
疎水性、サイズおよびコンフィギユレーションを維持す
る1個または2個以上の他のアミノ酸で置換することが
できる。たとえば、SepをThrにもしくはその逆、
GluをASDにもしくはその逆、GlnをAsnにも
しくはその逆の置換を行うことができる。アミノ酸10
のser残基はASnに置換できる。
配列を一方の末端でまたは両末端で延長することもでき
る。これは付加的カルボキシ末端CyS残基ではないこ
とが条件になる。しかしながら、配列は一方の末端また
は両末端に50アミノ酸残基まで延長できる。40個ま
でのアミノ酸、たとえば20個までのアミノ酸を、非修
飾配列のアミノ酸末端および/またはカルボキシ末端に
付加できる。しかしながら、アミン末端アミノ酸は、そ
こから蛋白質が発現する核酸配列の翻訳開始コドンであ
るため、通常1yletである。蛋白質が発現しない場
合には、これをそのアミン末端で担体蛋白質に融合し、
融合蛋白質を切断して本発明の蛋白質を遊離させる。
配列は、非修飾蛋白質をコードするDNA配列に相当す
る変化を導入することによって修飾できる。これは、エ
ンドヌクレアーゼによる配列の制限、リンカ−の挿入、
エンドヌクレアーゼおよび/またはポリメラーゼの使用
ならびに特定部位の突然変異等を包含する適当な任意の
技術により達成できる。修飾されたDNAが、抗−p2
4および抗gp 41の両者を結合できる修飾蛋白質を
コードしているか否かは容易に決定できる。修飾された
配列を適当なプラスミド中にクローニングし、このプラ
スミドで宿主細胞を形質転換し、発現された蛋白質につ
いて抗−p24および抗−0p41の結合能を調べる。
また、修飾および非修飾蛋白質のアミノ酸配列間には少
なくとも75%、たとえば85%もしくはそれ以上また
は90%もしくはそれ以上のホモロジーがなければなら
ない。
本発明の蛋白質は、(i)この蛋白質をコードする遺伝
子を組込み、宿主細胞内でこの蛋白質を発現できるベク
ターにより宿主細胞を形質転換し、(ii)形質転換宿
主細胞を培養して蛋白質を発現させ、ついで(iff)
蛋白質を回収することからなる方法によって製造される
この蛋白質をコードする遺伝子は、p24のアミノ酸残
基をコードするDNA配列を組込んだアミン末端部分と
、C11)41アミノ酸残基をコードするDNA配列を
組込んだカルボキシ末端部分の2部分に構築されること
が好ましい。ついで、この2部分を一緒に融合し、発現
ベクター内に挿入する。この遺伝子には適当な転写調節
配列および翻訳開始、停止]トンが与えられる。遺伝子
はATGコドンに対して正しい読み取り枠で、プロモー
ターの制御下に発現ベクター内に挿入される。
任意の発現ベクター、たとえばプラスミド、または組換
えバキュロウィルスもしくはワクシニア−30= ウィルスのようなウィルスベクターが使用できる。
この発現ベクターで形質転換される宿主は真核生物ま1
=は原核生物で、たとえば単細胞微生物または昭1乳動
物細胞である。単細胞原核生物宿主としては、sacc
haromyces cerevisiae。
s、 kluveromycesおよびS、 pomb
eを挙げることができる。細菌、たとえば大腸菌、枯草
菌またはB、 thermophilusは原核生物宿
主として使用できる。大腸菌が好ましい。形質転換され
た細胞を培養し、発現した蛋白質を回収する。
本発明の蛋白質は、抗−HIV−1抗体とくに抗−II
)24および/または抗−gp41の検定に使用できる
。検定には任意の適当な生理学的液体たとえば尿、血漿
、血液または血清の試験サンプルを使用できる。検定方
法は、試験サンプルを本発明の蛋白質と接触させ、抗−
p24および/または杭−Qp41がこの蛋白と結合し
たかどうかを決定することからなる。この目的には、本
発明の蛋白質と、試験サンプル中に存在する可能性があ
る抗−ρ24および/または抗−Clp41がこの蛋白
質と結合するかどうかを決定するための手段からなる試
験キットを提供することもできる。
様々なアッセイフォーマットを採用することができる。
蛋白質は、抗−p24および/または抗−Ql)41を
溶液から選択的に捕捉するように、すでに捕捉された抗
−D24および/または抗−qp41を選択的に標識す
るように、あるいは捕捉と標識の両者を行うように使用
できる。また、蛋白質は、蛋白質と反応する抗体が相分
離をすることなく溶液中で検出される様々な均一アッセ
イフォーマットに使用することもできる。この蛋白質は
HIV−1抗原の検出にも使用できる。
蛋白質が溶液から抗体を捕捉するために用いられるタイ
プの検定では、固相への蛋白質の固定化が行われる。こ
の表面は何らかの方法で洗浄できる必要がある。使用で
きる表面としては、各種のポリマー(成型されたマイク
ロタイターウェル、ビーズ、各種のデイツプスティック
、吸引チップ、電極おにび光学デバイス)、粒子(たと
えばラテックス、安定化血液、細菌もしくは黴の細胞、
胞子、金もしくは他の金属のゾルおよび蛋白性コロ41
42粒子径tま通常0.1〜5ミクロン)、膜(たとえ
ばニトロセルロース、濾紙、セルロースアセテート、有
機もしくは無機材料の多孔性/高表面積膜)がある。
表面への蛋白質の付着は、界面活性剤、溶媒、塩、カ第
1・ロピックイオンを含有していてもよい至適組成の溶
液から受動吸着(その疎水性に基づく場合が理想的であ
る)により、または能動化学結合により行われる。能動
結合は、表面に付着している様々な反応性もしくは活性
化可能官能基を介して行われる(たとえば、縮合剤:活
性化エステル;ハライド、無水物;アミノ、ヒドロキシ
ルもしくはカルボキシル ルボニル基;ジアゾ基;不飽和基)。また、能動結合は
、伯の蛋白質(それ自体は表面に受能的にまたは能動結
合で付着している)、たとえば蛋白質にJ:って提供さ
れるエピトープのいずれかまたはづ゛べてに対するポリ
クロナールまたはモノクロナール抗体を介する結合、あ
るいは、蛋白質に任意の様々な様式で結合し、その等電
