JPWO2019124532A1 - イムノクロマトグラフィー装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、（１）前記測定物質と特異的に結合する第１抗体が多孔質担体に固定化され、検出部位である第１部位、（２）前記測定物質と特異的に結合し、前記第１抗体と認識部位が異なる標識抗体である第２抗体が移動可能なように多孔質担体に保持され、検体液の添加部位である第２部位、及び（３）前記第２抗体の標識物と特異的に結合する物質を結合させた着色微粒子が移動可能なように多孔質担体に保持され、検体液又は展開液の添加部位である第３部位、を有し、前記第１部位と前記第３部位の間に前記第２部位が設置されており、前記第２部位から第１部位へ、及び前記第３部位から第１部位へ、毛細管現象による検体液又は展開液の移動が可能である、テストストリップ、及びそのテストストリップがカセットに収納されたイムノクロマトグラフィー装置に関する。

Description

本発明は、イムノクロマトグラフ法によるテストストリップ、そのテストストリップを収納するためのカセット、及びそのカセットにテストストリップが収納されているイムノクロマトグラフィー装置に関する。

臨床検査などにおいて、検体中の成分を測定する方法として免疫測定方法が利用されている。その中のイムノクロマト法は、操作が簡便かつ短時間で測定可能であることから臨床現場などで汎用されている。イムノクロマト法の一般的なテストストリップは、検体を添加するサンプルパッドと呼ばれる多孔質担体、着色微粒子標識抗体が検体液で溶解され移動可能なように保持されているコンジュゲートパッドとよばれる多孔質担体、検出ラインの位置に抗体が固定化されておりコンジュゲートパッドを通過し流れ出た液が展開していくメンブレンとよばれる多孔質担体、及びメンブレンを展開した液を吸い取る吸収パッドとよばれる吸水性素材から構成される。

一般的なイムノクロマト法の測定は、サンプルパッドに検体を添加することにより行われる。測定物質と着色微粒子で標識された抗体が複合体を形成しながらメンブレンを移動し、検出ラインを通過するとき固定化してある抗体に複合体が捕捉され、複合体がライン状の発色として観察される。感染症の検査に広く使用されており、一般的には発色が確認された場合は陽性、そうでない場合は陰性と判定される。

イムノクロマト法は、反応時間を長くすると測定感度が高くなる傾向にあるが、その分反応時間が長くなり利便性が低下するという課題があった。近年、イムノクロマト法の高感度化の研究により、より短時間で陽性判定できるようになるとともに、より微量の測定物質が検出可能になってきた。

検出ラインの呈色を高めて高感度化する方法として、水溶性高分子化合物を添加する方法（特許文献１）、標識物質である金属コロイドを銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感する方法（特許文献２）、発色量を高めた有機着色微粒子を用いる方法（特許文献３）が開示されている。しかし、いずれも測定物質と抗体の反応は、着色微粒子に結合した抗体との間で行われること、更にメンブレンの多孔質担体内を移動しながらの反応であることから、動的制約、立体障害などを受け抗原抗体反応の効率が低いという問題点がある。そのため、反応効率を向上させるために、低濃度の測定物質を測定する必要がある場合は、検体の展開速度を遅くするとか検体量を多く展開させるなどの対策がとられている。

また、反応効率を改善して感度の向上を図る方法として、検出ライン上に着色微粒子標識抗体と測定物質の複合体を効率よく捕捉する方法（特許文献４）、着色微粒子標識抗体と測定物質の結合反応を効率よく行う方法（特許文献５）が開示されている。イムノクロマト法は測定原理上、測定物質と着色微粒子標識抗体との反応効率が悪い、着色微粒子による立体障害などで検出ライン上での捕捉効率が悪いことが指摘されており、これらの開示された方法は、どちらか一方のみ改善しただけで、依然として課題は残っている。

更に、イムノクロマト法の測定操作は一般的に検体を添加、或いは検体が入った容器にテストストリップの端を浸す１段階の操作で完了するが、検体を添加後に別の場所に緩衝液を添加する２段階の操作で測定を行う方法が開示されている。操作を２段階にすることにより、検体に含まれる反応阻害物質の影響が回避できること（特許文献６、特許文献８）が示されているが、操作が煩雑になる上に依然として着色微粒子の検出ライン上での捕捉効率の課題は残っている。更に、イムノクロマト法で酵素免疫測定方法を実施すること（特許文献７）が示されているが、操作が煩雑になる課題に加え、酵素反応に十分な時間が必要になるため測定時間が長くなるという課題がある。

また更に、例えば、インフルエンザ、アデノウィルスなどの感染症の市販測定キットでは、測定物質が高濃度の場合は２、３分で検出ラインが呈色して陽性と判定することができるが、低濃度の場合は検出ラインの呈色に時間を要するため、概ね８〜１５分の測定時間が設定されている。その一方で、測定時間を超えても検体の展開が持続して、微量に残存する着色微粒子標識抗体と測定物質の反応が徐々に進行するため、必要以上に反応時間を長くすると偽陽性が出現する可能性がある。そのため市販キットでは、測定時間を超えての測定は行わないよう注意喚起がなされている。

特開２００３−３４４４１３ 特開２００８−２８６５９０ 国際公開第２０１１／０６２１５７ 特開平９−１８４８４０ 特開平１０−６８７３０ 特開２００１−３３７０９１ 特開平１０−３００７５０ 特開２００９−００２８２２

