JPH1151940A - Ｈｃｖの検出又は測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＣＶを簡便で高感度に検出または測定する
方法の提供。 【解決手段】 ＨＣＶを含む検体を、（１）カオトロピ
ックイオン、及び（２）酸性化剤を含む処理液で処理す
ることを特徴とするＨＣＶ含有検体の処理方法；並びに
この方法の実施のためのモノクローナル抗体及びそれを
生産するハイブリドーマ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＨＣＶの検出又は測
定方法、及びそのための試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎は、長い間その原因因子が明ら
かではなかったが、その遺伝子がクローニングされ（Ｓ
ｃｌｅｎｃｅ ２４４：３５９−３６２，１９８９）、
その遺伝子を基に作られたリコンビナント抗原を用いた
抗体測定による診断法が開発されたことにより（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２４４：３６２−３６４，１９８９）；特表平
２−５００８８０号公報）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィル
ス、ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ Ｖｉｒｕｓ）を原因因子と
する、血液及び血液関連製剤を主たる感染経路とする感
染症であることが明らかとなった。組換えコア抗原、組
換えＮＳ３抗原を加えたいわゆる第２世代抗体検査法の
開発により、ＨＣＶ感染者のほとんどを血清検査により
判別する事が可能となった。このことにより国内献血に
よる感染をほとんど絶つことが可能となった。

【０００３】しかしＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウィルス）
などの一般的なウィルス感染症同様に、感染初期の抗体
が生じて来るまでの期間、いわゆるウィンドピリオドと
呼ばれる判別不能期間が存在し、売血が認められている
地域などや国内の一部でも抗体検査では判別できなかっ
た血液由来の成分により、依然として二次感染が起こる
リスクが存在している。また抗体検査は、その原理から
感染後治癒した既住者か、活動性の感染者か否かを判別
することが出来ないことが問題である。

【０００４】また現在Ｃ型肝炎の治療にはインターフェ
ロン（ＩＦＮ）が用いられているが、ＩＦＮによりＨＣ
Ｖが駆除されて６ヶ月後にはＨＣＶ抗体価が低下するこ
とから、ＨＣＶ抗体価を測定することのみにて治療効果
を判別することが可能であるとする研究者もいる。しか
し抗体価の動きは抗原刺激低下後、すなわち抗原駆除後
数カ月間以降でないと低下しないことから、抗体検査を
行なうのみではＩＦＮ投与によりＨＣＶが駆除されたか
否かを適時に的確に判別することが出来ない。すなわち
治療のモニタリングを行なうためには、ＨＣＶに対する
抗体ではなく、ＨＣＶそのものを検出する方法が必要で
ある。

【０００５】ＨＣＶは他のウィルスたとえばＨＢＶ（Ｂ
型肝炎ウィルス）などに比して血中ウィルス量が低い
事、および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、または動物
などを宿主としてウィルスを増殖させることが出来ない
ため、ウィルス粒子（ウィルス抗原）を直接検出する方
法を確立することが困難であった。そのためウィルス抗
原を検出する代わりにＰＣＲ（ポリメレースチェーンリ
アクション）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−
１３５４，１９８５）や分岐鎖ＤＮＡプローブ法によ
り、ウィルスゲノムＲＮＡを検出する方法が開発され
た。しかしウィルスゲノムを検出する方法は、ウィルス
抗原を検出する方法と比較していくつかの問題点があ
る。

【０００６】まず検出する物質がＲＮＡであるため保存
安定性が低いため、血清の凍結融解操作により定量値が
低下するなどの問題が指摘されている。そのため従来の
血清検査法よりも検体の保存に留意する必要が生じる。
また検体の輸送の際にも細心の注意をはらう必要が有
る。

【０００７】例えばＰＣＲ法を用いた検査法は、遺伝子
断片を検出するには最も高感度な検出方法であるが、検
体中からＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する際、またゲノム
ＲＮＡから鋳型ＤＮＡへの逆転写の際にロスを生じやす
く安定した定量値を得るためには熟練を要すること、ま
た増幅を行うことが重要な原理であるために、コンタミ
ネーションを起こした際に高頻度に偽陽性を生ずるなど
の問題があり、一度に大量の検体を処理することができ
ない。

【０００８】また簡便とされる方法を用いても前処理時
間が２時間以上も必要であり、多数回の遠心操作を含む
など煩雑である。加えて、このように操作が繁雑である
ために、コンタミネーションの機会が増え、偽陽性検体
の生じる可能性を増加させている。一方分岐鎖ＤＮＡプ
ローブ法は検出感度が低く、結果が得られるまで約２０
時間を要し（医学と薬学 ３１：９６１−９７０，１９
９４）、感度、操作時間という点で課題が残されてい
る。

【０００９】上記のウィルスゲノムを検出する方法の問
題点を解決するために、ウィルス抗原を直接検出する方
法も開発された。特開平８−２９４２７に示されている
ように、ＨＣＶのコア抗原に対して特異性を有するモノ
クローナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する
方法が開発された。本報は田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９
９５）および河合等（医学と薬学 ３６：１０６５−１
０７０，１９９６）に報告されているように血清中に存
在するコア抗原を検出することにより、上記のウィルス
ゲノムを検出する方法同様に臨床的有用性を持つことが
示されている。しかしながらウィルスゲノム検出法と同
様にいくつかの点で大きな問題が残されている。

【００１０】一点はＰＣＲ法と比較して感度が低いた
め、血清スクリーニングの最終検査に用いることが出来
ないことである。田中等は（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅ
ｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９９
５），ＨＣＶ ＲＮＡ量として、１０⁴ 〜１０⁵ コピー
／ml間が検出限界であることを示しており、河合等は
（医学と薬学 ３６：１０６５−１０７０，１９９
６）、最も感度が高い検出方法であるＣＲＴ（コペテテ
ブリバーストランスクリプション）−ＰＣＲ法でＲＮＡ
陽性に分類されるＣ型慢性肝炎患者１０２例の治療前血
清において、６７％の陽性率であることを報告してい
る。すなわち、感度の高いＣＲＴ−ＰＣＲ法と比較した
場合に感度の面で大きく劣っている。

