PT88416B - Processo para determinacao imunologica de anticorpos e processo para a preparacao de uma proteina com capacidade de ligacao a anticorpos e de composicoes farmaceuticas que a contem - Google Patents

Description

Descrição

SP ·

A presente invenção refere-se a um processo imunológico para a determinação de anticorpos e para a preparação de conjuntos de análise (kits) para utilização nessas determinações imunológicas.

Os sistemas de expressão mais comuns para antigenes de clonagem são os sistemas em que os antigenes são expressos em E.coli. No entanto o E.coli ocorre de forma notável como um constituinte da flora intestinal. Por conseguinte, muitos soros humanos contém anticorpos contra E.coli. Quando

- 1 Í««5W*A*U’

se utilizam antigenes produzidos em E. coli em análises imunológicas do tipo sandwich para anticorpos, existe a posssibilidade de que alguns individuos possam reagir com material bacteriano contaminante. E_sta reacção pode dar lugar a um resultado falso positivo para este individuo em particular. Este tipo de resultados falsos positivos podem ser minimizados por mistura de material de E,coli com uma amostra a analisar.

Desenvolvemos agora um' novo modo de ultrapassar o problema do material contaminante. Essencialmente manipulam-se geneticamente em diferentes organismos antigenes imunologicamente idênticos. Proporcionam-se portanto antigenes clonados a partir de diferentes organismos nos quais nos dois lados da sandwich. tfav- anticorpo que não se pretenda detectar numa amostra a analisar pode ligar-se o material contaminante associado com um dos antigenes clonados mas, uma vez que são de origens diferentes, não se liga a contaminantes associados com ambos os antigenes clonados. Deste modo é possível evitar os resultados falsos positivos, á importante notar que neste caso não é necessário assegurar que os antigenes clonados estejam absolutamente isentos de proteínas contaminantes. A especificidade do processo de determinação é muito melhorada. A preparação dos antigenes é simplificada.

DgSte modo, a presente itítvenção proporciona um processo de determinação imunologica para um anticorpo que compreende as fases de:

(i) fazer contactar uma fase sólida, na qual se encontra imobilizado um primeiro peptídeo recombinante que apresenta uma sequência antigénica a qual o anticorpo é capaz de se ligar, com uma amostra a analisar;

(ii) fazer contactar a fase sólida com um segundo peptídeo recombinante que apresenta a referida sequência antigénica e

que está marcado; e (iii) determinar se a amostra a ai alisar contem qualquer quantidade do referido anticorpo.

Qualquer anticorpo pode ser analisado deste modo. Os peptídeos recombinantes devem ambos incluir o mesmo local de ligação de um anticorpo. A detecção depende do facto de os anticorpos terem pelo menos dois locais de combinação de antigenes, dois para IgA e IgE e cinco para IgM. Tomando IgG como exemplo, um dos locais de combinação de antigenes liga-se com o primeiro peptideo recombinante que está imobilizado numa fase sólida. O segundo peptideo recombinante marcado liga-se com o segundo local de combinação de antigene de IgG.

Os peptídeos recombinantes são integrados em organismos de géneros diferentes. De preferência, cada organismo é de uma família diferente. Por exemplo, podem ser usados sistemas de expressão bacterianos diferentes. Em alternativa, podem ser usados um antigene clonado num sistema de expressão bacteriana e um outro clonado numa levedura ou em células de insectp ou de mamífero. De modo especialmente preferido, um antigene é clonado num organismo procariótico, enquanto que o outro é clonado num sistema eucariótico. E_ntre os exemplos de hospedeiros adequados para a clthnagem incluem-^εθ B. subtilis, E. coli, Streptomyces, células de insecto, leveduras e células de mamífero. As alternativas eucarióticas preferidas são um sistema de expressão de baculovirus ou um sistema de expressão de variola bovina, nos quais os peptídeos são expressos em células de insecto ou de mamífero respectivamente. Um hospedeiro procariótico preferido é o

E.coli..

Os peptídeos recombinantes primeiro e segundo não necessitam ser idênticos na sua estrutura, Ê possível gue um seja mais comprido do que o outro. Os dois peptí** 3 — deos devem conter, no entanto, a sequência antigénica à qual o anticorpo que se pretende detectar é capaz de se ligar.

P_or outras palavras, cada um dos peptídeos devem incluir o mesmo local de ligação de anticorpos. No termo peptídeo incluimos proteínas.

Qualquer marcação apropriada pode ser fixada no segundo peptídeo recombinante. A marcação pode ser uma enzima, um rádioisótopo ou outro reagente que proporcione uma actividade colorimétrica ou fluorimétrica. Uma marcação preferida é a fosfatase alcalina. Pode ser iniciada uma reacção cíclica de amplificação usando a marcação. A fosfatase alcalina reage com o substrato nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADP) a fim de formar nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD). 0 NAD é utilizado numa reacção de ciclizaçâo que envolve de-hidrogenase de álcool, diaforase e violeta de iodonitrotetrazílio que conduz a um produto corado.

processo de determinação imunológica é particularmente adequado para utilização na determinação da presença de anticorpos de HIV, especialmente de anticorpos de HIV-1, numa amostra. Podem proporcionar-se antigenes de HIV clOnados de diferentes origens. Os antigenes podem ser sequências gag e)ou env. 0 HIV-1 provoca em particular dois tipos de anticorpos. Estes anticorpos são o anti-p24 contra a proteína gag e o anti-gp4l contra a proteína env.

A sequência preferida gag corresponde aos ácidos aminados 121-356. E_sta sequência incorpora toda a sequência da proteína p24. A sequência preferida env correspon de aos ácidos aminados 542-674. As vantagens desta sequência sp41 residem na circunstância de que é semi-solúvel e de que inclui o epitopo dominante do gene de env. A numeração está de acordo com Meusing et al., N_ature 313 450-458 (1985).

D_e preferêndia, cada sequência é fundida a p-galactosidase (β-gal). E_sta fusão facilita a purificação

por cromatografia de afinidade usando uma coluna de afinidade anti-galactosidase ou uma coluna de substrato. Sm alter nativa, as duas sequências podem ser fundidas entre si sob a forma duma proteína de fusão gag/env. Uma seroconversão precoce pode ser tanto contra o antigene gag como contra o antigene env ou contra ambos. É desejável, por conseguinte, que tanto o primeiro como o segundo peptídeo recombinante contenham tanto a sequência gag como a sequência env. As proteínas de fusão gag/p-gal e env β/gal podem ser usadas para chegar a este resultado ou a proteína de fusão gag/env pode ser usada para este fim.

Uma proteína de fusão gag/env preferida é uma proteína com a sequência:

20 MetAsnSerProAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsnTyrProIleValGln pl8> p24>

40

AsnlleGlnGlyGlnMetValHisGlnAlalleSerProArgThrLeuAsnAlaTrpVal

60

LysValValGluGluLysAlaPheSerProGluValIleProMetPheSerAlaLeuSe r

80

GluGlyAlaThrProGlnAspLeuAsnThrMetLeuAsnThrValGlyGlyHi sGlnAla

100

AlaMetGlnMetLeuLysGluThrlleAsnGluGluAlaAlaGluTrpAspArgValHi s

110 120

ProValHisAlaGlyProIleAlaProGlyGlnMetArgGluProArgGlySerAspIle

130 140

AlaGlyThrThrSerThrLeuGlnGluGlnlleGlyTrpMetThrAsnAsnProProIle

150 160

ProValGlyGluIleTyrLysArgTrpIlelleLeuGlyLeuAsnLysIleValArgMet

170 180

TyrSerProThrSerlleLeuAspIleArgGlnGlyProLysGluProPheArgAspTyr

190 200

ValAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp

210 220

MetThrGluThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysThrlleLeuLysAla

230 240

LeuGlyProAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaCysGlnGlyValGlyGlyPro

250 260

AsnSerProArgGlnLeuLeuSerGlylleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla gp41>

270 280

IleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla

290 300

ArglleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCys

310 320

Se rGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSer

330 340

LeuGluGlnlleTrpAsnAsnMetThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyr

350 360

ThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln

370

GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnGlyAspPro;

— opcionalmente modificada por uma ou várias modificações de ácidos aminados, inserções e/ou supressões e/ou por uma extensão em qualquer das extremidades ou em ambas desde que uma proteína com a sequência modificada desse modo conserve a capacidade de ligação tanto a anti-p24 como a anti-gp41 e que haja um grau de homologia de pelo menos 75 % entre a sequência modificada e a sequência não modificada.

A sêquência não modificada é basicamente uma fusão de partes das proteínas p24 e gp41 do produto CBL-1 isolado de HIV-1 (WO 86/04423). Estas partes correspondem aos ácidos aminados 121 a 356 e 542 a 674 respectivamente. 0 início destas partes é apresentado sobre os ácidos aminados 17 a 244 respectivamente. Os ácidos aminados 5 a 16 anteriormente apresentados são derivados da proteína pl8. Os ácidos aminados 1 a 4, 241 a 243 e 377 a 379 anteriormente apresentados são derivados do vector de expressão do qual a construção de fusão foi obtida e de manipulações de ADN.

A sequência pode ser modificada por uma ou por várias modificações, inserções e/ou supressões de ácidos aminados. E_stes alterações podem ocorrer em qualquer ponto da sequência mas especialmente nas partes da sequência que não são derivadas das proteínas p24 egp41. No caso de substituições, um ou vários dos ácidos aminados da sequência não modificada podem ser substituídos por um ou vários outros ácidos aminados que conservam o carácter físico-químico da sequência, isto é, em termos de densidade de carga, hidrofilicidade/hidrofobicidade, dimensão e configuração. P_or exemplo, Ser pode ser substituída por Thr e vice versa, Glu pode ser substituído por Asp e vice versa e Gin pode ser substituída por Asn e vice versa. 0 resíduo de Ser no ácido aminado 10 pode ser substituído por Asn.