本発明が解決しようとする課題は、イムノクロマト法における反応効率の問題を解決し、簡便な操作で高感度かつ短時間で判定できるイムノクロマト法によるテストストリップ、そのテストストリップを収納するためのカセット、及びそのカセットにテストストリップが収納されているイムノクロマトグラフィー装置を提供することである。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、メンブレン上を移動しながら測定物質と着色微粒子標識抗体とを反応させ、次いで着色微粒子標識抗体と測定物質との結合体を検出ラインに固定した抗体で捕捉させる従来のイムノクロマト法では、反応効率の向上は困難であることがわかった。そこで従来のイムノクロマト法で実施されている２段階の抗原抗体反応を、まずは着色微粒子が存在しない状態で実施させ、次いで検出ラインに捕捉された測定物質と抗体の結合体に着色微粒子を捕捉させるようにしたテストストリップを用いて測定を行ったところ、高感度かつ短時間に測定できることを見出した。しかし、このテストストリップは測定物質に最初に反応させる抗体を保持する部位と着色微粒子を保持する部位を有し、それぞれの部位に前者には検体液を、後者には検体液又は展開液を滴下し、２回の滴下が必要になり、操作が従来の方法に比べて煩雑になるため、１回の滴下操作でテストストリップの２か所の部位に検体液を導入できるカセットを考案した。こうして、操作性を犠牲にすることなく、高感度かつ短時間に測定できるイムノクロマトグラフィー装置を創作し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下のようである。
［１］ 検体液中の測定物質をイムノクロマト法で検出するテストストリップであって、
（１）前記測定物質と特異的に結合する第１抗体が多孔質担体に固定化され、検出部位である第１部位、
（２）前記測定物質と特異的に結合し、前記第１抗体と認識部位が異なる標識抗体である第２抗体が移動可能なように多孔質担体に保持され、検体液の添加部位である第２部位、及び
（３）前記第２抗体の標識物と特異的に結合する物質を結合させた着色微粒子が移動可能なように多孔質担体に保持され、検体液又は展開液の添加部位である第３部位、
を有し、前記第１部位と前記第３部位の間に前記第２部位が設置されており、前記第２部位から前記第１部位へ、及び前記第３部位から前記第１部位へ、毛細管現象による検体液又は展開液の移動が可能である、テストストリップ。

［２］ 更に、前記第１部位の前記第２部位とは反対側の近傍に、反応が正常に行われたことを示すコントロールラインを有する、［１］記載のテストストリップ。
［３］ 前記第２部位において、前記標識第２抗体を含む部位が、前記検体液の添加部位よりも前記第１部位よりに位置する、［１］又は［２］に記載のテストストリップ。
［４］ 更に、前記第１部位及び／又は前記コントロールラインの前記第２部位とは反対側に、検体液若しくは展開液を吸収又は移動させるための、吸水体又は多孔質担体を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のテストストリップ。
［５］ 前記第２抗体の標識物がビオチンであり、前記着色微粒子に結合している前記第２抗体の標識物と特異的に結合する物質が、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及び抗ビオチン抗体からなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載のテストストリップ。
［６］ 前記ストレプトアビジンがタンパク質との複合体である、［５］に記載のテストストリップ。
［７］ 前記着色微粒子が、金属コロイド、着色ラテックス、及び着色セルロース粒子からなる群から選択される、［１］〜［６］のいずれかに記載のテストストリップ。
［８］ 前記第２部位と前記第３部位に同時に、又は前記第２部位に次いで前記第３部位に、前記検体液若しくは展開液が添加されるように用いられることを特徴とする、［１］〜［７］のいずれかに記載のテストストリップ。

［９］ イムノクロマト法で検体液中の測定物質を検出するテストストリップを収納するための、上面に判定窓と凹状の検体添加部とが配置されたカセットであって、
前記凹状の検体添加部の中に第１の貫通孔を有する凸部を有し、
前記凹状の検体添加部の前記判定窓とは反対側に第２の貫通孔を有し、
前記凹状の検体添加部から前記第２の貫通孔に、前記凸部の第１の貫通孔から漏れた添加された検体液の一部を送液するための流路を有する溝部が形成されている、カセット。
［１０］ 前記溝部に、送液するための流路として多孔質担体を備えており、前記多孔質担体の一端が、カセット内に収納されるテストストリップと前記第２の貫通孔を通じて接触するように備えられている、［９］に記載のカセット。
［１１］ 更に、前記溝部に蓋が装着されている、［９］又は［１０］に記載のカセット。
［１２］ ［１］〜［８］のいずれかに記載のテストストリップが［９］〜［１１］のいずれかに記載のカセットに収納されている、イムノクロマトグラフィー装置。
［１３］ 前記カセットの判定窓が前記テストストリップの検出部位である第１部位に、前記カセットの第１の貫通孔が前記テストストリップの第２部位にある検体液の添加部位に、前記カセットの第２の貫通孔が前記テストストリップの第３部位にある検体液又は展開液の添加部位に、それぞれ対応した位置に配置されている、［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー装置。

本発明によるテストストリップ、カセット、及びイムノクロマトグラフィー装置によれば、イムノクロマトグラフ法の測定において高感度な検出性能を維持した状態で従来法に比べて測定時間を短縮化することが可能である。特に、臨床検査の分野において利用価値が高い。

図１（ａ）は、本発明の一実施形態であるテストストリップの側面図である。図１（ｂ）は、本発明の一実施形態であるテストストリップの平面図である。 図２（ａ）は、本発明の一実施形態であるカセットの側面図である。図２（ｂ）は、本発明の一実施形態であるカセットの平面図である。図２（ｃ）は、図２（ａ）に示すカセットのＡ−Ａ線断面図である。 図３（ａ）は、本発明の一実施形態であるカセットで、溝部の蓋を取り外した状態を示す斜視図である。図３（ｂ）は、図３（ａ）のカセットで、溝部の蓋を装着したときの斜視図である。図３（ｃ）は、本発明の一実施形態であるカセットで、溝部の蓋が検体添加部と一体となっているもので、当該蓋を取り外した状態を示す斜視図である。図３（ｄ）は、図３（ｃ）のカセットで、溝部の蓋を装着したときの斜視図である。