【００１１】さらに測定のための検体処理の工程が繁雑
であり、かつ時間がかかることがスクリーニングなどの
用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体
（血清）の処理のために、ウィルス粒子の濃縮と血清成
分の除去のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処
理（４℃１時間）、遠心操作（１５分間）、上清の除
去、尿素処理、アルカリ処理（３７℃３０分間）、中和
剤添加といった多段階処理工程を必要とする。また強固
に形成され、ＰＥＧにより粘性を増した沈殿の尿素処理
による分散工程は、非常に熟練を要する作業である。そ
のため、再現性を得るためには熟練が必要であり、また
最低約２時間の処理時間が必要である。さらに遠心操
作、上清除去等の工程があるために、自動化および同時
大量処理を困難にしており、操作面においてもスクリー
ニングなどの大量処理を必要とする用途に適していな
い。

【００１２】一方ウィルス抗原検出系は、以下の点で高
感度ＰＣＲ法と比較して優れている点がある。すなわち
検出過程で過度の増幅処理操作が加わらないため、コン
タミネーションに対し、極めて寛容である。またＲＮＡ
のように不安定な物質を検出するのではなく、比較的安
定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の
保存に過度の注意をはらう必要がなく、ＰＣＲ検体に求
められる超低温槽のような特別な機器を用いる必要もな
く、また検体の輸送も容易になる。

【００１３】これらの特長は例えば血液事業や、健康診
断の様に、多数の検体を測定する用途には必須の要件で
ある。しかしながら、既に指摘したように、開示されて
いるコア抗原検出法は、前処理が煩雑で自動化に適して
いない、感度が低く例えば血液事業などの感度が求めら
れる様な用途におけるゴールデンスタンダードにはなり
得ないなどの理由により、多数の検体を扱ういわゆるス
クリーニング用途に用いることが出来ず、ＰＣＲ法に対
して優れている点を活かすことが出来ていない。また、
臨床的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、
再現性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満
たすように鋭意開発していく必要性がある。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血液
事業や、健康診断のような、いわゆるスクリーニング用
途のごとく多数の検体を処理するのに適したＨＣＶ抗原
検出法を提供することである。すなわちＰＣＲ法と比較
し同等の感度、特異度を持ち、前処理を簡便化すること
により、容易に自動化などの大量処理システムに適用可
能なＨＣＶ抗原検出及び定量する系を提供することであ
る。さらに、ＨＣＶと同様の構造を持つウィルス抗原の
検出及び定量する系を提供することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】ＨＣＶは血中濃度が１０
² 〜１０⁶ コピー／mlであり、ＨＢＶ（１０⁹ コピー／
ml）と比較し低いことから、ウィルス抗原を検出するた
めには極めて高い感度を必要とする。一般に抗体をプロ
ーブとする免疫学的な手法に代表される検出方法に於
て、検出感度を増加させる方法としては、Ｉ）検出する
抗原分子の分子数を上昇させる、II）抗原に結合するプ
ローブ、例えば抗体の分子数を上昇させる、III)検出感
度の下限を規定するプローブ、例えば抗体と抗原以外の
物質との結合などに起因する非特異反応を減少させる、
IV）検出に用いる標識物の検出感度を増加させる方法が
考えられ、これらの方法を組み合わせることにより感度
を上昇させることが可能となる。

【００１６】抗原分子数を増加させる方法としては、Ｉ
−１）検体の量を増加させる事が最も容易に考えられる
ことであるが、一般的に用いられている反応系（例えば
９６ｗｅｌｌイムノプレート）では最大添加可能な容量
は３００μｌ程度であり自ずと上限が規定されるので、
Ｉ−２）濃縮により反応系に加える分子数を増加させる
方法が用いられる。

【００１７】抗原に結合する検出のためのプローブ、例
えば抗体の分子数を上昇させるためには、II−１）複数
のプローブ、例えば抗体を用いることにより認識エピト
ープの数を増加させる、II−２）プローブ、例えば抗体
と抗原との親和性（アフィニティー及びアビディティ
ー）を上昇させることにより、単位時間あたりに結合す
る抗体の数を増加させる事が容易に考えつく手法であ
る。ここで抗原とプローブ、例えば抗体の親和性を向上
させる方法としては、反応系の緩衝液の組成を変化させ
る方法、プローブを改変する方法、これらの組み合わせ
が考えられる。II−３）ビーズや磁性粒子などの表面積
の広い担体に多量に抗体を結合させることによって、限
られた量の抗原との反応面積を広くすることにより、多
くの抗原を捕獲することも考えられる。

【００１８】また感染症の場合は検体中に抗原と結合す
る高い親和性を示すヒト抗体が存在することが予想さ
れ、これらの抗体のエピトープが検出に用いるプロー
ブ、例えば抗体のエピトープと重なることにより競合反
応が起こり検出に用いる抗体数の減少につながることが
予想されるため、この検体中の反応を阻害する抗体を除
く事により抗原に結合する検出のための抗体の分子数を
増加させる事につながる（II−４）。

【００１９】非特異反応を減少させる方法を一般化する
ことは困難であるが、III −１）緩衝液組成を変化させ
ることによりプローブ、例えば抗体の抗原との親和性
（アフィニティー及びアビディティー）を上昇させるこ
とにより非特異反応を軽減させる、III −２）非特異反
応の原因物質を除去するなどの方策が考えられる。標識
物の検出感度を上昇させる方法としては、IV−１）検出
感度の高い標識物（放射性同位元素など）を用いる、IV
−２）酵素や触媒を標識物に用いることにより信号を増
幅させる、IV−３）酵素基質をより感度の高い基質に改
変する、IV−４）酵素反応、化学反応の基質のシグナル
を化学的、または電気的、機械的に増幅させる、IV−
５）抗体当たりの標識物の数を増加させる、IV−６）シ
グナルの検出に用いる機器の感度を上昇させるなどの方
法が考えられる。