A sequência pode ser também alongada numa ou nas duas extremidades.Este alongamento pode não ser mais do que uma adição de um resíduo Cys carboxi-terminal.

No entanto, a sequência pode ser alongada por adição de um máximo de 50 residuos de ácidos atninados a qualquer das extremidades. Podem ser adicionados por conseguinte um máximo de 40 ácidos aminados, por exemplo até 20 ácidos aminados, à extremidade amino-terminal e/ou carboxi-terminal da sequência não modificada. 0 ácido aminado amino-terminal.

no entanto, será normalmente Met devido ao codão de inicio de tradução da sequência de ácidos nucleicos a partir das quais a proteína é expressa. Esta circunstância ocorre a meno que a proteína tenha sido expressa fundida pela sua extremidade amino-terminal a uma proteína de transporte e que a proteína tenha sido cindida para libertar a proteína da prese: te invenção.

A sequência pode ser modificada pela introdução de alterações correspondentes na sequência de ADN de codificação da proteína não modificada. Esta modificação pode ser conseguida por qualquer técnica apropriada, incluindo técnicas de restrição da sequência com uma endonudease, inserção de adaptadores, utilização de exonuclease e/ou uma polimerase e por mutagénese dirigida a um local. Pode ser facilmente determinado se a sequência de ADN modificada codificada para uma proteína modificada a qual tanto o anti-p24 como o anti-gp41 são capazes de ligação. Pratica-se a clonagem da sequência modificada num plasmídeo apropriado, transforma-se a célula hospedeira com o plasmídeo e ensaia-se a proteína que é expressa para avaliar a respectiva capacidade para se ligar a anti-p24 e a anti-gp41. Além disso, deve existir um grau de homologia de pelo menos 75%, por exemplo de 80 % ou mais ou de 90 % ou mais, entre as sequências de ácidos aminados das proteínas modificadas e não modificada.

As proteínas de fusão gag/p-gal, βην/β-gal e gag/env podem ser expressas em transformantes de E.coli. E_stas proteínas de fusão gag/p-gal e env/p-gal ou a proteina de fusão gag/env podem estar situadas num dos la- 8 -

dos da sandwich. D_e preferência, são estas proteínas de fusão que são marcadas e que constituem o(s) segundo(s) peptídeo(_s) recombi nante(_s)·

Para origem dos antigenes gag e env no outro lado da sandwich, pode ser utilizado qualquer sistema de expressão apropriado. De preferência, no entanto, utiliza-se um sistema de expressão de baculovirus no qual o gene da poliedrina incorpora ou se encontra substituido por uma sequência de ADN que codifica para as sequências antigénicas gag e/ou env. O peptídeo recombinante é expresso em células de insecto. D_e modo típico, o hospedeiro é Spodoptera fruqiperda. P_ode ser expressa uma sequência env maior que incorpora pelo menos os ácidos aminados 542-674, por exemplo uma sequência env que corresponde aos ácidos aminados 24 a 750. Os peptídeos clonados usando o sistema de expressão de baculovirus são de preferência os peptídeos que se encontram imobilizados na fase sólida.

Para levar a efeito o processo imunológico de determinação, o primeiro peptídeo recombinante é imobilizado numa fase sólida. A fase sólida pode ser constituida por esferas de poliestireno, microalvéolos de plástico, etc.. 0 peptídeo pode ser adsorvido na superfície da fase sólida ou ligado na fase sólida ao anticorpo. Faz-se em seguida contactar uma amostra a analisar com a fase sólida. A amostra a analisar pode ser constituida por uma amostra de qualquer fluído fisiológico apropriado, por exemplo urina, plasma ou soro. 0 anticorpo na amostra a analisar que é específico para o peptídeo imobilizado na fase sólida liga-se ao peptídeo. Qualquer anticorpo na amostra a analisar que é específico para material contaminante derivado do hospedeiro no qual o peptídeo foi clonado pode ligar-se a este material.

segundo peptídeo recombinante marcado é t ambém feito contactar com a fase sólida. E_ste contacto

- 9 pode ser realizado apos se ter feito contactar a amostra a analizar com a fase sólida. Em alternativa, as duas operações podem ser efectuadas simultaneamente. O anticorpo na mostra a analisar que se liga ao primeiro peptídeo também se liga ao segundo epeptídeo marcado a pode deste modo ser detectado. 0 anticorpo na amostra a analisar que se liga aos contaminantes derivados do hospedeiro associados com o primeiro peptídeo não se liga a quaisquer contaminantes marcados derivados do hospedeiro associados com o segundo peptídeo e vice-versa. Os falsos positivos podem deste modo ser evitados.

processo de determinação imunológica pode ser realizado de modo qualitativo, isto é, pode ser levado a efeito simplesmente para detectar a presença ou a ausência de um anticorpo particular numa amostra a analisar. Em alternativa, o processo pode ser realizado de modo quantitativo ou semi-quantitativo a fim de dar uma medida de quanto anticorpo existe na amostra.

Os materiais para utilização no processo de determinação imunológica podem ser apresentados num conjunto de análise (test kit). Este conjunto de análise no malmente contém:

(_a) uma fase sólida na qual se encontra imobilizado um primeiro peptídeo recombinante que apresenta uma sequência antigénica à qual o anticorpo possui a capacidade de se ligar; e (fc>) um segundo peptídeo recombinante que apresenta a referida sequência antigénica, que contém uma marcação e que foi expresso num organismo de um género diferente do género em que se expressou o primeiro peptídeo recombinante.

Q conjunto de análise pode incluir também um substrato para a parcação quando a marcação é efec-

tuada por uma enzima. Podem também existir outros componentes como líquidos de lavagem e reguladores. 0 conjunto pode ainda conter matériais para levar a efeito um segundo processo de determinação imunológica juntamente com o processo principal. 0 segundo processo de determinação imunológica pode ser para um anticorpo diferente, podendo neste caso ser efectuado de modo semelhante.

Se o segundo processo de determinação imunológica se destina a determinar se a amostra a analisar contém também um antigene particular, pode existir adicionalmente imobilizado na fase sólida um anticorpo com capacidade de ligação ao antigene. Existe também um segundo anticorpo marcado para a detecção do antigene ligado ao primeiro anticorpo. C_ada um dos anticorpos pode ser monoclonal ou policlonal. Os dois anticorpos podem possuir a capacidade de se ligarem a diferentes locais do antigene. Quando o antigene é polimérico, os anticorpos podem ser capazes de se ligarem ao mesmo local. 0 segundo anticorpo marcado é feito contactar com a fase sólida ao mesmo tempo que a amostra a analisar ou susequentemente. A marca pode ser igual à do segundo peptídeo recombinante quando apenas se necessita de uma indicação da presença de um anticorpo e/ou de um antigene que se pretende detectar na amostra a analisar.

É deste modo possível proporcionar um processo de determinação imunológica tanto para os anticorpos de HIV, em particular para anticorpos de HIV-1, como para o antigene de superfície da heptatite B (HBsAg). A análise para os anticorpos de HIV pode ser efectuada usando os antigenes já descritos. Podem ser utilizados dois anticorpos diferentes para HBsAg para a análise de HBsAg, reagindo cada um com um local diferente do antigene. C_ada um dos anticorpos pode ser monoclonal ou policlonal. D_e preferência cada um dos anticorpos é um anticorpo monoclonal de tal modo que a fase sólida pode ser contactada com a amostra a analisar e com o segundo anticorpo marcado.

simultaneamente, de preferência as marcas no segundo peptideo recombinante para utilização na detecção dos anticorpos de HIV e no segundo anticorpo específico para HBsAg são as mesmas.

processo de determinação imunológica para os anticorpos de HIV pode ser usado como um ensaio de prognóstico. Os indivíduos infectados por HIV-1 inicialmente tem um título alto razoavelmente constante de anticorpo anti-p24 quando não apresentam sintomas de SIDA. P_or outro laêo, um título de anticorpo anti-p24 baixo ou decrescente esta associado de modo significativo com a progressão clínica e representa uma indicação para o início da SIDA ou do complexo relacionado com SIDA (ARC) (Weber et _al. (1985) The Lancet, 17 de Janeiro).

A fim de efectuar um ensaio de prognóstico, é necessário por conseguinte seguir o título de anticorpo anti-p24 num individuo durante um determinado período de tempo. Um processo de determinação imunológica pode ser pojr conseguinte ser conduzido usando peptídeos p24 clonados obtidos a partir de diferentes organismos. São preferidos as construções de p24 discutidas anteriormente. Quando o título de anticorpo anti-p24 decresce, considera-se o facto como sendo um sinal de um mau prognóstico.

A presente invenção também se refere a um processo para a preparação de construções de fusão e a um processo de determinação de anticorpo anti-HIV-1 e de preparação de uma vacina que contém estas construções.

Foram já propostas vários processos para a determinação do anticorpo anti-HIV-1. No entanto, existem problemas com a ocorrência de resultados falsos positivos e ffalsos negativos. 0 HIV-1 provoca em particular dois tipos de anticorpos. E_stes anticorpos são o anticorpo anti-p24 contra a proteína gag e o anticorpo anti-gp41 contra a proteína env.

NÓs preparamos agora uma construção de fusão específica à qual tanto o anticorpo anti-p24 como o anticorpo anti-gp41 se ligam. Esta construção permite processos de determinação precisos e sensíveis que podem ser levados a efeito sem o risco de resultados falsos positivos ou falsos negativos.