以下、本発明の実施形態を、図面を用いて説明する。図面は、本発明の説明に用いられるものであり、本発明の技術的範囲は、図面に示す実施形態に限定されない。
図１は本発明のテストストリップの一例を示している。テストストリップ（１１）は、粘着シート（１２）、担体（１３）、吸水体（１４）、第１部位（１５）、第２部位（１６）、第３部位（１７）、及びコントロールライン（１８）から形成される。

第１部位（１５）は、測定結果を目視又は機械的に観察するための検出部位であって、多孔質担体からなる担体（１３）に測定物質と特異的に結合できる第１抗体が固定化されている部位である。担体（１３）は好ましくはニトロセルロース製メンブレンフィルターが用いられるが、検体液又は展開液を展開することが可能で、かつ抗体を固定可能なものであれば、他のセルロース製メンブレンフィルター、ナイロン製メンブレンフィルターなども使用できる。

第２部位（１６）は、検体中の測定物質と特異的に結合できる標識された第２抗体（以下、標識第２抗体という）を含む多孔質担体からなるパッドであり、検体液の添加部位である。この検体液の添加部位は、標識第２抗体を含む部位よりも、検出部位である第１部位（１５）から離れた側に位置させることが好ましい。すなわち、標識第２抗体を第２部位（１６）の第１部位（１５）よりに含ませ、第２部位（１６）の第１部位（１５）とは離れた側を検体液の添加部位とすることが好ましい。また、第２部位（１６）の第１部位（１５）とは反対側の近傍を検体液の添加部位とすることもでき、第２部位（１６）が検体液の添加部位であるとは、このような実施態様も含む。このようにすることで、標識第２抗体は、検体液の添加により、検出部位である第１部位（１５）の方向に移動しやすくなり、逆方向への移動及び標識第２抗体と後述の結合性着色微粒子が先に結合物を形成することを防止することができる。従って、標識第２抗体を含む部位が検体液の添加部位よりも概ね第１部位（１５）よりに位置するようにすれば、良好な結果が得られる。

第２部位（１６）は、担体（１３）に両面テープなどを介して固定されているが、その際、第２部位（１６）に滴下された検体液を担体（１３）に移動できるようにするため、第２部位（１６）の一部が直接担体（１３）と接触するようにしておく。第２部位（１６）の多孔質担体は、上部から添加された検体液を吸収しやすく、保水性が低く、かつ担体（１３）中を移動、展開している液を吸い取り難い性質のものが好ましく、グラスファイバー、ポリエステル製の膜、不織布などが使用できる。

前記検体液は、測定物質を含む液体であって、生体試料、又は生体試料の希釈液若しくは抽出液などが用いられる。生体試料としては、全血、血清、血漿、尿、唾液、髄液、羊水、鼻汁、痰、組織浸出液、鼻腔又は咽頭拭い液、細胞及び糞便などが挙げられる。希釈液又は抽出液は、緩衝剤などを含む溶液で、塩類、界面活性剤、タンパク質、糖類、ポリマー類、防腐剤などを適宜含んでも良い。測定物質は、抗原抗体反応による免疫測定が可能なものならいずれでもよく、タンパク質、ウィルス、細菌、ホルモンなどが挙げられる。

第２部位（１６）の標識第２抗体の標識物は、標識物に対して特異的に結合でき、かつ、後述の着色微粒子に担持可能な物質を用意できるものであればいずれでもよい。例えば、当該標識物としては、ハプテン、ビオチン、ペプチド、タンパク質などが用いられる。ハプテンを標識物とする例としては、６−（２，４−ジニトロアニリノ）ヘキサン酸 Ｎ−スクシンイミジルで第２抗体を標識し、当該第２抗体の標識物と特異的に結合する物質として抗ジニトロフェニル抗体を着色微粒子に結合させる組み合わせ、ビオチンを標識物とする場合は、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体類（例えば、商品名：ＥＺ−Ｌｉｎｋ^ＴＭ ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）で第２抗体を標識し、当該第２抗体の標識物と特異的に結合する物質としてストレプトアビジンを着色微粒子に結合させる組み合わせなどが使用できる。これらの中でも、ビオチンを標識物として使用することが好ましい。

第２部位の標識第２抗体を含む多孔質担体は、その上面又は下面に標識第２抗体を含有しない多孔質担体からなるパッドで全体又は一部を覆ってもよい。このパッドには必要に応じて、親水性ポリマー、タンパク類、緩衝成分、界面活性剤などを含有させてもよい。このパッドは、検体液を吸収しやすく、保水性が低く、かつ担体（１３）中を移動、展開している液を吸い取り難い性質のものが好ましく、グラスファイバー、ポリエステル製の膜、不織布などが使用できる。また、第２部位（１６）は、独立した構造物とはせずに、担体（１３）の一部をそのまま第２部位（１６）とすることもできる。

第３部位（１７）は、標識第２抗体の標識物と特異的に結合する結合性物質を結合させた着色微粒子（以下、結合性着色微粒子という）を含む多孔質担体からなるパッドであり、検体液又は展開液の添加部位である。この検体液又は展開液の添加部位は、結合性着色微粒子を含む部位よりも、検出部位である第１部位（１５）から離れた側に位置させることが好ましい。第３部位（１７）においては、結合性着色微粒子を第１部位（１５）よりに含ませ、第１部位（１５）とは反対側の近傍を検体液又は展開液の添加部位とすることができる。第３部位（１７）が検体液又は展開液の添加部位であるとは、このような態様も含む。このようにすることで、結合性着色微粒子は、検体液又は展開液の添加により、検出部位である第１部位（１５）の方向に移動しやすくなる。第３部位（１７）は、担体（１３）に接触するように粘着シート（１２）により固定されているが、担体（１３）の端部を延長（図１で第３部位の右側にまで）し、担体（１３）に直接固定することもできる。また、第３部位（１７）は、独立した構造物とはせずに、担体（１３）の一部をそのまま第３部位とすることもできる。