【００２０】開示されているＨＣＶコア抗原検出法の前
処理法の工程を解析すると、検体にポリエチレングリコ
ールを加えた後に遠心操作によりＨＣＶを沈殿として回
収することにより抗原を濃縮する（Ｉ−２）ことと同時
に血清成分の一部を除去する（II−２）工程を行った
後、尿素とアルカリ剤を含む溶液に再懸濁することによ
り検体中に存在するヒト抗体を不活化し（II−３）ＨＣ
Ｖからコア抗原を遊離させさせる工程、非イオン性界面
活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と中和剤を含む溶液
を加えることにより、モノクローナル抗体と反応させる
溶液にする工程から成り立っている。

【００２１】既に上記に指摘したように遠心操作、沈殿
の再懸濁操作が操作上煩雑な過程であり、熟練度を必要
とする過程である。従って本発明の達成目標は、これら
の操作上の問題点を解決したコア抗原検出系である。Ｈ
ＣＶそれ自体はいまだその姿が明らかとなっていない
が、そのゲノム構造、類縁のウィルス粒子の構造、一般
的なウィルスに関する情報から、ＨＣＶ粒子はゲノムＲ
ＮＡがコア抗原によりパッキングされ、それを取り囲む
ように脂質膜にアンカリングしているＥ１，Ｅ２／ＮＳ
１抗原からなる外被蛋白質によって囲まれた状態で存在
するものと推定される。

【００２２】そのためコア抗原を検出するためには外被
を取り除き、コア抗原の検出に用いるプローブ、例えば
抗体が結合できるようにする必要がある。またウィルス
粒子は血中ではＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）などに囲ま
れた複合構造をしていることが報告されており、さらに
外被蛋白質に対する抗体も存在することから、ウィルス
粒子と抗外被蛋白質抗体との免疫複合体としても存在す
ることが予想される。すなわち検出する抗原の分子数を
増加させるためには、ウィルス粒子から効率よく外被や
ウィルス粒子を取り囲む夾雑物を取り除き、かつコア抗
原分子を効率よく遊離させることが最も重要である。

【００２３】従って、本発明が提供する要件の一つは、
検体（血清）中のＨＣＶコア抗原を、遠心分離のような
煩雑な操作によって濃縮することなく、プローブを用い
た検出に適した状態にさせる処理方法にある。さらに上
記のように検体中には検出に用いるプローブ、例えば抗
体と結合を競合するヒト抗体が高力価で存在するため、
これを取り除く操作が、感度上昇のために重要である。
従って本発明の重要な要件の一つは、検体中のＨＣＶコ
ア抗原を簡易に遊離させる処理方法によって、検体中に
存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理方法にあ
る。

【００２４】本発明によって示される処理方法を用いる
ことにより、検体中に存在するＨＣＶコア抗原は、プロ
ーブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した
状態でウィルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時
に検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同
時に不活化させることにより、例えば抗体のようなプロ
ーブを用いた免疫測定法によって容易にかつ感度高く検
出することが可能となる。

【００２５】検出に用いるプローブ、例えば抗体はＨＣ
Ｖのコア抗原に特異的に結合するもので有り、一定の高
い親和性を示し、反応系に加えた際に非特異反応などを
誘発しないようなものであればかまわないが、一次反応
に用いるプローブの一つはＨＣＶコア抗原のＮ端側を認
識し結合できるものが含まれていることが好ましい。こ
こでコア抗原のＮ端側とは、配列番号２に示す配列の１
０番目から７０番目の配列、もしくはその一部をいう。
さらにここにコア抗原のＣ端側に対するプローブが含ま
れていても良い。ここでコア抗原のＣ端側とは、配列番
号２に示す配列８１番目から１６０番目の配列、もしく
はその一部をいう。

【００２６】ここでプローブとは、マウス、ウサギ、ニ
ワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して
得られるポリクローナル抗体、免疫した個体から、脾臓
細胞を分離し、ミエローマ細胞と融合させることによっ
て得られるハイブリドーマの産生するモノクローナル抗
体、または脾臓細胞、血中白血球をＥＢウィルスによっ
て不死化させた細胞の産生するモノクローナル抗体、Ｈ
ＣＶに感染しているヒト、チンパンジーなどが産生して
いるモノクローナル抗体、マウス、ヒトなどのイムノグ
ロブリンのｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡから得られる可変領
域遺伝子断片、またはイムノグロブリンのｃＤＮＡ、染
色体ＤＮＡの一部と人工的に作製した配列とを組み合わ
せることによって構成される可変領域遺伝子断片、人工
的な遺伝子配列を用いて構成される可変領域遺伝子断
片、またはこれらを材料に遺伝子組換え手法によって作
製される可変領域遺伝子断片を、イムノグロブリン定常
領域遺伝子断片を組み合わせることによって構成される
組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生す
る組換え抗体、上記の可変領域遺伝子断片と例えばバク
テリオファージの構造蛋白質と融合させて作られるファ
ージ抗体、上記の可変聴域遺伝子断片を他の適用な遺伝
子断片例えばｍｙｃ遺伝子の一部などと組み合わせるこ
とにより構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換
された細胞が産生する組換え抗体、トリプシン分子に可
変領域を人工的に導入することによって産生されるプロ
ーブ、レセプターなどの蛋白質に特異的に結合する分子
を人工的に改変することによって得られるプローブ、そ
の他コンビナトリアルケミストリー技術によって作製さ
れたプローブなど、コア抗原に高い特異性、親和性を示
す分子であればそれを用いることが出来る。

【００２７】さらに、本発明はＨＣＶコア抗原を含む検
体から、ＨＣＶコア抗原とプローブ、例えば抗体との免
疫複合体を形成するのに適した状態にするため、ウィル
ス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を
阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活性化
させる処理剤によって検体を処理する工程、遊離したコ
ア抗原を例えば抗体のようなプローブを用いた免疫測定
法によって検出並びに定量するアッセイ方法、並びに検
査キットを提供する。