A presente invenção refere-se também a um processo para a preparação de uma proteína com a sequência:

MetAsr.SerProAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsnTyrProIleValGln plS> p24>

40

Asn i leGlr.GlyGlnMe tVa 1 Hi sGlnAl alleSerP roAr gThrLeuAsnAlaTrpVal

60

LysVaiValGluGluLysAlaPheSerP roGluValIleProMetPheSe rAlaLeuSer

80

GiuGlyAlaTh rP roGlnAspLeuAsnTh rMetLeuAsnTh rValGlyGlyHisGlnAla

100

AlaMerGlnMetLeuLvsGluThrl1eAsnGluGluAlaAlaGluTrpAspA rgValH i s

110 120

P r o7a1Hi sAlaGlyP rol1eAlaP roGlyGlnMetAr gGluPr oAr gGlySe rAspI1e

130 140

AlaGlyThrThrSe rThrLeuGlnGluGlnlleGlyTcpMe tThcAsnAsnProProIle

150 160

PrcValGlyGlulleTyrLysArgTrpIleIleLeuGlyLeuAsnLysIleValAr gMe t

170 180

Ty zSe r? roTh rSe r11eLeuAspI1eArgGlnGlyP roLysGluP roPheArgAspTy r

190 200

ValAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp

210 220 MetThrGluThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysThrIleLeuLysAla

230 240

LeuGiyProAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaCysGlnGlyValGlvGlyPro

250 260

AsnSerProArgGlnLeuLeuSerGlylleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla gp41 >

270 280

IleGluAlaGlnGlnHi sLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla

290 300

ArglXeLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCys

310 320

SerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSer

330 340

LeuGluGlnl1eTrpAsnAsnMetThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyr

350 360

ThrSe rLeuIleKisSe rLeuIleGluGluSe rGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln

370

GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSe FLeuTrpAsnTrpPheAsnGlyAspPro ;

opcionalmente modificada por uma ou várias modificações de ácidos aminados, inserções e/ou supressões e/ou por uma extensão em qualquer das extremidades ou em ambas desde que uma proteína com a sequência modificada desse modo conserve a capcidade de ligação tanto a anti-p24 como a anti-gp41 e que haja um grau de homologia de pelo menos 75% entre a sequência modificada e a sequência não modificada.

A sequência mão modificada é basicamente uma fusão de partes das proteínas p24 s gp41 do produto CBIj-1 isolado de HIV-1 (WO 86/04423). Estas partes correspondem aos ácidos aminados 121 a 356 e 542 a 674 respectivamente, seguido um sistema de numeração semelhante ao de Meusing et a_l., N_ature, 313 , 450-458 (1985). 0 início destas partes é apresentado sobre os ácidos aminados 17 a 244 respectivamente. Os ácidos aminados 5 a 16 anteriormente apresentados são derivados da proteína pl8. Os ácidos aminados 1 a 4,

241 a 243 e 377 a 379 anteriormente apresentados são derivados do vector de expressão do qual a construção busão foi obtidae de manipulação de ADN.

A sequência pode ser modificada por uma ou por várias modificações, inserções e/ou supressões de ácidos aminados. Estas alterações podem ocorrer em qualquer ponto de sequência mas especialmente nas partes da sequência que não são derivadas das pSoteínas p24 e gp4l. No caso de substituições, um ou vários dos ácidos aminados da sequência não modificada podem ser substituidos por um ou vários outros ácidos aminados que conservem o carácter físico-químico da sequência, isto e, em termos de densidade de carga. hidrofili cidade/hidrofobicidade, dimensão e configuração. P_or exemplo. Ser pode ser substituída por Thr e vice versa, Glú pode ser substituído por A_sp e vice versa e Gin pode ser substituída por Asn e vice versa. 0 resíduo de Ser no ácido aminado 10 pode ser substituído por Asn.

Ρ—η—ΜίΤΜ**^

A sequência pode ser também alongada numa ou nas duas extremidades. Egte alongamento pode não ser mais do que uma adição de um resíduo Cys carboxi-terminal.

No entanto, a sequência pode ser alongada por adição de um máximo de 50 resíduos de ácidos aminados a qualquer das extremidades. Podem ser adicionados por conseguinte um máximo de 40 ácidos aminados, por exemplo até 20 ácidos aminados, à extremidade amino-terminal e/ou carboxi-terminal da sequência não modificada. 0 ácido aminado amino-terminal, no entanto, será normalmente Met devido ao codão de início de tradução da sequência de ácidos nucleicos a partir das quais a proteína é expressa. Esta circunstância ocorre a menos que a proteína tenha sido expressa fundida na sua extremidade amino-terminal a uma proteína de transporte e que a proteína tenha sido cindida para libertar a proteína da presente invenção.

A sequência pode ser modificada pela introdução de alterações correspondentes na sequência de ADN de codificação da proteína não modificada. E_sta modificação pode ser conseguida por qualquer técnica apropriada, incluindo técnicas de restrição da sequência com uma endonuclease, inserção de adaptadores, utilização de exonuclease e/ou uma polimerase e mutagénese dirigida a um local. Pode ser facilmente determinado se a segugncia de ADN modificada codifica para uma proteína modificada à qual tanto o anti-p24 como o anti-gp41 são capazes de ligação. Pratica-se a clonagem da seguéncia modificada num plasmídeo apropriado, transforma-se a célula hospedeira com o plasmídeo e ensaia-se a proteína que é expressa para avaliar a respectiva capacidade para se ligar a anti-p24 e a anti-gp41. Além disso, deve existir um grau de homologáa de pelo menos 75%, por exemplo de 80% ou mais ou de 90% ou mais, entre as sequências de ácidos aminados das proteínas modificadas e não modificadas.

τ

Ο processo da presente invenção para a preparação de uma proteina como a referida compreende:

(i) a transformação de uma célula hospedeira com um vector que incorpora um gene de codificação para uma proteína e que possui a capacidade de expressar a proteína na célula hospedeira?

(li) a cultura da célula hospedeira de modo a que a proteína seja expressa? e (iii) a recuperação da proteína.

gene que codifica para a proteína e de preferencia construído em duas partes, uma parte amino-terminal que contém a sequência de ADN que codifica para os resíduos de ácidos aminados de p24 e uma parte carboxi-terminal que codifica para os resíduos de ácidos aminados de gp41. As duas partes são em seguida fundidas entre si e inseridas num vector de expressão. 0 gene contém sequências de regulação de transcrição e codões de início e de paragem da tradução apropriados. 0 gene é por conseguinte inserido no vector de expressão no quadro de leitura correcto com respeito ao codão de início ATG sob a regulação de um promotor.

Pode ser utilizado qualquer vector de expressão adequado, por exemplo um plasmídeo ou um vector virai como seja um baculovirus recombinante ou um virus de varíola bovina recombinante. Os hospedeiros transformados com o vector de expressão podem ser eucarioticos ou procarióticos, por exemplo microorganismos unicelulares ou células de mamífero. Como.hospedeiros eucarioticos unicelulares podem mencionar-se Saccharomyces cerevisiae, S.Klyyeromyces e S. pombe. Como hospedeiros procarióticos podem usar-se estirpes de bactérias como por exemplo E.coli, B.subtillis. ou B.thermophilus. Considera-se preferido E.coli. o hospedeiro transformado e cultivado e a proteína que é expressa é recuperada.

Uma proteína da presente invenção pode ser utilizada em processos de determinação imunológica para os anticorpos anti-HIV-1, em particular para anti-p24 e/ou anti-gp41. Pode ser utilizado no processo uma amostra a analisar de qualquer fluído fisiologic amente apropriado, por exemplo urina, plasma, sangue ou soro. 0 processo compreende o contacto de uma amostra a analisar com uma proteína da presente invenção e a verificação de se qualquer anticorpo anti-p24 e/ou anti-gp41 se ligua à proteína. Para este fim, pode proporcionar-se um conjunto de análise (test kit”) que compreende uma proteína da presente invenção e meios para a verificação de se qualquer anticorpo anti-p24 e/ou anti-gp41 que possa existir na amostra a analisar se liga à proteína.

Podem ser utilizados vários modos de determinação. A proteína pode ser utilizada para a captura selectiva de anticorpos anti-p24 e/ou anti-gp41 a partir da solução, para a marcação selectiva de anticorpos anti-p24 e/ou anti-gp41 já capturados. Além disso, a proteína pode ser usada em vários modos de determinação homogénia nos quais os anticorpos que reagem com a proteína são detectados em solução sem separação de fases. A proteína pode também ser usada para a detecçâo de antigenes de HIV-1.

Os tipos de determinação nos quais a proteína é usada para capturar anticorpos a partir da solução engloba a imobilização da proteína numa superfície sólida. Egta superfície deve ser capaz de ser lavada de algum modo. As espécies de superfícies qne podem ser usadas são polímeros de vários tipos (moldados em alvéolos de microtitulação? esferas; cilindros de vários tipos; pontas de aspiração? electródos e dispositivos ópticos), partículas (por exemplo latex; sangue estabilizado, células bacterianas ou de fungos; esporos; partículas de ouro ou de outros metais e colóides proteinácios; sendo a dimensão normal das partículas de 0,1 a 5 microns), membranas (por exemplo de —

τ

nitrocelulose; papel? acetato de celulose e membranas de alta porosidade/alta superfície específica de um material orgânico ou inorgânico).

A fixação da proteína à superfície pode ser por adsorção passiva (para a qual a proteína é idealmente adequada em virtude da sua natureza hidrofóbica) a partir de uma solução de composição óptima que pode incluir agentes tensioactivos, solventes, sais ou caótropos ou pode ser por ligação química activa. A ligação activa pode ser efectuada através de vários grupos funcionais reactivos ou activéveis que podem ser fixados à superfície (por exemplo agentes de condensação? ésteres, halogenetos ou anidridos activos? grupos amina, hidroxilo ou carboxilo? grupos sulfidrilo? grupos carbonilo? grupos diazo ou grupos insaturados). E_m alternativa a ligação activa pode ser efectuada através de outra proteína (esta última fixada passivamente ou por uma ligação activa à superfície), por exemplo através de um anticorpo policlonal ou monoclonal dirigido contra qualquer dos epitopos apresentados pela proteína ou contra todos ou através de uma proteína de suporte como por exemplo albumina ou caseina à qual a proteína pode ser ligada por via química por um qualquer de vários métodos e que pode conferir vantagens por causa do ponto isoeléctrico, carga, hidrofilicidade ou outra propriedade físico-química. A proteína pode ser também fixada à superfície (normalment e mas não necessariamente uma membrana) a seguir a separação electroforética de uma mistura reaccional, por exemplo uma precipitação imune.