第３部位（１７）の多孔質担体は、不織布、グラスファイバー、ポリエステル製の膜などが用いられる。第３部位（１７）においては、余剰の検体液をそのまま添加してもいいし、検体液の代わりに展開液を使用することもできる。展開液は、緩衝剤などを含む溶液で、塩類、界面活性剤、タンパク、糖類、水溶性高分子、防腐剤などを適宜含んでも良い。結合性着色微粒子を含む多孔質担体は、上面の全体又は一部を結合性着色微粒子を含有しない別の多孔質担体からなるパッドで覆ってもよい。このパッドには必要に応じて、親水性ポリマー、タンパク類、緩衝成分、界面活性剤などを含有してもよい。このパッドは、検体液又は展開液を吸水しやすい性質のものが好ましく、グラスファイバー、ポリエステル製の膜、不織布などが使用できる。

第３部位（１７）の結合性着色微粒子に用いられる着色微粒子は、イムノクロマト法で通常使用されるものであればいずれでもよく、金属コロイド、着色ラテックス、着色セルロース微粒子などが用いられる。着色微粒子に結合させる物質は、標識第２抗体の標識物に応じて適宜選択され、標識物が合成ペプチドであればそれに対する抗体、ビオチンであればストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体などがあげられるが、中でも、標識第２抗体の標識物にビオチンを使用し、着色微粒子に結合させる物質にストレプトアビジンを使用するのが好ましい。このようにストレプトアビジンを使用する場合は、ビオチンとの反応性を高めるため、タンパク質との複合体にするのが好ましく、複合体に用いるタンパク質としてＢＳＡ、ＩｇＧなどが挙げられる。複合体の作製方法は、例えば、タンパク質にＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物によりチオール基を導入し、ストレプトアビジンにＮ−［（４−マレイミドメチル）シクロヘキシルカルボニルオキシ］スルホスクシンイミドによりマレイミド基を導入し、両者を反応させることにより作製することができる。

ここで、着色微粒子に結合させる物質の量は、第１部位で捕捉された標識第２抗体の標識物と反応できる量であれば構わないが、より反応性を高めるため着色微粒子に結合しうる最大量を結合させるのが好ましい。最大量は着色微粒子の表面積、結合させる物質の大きさなどにより決定されるが、当業者であれば実験などで容易に設定することができる。

第２部位に添加する検体液、及び第３部位に添加する検体液又は展開液の液量は、各部位に用いるパッドの大きさ、含水量などにより設定されるが、添加する液量が少なすぎると、各部位から担体（１３）に液体が移動できないため、添加した液体が各部位から担体（１３）に移動できる液量が最少液量、添加した液体が各部位を構成するパッドを均一に液体で満たす量が最大液量として設定される。この液量の範囲から必要な測定感度などに応じて適宜最適量を設定することができる。少なくとも、第３部位に添加する検体液又は展開液は、第２部位（１６）から更に第１部位（１５）に移動する必要があり、液が移動、展開する距離が長いので、必要な液量は多くなる。

第１部位（１５）の第２部位（１６）とは反対側の近傍には、コントロールライン（１８）を設けている。コントロールライン（１８）は、第３部位（１７）から移動、展開し、第１部位（１５）で捕捉されずに通過した結合性着色微粒子が捕捉され、それにより反応が正常に行われたことを示す部位である。コントロールラインを形成する物質は、第３部位に添加した検体液又は展開液が正常に第１部位を通過したときに結合性着色微粒子がラインとして呈色することができるものであれば如何なるものを用いても良い。例えば、コントロールラインの位置に固定化する物質としては、標識第２抗体又はその標識物を使用してもよく、結合性着色微粒子に結合させる物質がストレプトアビジン、ニュートラアビジンであれば、ビオチンを使用することもできる。また、標識第２抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体であれば抗マウスＩｇＧ抗体を固定化することも可能である。

また、第１部位（１５）及びコントロールライン（１８）の第２部位（１６）とは反対側には、担体（１３）の延長部分及び／又は吸水体（１４）を設けている。これにより、第２部位（１６）の検体液が第１部位（１５）に向けて、更には第１部位（１５）を超えて移動、展開しやすくなり、これに伴い、第３部位（１７）の検体液又は展開液の第１部位（１５）方向に向かう移動、展開がスムーズになる。吸水体（１４）としては、吸水性、保水性のある多孔質担体が好ましく、セルロース製の膜、ろ紙、不織布などが用いられる。