点、電荷、親水性またはその他の物理学的性質による利
点を付与する担体蛋白質たとえばアルブミンもしくはカ
ゼインを介する結合であってもよい。蛋白質はまた、反
応混合物たとえば免疫沈降物の電気泳動分離後の表面(
通常は膜であるが必ずしもその必要はない)に付着して
いてもよい。
蛋白質を有する表面を問題の抗体を含有する溶液と反応
させ、必要に応じて任意の各種手段(洗浄、遠心分離、
濾過、磁化、毛細管作用)で過剰のサンプルを除去した
のち、捕捉した抗体を検出可能なシグナルを与える任意
の手段で検出する。
たとえば、これは、捕捉された抗体と反応する上述の標
識分子または粒子の使用によって達成される(たとえば
、プロティンAまたはG蛋白質等;抗一種もしくは抗−
免疫グロブリン亜型;リウマトイド因子;蛋白質に含有
され、競合もしくは遮断様式で使用される任意のエピト
ープに対する抗体;または蛋白質自体ならびにHIV−
1から直接もしくは間接的に誘導される他の蛋白質およ
びペブヂドを包含する蛋白質のエピトープを含む分子)
検出可能なシグナルは、関係する分子を直接、たとえば
染料、放射性標識、電子活性種、磁気共鳴種もしくは蛍
光団で標識することにより得られる光学的もしくは放射
性またはその他の物理化学的シグナル、また分子もしく
は粒子の測定可能な任意の種類の変化を生成することが
できる酵素自体による間接的標識によって得られるシグ
ナルであってよい、また関係する表面が粒子である場合
には、シグナルはたとえば、凝集、回折効果または複屈
折効果によるものであってもよい。
すでに捕捉されている抗体を標識するために蛋白質を使
用するタイプの検定では、蛋白質を検出可能にするある
形式の標識が必要である。標識は、直接の化学的または
受働的付着、たとえば、蛋白質への放射性、磁気共鳴、
粒または酵素標識でもよく、また間接的に、それ自体蛋
白質と反応する分子、たとえば蛋白質の任意のエビ1〜
−プに対重る抗体に任意の形の標識を付着させ、ついで
標識分子を蛋白質と反応させて得られる標識であっても
よい。蛋白質に標識を結合させる化学的方法は、蛋白質
にすでに存在するアミンもしくはスルフヒドリル基を介
して直接行う方法、またはマレイミドのような挿入基を
介して行う方法がある。抗体の捕捉は既述の任意の表面
に、任意の試薬を用い、受動または活性化吸着によって
行われ、特異的抗体または免疫複合体の結合が生じる。
とくに抗体の捕捉には、抗一種もしくは抗−免疫グロブ
リン亜型、リウマ1〜イド因子、プロティンA、G等、
または上述の蛋白質の任意のエピトープを含有する分子
が使用される。
サンプル中のl」■■−1抗原を測定するために蛋白質
を使用する検定では、蛋白質を上述の任意の方法で標識
し、上に例示した任意の表面上におtプる特異的分子に
よるその結合が4ノーンプル中の抗原によって妨害され
る競合的結合様式、またはサンプル中の抗原が上述の任
意の表面に特異的もしくは非特異的に結合する場合には
引き続いて特異的な2価もしくは多価分子(たとえば抗
体)が結合し、その分子の残りの結合価が標識蛋白質の
捕捉に用いられる非競合的様式のいずれかが用いられる
一般に均一検定法においては、蛋白質と抗体を標識させ
、自由な溶液中で抗体が蛋白質と反応する場合、2種の
標識が相互作用してたとえば一方の標識によって捕捉さ
れたエネルギーの他の標識への非放散性転位を起こさせ
、励起した第2の標識または消失した第1の標識を適当
に検出することができる(たとえば蛍光、磁気共鳴、酸
素測定)。サンプル中の抗原または抗体が添加されると
、標識された対の相互作用が制限され、検出器にd3け
るシグナルのレベルが変化する。
本発明の蛋白質は、抗−p24または抗−gp41のサ
ンドイッチイムノアッセイに使用できる。
この場合、同じ抗原性配列を提供するが別の生物内で発
現された組換え抗原をサンドイッチの各側に配置する。
抗原のクローニングに最も一般的な発現系は、抗原を大
胆菌内で発現させる系である。
しかしながら、大腸菌は腸内菌叢のきわ立った部分を占
めている。したがって、ヒトの血清は大腸菌に対する抗
体を含む場合が多い。大腸菌内で生成させた抗原を抗体
のサンドイッチイムノアッセイに使用すると、一部の固
体は夾雑する細菌性物質と反応する可能性がある。この
ような反応は、特定の固体において偽陽性の結果を与え
ることがある。このような種類の偽陽性は、大腸菌から
の物質を試験サンプルと混合することによって最小限に
抑えることができる。
本発明者らは、夾雑物質に対する抗体による偽陽性の問
題を克服する新しい方法を発明した。基本的には、免疫
学的に同一の抗原を異なる生物内に組込むものである。
すなわち、異なる生物からのクローン化抗原をサンドイ
ッチの各側に配する。
試験サンプル中の検出を望まない抗体は、クローン化抗
原の一方に会合した夾雑物質と結合することはあっても
、起源が異なるので両クローン化抗原と会合した夾雑物
質と結合することはない。このようにして、偽陽性の問
題は回避できる。確実に夾雑物質を完全に含まないよう
にクローン化抗原を調製する必要がなくなることはきわ
めて重要である。アッセイの特異性は著しく改善される
抗原の調製は簡単になる。
このフォーマツ1〜におりる抗−p24および/または
抗−qp41抗体のイムノアッセイは、基本的には、(
i)抗体が結合できる抗原性配列を提供する第10組換
えペプチドを固定化した固相を試験ザンブルと接触させ
、(ii)上記抗原性配列を提供し、標識されていて、
かつ第10組換えペプチドを発現させた生物と異なる生
物内で発現させた第2の組換えペプチドを固相に接触さ
せ、ついで(iiil試験(ノンプルが上記抗体を含む
か否かを決定する各工程からなる。
第1の組換えペプチドおよび/または第2の組換えペプ
チドは、本発明の組換え蛋白質である。
第1および第2の両組換えペプチドは構造が同一である
必要はない。たとえば、一方が他方より長いことも許さ
れる。しかしながら両者とも、検出を所望の抗−p24
および/または抗−qp41に結合できる抗原性配列を