Depois de fazer reagir a superfície que contém a proteína fixada com uma solução que contém o anticorpo de interesse e de eliminar o excesso da amostra quando necessário por um qualquer de vários meios (lavagem, centrifugação, filtração, magnetismo ou acção capilar), o anticorpo capturado é detectado por qualquer meio que dê um sinal detectável. Por exemplo a detecção pode ser conseguida por meio da utilização de uma molécula ou partícula marcada conforme definido anteriormente a qual reage com o anticorpo capturado (por exemplo proteína A ou proteína G ou semelhantes; anti-espécies ou anti-imunoglabulina-sub-tipo; factor reumatoide; anticorpos contra qualquer dos epítopos contidos na proteína e usados de modo competitivo ou por bloqueio; ou qualquer molécula contendo os epitopos da proteína, incluindo a própria proteína e outras proteínas e peptídeos derivados directamente ou indirectamente de HIV-1).

sinal detectável pode ssr óptico ou radioactivo ou físico-químico, proporcionado por marcação directa da molécula referida com por exemplo um corante, uma marca radioactiva, espécies electroactivas, espécies de ressonância magnética ou fluoroforos; ou indirectamente por marcação da molécula ou partícula com uma enzima que possui capacidade de dar origem a uma mudança que possa ser medida de algum modo. Em alternativa o sinal detectável pode ser devido a, por exemplo, aglutinação, efeito de diferaação ou efeito de birrefringência ocorrendo se qualquer das superfícies referidas são partículas.

Estes tipos de determinação nos quais a proteína é usada para marcação de um anticorpo já capturado necessitam de alguma forma de marcação da proteína que permite que aquele seja detectada. A marcação pode ser directa, por fixação química ou passiva à proteína, por exemplo uma marcação radioactiva, de ressonância magnética de partículas ou enzimática; ou pode ser indirecta por fixação de qualquer forma de marcação a uma molécula que po r sua vez é feita reagir com a proteína, por exemplo um anticorpo de qualquer dos epitopos da proteína, com reacção subsequente da molécula marcada com a proteína. A química da ligação de uma marcação à proteína pode ser directamente através de uma uantidade química jâ presente na proteína, como por exemplo um grupo amina ou sulfidrilo. ou através de um grupo inserido, como por exemplo uma maleimida. A captura do anticorpo pode ser em qualquer das superfícies já mencionadas» por qualquer rea20

gente, incluindo adsorção passiva ou activa, tendo como resultado a ligação de um anticorpo específico ou de complexos imunes. Em particular, a captura do anticorpo pode ser por anti-espécies ou por anti-imunoglobulina-sub-tipo, por factor reumatóide, proteínas A, G e Semelhantes ou por qualquer molécula que contenha qu alquer dos epitopos da proteína conforme descrito anteriormente.

Para as determinações nas quais a proteína é usada para proporcionar uma medida de antigenes de HIV-1 numa amostra, a proteína pode ser marcada por qualquer das vias descritas anteriormente e usada .de acordo com o modo de ligação competitivo de modo que a sua ligação a gualguer molécula específica sobre qualquer das superfícies exemplificadas anteriormente é bloqueada pelo antigene na amostra ou de um modo não competitivo quando o antigene na amostra é ligado de modo específico ou não específico a qualquer das superfícies referidas, por sua vez se liga a uma molécula bivalente ou polival ente (por exemplo a um anticorpo) e as restantes valências da molécula são usadas para capturar a proteína marcada.

Em geral em determinações homogénias a proteína e um anticorpo são marcados, de modo que, quando o anticorpo reage com a proteína em solução livre, as duas marcações interactuam, por exemplo de modo a permitir uma transferência não radioactiva de energia capturada por uma marcação para a outra marcação com detecção apropriada da segunda marcação excitada ou da primeira marcação desactivada (por exemplo por fluorimetria, ressonância magnética ou medição enzimática). A adição de um antigene ou de um anticorpo a uma amostra tem como resultado uma restrição da interacção do par marcado e este modo provoca um nível diferente do sinal no detector.

A proteína da presente invenção pode ser usada num processo de determinação imunológica em

sandwich para anti-p24 ou anti-gp41 no qual os antigenes recombinantes, que apressntam a mesma sequência antigénica mas que foi expressa em diferentês organismos, estão presentes em qualquer dos lados da sandwich. Os sistemas de expressão mais comuns para antigenes de clonagem são os sistemas nos quais os antigenes são expressos em B.coli. No entanto o E.coli ocorre de forma notável como um constituinte da flora intestinal. Por conseguinte muitos soros humanos contêm anticorpos contra E.coli. Quando se utilizam antigenes produzidos em E.coli em análises imunolágicas do tipo sandwich para anticorpos, existe a possibilidade de que alguns indivíduos possam reagir com material bacteriano contaminante. Esta reacção pode dar lugar a um resultado falso positivo para eate indivíduo em particular. Este tipo de resul tados falsos positivos podem ser minimizados por mistura de material de B.coli com uma amostra a analisar.

Desenvolvemos agora um novo modo de ultrapassar o problema dos falsos positivos d evido a anticorpos contra o material contaminante. Essencialmente manipulam-se geneticamente em diferentes organismos antigenes imunologicamente idênticos. Proporcionam-se portanto antigenes clonados a partir de diferentes organismos nos dois lados da sandwich. Um anticorpo que não se pretenda detectar numa amostra a analisar pode ligar-se a material contaminante associado com um dos antigenes clonados mas, uma vez que são de origens diferentes, não se liga a contaminantes associados com ambos os antigenes clonados. Deste modo á possível evitar os resultados falsos positivos. É importante notar que neste caso não é necessário assegurar que os antigenes clonados estão absolutamente isentos de proteínas, contaminantes. A especificidade do processo de determinação e muito melhorada. A preparação dos antigenes é simplificada.

Essencialmente, um processo de determinação imunológica de acordo com esta técnica para um anticorpo anti-p24 e/ou anti-gp41 compreende as seguintes fasess (i)

fazer contactar uma fase sólida, na qual se encontra imobilizado um primeiro peptídeo recombinante que apresenta uma sequência antigénica a qual o anticorpo é capaz de se ligar, com uma amostra a analisar;

(ii) fazer contactar a fase sólida com um segundo peptídeo recombinante que apresenta a referida sequência antigénica, que está marcado e que foi expresso num organismo diferente do da expressão do primeiro peptídeo recombinante; e (iii) determinar se a amostra a analisar continha qualquer quantidade do referido anticorpo.

O primeiro peptídeo recombinante e/ou o segundo peptídeo recombinante é uma proteína recombinante de acordo com a presente invenção. 0 primeiro e o segundo peptídeo recombinante não precisam de ser de estrutura idêntica. Ê possível que uma seja mais comprido que o outro, por exemplo. Os dois peptideos devem contudo estar presentes na sequência antigénica à qual o anticorpo anti-p24 e/ou anti-gp4l que se pretende detectar é capaz de se ligar. Por outras palavras, ambos devem conter o mesmo local ou locais de ligação de anticorpo.

Pode por conseguinte usar-sc duas proteínas recombinantes de sequências diferentes de acordo com a presente invenção ou duas proteínas recombinantes da mesma sequência de acordo com a presente invenção. Em alternativa, pode apenas um dos peptideos recombinantes ser uma proteína de acordo com a presente invenção. Nestas circunstâncias, no entanto, o outro peptídeo e a proteína recombinante da presente invenção devem apresentar um epitopo comum. 0 outro peptídeo recombinante pode ser uma fusão gag/env ou apenas um peptídeo qaq ou env.

& detenção de um anticorpo anti-p24 e/ ou anti-gp41 depende do facto de que os anticorpos tem pelo menos dois locais de combinação de antigenes, dois para igG, IgA e SgE e cinco para NgM. Tomando IgG para exemplo, um dos locais de combinação de antigenes liga-se com o primeiro peptídeo recombinado que está imobilizado numa fase sólida. 0 segundo peptídeo recombinante marcado liga-se com o segundo local de combinação de antigenes de IgG.

Os.peptídeos recombinantes deste modo de determinação são introduzidos em diferentes organismos.

De preferencia pelo menos o género dos organismos é diferente. De modo especialmente preferido, os organismos são de fãmilias diferentes. Por exemplo, podem usar-se sistemas de expressão de diferentes bactérias. Em alternativa, pode usar-se um antigene clonado num sistema de expressão bacteriano e um clonado numa levedura ou em células de insecto ou de mamífero.

De modo especialmente preferido, um antigene é clonado num organismo procftriótico enquanto que o outro é clonado num sistema eucariótico. São exemplos de hospedeiros adequados para a clonagem B.subtilis, E.coli, Streptomyces, células de insectos, leveduras e células de mamíferos. São alternativas eucarióticos preferidos um sistema de expressão de baculovirus ou um sistema de expressão em virus da varíola bovina, nos quais os pepeáideos são expressos em células de insectos ou de mamíferos, respectivamente. E.coli é um hospedeiro procariótico preferido.

Uma proteína da presente invenção pode também ser usada para vacina contra HIV-1. Para este fim, a proteína pode ser incorporada numa formulação de uma composição farmacêutica com uma substância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitável. A proteína pode apresentar-se sob a forma de uma formulação injectável. De entre os diluentes adequados podem mencionar-se água para injecçSes e solução ealina isotónica. A composição é administrada por via subcutânea. Administra-se a um paciente uma quantidade eficaz. Nor24

malmente administra-se por via parenteral uma dose de 10 a 200 _zug.