本発明のテストストリップを更に詳細に説明する。測定は、第２部位（１６）に検体液を添加し、それと同時又はその後すぐに第３部位（１７）に検体液又は展開液を添加することにより開始される。ここで、第２部位（１６）及び第３部位（１７）における検体液又は展開液の添加タイミングは、手動で操作する場合は、できる限り、常に同じタイミングで行うことが好ましい。第２部位（１６）に添加された検体液は、第２部位に保持されている標識第２抗体を溶解して測定物質と反応しながら担体（１３）に移動し、担体（１３）中を第１部位（１５）と第３部位（１７）に向けて展開していく。ここで、標識第２抗体と測定物質との反応物は、第３部位（１７）に向けて移動しない方がいいことは、既述の通りである。そして第３部位（１７）に添加された検体液又は展開液は、結合性着色微粒子を分散しながら担体（１３）に展開し、第２部位（１６）から展開してきた検体液と衝突する。この衝突によって、第２部位（１６）の検体液はすべて第１部位（１５）方向に向かって移動、展開し、測定物質と標識第２抗体の結合物は第１部位の抗体に捕捉される。第２部位（１６）の検体液が持続的に担体（１３）に移動している状態では、第３部位（１７）から移動してきた液の展開は非常に遅くなるか若しくはほとんど停止した状態になる。そして第２部位（１６）の検体液がほぼすべて第１部位方向へ移動した段階で第３部位（１７）から移動してきた液が通常速度で第１部位方向へ移動、展開し始め、第１部位の第１抗体に捕捉された測定物質と結合している標識第２抗体の標識物に結合性着色微粒子が捕捉され発色が確認される。更に、過剰の検体液又は展開液は担体（１３）の延長部分及び／又は吸水体（１４）に向けて移動し、第１部位の洗浄液として機能し、発色を鮮明にするとともに反応を停止する作用を有する。

また、本発明の好ましい形態のテストストリップでは、第２部位（１６）及びその近傍における測定物質と標識第２抗体の反応、並びに、第１部位（１５）における測定物質と標識第２抗体の結合物と固定化された抗体との反応は、着色微粒子が存在しない状態での反応であるため、一般的なイムノクロマト法のような立体障害による反応性の低下がなく効率よく反応を行うことができる。なお、本発明の一部の形態のテストストリップでは、標識第２抗体又は測定物質と標識第２抗体との結合物が先に結合性着色微粒子と結合することがあるが、そのような結合物を形成するものは量的に少なく、標識第２抗体又は測定物質と標識第２抗体との結合物の大半は先に第１部位（１５）に移動するため、問題はない。また、第１部位に測定物質を介して捕捉された標識第２抗体の標識物と結合性着色微粒子との反応は、着色微粒子に結合性物質が結合している状態での反応であるが、本発明の結合性着色微粒子は非常に効率的に反応を行うことが可能である。一般的なイムノクロマト法では、測定物質の濃度が高いと着色微粒子に多くの測定物質が結合し、第１部位の抗体に対して高い反応性を有する着色微粒子となり、測定物質の濃度が低いと着色微粒子に結合する測定物質は少なくなるので、第１部位の抗体に対する反応性が低い着色微粒子となる。それに対して、本発明では、着色微粒子にはあらかじめ着色微粒子に結合できる最大量の標識第２抗体の標識物に反応する結合性物質が担持されているため、着色微粒子に結合性物質が結合している状態の反応であっても、測定物質の濃度に関係なく第１部位に捕捉された標識第２抗体の標識物に対して高い反応性を有している。そのため測定物質の濃度に関係なく短時間に効率よく反応させることが可能となり、着色微粒子が第１部位を通過してバックグラウンドが概ね白色になった時点で、すなわち、測定物質の濃度に関係なく３〜５分の測定時間で一般的なイムノクロマト法と同等以上の高感度な測定が可能となる。更に、この時点で第２部位から展開した標識第２抗体もすべて第１部位を通過してこれ以上の抗原抗体反応が進行することがないため、測定時間を超えても偽陽性が出現することがなくなる利点がある。

図２は本発明のカセットの一例を示している。本実施形態のカセットは、検体に含まれる測定物質を測定するために用いられるイムノクロマト法によるテストストリップ（２９）、ここでは特に本発明のテストストリップ（２９）を収納するためのカセットであって、テストストリップ（２９）の検査面を覆うカバー部（２２）とテストストリップ（２９）を載せるベース部（２１）から構成され、材質は特に限定されないがプラスチック等の樹脂で形成される。カバー部（２２）は、テストストリップ（２９）を収納するために、取り外しが可能となっている。

本発明のカセットは、内部に収納されたテストストリップ（２９）の測定結果を観察するための開口部である判定窓（２３）が設けられており、その測定結果は目視で又は機械的に観察することができる。更に本カセットには、内部に収納するテストストリップ（２９）に検体液を導入するための検体添加部（２４）及び第２の貫通孔（２８）が設けられ、検体添加部と第２の貫通孔は溝部（２６）により連結されている。検体添加部（２４）は凹状に形成され、更にその底面には凸部（２７）が設けられている。凹状の形状は、特に限定されないが、円柱又はすり鉢状、もしくはその組み合わせの形状が好ましく、底面は滴下した検体をすべて受け止めることができる形状、大きさで、溝部（２６）に向かって傾斜を付ける等して、液が溝部（２６）に移動しやすい構造とすることが好ましい。

検体添加部（２４）の底面に設けられた凸部（２７）は、検体添加部（２４）を上部から見て凹状の底面の面積より小さい突起物であり、凸部（２７）の形状は特に限定されないが、円柱状に形成するのが好ましい。更に凸部（２７）には滴下した検体液を内部に収納するテストストリップ（２９）に導入するための第１の貫通孔（２５）が設けられ、その貫通孔の直径又は幅は検体液一滴の直径より小さくなるように形成されている。凸部（２７）の高さと第１の貫通孔（２５）の直径又は幅は、第１の貫通孔（２５）を通過させたい液量に基づいて設定され、水滴のサイズ、滴数、収納するテストストリップ（２９）の幅などを考慮して決定されるが、テストストリップ（２９）の幅が３〜５ｍｍの場合では、高さは０．１〜５ｍｍ、直径又は幅は０．５〜３ｍｍが好ましい。