提供するものでなければならない。換言すれば、それぞ
れは同じ抗体結合部位をもたねばならない。
したがって、本発明の異なる配列を有する2種の組換え
蛋白質または本発明の同一の配列を有する2種の組換え
蛋白質が使用できる。また、一方の組換えペプチドのみ
が本発明の蛋白質である場合もある。しかしながら、こ
の場合、他のペプチドと本発明の組換え蛋白質は共通の
エピトープをもっていなければならない。
抗−p24および/またば抗−g¥:+41の検出は、
抗体が少なくとも2個の抗原結合部位をもつという事実
によっている。IgG、ICIAおよびIQEは2個、
IQMは5個の抗原結合部位をもっている。IqGを例
にとれば、抗原結合部位のひとつが固相上に固定化され
た第10粗換えペプチドに結合する。標識された第2の
組換えペプチドはIgGの第2の抗原結合部位と結合す
る。
このアッセイフォーマットにおける組換えペプチドは、
異なる生物内で操作される。両生物は少なくとも属が異
なることが好ましい。両生物は科が異なることがさらに
好ましい。たとえば、異なる細菌性発現系が使用できる
。また、一方の抗原を細菌性発現系にクローニングし、
他方は酵母または昆虫もしくは哺乳動物細胞にクローニ
ングすることもできる。一方の抗原を原核生物に他方を
真核生物システムにクローニングすることがとくに好ま
しい。クローニングに適当な宿主の例には、枯草菌、大
腸菌、放線菌、昆虫細胞、酵母および哺乳動物細胞が包
含される。ペプチドを昆虫細胞または吐乳動物細胞中で
発現させる場合、それぞれバキュロウィルスまたはワク
シニアウィルスの発現系の利用が、好ましい真核生物の
別の利用法である。原核生物宿主としては大腸菌が好ま
しい。
本発明の蛋白質はまた、I」IV−1に対するワクチン
としても使用できる。この目的では、蛋白質を医薬的に
許容される担体または希釈剤とともに医薬組成物に処方
することができる。蛋白質は注射用製剤として提供する
ことができる。適当な希釈剤としては、注射用精製水お
よび等張性食塩溶液がある。この組成物は、非経口的に
、たとえ−41= ば静脈内、筋肉内または皮下に投与される。ヒトに有効
量を投与する。通常、10〜200μqの用量を非経口
的に投与する。
次に本発明を以下の実施例により、さらに詳細に説明す
る。
添付図面において、第1図は、例1において1)DM3
22中に組込まれた好ましいenv配列を示す。第2図
は、例1においてpDM614中に組込まれた好ましい
gaq配列を示す。第3図は、例1のQaQ/enV蛋
白質のDNA配列を示す。ベクター配列はボルト体で示
しである。第4図は、例3におけるDFO日Cの禍築を
示す図である。第5図は、シャトルベクター 1)VFOHC;を示す。この配列はFMDVVPl 
 142〜160配列と真正のHBプレ]ア配列の6個
のアミノ酸で分離された2個のインフェース間始]トン
を含有する。第6図は、例3のサンドイッチELISA
の結果を示す。第7図は、例3で行られたコア反応性物
質の蔗糖勾配像を示す。
= 42− 例1 大腸菌発現構築体 ラムダQ t 10 (DNA Cloning、第1
巻、D。
H,GIOVer編、IRI  Press 、 19
85)CDNAライブラリーを標準方法(H016cu
larC1oning、 Haniatisはが著、C
o1d Spring HarborPress、19
82)によって1−111−11V(CBの英国単離体
で感染させたOEM細胞のポリ(A” )−RNAから
構造した。CcRF−CFMと命名された白血病T−細
胞はCBI −1に係留され、F CA CC、Por
ton Down、 G、 B ニ1985年1月11
日、寄託番号第85011101号として寄託されてい
る。
全エンベロープ遺伝子を含むラムダ組換え体を同定し、
EC0RI挿入フラグメントをプラスミドベクターpu
csにサブクローニングしてプラスミドpDP4を製造
した。pDP4内のエンベロープ遺伝子の正確な位置は
、制限酵素解析および部分DNA配列決定後発表されて
いるデータと比較して決定した(Heusingほか:
 Nature、 313:450〜4.58.198
5 : 14ain−Hobson ホか: Ce1l
、 40 : 9〜17.1985 ; 5anche
z−pescadorら:5cience 、  22
7 :484〜492.1985)  。
本発明者らは、HIVゲノムの部分を、l acZ遺伝
子に対する融合フラグメントにより大腸菌に発現させた
。選択された発現ベクターはp X Y 460であっ
た。これは、読み取り枠ベクターで、強力なtacプロ
モーターは、開始ATGとβ−ガラクトシダーゼの暗号
配列が、フレーム外になっている突然変異l acZ遺
伝子に由来する。このベクターはpXY410から誘導
される(Winterら:J、 Tmmunol、13
6 : 1835〜1840,1986)。1acZ3
!伝子の開始部分に[:coRI、SmaIおよびB 
a m l−1■の制限部位がある。ここに挿入された
DNAフラグメンl〜は読み取り枠を元戻りにできれば
、挿入体がコードする配列にβ−ガラク1〜シダーゼの
付着した融合蛋白質が産生される。
EcoRI           Bc1mH工大腸菌
HBIOI内に係留したベクターpXY460はNcI
MB、Aberdeen、GBに1988年7月26日
、登録番号NCl840039号として寄託されている
a)エンベロープ アミノ酸542〜674をコードするHIV−1en■
遺伝子の領域をpXY460中に次の方法でクローン化
した。BamHI制限部位を含有するDNA配列を、そ
の遺伝子のヌクレオチド8276番目に挿入した。これ
により、2個のアミノ酸(Gly−Asp)が674番
目に付加され、pXY460ベクターとインフレームに
BamHI部位が導入される。
7875番目の位置(アミノ酸541)には酵素Hae
I[lの部位があり、これはI)XY460のSma■