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção. Nos desenhos em anexos

A Figura 1 mostra a sequência env preferida incorporada no plasmídeo pDM322 no Exemplo 1;

A Figura 2 mostra a sequência gag preferida incorporada no plasmídeo pDM614 no Exemplo 1?

A Figura 3 mostra a sequência de ADN da proteína gag/env do Exemplo 1 com as segu^ncias relacionadas com o vector impressas a negro;

A Figura 4 mostra a construção do plasmídeo pFOHc no Exemplo 3;

A Figura 5 mostra o vector lançadeira pvFOHC, cuja sequência contém dois codões de início em fase separados pela sequência FMDV VPl 142-160 e seis ácidos aminados da sequência autêntica HB pré-núcleo;

A Figura 6 apresenta os resultados duma determinação por ELISA tipo sandwich no Exemplo 3; e

A Figura 7 mostra o perfil de gradiente de sucrose do material reactivo do núcleo obtido no Exemplo 3.

Exemplo 1» Construções de expressão, em E.coli

Gonstruiu-se por técnicas normais (Molecular Cloning (1982) Maniatis et al. Cold Spring Horbor Press) um banco de ADNc lambda gtlO (DNA Cloning vol. 1,

Editor - D.M. Glover, IRL Press 1985) a partir de poli(A+)-ARN de células CEM infectadas com o produto isolado de HIV

britânico (CBL-l). Depositaram-se células de uma linha de células T leucémicas designada por CCRF-CEM que contém CBL-l na ECACC, Porton Down, Grã-Bretanha em 11 de Janeiro de 1985 sob o número de depósito 85 01 1101.

Identificou-se um recombinante lambda contendo o gene integral do invólucro e subclonou-se o fragmento EcoRI inserido no vector plasmídeo pUC8 a fim de se obter o plasmídeo pDP4. A localização exacta do gene do invólucro em pDP4 foi determinado por comparação com dados publicados após análise por enzimas de restrição e sequênciação parcial de ADN (Meusing et al. (1985) Cell 40 9-17, Sanchez-Pescador et al. (1985) Science 227 484-492)»

Nos expressamos fracções do genoma de HIV em E.coli por fusáo de fragmentos no gene lacZ. 0 vector de expressão usado foi pXY460. Este vector é um vector de quadro de leitura livre no qual o promotor tac forte conduz um gene lacZ mutado no qual o ATG de início e a seguência de codificação para a β-galactosidase não estão em concordância de quadro. O vector é um derivado do plasmídeo pXY4lO (Winther et al. J. Immunol. 136 (1986)

1835-1840). Existem locais de restrição para EcoRI, Smal e BamHI no início do gene lacZ. Todos os fragmentos de ADN inseridos aqui que podem restaurar o quadro de leitura produzem proteínas de fusão constituídas da sequência codificada pela inserção fixada à β-galactosidase.

EcoRI BamHI

... ATG AAT TCC C GGG GAT CC.......lacZ

Smal vector pXY460, incorporado em Ξ.coli HB101, foi depositado no NCIMB, Aberdeen, Grã-Bretanha, em Julho de 1988 sob o número de acesso NCIB 40039.

a) Invólucro

A região do gene de env de HIV-1 que codifica para os ácidos aminados 542-674 foi clonada em pXY460 do modo seguinte. Introduziu-se uma sequência de ADN contendo um local de restrição BamHI no gene na posição nucleotidica 8276. 0 resultado desta operação consistiu na adição de dois ácidos aminados (Gly-Asp) na posição 674 e na introdução de um local BamHI em concordância de quadro com o vector pXY460.

674 BamHI env. ...TGG TTT AAC GGG GAT CC.......

...Trp Phe Asn Gly Asp Pro ...

Existe um local para a enzima HaelII na posição 7875 (ácido aminado 541) que está em concordância de quadro com o local Smal de pXY46O. Purificou-se o fragmento HaelII/BamHI de 403 pb poreluição a partir de uma tira de gel de agarose e ligou-se com pXY460 digerido com Smal/ /BamHI. 0 ADN ligado foi utilizado para transformação da estirpe B.coli TGl e seleccionaram-se os recombinantes sob a forma de colónias azuis em placas de agar L-Amp-Xgal. Os transformantes individuais foram caracterizado por digestão com enzimas de restrição e um dos que possuiam o padrão previsto de fragmentos foi designado por digestão com enzimas de restrição e um dos que possuiam o padrão previsto de fragmentos foi designado por pDM322. A sequência env incorporada em pDM322 é apresentada na Figura 1.

a) Gag (núcleo)

Cionou-se a região do gene de gag de HIV-1 que codifica para os ácidos aminados 121-356 em pXY46O do seguinte modo.

Existe um local para a enzima ^Ncll ^/CCÍC/GJGG/ na posição 1180 (ácido aminado 356) no interior do gene de gag.

Ncil

... GGA GGA CCC GGC ......

Gly Gly Pro Gly

A saliência 5‘ gerada por esta enzima foi alinhada por incubação com o fragmento de Klenow de polimerase I de ADN de E.coli na presença de apenas dCTP. Esta extremidade estava então em concordância de quadro com o local Smal em pXY46O. De modo semelhante, o local Pvull na posição 468 (ácido aminado 121) deu uma extremidade alinhada em concordância de quadro com o local Smal em pXY460.

Pvull . . . GCA G CA GCT GAC......

Ala A la Ala Asp

Purificou-se o fr agmento PvuII/Ncil (extremidades alinhadas) de 710 pb por electroforese em gel de agarose a partir de uma tira de gel e ligou.-se com pXY460 tratado com fosfatase e digerido por Smal. Transformou-se a estirpe E.coli TGi com o ADN e seleo&ionaram-se as colónias recombinantes por meio da sua cor azul em placas de L-Amp-Xgal. Caracterizaram-se os transformantes individuais por digestão com enzimas de restrição e designou-se um dos que apresentavam o padrão de fragmentos previsto por pDM614. Também se caracterizaram os transformantes pela sua imunorreactividade com soro de pacientes com SIDA. Na Figura 2 apresenta-se a sequência gag incorporada no plasmídeo pDM614.

c) Gag/env

Combinaram-se entre si as sequências de HIV-1 expressas individualmente em pDM322 e pDM614 do modo que se segue. Um local Smal foi retido no plasmídeo pDM614 na extremidade 3' da inserção gag porque o local Ncil pre28 -

enchido representa metade de um local Smal (CCCGGG).

Quando o local EcoRl do plasmídeo pDM322 foi preenchido usando o fragmento de Klenow de polímerase I de ADN de

E.coli, a extremidade alinhada resultante estava em concordância de quadro com o local Smal do plasmídeo pDM614.

DM324 DM322 gag ... CGA GGA GCC AAT TCC CCC AGA CAA ... env Gly Gly Pro Asn Ser Pro Arg Gin

Digeriu-se o plasmídeo DM322 com EcoRl, preencheu-se e em seguida digeriu-se com BamHI? purificou-se num gel o fragmento de 410 pb resultante. Digeriu-se o plasmídeo pDM614 com Smal e BamHI e purificou-se num gel. Ligaram-se entre si os dois fragmentos e transformou-se B.coli TG1 com eles. Sele ccion aram- se as colónias azuis em placas de L-Amp-Xgal e analisaram-se por digestão com enzimas de restrição. D_esignou-se por pDM624 um transformante que possuia o padrão previsto de fragmentos de dLgestão. Transferiu-se também o fragmento EcoRI/BamHI do plasmídeo pDM624 de 1120 pb para o plasmídeo pXX46X. o qual foi derivado do plasmídeo pX¥64O por supressão de todo o gene lacZ e inserção em concordância de quadro de leitura de codões de terminação a seguir ao local BamHI, a fim de se obter o plasmídeo pDM626. Na Pigura 3 apresentam^ase a sequência de ADN da fusão gag/env do plasmídeo pDM626.

d) Produção de antigenes

Inocularam-se as estirpes recombinantss de E.coli em meios selectivos (L-Amp ou L-Amp-Xgal) e usaram-se colónias isoladas para inocular culturas de um dia para o outro ( <. 300 ml). A^icionaram-se porções destes inoculo s a volumes maiores de meio (até um máximo de 3 litros) em fermentadores. S_eguiu-se o crescimento das culturas e quando a ϋΟ^θθ atingiu 2,0 a 2,5, adicionou-se o indutor IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosido) até uma ooncentra— 29 — ção final de 5 jig/ml. Cultivaram-se em seguida as bactérias durante mais 2 a 4 horas a fim de permitir a indução das proteínas recombinantes.

Separararo-se as células por centrifugação e ressuspenderam-se em tampão (tris-HCl 25 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM e 0, 2 % de Nonodet P40) até uma concentração final de 100 unidades de °Οθθ_ο· Prepararam-se extractos a partir das células por um dos dois métodos seguintes:

i. Adicionou-se lisozima e PMSF às células em suspensão até concentrações finais de 1 mg/ml e de 1 mmol respectivamente e incubaram-se as culturas dum dia para c outro a 4°C. Adicionaram-se MgSO_A (2 mM) e DNase I (40 pg/ml) e continuou-se a incubação a 4°C. Adicionou-se mais PMSF até 2 mM e ajustou-se a concentração da EDTA a 5 mM. Tomou-se o extracto limpido por centrifugação a 15 000 g durante 20 minatos. D_ecantou-se o sobrenadante e guardou-se a -70°C.

ii) Fizeram-se passar as células ressuspensas através de uma prensa francesa a uma pressão de operação de 12 a 15 000 psi (cerca de 840 a 1050 kg/cm^). Adicionaram-se PMSF e EDTA ao lisado até concentrações finais de 2 mM e de 5 mM respectivamente. T_ornou-se o extracto limpido por centrifugação a 15 000 g durante 20 minutos. Decantou-se o sobrenadante e conservou-se a -70°C. A_s passagens através da prensa podem ser repetidas a fim de aumentar o rendimento de libertação de antigene das células.