第２の貫通孔（２８）は、検体添加部（２４）から見て判定窓とは反対側に設けられ、検体添加部（２４）と溝部（２６）を介して検体液が移動できるように繋がっている。第２の貫通孔（２８）の大きさは特に限定されないが、内部に収納するテストストリップ（２９）の幅などを考慮して決定される。例えばテストストリップ（２９）の幅が４ｍｍ程度の通常の幅である場合は、第２の貫通孔（２８）の幅はテストストリップ（２９）に揃えるのが好ましく、テストストリップ（２９）の長さ方向は４〜８ｍｍ程度の長方形の貫通孔が好ましい。

溝部（２６）は第１の貫通孔（２５）に入らなかった検体を第２の貫通孔（２８）に移動させるためのもので、毛細管現象、勾配などにより移動させることができるが、溝部（２６）に不織布、ろ紙、グラス繊維などの吸水性多孔質担体を設置するのが好ましく、この場合は担体の一端が検体添加部（２４）に接し、もう一端は第２の貫通孔（２８）から内部に収納するテストストリップ（２９）に接触するように設置することが好ましく、吸水性多孔質担体を固定するために溝部（２６）に蓋を装着するのが好ましい。蓋の内側には、吸水性多孔質担体を固定するための突起物、第２の貫通孔（２８）を介して吸水性多孔質担体と内部に収納するテストストリップ（２９）を接触させるための突起物を構成するのが好ましい。また、蓋は検体添加部（２４）の凹状の一部を構成することもできる。

蓋を装着した例を図３に示す。図３（ａ）及び（ｂ）は、溝部（２６）に吸水性多孔質担体（３２）が装着され、蓋（３１）が溝部（２６）のみを覆う例で、蓋（３１）が取り外された状態が（ａ）で蓋（３１）が装着された状態が（ｂ）である。一方、図３（ｃ）及び（ｄ）は、吸水性多孔質担体（３２）が装着され、蓋（３１）が溝部（２６）を覆い、かつ検体添加部（２４）の凹状の一部として一体となっている例で、蓋（３１）が取り外された状態が（ｃ）で蓋（３１）が装着された状態が（ｄ）である。

本発明のカセットと本発明のテストストリップの組み合わせで使用する場合を例に更に詳細に説明する。本発明のカセットと本発明のテストストリップとの各部位の位置関係は、カセットの判定窓はテストストリップの第１部位又は第１部位とコントロールラインが確認できるように設けられ、カセットの第１の貫通孔はテストストリップの第２部位にある検体液の添加部位に対応する位置に設けられ、更にカセットの第２の貫通孔はテストストリップの第３部位にある検体液又は展開液の添加部位に対応する位置に設けられる。また、カバー部（２２）の内部面には、テストストリップの担体と吸水体、担体と第２部位、担体と第３部位を互いに密着させるための突起物を設けるのが好ましく、第１の貫通孔の出口にも突起物を設けるのが好ましい。

測定は検体添加部に検体液を滴下することにより開始され、検体添加部に滴下した検体液は、その一部が凸部の第１の貫通孔からテストストリップの第２部位にある検体液の添加部位へ、第１の貫通孔を通過できなかった残りの検体液が溝部を経て第２の貫通孔からテストストリップの第３部位にある検体液又は展開液の添加部位へ移動し、所定の反応を進行させることができる。測定に用いる検体液の液量は、第２部位及び第３部位に用いるパッドの大きさ、含水量などにより設定されるが、例えば幅３〜５ｍｍ、長さ７０〜８０ｍｍ程度のテストストリップで、１滴の液量が１５〜３０μＬ程度の場合は、２〜５滴が好ましい。

本発明のカセットに本発明のテストストリップを収納することにより、本発明のイムノクロマトグラフィー装置となるが、このようにして測定することによって、２箇所に検体液を滴下する必要があった本発明のテストストリップが、従来のイムノクロマト法と同様に１箇所に検体を滴下する操作で実施することが可能となる。更に、２箇所に検体液又は展開液を滴下する場合、その２箇所に滴下する時間及び間隔を一定にしないと、測定の再現性が低下する恐れがあるが、本発明のカセット又はイムノクロマトグラフィー装置によれば、２箇所に検体液が供給される時間及び間隔は、溝部の長さ、溝部に設置した吸水性多孔質担体の長さ、吸水速度などにより決定され、操作手技のばらつきが無くなるため、測定の再現性を向上させる効果をもたらすことができる。

本発明のカセットは、本発明のテストストリップに限らず、2か所に検体液又は展開液を滴下するタイプのテストストリップに対して、好適に使用することができる。そのようなテストストリップとしては、特開２００１−３３７０９１記載のテストストリップ、特開平１０−３００７５０記載のテストストリップ、及び特開２００９−００２８２２記載のテストストリップ等が挙げられる。これらにおいても、本発明のカセットと本発明のテストストリップの組み合わせと同様な効果をもたらすことができる。

測定に用いる検体としては、全血、血清、血漿、尿、鼻腔や咽頭などから採取した生体試料を試液で抽出した抽出検体を用いることができるだけでなく、血清、血漿、尿はそのまま測定試料として用いることができる。全血は等張溶液などの試液で希釈して用いるのが好ましく、希釈した液から血球成分を除去するため、フィルターでろ過するか、テストストリップの第２部位と第３部位に血球分離膜を設置するのが好ましい。測定物質は、抗原抗体反応による免疫測定が可能なものならいずれでもよく、タンパク質、ウィルス、細菌、ホルモンなどが挙げられる。

以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
（１）インフルエンザウィルスの測定用テストストリップの作製
１．ビオチン標識抗インフルエンザＡ抗体の作製
２．５ｍｇ／ｍＬの抗インフルエンザウィルスＡマウスモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ製 製品番号C1733M）１ｍＬに６ｍｇ／ｍＬスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）１５μＬを添加し、室温で３０分反応させた。