部位とインフレームである。403 bpのHaeI[
[/BamHIフラグメン]へをアガロースゲルスライ
スから溶出し、SmaI/BamHI消化pXY460
とリゲーションした。リゲーションしたDNAで大腸菌
株TGIを形質転換し、組換え体をし−Amp−Xga
 lアガール板上、青色コロニーとして選択した。個々
の形質転換体を制限酵素消化で調べ、予想されたパター
ンのフラグメントを有する形質転換体をpDM322と
命名した。pDM322に組込まれたenv配列を第1
図に示す。
b)Gaq(コア) アミノ酸121〜356をコードする1−IIV−i 
 gaq遺伝子の領域を次の方法でpXY460内にク
ローン化した。
QaQ遺伝子内の1180番目(アミノ酸356)には
酵素Nc i I [CC(C/G)GG)の制限部位
がある。
−46= この酵素によって発生した5′オーバーハングをdCT
Pのみの存在下に大腸菌DNAポリメラーゼエのフレノ
ウフラグメントとインキュベーションして充填した。こ
の末端はpXY460の3maI部位とインフレームに
なった。同様に468番目(アミノ酸121)のpvu
■部位は1)XY460内の3maI部位とインフレー
ムなプラント末端を与えた。
Ala A la Ala Asp PvuII/Nc i 工(プラント末端)フラグメン
ト(710bp)をアガロース電気泳動、ゲルスライス
からの溶出によって精製し、3maI消化、ホスファタ
ーゼ処理pXY640とリゲーションさせた。このDN
Aで大腸菌株TG1を形質転換し、形質転換体をL−A
rr+p−Xqa lプレート上前色コロニーとして選
択した。個々の形質転換体を制限酵素消化によって調べ
、予想されたパターンのフラグメントを有する形質転換
体をpDM614と命名した。形質転換体はAIDS患
者からの血清に対する免疫活性によっても調べた。
1)DM614内に組込まれたpact配列を第2図に
示す。
C)  Ga(it/enV pDM322およびl)DM614で個々に発現された
HIV−1配列を、次の方法で合した。
1)DM614中、coac+挿入体の3′末端には、
充填したNcil:部位がSmaI部位(CCCGGG
 )の半分を与えるので、SmaI部位が残っていた。
pDM322のECoRI部位を大腸菌DNAポリメラ
ーゼ■のフレノウフラグメントを用いて充填した場合、
生成したプラント末端ばI)DM614の3maI部位
とインフレームになった。
プラスミドDM322をEC0RIで消化し、充填し、
ついで3amHIで消化し、生成した410b11フラ
グメントをゲル精製した。プラスミド1)DM614は
Sma工と3amHIで消化し、ゲル精製した。2種の
フラグメントをたがいにリゲーションし、大腸菌TG1
に形質転換した。
L−Amp−XQalプレート上で選択した青色コロニ
ーを制限酵素消化で解析した。予想された消化フラグメ
ントのパターンを有する形質転換体をpDM624と命
名した。I)DM624からの1120bp  EC0
RI/BanHI7ラグメントも、1)XY460から
全l acZ遺伝子を欠失させ3 a m t−I I
の次にインフレームな停止]トンを挿入して誘導したプ
ラスミド1)XY46Xに移し、l)DM626を作成
した。pDM626のgag/en■融合DNA配列を
第3図に示す。
d)抗原製造 組換え大腸菌株を選択メジウム(L−Ampまたはl−
−Amp−Xg a l )上で平板培養し、単一のコ
ロニーを接種して一夜培養した(<300威)。これら
の種の一部を発酵槽中、大量のメジウム(3℃まで)に
加えた。培養物の生育を監視し、oD6ooが2.0〜
2.5に達したとき、インデューサーIPTG(イソプ
ロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を最終濃度
5μ9/dになるように加えた。細菌をさらに2〜4時
間生育させ、組換え蛋白質を誘導した。
細胞を遠心分離によって収穫し、緩衝液(25mHTr
 i 5−Cj!、 pH8,0,1mHEDTA。
0.2%Non1det  P 40 )中に最終濃度
1000D6ooになるように再懸濁した。細胞から抽
出液を次の2法の一方で調製した。
(i)  再懸濁した細胞にリゾチームおよびPMSF
をそれぞれ最終濃度1■/dおよび1mmo lになる
ように加え、−夜4℃でインキュベーションした。1v
lQso4 (2nlH)とDNaseI(40μCj
/d)を加え、4℃でインキュベーションを続けた。さ
らにPMSFを加えて2n+Hとし、EDTAを511
IHに調整した。抽出液を15.0009で20分間遠
心分離して澄明化した。上澄液を傾瀉し、−70℃に保
持した。
(ii)  再懸濁した細胞を、操作圧12〜1500
0 pSiでフレンチ−プレッシャーセルに通した。
分解液にP M S FとEDTAをそれぞれ最終濃度
が2mMおよび5mMになるように加えた。抽出液を1
5.0OOyで20分間遠心分離して澄明化した。上澄
液を傾瀉して一70℃に保存した。プレッシャーセルの
通過を反復すると細胞からの抗原の放出を増大させるこ
とができる。
env/β−galおよびqaq/β−gal融合蛋白
質は、それらに組込んだβ−ガラクトシダーゼ酊素蛋白
質を使用したアフィニティークロマ1〜グラフイーによ
り、抗−ガラクトシダーゼアフィニティーカラム上また
は基質アフィニティーカラム上で精製した。この操作の
のちに、抗原はさらにサイズ排除カラムで精製すると分
析ゲル電気法IJ+により均一である。
gag/env融合蛋白質は分解細胞の不溶性分画から
、カオトロピック剤(尿素)で分画抽出することにより
精製し1:03〜8Mの尿素に溶解した分画を、フェニ
ルセファロースカラム上、8M尿素で溶出するクロマト
グラフィーによってさらに精製した。総数率は、抗原活
性で70%以上、電気泳動(SDS−PAGE)および
ウェスタンブロッティング後融合蛋白質として免疫学的