【００２８】

【発明の実施の形態】本発明によって示される検体処理剤と処理方法 本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾
液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などが
含まれる。本発明においては、検体を煩雑な操作なく、
プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるの
に適した状態に検体中のコア抗原を処理する方法が最も
重要な要件である。すなわち、抗原分子数を増加させる
ために、ウィルス粒子中などに含まれるコア抗原を効率
よく遊離させることが重要になる。

【００２９】ＨＣＶの外被蛋白質などの膜タンパク質な
どは、何らかの処理をしない限り水に溶けることはな
い。このような疎水性部分をその一部に持つ蛋白質を水
に溶かすには、界面活性剤を用い、疎水性部分を親水性
に変換させることによる方法がよく知られているが、グ
アニジン塩酸などのある種の塩はこのような難溶性の蛋
白質を水に溶けやすくさせる性質を持っていることが知
られている。このような性質を示す塩（カオトロピック
剤）から生じるイオンはカオトロピックイオンと呼ばれ
ており、陰イオンとしてはグアニジンイオン、チオシア
ン酸イオン、ヨウ素イオン、過ヨウ素酸イオン、可塩素
酸イオンなどが知られており、これらのイオンを生ずる
塩が難溶性蛋白質の可溶化に用いられている。カオトロ
ピックイオンは、ウィルス粒子から抗原が効率よく遊離
させる機能を持つことが予測された。

【００３０】しかしながら、このようなカオトロピック
イオンを加えると蛋白質の２次構造が部分的に破壊され
るため、その結果としてエピトープ構造が失われる。そ
のためカオトロピックイオン存在下でそのままプロー
ブ、例えば抗体との免疫複合体形成反応に加えると、抗
体の結合が弱められ、感度が低下するので、大きな問題
点となると考えられる。

【００３１】その一方でカオトロピックイオンの変性作
用は可逆的である場合が多く、透析や希釈によりイオン
強度を弱めることにより一時的に変性した構造が元に戻
る場合がある。このことは、グアニジンなどのカオトロ
ピックイオンによる処理剤を用いた場合のもう一つの問
題点を示している。つまり本発明の目標とする処理方法
には、検体中に存在するウィルス粒子などに含まれる抗
原を効率よく遊離させることのみならず、同時に検体中
に存在する抗原に結合する高力価抗体をも失活させる必
要がある。すなわち、カオトロピックイオンによる可溶
化では、検体中に存在する高力価抗体の失活が不十分
で、この抗体の影響により感度が低くなることが考えら
れる。

【００３２】そのためカオトロピックイオンを用いた処
理方法は２つの相反する課題を内包している。つまりカ
オトロピックイオンにより構造を壊すような条件では抗
原抗体反応が阻害される、その一方でカオトロピックイ
オンの効果のみでは検体中の反応を阻害する抗体の不活
性化が不十分であり、抗原抗体反応を阻害しない様な状
況にした場合、夾雑抗体により反応が阻害される。すな
わちこの相反する課題を解決するためには、抗原のエピ
トープ構造は可逆的に破壊され、検体中の夾雑抗体の機
能破壊が不可逆的に起こるような条件を見いだす必要が
ある。

【００３３】抗体の活性を失活させる条件は、アルカリ
処理、酸処理などが知られている。血清を酸処理する
と、一部の血清蛋白質は非可逆的に変性し沈殿を生じる
ため、検体処理後の例えばピペッティング操作の障害に
なることが多く、また測定の際に固相に変性蛋白質を巻
き込んだ沈殿が吸着し、濁度として検出されることもあ
り、擬陽性の原因ともなりえる。加えて、それらの沈殿
物の中に、非特異的に目的とする抗原が巻き込まれ、プ
ローブとの反応量の減少による感度低下につながるなど
の問題点も生じる。

【００３４】本発明者は、酸処理とグアニジン処理を組
み合わせることにより、沈殿物の形成などの酸処理の問
題点、グアニジン処理の相反する問題点が解消されるこ
とを見いだし本発明を完成させるに至った。また、グア
ニジンなどのカオトロピックイオンを生じる処理剤と酸
性化剤からなる処理剤に、界面活性剤を加えると、さら
に好ましいことも見いだした。酸性化剤としては、塩
酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロル酢酸な
どが、適当である。

【００３５】また、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ
（３−〔３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕
−１−プロパンスルホン酸），ＣＨＡＰＳＯ（３−〔コ
ラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキ
シ−１−プロパンスルホン酸）、ドデシル−Ｎ−ベタイ
ンなどの両イオン性界面活性剤や、ＴｒｉｔｏｎＸ１０
０などのポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエー
テル類、ＮＰ４０などのポリオキシエチレンノニルフェ
ニルエーテル類、Ｔｗｅｅｎ２０などのポリオキシエチ
レンソルビトールエステル類、Ｂｒｉｊ５８のようなポ
リオキシエチレンドデシルエーテル類、オクチルグルコ
シドといった非イオン性界面活性剤が適当である。さら
にここに尿素などの水素イオン結合を弱めることにより
蛋白質の高次構造を部分的に壊す様な作用を示す薬剤を
加えてもよい。

【００３６】特に、塩酸グアニジン濃度は２Ｍ以上で、
ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度は２％以上で、Ｔｗｅｅｎ２
０濃度は０．０２％以上で、４℃から４５℃の範囲で使
用することがより好ましい。本発明の処理方法を用いる
ことにより、ＨＣＶと同様の構造を持つウィルス粒子を
含む検体から、ウィルス抗原を、抗体などをプローブと
して用いるいわゆる免疫測定方法に適した状態に遊離さ
せることが出来ることは明らかである。ここでＨＣＶと
同様の構造を持つウィルスとは、ゲノムＲＮＡ，ＤＮＡ
をパッキングする蛋白質と、それを取り囲む膜タンパク
質と脂質膜から構成される構造を持つウィルス粒子を形
成するウィルスであり、例えばＨＣＶの類縁のウィルス
であるフラビウィルス類、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）などのレトロウィルスなどが含まれる。さらにゲノ
ムとしてＤＮＡを持つものであっても同様の構造を持つ
ものが含まれる。