２．ＢＳＡ−ストレプトアビジン複合体の作製
５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍＬに６０ｍｇ／ｍＬのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物液を５０μＬ添加し、室温で３０分反応させた。次に、３６ｍｇ／ｍＬ塩酸ヒドロキシルアミンを１ｍＬ加え室温で１０分反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で置換しＳＨ化ＢＳＡとした。
５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン１ｍＬにＮ−［（４−マレイミドメチル）シクロヘキシルカルボニルオキシ］スルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を添加し、室温で１時間反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で置換しマレイミド化ストレプトアビジンとした。
ＳＨ化ＢＳＡとマレイミド化ストレプトアビジンを等モル混合し、室温で１時間反応させて、ＢＳＡ−ストレプトアビジン複合体を作製した。

３．金コロイド標識ストレプトアビジンの作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業製）３ｍＬに２で作製した２．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ストレプトアビジン複合体を１０μＬ添加し、室温で３０分反応させた。次に５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを３ｍＬ添加し、室温で３０分反応させた。遠心分離により金コロイドを洗浄し、０．３ｍＬの１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。

４．抗インフルエンザ抗体固定化担体の作製
ニトロセルロースメンブレン（４５ｍｍ×１５０ｍｍ、ミリポア製）に、抗インフルエンザウィルスＡマウスモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ製 製品番号C1736M）（１ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ／ｃｍの条件でニトロセルロースメンブレンの下端２２ｍｍ位置にライン状に塗布した。塗布後、４０℃で３０分乾燥させ、０．５％カゼイン溶液に含浸させた後に、４０℃で１時間乾燥させて抗インフルエンザ抗体固定化担体を作製した。

５．ビオチン標識抗体含有パッドの作製
１で作製した２．５ｍｇ／ｍＬのビオチン標識抗インフルエンザＡ抗体１μＬを２%トレハロース含有１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）３００μＬに添加した。この溶液をガラス繊維シート（１１ｍｍ×１５０ｍｍ、ミリポア製）に含浸させ凍結乾燥させた。

６．金コロイド標識ストレプトアビジン含有パッドの作製
３で作製した金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液０．２３ｍＬをガラス繊維シート（５ｍｍ×１５０ｍｍ、ミリポア製）に含浸させ凍結乾燥させた。

７．イムノクロマトテストストリップの作製
粘着シート（８０ｍｍ×１５０ｍｍ）の下端１１ｍｍの位置から抗インフルエンザ抗体固定化担体を貼り合わせ、粘着シートの上端からセルロースファイバーパッド（３５ｍｍ×１５０ｍｍ）を貼り合わせた。次に粘着シートの下端７ｍｍの位置から金コロイド標識ストレプトアビジン含有パッドを抗インフルエンザ抗体固定化担体と一部重なるように貼り、次いで粘着シートの下端から不織布（８ｍｍ×１５０ｍｍ）を貼り合わせた。更に、粘着シート下端１６ｍｍの位置から上端側に１０ｍｍ幅の両面テープを貼り、粘着シート１７ｍｍの位置から上端側にビオチン標識抗体含有パッドを貼り合わせ、４ｍｍ幅に切断してイムノクロマトテストストリップを作製した。

８．イムノクロマトグラフィー装置の作製
７で作製したテストストリップを収納したときの下端の位置から２３ｍｍの位置に、直径３ｍｍ×高さ２ｍｍの凸部に直径１．６ｍｍの第１の貫通孔を設け、更に前記下端の位置を基準に４ｍｍ×６ｍｍの第２の貫通孔を設け、溝部に２０ｍｍ×４ｍｍの不織布を設置したカセットを作製した。このカセットに７で作製したテストストリップを収納し、インフルエンザＡウィルス測定用のイムノクロマトグラフィー装置とした。

（２）試料の調整と測定
インフルエンザＡ抗原液（Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ製）を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）入り５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて希釈検体を調製した。希釈検体の希釈倍数は表１に示した。調製した希釈液は点眼瓶に入れ、本カセットの検体添加部の凸部に３滴滴下して反応を開始した。反応開始から陽性又は陰性と判定されるまでの時間経過並びに検出感度を調べた。

以下の比較例は、いずれも一般的なイムノクロマト法を測定原理とするもので、着色微粒子と抗インフルエンザウイルス抗体とを結合した第１抗体と検体液中のインフルエンザウイルスとの結合物を固定化抗インフルエンザウイルス第２抗体に結合させて検出するものである。

比較例１
比較対象１として、市販されているインフルエンザウイルス抗原検出試薬イムノエースＦｌｕ（登録商標）を用いた。希釈検体はキット添付の抽出液を用いて実施例と同様に調製した。希釈検体を３滴滴下して反応を開始し、反応開始から陽性又は陰性と判定されるまでの時間経過並びに検出感度を調べた。

比較例２
比較対象２として、市販されているインフルエンザウイルス抗原検出試薬ファインビジョンｉｎｆｌｕｅｎｚａ（登録商標）を用い、比較例１と同様に試験を実施した。

比較例３
比較対象３として、市販されているインフルエンザウイルス抗原検出試薬アルソニック（登録商標）を用い、比較例１と同様に試験を実施した。

評価結果
実施例及び各比較例の結果を表１に示す。
反応開始後の時間経過に伴う検出ラインの出現の有無を目視で確認し、僅かでもラインが確認される場合は「＋」、ラインが確認されない場合は「−」で判定した。表中、判定が括弧（ ）付きで示されているものは、各比較例において市販キット指定の時間を超えたときの判定である。
４０００倍希釈のときは、すべての例において３~４分で「＋」と判定され、１５分まで反応時間を延長しても結果は変わらなかった。
８０００倍希釈のときは、実施例は３分で「＋」と判定されたのに対し、比較例１は「＋」と判定されるまでに５分、比較例３では４分要し、更に比較例２は「−」と判定され、本発明が高感度であることが示された。また、比較例２においては、キット指定の判定時間を超えた８分で「＋」と判定された。
１６０００倍希釈のときは、実施例は３分で「−」と判定され、反応時間を１５分まで延長しても判定が変わることはなかった。比較例はキット指定の判定時間ではすべて「−」と判定されたが、判定時間を超えた場合は「＋」と判定される現象が確認された。