に反応するバンドの蛋白質の80%以上であった。
例2.バキュロウィルス 環系 バキュロウィルスAutographa califo
rnia核ポリへドロシスウィルス(ACNPV)は、
有用なヘルパー非依存性真核生物発現ベクターとして開
発された(Rohrnann: J、 Gen、 Vi
rol、、67:1499〜1513.1986 ;に
urodaほか;EMBOJ、 、旦:1359〜13
65.1986)。このベクターはウィルスのポリヘト
リン遺伝子の使用を可能にし、2つの魅力的な性質をも
っている。これは、ウィルスの生命ザイクルの後期に高
度に発現される。これは、ウィルスの生育を必要としな
い。異種遺伝子はポリヘトリン遺伝子内に、そのプロモ
ーターおよび他の調節要素の制御下に発現され、ポリヘ
トリン遺伝子自体は不活性化されるように導入される。
ACNPVのゲノムはきわめて大きく、直接のクローニ
ングには使用できない。代わりに転移ベクターを使用し
なければならない。転移ベクターはポリヘトリン遺伝子
と、大腸菌プラスミドたとえばpucsにおける、遺伝
子内に導入された便利な制限部位をもつ隣接配列を含有
する。ACNPVでも感染させた昆虫細胞(たとえば5
podoptera fruqiperda。
FP9)に転移ベクターを導入すると組換えを起こすこ
とができる。1%未満の頻度で生じる組換え体では、野
生型ポリヘトリン遺伝子が異種遺伝子を発現J−る配列
で置換されている。このようなウィルスはポリヘトリン
マイナスで、そのプラークの形態によって同定できる。
本発明者らは、この系で、HIV−1エンベロープ蛋白
質とqag/env蛋白質を切端型として発現させた。
a)エンベロープ 位置6190における[)ra■部位(^^■^TT)
はHIV−1env遺伝子のIIJf3点から65bp
上流にある。この部位はベクターpUc9へのクロ−ニ
ングによりpDNAl 00を作成するとBam)lI
に変換された。
、、、  TAGGAAAATATTAAGACA  
、、、、→ra1 、、、、GGATCCCCATTAAGAGA、、、、
、、。
BamHI env遺伝子内の位置8505にはBamHI部位があ
り、これがアミノ酸752における暗号配列の先端を切
る。
750  BamHI pDNAlooからの2.32kbフラグメントを上述
のようにアガロースゲル電子泳動で精製し、いわゆるバ
キュロウィルス転移ベクターpAC373(にurod
aはか)とリゲーションし、大腸菌株HB101に形質
転換した。ポリへドリンプロモーターからの発現に正し
い方向でのenv挿人体をもつ形質転換体を、制限酵素
マツピングで同定した。これを次に、ACNPXで感染
させたSP9細胞にトランスフェクションした。ポリヘ
ドリンマイナスのウィルスを同定し、プラークを標準方
法で精製した(Sumers & Sm1th: ”M
anual forBaculovirus Vect
ors and In5ect Cu1turePro
cesures”  、  Texas  Agric
ulture  Experi−mental 5ta
tion、 1986 : ”Current Toρ
1csin Hicrobiology and II
IIIIILJIIOIO(IV” 、No、 131
、The Mo1ecular Biology of
 Baculoviruses、 1986年、W、D
oerfler & P、Bohm編、Springe
r Verlag刊)。
b)Gaq/env pDNA626の1120bp EcoRI/13am
HIフラグメントはpAC373ベクターを使用して直
接発現させることはできない。それ自身の開始ATGコ
ドンをもたないからである。
このフラグメントの5′末端におけるECoRI部位を
、ATGを与えE c o RI部位をBCIIIIに
変換させる合成オリゴヌクレチドの添加によって修飾し
た。
5’   AATTCAT AGATCT ATG  
3’QaC1/enV  暗号配列はBamH工消化p
AC373にBCI I I[/BamHIフラグメン
トとしてクローン化し、上3爪のようにして組換えAc
NPVを発生させた。
C)抗原の調製 SP9細胞の新鮮な培養液を、感染多重度1〜10で組
換えAcNPVにより感染させた。感染細胞を撹拌した
フラスコ内に28℃で36〜72時間保持したのち、細
胞を収穫し、2〜5×107細胞/戒において1% N
on1det N P 40で分解し、抗原を放出させ
た。抗原を4℃において、15,000gで20分間遠
心分離し、透明化した。上澄液を一70℃に使用時まで
保存した。
抗原は、レンズ味豆レクチンのカラム上アフィニティー
クロマドグフィーで精製できる。この方式で調製した抗
原は111胞分解液から有意に精製されているが、分析
的に純粋ではない。
例3. ワクシニアウィルス発現系 口蹄疫ウィルス(FMDV)の主要抗原エピトープがB
型肝炎コア抗原(HBCAg)に融合した融合蛋白質を
構築するために、2種のクローンを使用した。HBcA
gを提供するひとつのクローンはP、 Ilighfi
eld博士から恵与された(pWRl−3123>。こ
のクローンは、大腸菌蛋白質TRPEに対する融合蛋白
質として細菌内で発現できるようにNH2末端を修飾し
た。大腸菌1−I B 101に係留して、pWRl−
3123は、N CI B 、、Aberdeen、 
G Bに1987年3月6日、登録番号NClB124
23として寄託されている。
β−ガラクトシダーゼのアミノ末端に連結された01 
KaurbeurenからのFMDV  VPl  1
42〜160配列を提供する第2のクローンは、H1n
ther博士から恵与された( pWRL 201、W
intherら:J、 1mmuno1..136 :
 1835.1986)。各クローンの制限酵素地図は
第4図に示す。第4図から明らかなように、FMDV配
列とβ−ガラクトシダーゼの間の接合部はBamHI部
位からなる。したがって、採用した方法は、FMDV配