【００３７】本発明によって示されるプローブとしての
モノクローナル抗体 本発明でいうＨＣＶの構造蛋白質遺伝子断片とは、ＨＣ
Ｖの構造蛋白質遺伝子のコア領域を含む遺伝子断片であ
り、少なくともＨＣＶのＮ末端の１番目から１６０番目
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配
列を有するＤＮＡ断片である。具体的には、配列番号２
のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片
である。

【００３８】本発明でいうＨＣＶ抗原活性を有するポリ
ペプチドとは、抗ＨＣＶ抗体と免疫学的に反応する融合
ポリペプチドもしくはポリペプチドを意味し、本発明の
ハイブリドーマならびにそれから得られるモノクローナ
ル抗体の作製に利用するための抗原として用いる。具体
的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活
性を有する融合ポリペプチドもしくは配列番号１のアミ
ノ酸配列の一部を含むＨＣＶ抗原活性を有するポリペプ
チドであり、そのＮ末端あるいはＣ末端に余分なアミノ
酸配列が付加されたものであってもよい。

【００３９】本発明の上記融合ポリペプチドならびに配
列番号３〜５に示されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体類は、当業者により
容易に作製することができる。ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の作製は良く知られている。例えばＢ
ＡＬＢ／ｃマウスなどの腹腔内あるいは皮内に、上記融
合ポリペプチドもしくはポリペプチド（以下、本抗原）
を単独もしくはＢＳＡ，ＫＩＨなどと結合させた抗原と
して、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のア
ジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価
が上昇した時点で、追加免疫として本抗原を尾静脈内に
投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス骨髄
腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本方法
は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って行
なうことができる。

【００４０】上記方法により得られたハイブリドーマ細
胞株を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対し
て特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドー
マのクローニングには限界希釈法のほか軟寒天法（Ｅｕ
ｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７
６）などを利用することができる。そして、産生された
モノクローナル抗体をプロテインＡなどを用いたカラム
クロマトグラフィーなどの方法により精製する。上記の
モノクローナル抗体以外にもプローブとして用いる分子
は作製することが出来る。例えば組換え抗体について
は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｎの総説などに詳しく記載され
ている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，１５：６２−７０，１９９７）。

【００４１】プローブを用いた検出系 本発明に従って調製されたモノクローナル抗体は、ＨＣ
Ｖコア抗原の検出および定量用に、エンザイム−リンク
イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノ
ドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づい
たアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッ
セイ法で検査試薬として用いることができる。また、検
出に標識化抗体が使用される場合は、標識化合物として
は例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素、
染色物質などが使用される。

【００４２】例えば、検体（血清）中のＨＣＶコア抗原
を検出するためにサンドイッチ反応系を原理とした方法
を用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体
（例えばマイクロタイターウェルの内壁）に被覆された
本発明の１種類以上のモノクローナル抗体および標識物
質と結合させた１種類以上のモノクローナル抗体または
そのフラグメントを含む。固体支持体に固相化するモノ
クローナル抗体および標識するモノクローナル抗体の組
み合わせは自由であり、高感度の得られる組み合わせを
選択できる。

【００４３】使用できる固体支持体としてはポリスチレ
ンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール
製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリ
ー、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物な
ど）、膜（リポソームなど）、フィルターなどが挙げら
れる。

【００４４】

【発明の効果】本発明により示される方法により、抗体
などをプローブとして抗原を検出するいわゆる免疫測定
方法に適した状態に、ＨＣＶなどのウィルス粒子から簡
便にウィルス抗原を遊離させることが可能となる。また
本発明によって示される方法によってＨＣＶなどのウィ
ルス粒子を含む検体を処理することにより、抗体などを
プローブとして抗原を検出するいわゆる免疫測定方法に
より、ウィルス抗原を簡便にかつ感度よく検出、及び定
量することが可能となる。また本発明によって示される
検体処理方法を用いた免疫測定方法を用いた、検体中の
ＨＣＶなどのウィルスの有無を判別するキット、定量す
るキット及び診断薬を作製することが可能となる。

【００４５】

【実施例】以下の実施例は本発明を例証するものである
が、これによって本発明の範囲を制限するものではな
い。実施例１．ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製 （Ａ）発現プラスミドの構築 ＨＣＶのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方
法で構築した。Ｃ１１−Ｃ２１クローンおよびＣ１０−
Ｅ１２クローン（特開平６−３８７６５）をｐＵＣ１１
９に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ１１−Ｃ
１２およびｐＵＣ・Ｃ１０−Ｅ１２の各ＤＮＡ１μｇを
制限酵素反応液２０μｌ〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ２，１mM ジチオスレ
イトール、１００mM ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩ
および１５単位のＣｌａＩ酵素〕中、および〔１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ２，
１mMジチオスレイトール、５０mM ＮａＣｌ，１５単位
のＣｌａＩおよび１５単位のＫｐｎＩ酵素〕中で各々３
７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気
泳動を行ない、約３８０bpのＥｏｏＲＩ−ＣｌａＩ断片
および約９２０bpのＣｌａＩ−ＫｐｎＩ断片を精製し
た。

【００４６】この２つのＤＮＡ断片とｐＵＣ１１９をＥ
ｏｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したベクターに１０×リ
ガーゼ用緩衝液〔６６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），６６mM ＭｇＣｌ２，１００mMジチオスレトー
ル、１mM ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３
５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で
一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用
い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ
・Ｃ２１−Ｅ１２を得た。