P_urificaram-se as proteínas de fusão βην/β-gal e gag/p-gal por cromatografia'de afinidade usando a enzima β-galactosidase que se tinha introduzido naquelas proteínas, quer numa coluna de afinidade de anti-galactosidase quer numa coluna de afinidade de substracto. P_or meio

deste procedimento os antigenes podem ser ainda purificados numa coluna deexclusão por dimensão, obtendo-se então produtos homogéneos por electroforese analítica em gel.

P_urificou-se a proteína de fusão gag/env a partir da fracção insolúvel das células lisadas por extracção diferencial com um agente caotropico (ureia). P_urificou-se ainda mais a fracção solúvel a concentrações de ureia entre 3 e 8 M por cromatografia numa coluna de fenil-Sepharose com eluição em ureia 8 M. 0 rendimento global foi superior a 70% de actividade antigénica e superior a 80% da proteína em bandas que reagem imunologicamente como proteína de fusão a seguir a electroforese (SDS-PAGE) e a técnica de mancha de Western.

Exemplo 2. Construções de expressão _.ds Baculoylrus báculovirus virus da poliedrose nuclear da Antographa californica (AcNPV) tornou-se num vector de expressão muito útil independentemente da utilização de meios auxiliares (Rohrnann (1986) J. Gen. Virol. 67 1499-1513,

Kuroda et al. (1986) EMBO J. 5 Ns 6 1359-1365). 0 vector utilizado o gene da poliedrina do virus, o qual tem duas propriedades atractivas. á expresso em alto grau tardiamente no ciclo de vida do virus e não é essencial para o crescimento deste. Introduzem-se genes estranhos no gene da poliedrina de tal modo que estes são expressos sob a regulação do seu promotor e de outros elementos de regulação e que o próprio gene da poliedrina é inactivado. 0 genoma do AcNPV é muito grande e não pode ser usado para clonagem directa; em vez disso deve usar-se um vector de transferência. 0 vector de transferência contém o gene da poliedrina e algumas sequências adjacentes num plasmídeo de Ξ.coli, como por exemplo o plasmídeo pUC8, com locais de restrição convenientes introduzidos no gene, Quando o vector de transferência é introduzido em células de insecto (por exemplo, Spodoptera frugiperda,

FP9) que estejam também infectadas com AcNPV, pode ocorrer recombinação. Os recombinantes, que ocorrem com uma frequência de menos de 1%, substituíram o gene da poliedrina de tipo selvagem por outro que expressa o gene estranho? estes virus são negativos em relação à poliedrina e podem ser identificados pela sua morfologia em placas. Nos expressamos uma forma truncada duma proteína do invólucro de HIV-1 e a proteína gag/env neste sistema.

a) Invólucro tocai Dral (AATATT) na posição 6190 está 65 pb a montante do início do gene de env de HIV-1.

Este local foi convertido num local BamHI por clonagem no vector pUC9 a fim de se obter o plasmídeo pDMIOO.

... TAGGAAAATATTAAGACA ... - ... GGATCCCCATTAAGAGA......

Dral BamHI

Existe um local 3amHI no interior do gene de env na posição 8505 que interrompe a sequência de codificação no ácido aminado 752.

750 BamHI

... GTG AAC GGA TGC TTA Vai Asn Gly Ser Leu

Ligou-se o fragmento BamHI de 2,32 kb do plasmídeo pDMIOO purificado por electroforese em gel de agarose com o denominado vector de transferência de báculo»· rivus pAc373 (Kuroda et al.) e transformou-se com este plasmídeo a estirpe E.coli HB101. Identificou-se por mapeamento com enzimas de rsirição um transformante que tinha a inserção env na orientação correcta. Para a expressão a partir do promotor de poliedrina. Transf.eetou-se este transformante em células SP9 infectadas com AcNPV. Identifcaram-se os virus negativos em relação à poliedrina e purificaram-se em placa por técnicas normais (Summers e Smith Manual of Methods for

Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures (1986) Texas Agricultural Experimental Station; Current Topics in Microbiology and Immunology, Numero 131, The Molecular Biology of Baculovirus, Anos 1986, Editors W. Doerfler e P. Bohm, P_ublicado por: Springer Veriag).

b) Gag/env fragmento EcoRl/BamHI de 1120 pb do plasmideo pDM626 não pode ser expresso directamente usando o vector pAc373 porque não possui o seu próprio codão de início ATG. Modificou-se o local EcoRI na extremidade 5' do fragmento por adição de um oligonucleótido sintético que proporciona um ATG e converteu-se o local EcoRI num local BglII.

5’ AATTCAT AGATCT ATG 3'

3' GTA TCTAGA TACTTAA 5·

BglII

Cjonou-se a sequência de codificação de gag/env no plasmideo pAc373 digerido com BamHI sob a forma de um fragmento BgiLL)BamHI e gerou-se AcNPV recombinante con forme descrito anteriormente.

c) Preparação de arfigenes

Usou-se o AcNPV recombinante para infectar culturas frescas de células SP9 com uma multiplicidade de infecçâo de 1 a 10. Mantiveram-se as células infectadas em balões agitados a 28°C durante 36 a 72 horas, separarando-se então as células e lisando-se a 2 a 5 x 10^ células/ml com Nonidet NP40 a fim de libertar o antigene. Gentrifugou-se o antigene a 15 000_av durante 20 minutos a 4°C para o tomar límpido. Conservou-sa o sobrenadante a -70°G até ser necessário. 0 antigene pode ser purificado por cromatografia de afinidade em colunas de lectina de lentilha. Os antigenes preparados deste modo estão significativamente mais puros do

- 33 que no lisado celular mas não são analiticamente puros

Exemplo 3 ? Construções de expressão do virus da varíola bovina

Usaram-se dois clones para construir proteínas de fusão constituídas pelo epitopo antigénico principal do virus da doença dos pés-e-boca (foot-and-mouth disease virus = FMDV) fundidos à extremidade amino-terminal do antigene do núcleo da hepatite B (HBcAg). Um clone representativo do HBcAg foi obtido do Dr. P. Highfield (pVJRL 3123). Este clone tinha sido modificado na extremidade NH₂ tal modo que podia ser expresso em bactérias sob a forma de uma proteína de fusão na proteína TRP E de E. coli. 0 plasmídeo pNRli 3123 integrado em Ξ. coli HB101 foi depositado na NCIB, A^erdeen, Grã-Bretanha, em 6 de Março de 1987 sob o número de acesso NCIB 12423.

Um segundo clone representa as sequências 142 a 160 de FMDV VPl de 0^ Kaufbeuren ligadas à extremidade amino-terminal da β-galactosidase foi obtido do Dr. M. Winther (pWRL 201) (Winther et al., J.Immunol. 136, 1835, 1986). Na Figura 4 apresentam-se mapas de restrição dos dois clones. Conforme se pode observar na Figura 4, a união entre a sequência do FMDV e a β-galactosidase contém um local de restrição BamHI. A estratégia adoptada por conseguinte, enç^oba a fusão da sequência do FMDV e da sequência HBcAg através deste local BamHI.

O estágio inicial da construção, por conseguinte, englobou a inserção de um adaptador oligonucleótidico sintético para BamHI na extremidade 5' do gene de HBcAg de pWRL 3123. 0 local usado para inserção do adaptador foi o local NarI na posição 290. No entanto estava também presente na plasmídeo um segundo locaê NarI na posição 1230. Por conseguinte, digeriu-se parcialmente o plasmídio com NarI de modo a que a população das moléculas do pias- 34 mideo que foram cortadas apenas em um local HarI pudesse ser observada por electroforese em gel de agarose e purificada. Após tornar as extremidades alinhadas nos locais NarI usando o fragmento de Klenow da polimerase I de ADR, ligou-se um adaptador oligonucleétídico sintético um local representando um BamHI no produto digerido parcialmente por llarl e usaram-se os plasmíàeos resultantes para transformar S.coli. Analisaram-se então clones para determinar a presença de um adaptador BamHI no local HarI correcto por mapeamento de restrição.

Isolou-se um destes clones, designado por p'EB20S, e preparou-se o ADR. 0 comprimento do adaptador BamHI foi escolhido especialmsnte para que, quando ligado à porção do FIÃDV do plasmídeo pWRL201 (Figura 4), o quadro de leitura de tradução fosse contínuo e fo.sse possível produzir uma proteína de fusão.

Simultaneamente com a inserção do adaptador BamHI, o lotai HarI no qual tinha sido inserido foi destruído, Foi portanto possível eliminar a sequência HBcAg do plasmídeo pE3208 por digestão com BamHI e HarI, ohtendc-se um fragmento de ADH de 940 bases. De modo semelhante, purificou-se um fragmento BamHI - HarI a partir do plasmídeo pWRL201 de aproximadamente 3»5 quilobases. Estes dois fragmentos foram ligados entre si e identificou-se o olone oorrecto (pFOHc) por mapeamento de restrição.

Conforme se pode observar na Figura 4, o plasmídeo pFHOc pode ser expresso em células bacterianas sob a regulação do promotor tac. A fim de facilitar a transferência do gene hibrido para um vector lançadeira do virus de varíola de bovino (TV), no entanto, cortou-se o plasmídeo pFOHc no local HarI singular e introduziu-se um segundo local EcoRI sob a forma de um adaptador sintético. Deste modo tornou-se possível isolar o gene híbrido completo sob a forma de um fragmento EcoRI.