列とHBCAQ配列の融合をこのBamHI部位で行う
ものである。
したがって、構築の第1段階は、pWRL3123のH
B CA gの5′末端における3 amHIのための
合成オリゴヌクレオチドリンカーの挿入とした。このリ
ンカ−の挿入に用いた部位は位置290におけるNar
I部位である。しかしながら、このプラスミドには第2
のNar 1部位が位置1230にも存在した。そこで
、1個のNarI部位のみで切断されたプラスミド分子
集団がアガロースゲル電気泳動で観察されるようにこの
プラスミドをNarIで部分消化し、精製した。、DN
Aポリメラーゼ■のフレノウフラグメントを使用してN
arIを平滑化し、NarI部分消化物にB a m 
l−I I部位をもつ合成オリゴヌクレオチドリンカー
をリゲーションし、生成したプラスミドを用いて大腸菌
を形質転換した。ついでクローンを制限酵マツピングに
伺して、正しいNar’l:部位におりる3 a m 
l−I Iリンカ−の存在を解析した。
1)BE208と命名したこのクローンを単離し、DN
Aを調製した。[3amhl Iリンカ−の長さは、p
WRL201 (第4図)のFMDV部位にリゲーショ
ンしたとき、翻訳読み取り枠が連続し、融合蛋白質が生
成されるようにとくに選択した。
BamHIの挿入と同時に、挿入が行われたNarI部
位は破壊されている。したがって、Bam1−II−N
arIW化により1)BE208からHBCAg配列を
取り出すことが可能であった。
これより940塩基のDNAフラグメントが生成された
。同様に、pWR1201から約3,5kbのBam1
−II−NarIフラグメントが精製された。これら2
つのフラグメントをたがいにリゲーションさせ、正しい
クローン(pFOト1c)を制限酵素マツピングで同定
した。
第4図から明らかなように、pFOHcはtacプロモ
ーターの制限下に細菌細胞から発現させることかできる
。しかしながら、ハイブリツド遺伝子のワクシニアウィ
ルス(■V)シャ1〜ルベクターへの転移を容易にする
ために、プラスミドpFOHcを1個のNar■部位で
切断し、合成リンカ−として第2のEcoRI部位を導
入した。これにより全ハイブリッド遺伝子をEcoRI
フラグメントとして単離することが可能となった。
■Vラシャルベクターは、ベクターp113J△R1A
 (Newtonら: Vaccines  B 6 
: New^pproach to Immunisa
tion、 Co1d Spring HarborL
aboratory 、 303〜309頁、1986
)から外来の■■配列を欠失させて誘導した1)Vpl
lにとした。このシャトルベクターはVVチミジンキナ
ーゼ(TK)遺伝子に挿入されたVVプロモーター(こ
の場合p11K)を有する。このベクターはVVpHに
プロモーターとAUGの直後に唯一のECoRI部位を
もっていル(Bertl′1O1etら:PNAS、8
2: 2096.1985)。このECoRI部位とA
UGは、71)FOHc中のハイブリッド遺伝子のアミ
ン末端EcoRI部位と同じ読み取り枠にある。したが
って、F M D V−l−I B c A o遺伝子
はEcoRI切断脱リン酸化すVp11 k中にEC0
RIフラグメントとして挿入した。このハイブリッド遺
伝子をpllにプロモーターに対して正しい方向に有す
るクローンを制限酵素地図マツピングで同定した。この
クローンは1)VFOHcと命名したく第5図)。
このシャトルプラスミドを次に、隣接TK配列を用いた
同種組換えにより、pHにプロモーターの制御下、■■
のWyeth  (U Sワクチン)株のゲノムに挿入
した。TK−表現型の個々の子孫プラークについて、ド
ツトプロットハイブリダイゼーションにより、FMDV
−HBCAG  DNAの存在をスクリーニングした。
野生型Byeth )および組換え体(vFOHc)感
染細胞からのcv−i細胞分解物について、コア抗原の
存在およびFMDV配列をサンドイッチELISAでス
クリーニングした。感染細胞からの抗原は、FMDウィ
ルス粒子(1463)またはウサギにおいて励起したF
MD  VPl  141〜160抗血清を用い、FL
ISAプレートに結合させた。捕捉された各抗原につい
て、次に、各モルモット抗血清との結合および抗モルモ
ットペルオキシダーゼ抱合体の生成によって、HBc、
FMD146SまたはFMD  VPl  142〜1
60エビ1−−プの存在を調べた。結果は第6図に示す
。第6図から明らかなように、VFO日C日東感染細胞
分解物の蛋白質組換え体は抗−FMDV141〜160
抗血清に捕捉され、ついでこの蛋白質はサンドイッチE
IISAにおいて抗HBG、抗FMDV141〜160
およびFMDV抗ピリオン血清と反応できた。
さらに、この蛋白質は超遠心で精製することが可能で、
このことはそれが粒子の性質をもつことを示している。
これは、遠心分離生成物を蔗糖密度勾配で沈降させ、分
画についてコア抗原の存在をELISAで再び評価する
ことによりさらに明確に示された。組換え(VF’0H
C)ワクシニアウィルス感染細胞からの細胞分解物また
は細菌発現天然コア抗原を15〜45%蔗糖勾配上で分
画した。分画を、捕捉抗体としてヒト抗コア抗血清、検
出にはモルモットl−I B c抗原抗血清を用いた間
接サンドイッチELISAによりコア反応性物質の存在
を検定した。結果は第7図に示す。FMDウィルスが沈
降する位置も示す。第7図は、1−I B CA 0反
応性物質のピークが、細菌で発現させたコア粒子を平行
して遠心分離した場合に観察されるのと類似の位置に観
察されることを示している。ずなわち、FMDV  V
Pl  142〜160配列の存在はコア粒子の粒子性
を妨害しないことがわかる。
融合蛋白質が、通常の27nmコア様粒子に自己集合す
る能力をもつことは、蔗糖勾配精製物質で形成された免
疫複合体の電子顕微鏡による観察でも確認された。この