この結果にもとづき、本発明の実施例と従来のイムノクロマト法を測定原理とする各比較例を比較したところ、以下の点で本発明が優れていることがわかった。
測定感度については、８０００倍希釈試料を測定したとき、本発明は比較例に対してラインの出現が速く、このことから各比較例より本発明は測定感度が高いことが確認された。また、比較例は試料の希釈倍数が高くなるとラインの出現時間が遅くなったのに対して、本発明は希釈倍数に関係なくラインの出現時間が同じであった。このことは、本発明は検体中の測定物質の濃度に関係なく短時間に高感度検出できるという優位性を示した結果であり、臨床検査の現場での有用性が高い装置であるといえる。

次に、判定結果の安定性を確認するため、指定の判定時間と１５分経過したときの結果を比較したところ、本発明は判定結果に変化はなかったが、各比較例では判定結果に変化が認められた。比較例の方法は、判定時間を経過しても反応は持続しているため、反応時間を長くすると得られる感度は高くなるが、その分判定時間が長くなり利便性が低下すること、反応時間を長くすると検体によっては非特異反応によるラインが出現する可能性があることから、総合的な性能から５〜１０分程度の反応時間が設定されている。従って、各比較例は測定者が反応時間を厳守しないと間違った判定を下す問題点があるのに対し、本発明はそのような現象は発生しないことから厳密な時間管理が不要になり、実際の臨床現場などで使用する際に利便性に優れた方法であることが明らかになった。

１１、２９ テストストリップ
１２ 粘着シート
１３ 担体
１４ 吸水体
１５ 第１部位
１６ 第２部位
１７ 第３部位
１８ コントロールライン
２１ ベース部
２２ カバー部
２３ 判定窓
２４ 検体添加部
２５ 第１の貫通孔
２６ 溝部
２７ 凸部
２８ 第２の貫通孔
３１ 蓋
３２ 吸水性多孔質担体

Claims (13)

1. 検体液中の測定物質をイムノクロマト法で検出するテストストリップであって、
   （１）前記測定物質と特異的に結合する第１抗体が多孔質担体に固定化され、検出部位である第１部位、
   （２）前記測定物質と特異的に結合し、前記第１抗体と認識部位が異なる標識抗体である第２抗体が移動可能なように多孔質担体に保持され、検体液の添加部位である第２部位、及び
   （３）前記第２抗体の標識物と特異的に結合する物質を結合させた着色微粒子が移動可能なように多孔質担体に保持され、検体液又は展開液の添加部位である第３部位、
   を有し、前記第１部位と前記第３部位の間に前記第２部位が設置されており、前記第２部位から前記第１部位へ、及び前記第３部位から前記第１部位へ、毛細管現象による検体液又は展開液の移動が可能である、テストストリップ。
2. 更に、前記第１部位の前記第２部位とは反対側の近傍に、反応が正常に行われたことを示すコントロールラインを有する、請求項１記載のテストストリップ。
3. 前記第２部位において、前記標識第２抗体を含む部位が、前記検体液の添加部位よりも前記第１部位よりに位置する、請求項１又は２に記載のテストストリップ。
4. 更に、前記第１部位及び／又は前記コントロールラインの前記第２部位とは反対側に、検体液若しくは展開液を吸収又は移動させるための、吸水体又は多孔質担体を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のテストストリップ。
5. 前記第２抗体の標識物がビオチンであり、前記着色微粒子に結合している前記第２抗体の標識物と特異的に結合する物質が、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及び抗ビオチン抗体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のテストストリップ。
6. 前記ストレプトアビジンがタンパク質との複合体である、請求項５に記載のテストストリップ。
7. 前記着色微粒子が、金属コロイド、着色ラテックス、及び着色セルロース粒子からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のテストストリップ。
8. 前記第２部位と前記第３部位とに同時に、又は前記第２部位に次いで前記第３部位に、前記検体液若しくは展開液が添加されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のテストストリップ。
9. イムノクロマト法で検体液中の測定物質を検出するテストストリップを収納するための、上面に判定窓と凹状の検体添加部とが配置されたカセットであって、
   前記凹状の検体添加部の中に第１の貫通孔を有する凸部を有し、
   前記凹状の検体添加部の前記判定窓とは反対側に第２の貫通孔を有し、
   前記凹状の検体添加部から前記第２の貫通孔に、前記凸部の第１の貫通孔から漏れた添加された検体液の一部を送液するための流路を有する溝部が形成されている、カセット。
10. 前記溝部に、送液するための流路として多孔質担体を備えており、前記多孔質担体の一端が、カセット内に収納されるテストストリップと前記第２の貫通孔を通じて接触するように備えられている、請求項９に記載のカセット。
11. 更に、前記溝部に蓋が装着されている、請求項９又は１０に記載のカセット。
12. 請求項１〜８のいずれかに記載のテストストリップが請求項９〜１１のいずれかに記載のカセットに収納されている、イムノクロマトグラフィー装置。
13. 前記カセットの判定窓が前記テストストリップの検出部位である第１部位に、前記カセットの第１の貫通孔が前記テストストリップの第２部位にある検体液の添加部位に、前記カセットの第２の貫通孔が前記テストストリップの第３部位にある検体液又は展開液の添加部位に、それぞれ対応した位置に配置されている、請求項１２記載のイムノクロマトグラフィー装置。