【００４７】このプラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２
ＤＮＡ１ngを２つのプライマー（５′−ＧＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡ−３′（配列番
号：６），５′−ＴＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣ
ＧＧＡＣ−３′（配列番号：７）を用いＰＣＲを行なっ
た。ＰＣＲはGeneAmpTM (DNA Amplification Reagent K
it, Perkin Elmer Cetus製）のキットを用いＤＮＡ変性
９５℃１５分、アニーリング５０℃２分、ＤＮＡ合成７
０℃３分の条件で行ない、得られたＤＮＡ断片を０．８
％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダ
ー法（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）で精製した。

【００４８】一方、ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで消
化し、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片を１０×リ
ガーゼ用緩衝液〔６６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），６６mM ＭｇＣｌ２，１００mMジチオスレトー
ル、１mM ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３
５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で
一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用
い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ
ｌ９・Ｃ２１−Ｅ１２・ＳｍａＩを得た。このプラスミ
ドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０mM
ＮａＣｌ，６mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），６mM
ＭｇＣｌ２，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢ
ａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化反応を行ない、そ
の後０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、約４９
０bpのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を分離し、これをグ
ラスパウダー法で精製した。

【００４９】次に発現ベクターであるＴｒｐ・ＴｒｐＥ
（特開平５−８４０８５）のＤＮＡ１μｇを制限酵素反
応液２０μｌ〔１５０mM ＮａＣｌ，６mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５），６mM ＭｇＣｌ２，１５単位のＥ
ｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃
で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを加え、７０
℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスフ
ァターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μｌ）を加え
て３７℃で１時間保温した。

【００５０】この反応液にフェノールを加えてフェノー
ル抽出を行ない、得られた水層をエタノール沈殿し、沈
殿物を乾燥した。得られたＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理
ベクターＤＮＡ１μｇと上述のコア１６０断片を１０×
リガーゼ用緩衝液〔６６０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），６６mM ＭｇＣｌ２，１００mMジチオスレトー
ル、１mM ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３
５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で
一晩保温し、連結反応を行なった。

【００５１】この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＨＢ
１０１株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸
菌株は塩化カルシウム法〔Mandel, M.とHiga, A., J. M
ol.Biol., 53, 159-162 (1970) 〕により作られる。形
質転換大腸菌を２５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ
プレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，１．５
％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート
上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培
養した。

【００５２】１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プ
ラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法
〔Manniatis ら、Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual,（1982）〕により行なった。得られたプラスミド
ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０mM Ｎ
ａＣｌ，６mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），６mMＭ
ｇＣｌ２，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａ
ｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化し、アガロースゲル
電気泳動を行なって、約４９０bpのＥｏｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片が生じるＴｒｐ・ＴｒｅＥコア１６０発現プラ
スミドを選別した。

【００５３】（Ｂ）クローンコア１６０でコードされる
ポリペプチドの発現および精製 発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０をもつ大腸
菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／mlのアンピシリンを含む３
mlの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養
する。この培養液１mlを５０μｇ／mlのアンピシリンを
含む１００mlのＭ９−ＣＡ培地（０．６％ＮＡ₂ ＨＰＯ
₄ ，０．５％ＫＨ₂ ＰＯ₄ ，０．５％ＮａＣｌ，０．１
％ＮＨ４Ｃｌ，０．１mM ＣａＣｌ２，２mM ＭｇＳＯ
４，０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え
継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終
濃度４０mg／ｌになるようにインドールアクリル酸を加
え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離し
て菌体を集めた。

【００５４】菌体に２０mlの緩衝液Ａ〔５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０），１mM ＥＤＴＡ，３０mM Ｎ
ａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現
菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ １０ml
中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に
遠心分離を行ない、ＨＣＶ ｃＤＮＡでコードされるポ
リペプチドとＴｒｐＥの融合ポリペプチドを含む不溶性
画分を得た。その画分を１０mlの６Ｍ尿素を含む緩衝液
Ａを加えて融合ポリペプチドを可溶化抽出した。可溶化
した抽出物をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイオン交
換カラムクロマトグラフィーにかけて、融合ポリペプチ
ドの精製を行なった。

【００５５】実施例２．ハイブリドーマの作製法 前記方法により調製した融合ポリペプチド（ＴｒｐＣ１
１）を６Ｍ尿素溶解後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１
０mMリン酸緩衝液（pH７．３）に終濃度が０．２〜１．
０mg／mlとなるように希釈し、等量のアジュバント（タ
イターマックス）と混和し、ＴｒｐＣ１１懸濁液とし
た。ＴｒｐＣ１１濃度が０．１〜０．５mg／mlとなるよ
うに調製した該懸濁液を４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マ
ウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同様の免疫をおこ
ないさらに約２週間後、生理食塩に溶解したＴｒｐＣ１
１ １０μｇを尾静脈内に投与した。

【００５６】最終追加免疫後３日目に、この免疫動物よ
り無菌的に脾臓を摘出し、ハサミで切片としてさらにメ
ッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄
腫細胞株ｓｐ２／０Ａｇ１４を前記と同様に洗浄後、該
細胞１．８×１０７個と脾臓細胞１．０×１０⁸ 個を５
０ml容の遠心管に入れ混合した。２００×ｇ、５分間遠
心分離を行ない、上清を除去し、３７℃に保温した５０
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（メルク
社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１mlを加えさらに
ＲＰＭＩ−１６４０培地１０mlを加えて細胞融合させ
た。

【００５７】融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分
間）によってＰＥＧを除いた後、９６ウエルプレートを
用いて、１０％ウシ胎児血清ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジン（以下、ＨＡＴと省略）を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で約１０日間培養してハイブリ
ドーマのみを増殖させた。その後、目的の抗体を産生す
るクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望の反応特
異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを得た。

【００５８】得られたハイブリドーマについて、常法の
限界希釈法に従い、単一クローン化を行ない、得られた
ハイブリドーマをＨＣ１１−１４、ＨＣ１１−１０、お
よびＨＣ１１−１１と命名した。該３種類のハイブリド
ーマに関しては、生命工学工業技術研究所に平成７年７
月４日付で、それぞれ、ＦＥＲＭ ＢＰ−６００６，Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６００４及びＦＥＲＭ ＢＰ−６００５
として寄託された。