- 35 0 vector lançadeira do VV foi o vector pVpllk que é um derivado do vector pEJJARlA (Newfcon et al., Vacoines 86; Uew approaches to Immunisation, Cold Spring Harbor Laboratory, 303-509» 1986) por supressão das sequên4 cias estranhas do VV. Este vector lançadeira tem um promotor de W (neste caso pllIC) inserido no gene da quinase de timidina (ΊΊί) de VV. Este vector tem um único local EcoRI imediatamente a seguir ao promoteor pllIO de VV e a AUG(Bertholet et al., PLÁS, 82, 2096, 1985). 0 local EcoRI e AUG estão no mesmo quadro de leitura de tradução que o local EcoRI amino-terminai do gene híbrido em pFOHc. 0 gene de HBcAg de PMDV é deste modo inserido sob a forma do fragmento EcoRI em pVpllx desfosforilado cortado com EcoRI. Identificaram-se por mapeamento de restrição os clones com o gene híbrido na orientação correcta relativamente ao promotor pllk. Este clone foi designado por pvEOHc (Figura 5).

Este plasmídeo lançadeira foi então inserido no genoma da estirpe Wyeth (US vaccine) de VV, sob a regulação do promotor de pllk por recombinação homóloga usando as sequências TK, adjacentes. Escrutinaram-se placas individuais progenitoras com um fenótipo TK - para determinar a presença de ADR de HBcAg de FMBV por hibridação de depósito de mancha.

Escrutinaram-se lisados de células CV-I a partir de células infectadas de tipo selvagem (Wyeth) e recombinantes (vFOHc) para detectar a presença de antigene de núcleo e de sequências de FMEV por análise de ELISA de sandvzich. Ligou-se o gene de células infectadas a placas de ELISA usando a partícula do virus PMD (14-6S) ou anti-soros de FMD VP1 141-160 suscitados em coelhos. Oada gene capturado foi em seguida avaliado para detectar a presença dos epitopos HBo, PHD 146S ou Fr© VP1 142-160 por ligação cornos respectivos anti-soros de cobaia e por revelação com conjugado anti-cobaia-peroxidase. Oa resultados são apresentados na Figura é. Oonforme se pode observar na Figura 6,

uma proteína recombinante de lisados de células infectadas (vFOHc) foi fixada com anti-soro anti-FÍ4DV 141-160 e foi possível em seguida fazer reagir esta proteína com anti-HBc, anti-FMDV 141-160 e soro antivirião FMDV numa análise ds ELIBA de sandwich”.

Para além disso, foi possível purificar esta proteína por ultracentrifugação, sendo de admitir em consequência, que é constituída por partículas. Esta circunstâncias foi mais claramente ilustrada quando os produtos da centrifugação foram sedimentados num gradiente de densidade de sucrose e se reanalisaram as fraoções por técnicas de ELISA PAPA determinar a presença de antigene nuclear. Fraccionaram-se em gradientes de sucrose de 15 a 45$ lisados celulares de células infectadas por virus de variola bovina recombinante (vFOHc) ou bactérias que expressam o. antigene nuclear nativo. Analisaram-se as fraoções para determinar a presença de material reactivo nuclear por ELISA de sandwich indirecta usando como anticorpo de fixação um anti-soro antinúcleo humano e para detecção anti-soro antigene de oobaia HBo. Os resultados são apresentados na Figura 7o A posição na qual o virus FMD sedimenta encontra-se também indicada. A Figura 7 mostra que se observa um pico de material reaotivo HBcAg numa posição semelhante à observada quando se centrifugam em paralelo partículas nucleares expressas em bactérias. Deste modo torna-se evidente que a presença das sequências de FMDV VPl^g χθο ihterfere com a natureza de partículas das partículas nucleares.

Confirmou-se gor exame ao microscopio electronico de complexos imunes formados com material purificado por gradiente de sucrose e capacidade da proteína de fusão para constituir por si so partículas regulares semelhantes a partículas nucleares de 27 nm. Os eomplexos foram formados por reacção de partículas de FMDV-HBcAg com anti-soro suscitado contra o virus intacto da doença dos pés e da boca. Os complexos foram adsorvidos formando um reticu- 57 lado revestido e foram corados negativamente com ácido fosfotúngstico. Gomo era de esperar a partir dos dados da análise por ELISA apresentados na Eigura 6, também se observaram complexos imunes após reacção das partículas com anti-soro de HBcAg ou de peptídeo 141-160 de PIYlDV sintético.

Exemplo 4 : Análise usando antigenes reoombinantes de HIV

a) Preparação de mioroalvéolos revestidos

Bevestiram-se com os antigenes obtidos a partir de células de insectos no Exemplo 2 e uma concentração óptima predeterminada mioroalvéolos por adsorção passiva a partir de um tampão a pH 8 contendo uma amina. Superrevestiram-se então os alvéolos com uma solução conten do altos níveis de uma proteína bovina para assegurar que todos os restantes locais hidrofóbicos se encontravam compleramente ocupados.

b) Preparação de conjugados

1. Os antigenes purificados a partir de E.coli do Exemplo 1 foram marcados com fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina foi fixada a radicais sulfidrilo da Ô -galactosidase usando a química bem estabelecida de maleimida-sulfidrilo.

2, Liofilizaram-se os conjugados numa matriz de áçucar-álcool com aditivos de proteína de soro e reconstituiram-se antes da utilização com um diluente contendo os cofaotores metálicos da fosfatase alcalina.

c) Execução do processo de determina

1. Modo sequencial. Adicionou-se a um alvéolo uma amostra a ser analisada para determinação da presença de anticorpos anti-HIV e incubou-se durante 30 minu tos a uma temperatura de 45°C. Bliminaram-se os resíduos dos microalvéolos por lavagem e em seguida adicionou-se o conjugado aos alvéolos e incubou-se durante 30 minutos a uma temperatura de 45°C. Eliminou-se o excesso de conjugado por lavagem. Em seguida detectou-se a presença de fosfatase alcalina usando o sistema de amplificação cíclica anteriormente descrito. Qualquer quantidade significativa de enzima ligada ao alvéolo indicada a presença na amostra de anticorpos contra as proteínas do invólucro do HIV, processo de determinação foi experimenta ,o usando 1662 soros que se sabia não conterem anticorpos contra as proteínas do invólucro do HIV e com 6 soros contendo estes anticorpos. Os resultados são apresentados no Quadro 1 (Antigenes de cultura de células de insectos) com uma análise levada a efeito com os antigenes de Eocoli tanto sob a forma de um conjugado e de uma proteína de revestimento para comparação (Antigene de cultura de

E.coli). Pode verificar-se que a coloração de fundo é superior no illtimo caso e que ocorrem amostras que dão origem a sinais que podem ser imputadas a impurezas nas preparações de antigenes e não à presença de anticorpos anti-HIV genuínos. Estas amostras não dão origem a sinais nas determinações em que o revestimento e os antigenes conjugados são preparados a partir de origens diferentes₀

Quadro 1

a) Fundo geral

Antigene de cultura de células de insectoss fundo de análise = 0,15 + 0,03 unidades de D.O.

Antigene de cultura de Ξ.coli : fundo de análise =

0,26 + 0,05 fc>) D_ados de falsos positivos (atribuíveis a actividades anti-coli)

A_ntigene de cultura de E.coli s 2 sinais falsos positivos de 1662 amostras

Não reactivo em antigene de cultura de células de insectos

c) Positív⁰³ verificados como positivos usando antigene de cultura de células de insectos 6/6

Exemplo 5¾ Detecção de anticorpo contra HIV por competição para a ligação de um anticorpo de marcação dirigido contra a proteína gag/env da_ presente invenção

Usou-se uma técnica de análise imunológica enzimática competitiva (EIA). Revestiram-se alvéolos de microtitulação com a proteína de fusão gag/env, designada aqui por 626, obtida no Exemplo 1, por captura através de um anticorpo monoclonal (TL03) dirigido contra p24. Adicionaram-se em seguida as amostras aos alvéolos preparados e adicionou-se imediatamente em conjugado anti-HIV. As amostras eram amostras de soro e amostras de plasma de dadores de sangue e amostras de soro de pacientes com SIDA, condições associadas com SIDA e outras doenças. A enzima usada no conjugado foi peroxidase. Após um período de incubação de cerca de 1 hora lavaram-se os alvéolos e adicionou-se o substrato para a enzima. Este foi 3,3,5,5'-tetrametil-benzidina. D_eterminou-se a presença de anti-HIV na amostra por comparação com

um padrão tratado do mesmo modo. Os resultados são apresentados nos Quadros 2 e 3.

Quadro 2s Detecção de anticorpo contra HIV em amostras de

	soro e em amostras de plasma de dadores de sangue
Centro	Ns de amostras	Não	Inicialmente	Reactivo
	analisadas	reactivo	reactivo	repetidamente
1	1699	1696	3	1	(0.06%)
2	1783	1780	3	2	(0,11%)
3	20 37	2034	3	1	(0,05%)
4	1908	1904	4	2*	(0.10-0.16°/
5	975	974	1	0
Total	8402	8388	14	6
			(0, 17%)	(0,07%)
* Apenas 3/4 das amostras analizadas de novo
Quadro,,	3s Reactividade	de soros	de pacientes	com	SIDA, con-

dição associada com_.SIDA e outras doenças.

Grupo	N2 de	Positivos para	Confirmado positivo
Clínico	amostras	anticorpos	cl para anticorpos
SIDA	59	59	_ h 59
Complexo relacionado com SIDA	62	62	62
Condições associadas 0 com SIDA	97	97	97
Alto riscoâ	426	272+	271
Doenças não relacionadas com SIDAe	67	2++	0

- 41 Misto a A confirmação foi feita por técnica de mancha de

Western e/ou por pelo menos duas determinações alternativas (excepto abaixo).

b Amostras de 30 pacientes com SIDA foram confirmadas com um processo de determinação alternativo.

c Inclui pacientes com linfadenopatia generalizada persistente, sarcoma de Kaposi, infecções oportunistas e pacientes que se sabia serem positivos para anticorpos contra HIV.

d Pacientes em grupos de risco estabelecidos.

e Pacientes com doenças virais agudas, doenças autoimune ou neoplasia.

f Inclui amostras de individuos saudáveis e de pacientes com condições indefinidas.