複合体はFMDV−1−I B CA g粒子を正常口
蹄疫ウィルスによって誘発された抗血清と反応させるこ
とにより形成された。この複合体は吸着されて表面被覆
グリッドを形成し、リンタングステン酸で染色されなか
った。
第6図に示したデータから期待されたように、この粒子
をHBcAqまたは合成FMDVペプチド141〜16
0に対する抗血清と反応させたのちにも、免疫複合体が
認められた。
例2において昆虫細胞から得られた抗原を予め定められ
た至適濃度で、1)H8のアミン含有緩衝液からの受動
吸着により、マイクロウェル上に被覆した。次にウェル
を高レベルのウシ蛋白質を含む溶液で表面をコーティン
グし、残った疎水性部位が完全に占拠されていることを
確認した。
b)抱合体の調製 (i)  例1において大腸菌から得た精製抗原をアル
カリホスファターゼで標識した。アルカリホスファター
ゼは、確立されたマレイミド−スルフヒドリル化学を用
い、β−ガラクトシダーゼのスルフヒドリル基に付着さ
せた。
(ii)抱合体は糖アルコールのマトリックス中、血清
蛋白質添加物とともに凍結乾燥し、使用前にアルカリホ
スファターゼの金属補因子を含有する希釈液で再構成し
た。
C)検定の実施 (i)  手順フォーマツ1〜:抗−HIV抗体の存在
を検定するサンプルをマイクロウェルに加え、45℃の
温度で30分間インキュベーションした。
残留物をマイクロウェルから洗い流し、抱合体をウェル
に加えて45℃の温度で30分間インキュベーションし
た。過剰の抱合体を洗浄して除いた。
次に、アルカリホスファターゼの存在を、前述の循環増
幅系を用いて検出した。ウェルに有意な量の酵素が結合
していれば、サンプル中におけるH I Vのエンベロ
ープ蛋白質に対する抗体の存在を示ず。
この検定を、HIVのエンベロープ蛋白質に対する抗体
を含まないことがわかっている1662個の血清とこの
抗体を含む6個の血清を用いて試験した。結果(昆虫培
養抗原)は、第1表に、大腸菌から抱合体および被覆蛋
白質の両者として誘導した抗原(大腸菌培養抗原)につ
いて実施した検定結果と比較して示す。バックグラウン
ドの着色は後者の方が高く、また真性の抗−HIV抗体
の存在によるものでなく、抗原プレバレージョンにおけ
る不純物に帰することができるシグナルを生じるサンプ
ルのあることを示している。これらのサンプルは異なる
起源から調製されたコーティング抱合抗原を用いた検定
ではシグナルを生じない。
第1表 a)バックグラウンド 昆虫培養抗原:検定バックグラウンド 0.15±0.03 0.D、単位 大腸菌培養抗原:検定バックグラウンド0.26±0.
05 0.D、単位 b)偽陽性データ(抗−coli活性による)大腸菌培
養抗原: 1662サンプル中2個に2個の偽陽性シグ
ナル 昆虫培養抗原:反応せず C)昆虫培養抗原を用いて陽性とされた陽性例6/6 の検出 古典的な競合的酵素イムノアッセイ(EIA>= 67
− を使用した。例1で得られた、626と命名したgag
/ne■融合蛋白質を、p24に対するモノクローナル
抗体(TlO2)を介して捕捉することによりマイクロ
ウェル上に被覆した。調整したウェルにサンプルを加え
、直ちに抱合抗−HI Vを加えた。サンプルは供血者
からの血清および血漿サンプル、ならびにA I DS
、AIDS関連症状および他の疾患の患者からの血清サ
ンプルであった。抱合に用いる酵素はペルオキシダーゼ
とした。約1時間インキュベーションしたのち、ウェル
を洗浄して、酵素に対する基質を添加した。
基質は3,3,5.5’−テトラメチルベンチジンであ
る。サンプル中の抗−HIVは同時に操作した標準との
比較によって確認した。結果は第2表および第3表に示
す。
第2表:供血者の血清および血漿サンプル中のHIVに
対する抗体の検出 ター ンプル せず 反応 番号 数 1  1699  1696  3  1  (0,0
6%)2  1783  1780  3  2  (
0,11%)3  2037  2034  3  1
  (0,05%)4  1908  1904   
4   2*(0,10−0,16%)計   840
2   8388   14    6(0,17%)
 (0,07%) 第3表:AIDS、AIDS関連症候群および他疾患患
者からの血清の反応性 A I D S     59    59     
59bAIDS関連  62    62     6
2症候群 高危険群d426   272    271AIDS
非関  67    1 ++0連疾患0 その(l!1f80    0     0a 確認は
ウェスタンプロットおよび/または少なくとも2種の異
なるイムノアッセイ(以下のbを除く) b  AIDS患者からの30個のサンプルは1種の別
のイムノアッセイで確認した。
C持続性−膜性リンパ腺腫、カポシ腫瘍、日和見感染お
よびHIV抗体陽性既知の患者d 確立された危険群の
患者 e 急性ウィルス疾患、自己免疫疾患、腫瘍患者 f 健康者および診断が確定していない患者゛ 矛盾の
あるサンプル(■薬剤耽溺患者)はウェスターンプロッ
トで解釈不能の結果を与えた44  矛盾のあるサンプ
ルは肉眼的に溶血が認められた これはl−11Vに対する抗体検出の標準方法である。
例1からの626をマイクロウェルに受動吸着で被覆さ
ぜた。予め1/100に希釈し1=血清50uflのサ
ンプルをウールに加えた。約30分間インキュベーショ
ンしたのちウェルからサンプルを洗い流し、抱合抗−ヒ
トゲロブリン50μ夕を加えた。抱合に用いる酵素はペ
ルオキシダーゼとした。さらに約30分間インキュベー
ションしたのち、ウェルを再び洗浄し、酵素基質を加え
た。
抗−1−11Vの存在は、同時に操作した標準との比較
によって検出した。結果は第4表に示す。
第4表:間接抗グロブリン試験 試験数        試験数 の検出 例1からの626を、例6と同様にしてマイクロウェル
に受動被覆した。調整したウェルに非希釈サンプル25
0μ(を添加した。抱合626(50uA)をサンプル
についで直ちに添加した。
約1時間インキュベーションしたのち、ウェルを洗浄し
、基質を加えた。酵素にはアルカリホスファターゼを使
用した。結果は第5表に示す。
第5表:直接サンドインチ試験 試験数        試験数 血清810*809    58     58血漿1
75*169 *1個の偽陽性血清、6個の偽陽性血漿があった(すべ
てが繰り返し偽陽性ではない)標準凝集試験を行った。
直径0.2μのプレコーティングラテックス粒子を、例
1で得られた626により受動被覆した。血清または血
漿サンプルを、装置を用いるかまたは表面上で撹拌して
、ラテックスと混合し1こ。日IVに対する抗体の存在
(粒子の凝集を生じる)は肉眼で検査するかまたは適当
な装置を用いて、試薬混合数分後に確認した。結果は第
6表に示す。
第6表ニラテックス凝集検定 試験数        試験数 血清480   479    80     80血
漿 5050 抗−ヒトゲロブリンをマイクロウェルに受動被覆した。
非希釈血清各50μ夕のサンプルを調製したウェルに添
加した。アルカリホスファターゼで標識した例1からの
626を直ちに加えた。約1時間インキュベーションし
たのち、ウェルを洗浄し、基質を加えた。抗−HIV抗
体の存在は標準との比較によって確認した。結果は第7
表および第8表に示す。
第7表:抗−ヒト捕捉検定 試験数        試験数 16     16    15*128弱い陽性3検
体、検出されず 第8表:抗−ヒト捕捉検定 試験数        試験数 138    137    46**45
【図面の簡単な説明】
第1図は、pDM322中に組込まれた好ましいenv
配列を示す。 第2図は、pDM61/l中に組込まれた好ましいga
g配列を示す。 第3図は(]ag/env蛋白質のDNA配列を示す。 第4図はDFOHcの構築を示す図である。 第5図はシャ1−ルベクターpV F Ol−I Cを
示す図でいる。 第6図は、本発明の蛋白質を用いたザンドイッヂELI
SAの結果を示す図である。 第7図は、コア反応性物質の蔗糖勾配分画の結果を示す
図である。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)(i)抗体が結合できる抗原性配列を提供する第
    1の組換えペプチドを固定化した固相を試験サンプルと
    接触させ、(ii)上記抗原性配列を提供し、かつ標識
    されている第2の組換えペプチドを固相に接触させ、(
    iii)試験サンプルが上記抗体を含むか否かを決定す
    る各工程からなるイムノアツセイにおいて、第2の組換
    え抗原は第1の組換え抗原を発現させた生物と属が異な
    る生物内で発現させたことを特徴とする抗体のイムノア
    ツセイ。
  2. (2)組換えペプチドの一方は原核生物内で発現させ、
    他方は真核生物内で発現させた特許請求の範囲第1項に
    記載のイムノアツセイ。
  3. (3)組換えペプチドの一方は大腸菌内で発現させ、他
    方はバキユロウィルスまたはワクシニアウイルス発現系
    をそれぞれ用いて昆虫細胞または哺乳類動物細胞内で発
    現させた特許請求の範囲第2項に記載のイムノアツセイ
  4. (4)組換えペプチドはHIVgagおよび/またはe
    nv配列である特許請求の範囲第1項から第3項までの
    いずれかに記載のイムノアツセイ。
  5. (5)(i)抗体が結合できる抗原性配列を提供する第
    1の組換えペプチドを固定化した固相と(ii)上記抗
    原性配列を提供し、かつ標識されている第2の組換えペ
    プチドからなるキッドにおいて、第2の組換え抗原は第
    1の組換え抗原を発現させた生物と属が異なる生物内で
    発現させたことを特徴とする抗体のイムノアツセイ用試
    験キット。
  6. (6)配列: 【遺伝子配列があります。】 を有する蛋白質、またはその1個もしくは2個以上のア
    ミノ酸の置換、挿入および/もしくは欠失、ならびに/
    または一方の末端もしくは両末端の延長によつて修飾さ
    れた蛋白質(ただし、修飾配列を有する蛋白質も抗−p
    24および抗gp−41の両者と結合可能であつて、修
    飾および非修飾配列問のホモロジーは少なくとも75%
    である)。
  7. (7)(i)蛋白質コードする遺伝子が組込まれ、宿主
    細胞内でその蛋白質を発現できるベクターによつて宿主
    細胞を形質転換し、(ii)形質転換宿主細胞を培養し
    て上記蛋白質を発現させ、(iii)その蛋白質を回収
    することによる組換え蛋白質の製造方法において、遺伝
    子は特許請求の範囲第6項に記載の蛋白質をコードする
    ことを特徴とする製造方法。
  8. (8)試験サンプルを抗−P24および/または抗gp
    −41 HIV−1抗体に結合できる蛋白質と接触させ
    、抗体が蛋白質に結合したか否かを決定する抗−P24
    および/または抗−gp41HIV−1抗体のアツセイ
    において、蛋白質は特許請求の範囲第6項に記載の蛋白
    質であることを特徴とするアツセイ。
  9. (9)抗−p24および/または抗−gp41HIV−
    抗体に結合可能な蛋白質、および試験サンプル中の抗体
    がその蛋白質に結合したか否かを決定するための手段か
    らなる抗−p24および/または抗−gp41 HIV
    −1抗体のアツセイ用キットにおいて、その蛋白質は特
    許請求の範囲第6項に記載の蛋白質であることを特徴と
    するキット。
  10. (10)医薬的に許容される担体または希釈剤と、活性
    成分として特許請求の範囲第6項に記載の蛋白質を含有
    することを特徴とする医薬組成物。
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