【００５９】実施例３．モノクローナル抗体の作製法 実施例２に記載の方法により得られたハイブリドーマを
プリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水中に
産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノ
クローナル抗体の精製は、プロテインＡを結合させたセ
ファロースカラムによりＩｇＧフラクションを分離し
た。前記３種類のハイブリドーマから産生されたそれぞ
れのモノクローナル抗体、Ｃ１１−１４，Ｃ１１−１０
およびＣ１１−１１のアイソタイプは、ウサギ抗マウス
Ｉｇ各アイソタイプ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたイ
ムノアッセイにより、Ｃ１１−１０がＩｇＧ２ａ，Ｃ１
１−１４，Ｃ１１−１１がＩｇＧ１であることが明らか
となった。得られた３種類のモノクローナル抗体につい
て、ＨＣＶコア領域由来の配列によって合成した２０ア
ミノ酸からなる合成ペプチドを用いてエピトープ解析を
行なった結果、表１に示す如くコア領域の一部を特異的
に認識するモノクローナル抗体であることがわかった。

【００６０】

【表１】

【００６１】実施例４．検体処理条件検討 処理条件検討 １）塩酸グアニジン濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１００
μｌに、種々の濃度に溶解した塩酸グアニジンと０．５
ＮＨＣｌを含む処理液を１００μｌ添加した。室温で３
０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とし
た。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時
の塩酸グアニジン濃度をとり、図１に示した。

【００６２】２）ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１００
μｌに、種々の濃度に溶解したＴｒｉｔｏｎＸ１００含
む処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｎ ＨＣｌ）を
１００μｌ添加した。室温で３０分間処理をおこない、
その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法によ
る結果を、横軸に処理反応時のＴｒｉｔｏｎＸ１００濃
度をとり、図２に示した。

【００６３】３）Ｔｗｅｅｎ２０濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１００
μｌに、種々の濃度に溶解したＴｒｉｔｏｎＸ１００含
む処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｎ ＨＣｌ，１
２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００μｌ添加し
た。室温で３０分間処理をおこない、その８０μｌを測
定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に
処理反応時のＴｗｅｅｎ２０濃度をとり、図３に示し
た。

【００６４】４）反応温度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１００
μｌに、処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５ＮＨＣ
ｌ，１２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，０．７５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０）を１００μｌ添加した。４℃、室温（２３
℃）、３７℃、４５℃で３０分間処理をおこない、その
８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法を用いて
検討した結果を図４に示した。

【００６５】測定法 上記の各々の血清処理法によって得られた試料は、以下
の測定法を用いて評価した。すなわち、抗ＨＣＶコア抗
原モノクローナル抗体（抗体Ｃ１１−１４とＣ１１−１
１の等量混合）を終濃度が計６μｇ／mlになるように
０．１Ｍ炭酸緩衝液（pH９．６）で希釈し、９６ウエル
マイクロプレート（ヌンク社製）１ウエルにつき１００
μｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
３）０．３５mlを用いて２回洗浄し、０．５％カゼイン
−Ｎａを含む１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．３
５）、（以下ブロッキング液）０．３５mlを添加し、さ
らに室温で２時間静置した。

【００６６】ブロッキング液除去後、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，１％ＢＳＡ，０．５％カゼイン−Ｎａ，０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH７．３）１４０μｌと１Ｍトリス２０μｌを混合
したもの計１６０μｌ（以下反応緩衝液とする）と、前
述した処理法で得られた測定試料８０μｌをそれぞれの
ウエルに加え、室温で２時間反応させ、洗浄液３００μ
ｌで５回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標
識したモノクローナル抗体（Ｃ１１−１０）１００μｌ
を添加して室温で３０分間反応させた。反応後、上記洗
浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（オルトフェニレン
ジアミン、以下ＯＰＤ）溶液１００μｌを加え室温で３
０分間反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加
し、波長６３０nmの吸光度を対照として波長４９２nmに
おける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。

【００６７】図１〜４から、処理条件の最適化が行われ
たが、パネル血清において、未処理検体ではコア抗原の
検出が困難であったが、このような極めて簡易な処理を
行うことによって、劇的にコア抗原の検出が可能となっ
た。いずれの場合でも、健常人ではシグナルの上昇は認
められなかった。また、特に塩酸グアニジン濃度は２Ｍ
以上で、ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度は２％以上で使用す
ることで、４℃から４５℃の範囲で、良好にコア抗原を
検出できることが示された。

【００６８】実施例５．コア抗原の検出および測定法 血清１００μｌに、処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．
５Ｎ ＨＣｌ，１２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，０．
７５％Ｔｗｅｅｎ２０）を１００μｌ添加した。室温で
３０分間処理をおこない、その１００μｌを測定試料と
した。抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（Ｃ１１−
１４とＣ１１−１１等量混合）を終濃度が計６μｇ／ml
になるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（pH９．６）で希釈
し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）１ウエ
ルにつき１００μｌずつ分注した。

【００６９】４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
を含む１０nMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．３）０．
３５mlを用いて２回洗浄し、ブロッキング液０．３５ml
を添加し、さらに室温で２時間静置した。ブロッキング
液を除去後、反応緩衝液１５０μｌと前述した処理法で
得た測定試料をそれぞれのウエルに加え、室温で２時間
反応させた。

【００７０】洗浄液３００μｌで５回洗浄し、さらにペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識したモノクローナル抗体
（Ｃ１１−１０）１００μｌを添加して室温で３分間反
応させた。洗浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（ＯＰ
Ｄ）溶液１００μｌを加え室温で４５分間反応させた
後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波長６３０nmの
吸光度を対照として波長４９２nmにおける吸光度（ＯＤ
４９２）を測定した。尚、標準血清として、パネル血清
５０を１Ｕ／mlとして、１％ＢＳＡを含む１０mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７．３）で段階的に希釈したもの
について同様に処理をおこない測定した。

【００７１】図５に、標準血清として使用したパネル血
清５０の希釈直線を示した。試料中コア抗原が濃度依存
的に測定されており、約０．５ｍＵ／mlの検出が可能で
あった。すなわち、本発明の極めて簡易な検体処理法と
モノクローナル抗体を組み合わせて用いることにより、
コア抗原を検出または定量できることが明らかとなっ
た。

【００７２】実施例６．血清処理と測定法で認識されて
いる分子形の解析 パネル血清１３の０．２５mlを各々血清処理法で処理
し、ゲルロカカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ，１
ｘ３０）で分画し、それらのフラクション中の抗コア免
疫活性を測定し、その結果を図６に示した。分子量約２
０〜３０ｋＤａの分子を認識していると考えられ、ウイ
ルス中のコア抗原は前述した前処理によって、ウイルス
破壊および血清中に存在する抗コア抗体の不活化によ
り、様々な相互作用から遊離されていることが示され
た。

【００７３】実施例７．血清試料中のコア抗原の測定法 ＰＣＲ法であるアンプリコアＨＣＶモニターキット（ロ
ッシュ社）を用いてＨＣＶ−ＲＮＡ量が１０³ 〜１０⁷
コピー／mlと測定された血清と健常人血清を用い、前述
の方法で、血清中のＨＣＶコア抗原の定量を行なった。
また、標準血清として、パネル５０血清（１Ｕ／mlと設
定）を１％ＢＳＡを含む１０mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH７．３）にて段階的に希釈し、同様に処理したもの
を用い、表２にその測定結果を示した。今回測定した検
体のうち、健常人検体は全て検出限界以下であり、ＰＣ
Ｒ法陽性例の全てを検出できた。このときの相関性を図
７に示したが、ＰＣＲ法との相関係数も０．８以上とな
り高い相関性を示した。

【００７４】

【表２】

【００７５】

【配列表】

（２）配列番号：１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１７７ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu 5 10 15 Phe Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 20 25 30 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 35 40 45 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 50 55 60 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg 65 70 75 80 Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro 85 90 95 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 115 120 125 Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 130 135 140 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe 145 150 155 160 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 165 170 175 Asp

【００７６】（２）配列番号：２： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１６０ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160

【００７７】（２）配列番号：３： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu 5 10 15 Leu Pro Arg Arg 20

【００７８】（２）配列番号：４： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１０ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド

【００７９】（２）配列番号：５： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg 5 10 15 Ser Arg Asn Val Gly 20

【図面の簡単な説明】

【図１】検体処理において塩酸グアニジン添加濃度によ
る効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎ
ｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１
３，５０を使用した。

【図２】検体処理においてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００添加
濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人
血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル
血清１３，５０を使用した。

【図３】検体処理においてＴｗｅｅｎ２０添加濃度によ
る効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎ
ｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１
３，５０を使用した。

【図４】検体処理中の温度による効果を検討した結果を
示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５０を使用した。

【図５】標準血清のパネル血清５０を１Ｕ／mlとして段
階的に希釈し、検体処理した試料をサンドイッチイムノ
アッセイ反応系で測定したときの希釈検量線と検出感度
を示す図である。

【図６】パネル血清１３を、検体処理をおこなってか
ら、ゲルロカカラムを用いて分画し、その分画中のコア
抗原活性を測定したものである。分子量は、ＩｇＧは約
１５０ｋＤ、アルブミンは約６８ｋＤである。

【図７】アンプリコアＨＣＶモニターキットで陽性を示
した検体について、本発明の検体処理後その遊離したコ
ア抗原活性を測定した値とアンプリコアＨＣＶモニター
（ＰＣＲ法）で求めたＨＣＶ−ＲＮＡ量との相関性を示
す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年３月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】得られたハイブリドーマについて、常法の
限界希釈法に従い、単一クローン化を行ない、得られた
ハイブリドーマをＨＣ１１−１４、ＨＣ１１−１０、お
よびＨＣ１１−１１と命名した。該３種類のハイブリド
ーマに関しては、生命工学工業技術研究所に平成９年７
月４日付で、それぞれ、ＦＥＲＭ ＢＰ−６００６，Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６００４及びＦＥＲＭ ＢＰ−６００５
として寄託された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 木村 達治 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 飯田 久美子 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 八木 慎太郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＣＶを含む検体を、（１）カオトロピ
   ックイオン、及び（２）酸性化剤を含む処理液で処理す
   ることを特徴とするＨＣＶ含有検体の処理方法。
2. 【請求項２】 ＨＣＶを含む検体を、（１）カオトロピ
   ックイオン、（２）酸性化剤、及び（３）非イオン性界
   面活性剤を含む処理液で処理することを特徴とするＨＣ
   Ｖ含有検体の処理方法。
3. 【請求項３】 請求項１〜２のいずれか１項に記載の検
   体処理方法を用いて、ＨＣＶコア抗原を特異的に認識す
   るプローブを反応させることにより、ＨＣＶコア抗原の
   存在を検出又は定量することを特徴とするＨＣＶの測定
   方法。
4. 【請求項４】 ＨＣ１１−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０
   ０５）であるハイブリドーマ細胞株。
5. 【請求項５】 ＨＣ１１−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０
   ０５）から成るハイブリドーマによって産生されるモノ
   クローナル抗体。
6. 【請求項６】 請求項３に記載の免疫測定方法に用いる
   ための、カオトロピック剤を含んで成る、検体中のＨＣ
   Ｖの有無を判別するキット、定量するキット又は診断
   薬。
7. 【請求項７】 請求項３に記載の免疫測定方法に用いる
   ための、ハイブリドーマＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭ Ｂ
   Ｐ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭＢＰ−６０
   ０４）またはＨＣ１１−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００
   ５）により生産されるモノクローナル抗体を含んでな
   る、検体中のＨＣＶの有無を判別するキット、定量する
   キット又は診断薬。