+ A amostra discrepante (de um utilizador de droga por via IV) deu um resultado na técnica de mancha de Western impossível de ser interpretado.

++ A amostra discrepante apresentava-se muito hemolisada.

Exemplo 6s_ Dgteçção de anticorpos contra HIV_ por, marcação com anti-qlubolina conjugada

D_escreve-se um método normal de detecção de anticorpos contra HIV. Revestiram-se microalvéolos com a proteína 626 do Exemplo 1 por adsorção passiva. Adicionaram-se aos alvéolos amostras de 50 >ul de soro pré-diluídas a 1/100. Depois de uma incubação de cerca de 30 minutos eliminaram-se as amostras dos alvéolos por lavagem e adicionararo-se 50 μιΐ de conjugado de globulina anti-humana. A enzima utilizada no conjugado foi peroxidase. Após incubação durante mais 30 minutos aproximadamente, lavaram-se novamente os alvéolos e adicionou-se o substrato enzimático. Detectou-se a presença de anti-HIV por comparação com um padrão tratado do mesmo modo. Os resultados são apresentados no Quadro 4.

Quadro 4: E_nsaio indirecto anti-globilina

Numero de negativos Numero de Numero de positivos Numero de ensaiados negativos ensaiados positivos

55 25 25

Exemplo 7t Detecção de anticorpos contra HIV usando a .proteína

626 marcada

Revestiram-se como no Exemplo 6 microalvéolos com a proteína 626 do Exemplo 1 por revestimento passivo. Adicionaram-se 250 ^ul de amostras não diluídas aos alvéolos preparados. A^icionou-se imediatamente depois das amostras a proteína 626 conjugada (50 _zul). Depois de uma incubação durante cerca de uma hora os alvéolos foram lavados e adicionou-se substrato. A enzima usada foi fosfatase alcalina. Os resultados são apresentados no Quadro 5.

Quadro 5; Determinação directa tipo sandwich

Número Numero Numero Numero de negativos de negativos de positivos de positivos ensaiados ensaiados

Soro 810* 809 58 58

Plasma 175* 169 jfc 1 soro falso positivo e 6 plasmas falsos positivos (nem todos repetidamente falsos positivos)

Exemplo 8; D^tecção de anticorpos contra HIV capturados usando proteína 626 marcada com uma partícula

Efectuou-se um ensaio normal de aglutinação. Revestiram-se de forma passiva com proteína 626 obtida no Exemplo 1 partículas de latex comum com um diâmetro de 0,2 micron. Misturaram-se amostras de soro ou de plasma com o latex usando um aparelho adequado ou por agitação sobre uma superfície. A presença de anticorpos contra HIV (que causam a aglutinação das partículas) foi detectada por inspecção visual ou por meio de instrumentação apropriada alguns minutos após a mistura dos reagentes.

Os resultados são apresentados no Quadro 6.

Quadro 6¾ Aglutinação de latexs Ensaio

Numero	Numero	Numero	Numero de
de negativos	de negati-	de positivos	positivos
ensaiados	vos	ensaiados
480	479	80	80

Plasma 50 50

Exemplo. 9t Utilização de proteína 626 para a marcação de anti corpoanti-HIV capturado por anti-globulina

Revestiram-se passivamente microalvéolos com anti-glúbolina humana. A<aicionaram~se amostras de 50 jil cada de soro não diluído aos alvéolos preparados. A^icionou-se imediatamente proteína 626 do Exemplo 1 marcada com fosfatase alcalina. Após uma incubação de cerca de uma hora, lavaram-se os alvéolos e adicionou-se o substrato, Verificou-se a presença de anticorpos anti-KIV por comparação com um padrão. Os resultados são apresentados nos Q_uadros 7 e 8.

—

Quadro 7 s Ensaio de captura anti-humano

Numero	Numero de	Numero de	Numero de
de negati-	negativos	positivos	positivos
vos ensaia-		ensaiados
dos
16	16	15*	12

Mf inclui 3 positivos fracos não detectados.

Quadro 8 : Ensaio de captura anti-humano

Numero de negativos ensaiados

Numero Numero Numero de negativos de positi- de positivos vos ensaiados

138* 137

46** 45 * 1 falso positivo ** positivo muito fraco não detectado.

***¥*»«

Claims (1)

1. - 1» Processo para a determinação imunológica „ de um anticorpo que compreendes (i) fazer contactar uma fase sólida, na qual se encontra imobilizado um primeiro peptídeo recombinante que apresenta uma sequência antigénica à qual o anticorpo é capaz de se ligar, com uma amostra a analisar?

   (ii) fazer contactar a fase sólida com um segundo peptídeo recombinante que apresenta a referida sequência antigénica e que está marcada? e (iii) determinar se a amostra a analisar continha qualquer quantidade do referido anticorpo?

   caracterizado por o segundo antigene recombinante ter sido expresso num organismo de um género diferente do género em que foi expresso o primeiro peptídeo recombinante.

   - 2S «

   Processo de acordo com a reivindicação

   1, caracterizado por um dos peptídeos recombinantes ter sido expresso num organismo procariótico enquanto que o outro foi expresso num organismo eucariótico.

   - 3â Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por um dos peptídeos recombinantes ter sido expresso em Ξ.coli e o outro ter sido expresso em células de insecto ou em células de mamífero por meio do sistema de expressão do baculovírus ou do vírus de varíola bovina respectivamente.

   - 4^ Processo de acordo com qualquer das reivindicações antériores, caracterizado por os peptídeos recombinantes serem sequências gag e/ou env de HIV.

   - 5ê Processo para a preparação de um conjunto de análise (test kit) para utilização numa análise imunológica para um anticorpo que contém:

   (i) uma fase sólida» na qual se encontra imobilizado um primeiro peptídeo recombinante que apresenta uma sequência antigénica à qual o anticorpo é capaz de se ligar? e (ii) um segundo peptídeo recombinante que apresenta a referida sequência antigéniGa e que está marcado?

   caracterizado por o segundo antigene recombinante ter sido expresso num organismo de um género diferente do género em que foi expresso o primeiro peptídeo recombinante.

   - Processo para a preparação de uma proteína recombinante com a sequência:

   10 20

   MetAsnSerProAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsnTyrProIleValGln pl8> p24>

   30 40

   AsnIleGlnGlyGlnMetValBi sGlnAlalleSerProArgThrLeuAsnAlaTrpVal

   50 60

   LysValValGluGluLysAlaPheSerProGluVal.IleProMetPheSe rAlaLeuSe r

   70 80

   SluGlyAlaThrProGlnAspLeuAsnThrMetLeuAsnThrValGlyGlyHi sGlnAla

   90 100

   AlaMetGlnMetLeuLysGluThrlleAsnGluGluAlaAlaGluTrpAspArgValHi s

   110 120

   ProValHisAlaGlyProIleAlaProGlyGlnMetArgGluProArgGlySerAsplle

   130 140

   AlaGlyThrThrSerThrLeuGlnGluGlnlleGlyTrpMetThrAsnAsnProProlle

   150 160

   Pr OValGlyGluIleTyrLysArgTrpIlelleLeuGlyLeuAsnLysIleValArgMet

   170

   180 pyrSe rProThrSerlleLeuAspIleArgGlnGlyProLysGluProPheArgAspTyr

   190 200 j/alAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp

   210 220 letThrGluThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysThrIleLeuLysAla

   230 240 euGlyPrcAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaCysGlnGlyValGlyGlyPro

   250 260

   ^.snSerProArgGlnLeuLeuSerGlylleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla gp41>

   270 280 £ leGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla

   290 300 brglleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCys

   310 320 ^erGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSe rTrpSerAsnLysSe r

   330 340 euGluGl η 11 eT rpAsnAsníle tTh r TrpMe tGluT r pAspAr gGluI 1 eAsnAsnTy r

   350 360 jphrSe rLeuIleHisSerLeuIleGluGluSe rGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln

   370 bluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnGlyAspPro;

   opcionalmente modificada por uma ou várias substituições de ácidos aminados, inserções e/ou supressões e/ou por uma extensão numa das extremidades ou em ambas com a condições cfe que a proteína com uma sequência modificada desse modo tenha a capacidade de se ligar tanto a anti-p24 como a anti-gp41 e que haja um grau de homologia de pelo menos 75% entre a sequência modificada e a sequência não modificada, caracterizado por compreender as seguintes fasesí (i) transformação de uma célula hospedeira com um vecter que incorpora um gene que codifica para a proteí na e que possui a capacidade de expressar a proteína na célula hospedeira;

   (ii) cultura a célula hospedeira transformada de tal modo que a proteína seja expressa; e (iii) recuperação da proteína.

   - 72 Processo para a determinação de um antiqerpo de HIV-1 anti-p24 e/ou anti-gp41 compreendendo fazer contactar uma amostra a analisar com uma proteína com capacidade de ligação a um anticorpo de HIV-1 anti-p24 e/ou anti -gp41 e determinar se qualquer quantidade do referido anticorpo se liga à proteína, caracterizado por a proteína ser uma proteína obtida de acordo com o pr ocesso da reivindicação 6.

   - 82 Processo para a preparação de um conjunto de análise (test kit) para utilização numa análise de anticorpo de HIV-1 anti-p24 e/ou anti-gp41 contendo uma φ

   proteína com capacidade de ligação a um anticorpo de HIV-1 anti-p24 e/ou anti-gp41 e um meio de determinação de se qualquer quantidade do referido anticorpo se liga á proteína, caracterizado por a proteína ser uma proteína obtida de acordo com o processo da reivindicação 6.

   «· 93 ~

   Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma proteína obtida de acordo com o processo da reivindicação 6 juntamente com uma substância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitável.