JP2001183376A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】簡便、迅速に被検液中の被検物質の検出を行な
うことができ、かつ被検液中に高濃度の被検物質を含む
場合でも良好に検出することが可能な免疫測定法、免疫
測定用試験片及びキットを提供する。 【解決手段】被検物質に結合しうる特異的結合物質を吸
水性基材上に固定化した固定相を少なくとも含有した試
験片に、着色粒子を担体として、該担体に被検物質の有
する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有する物
質を結合した着色粒子標識免疫体と、被検物質を含有し
た被検液とを展開させた後、固定相で捕捉されずに通過
した着色粒子標識免疫体のシグナルを測定する。免疫用
試験片は、被検物質に結合する特異的結合物質を吸水性
基材上に固定化した固定相並びに固定相の下流側にアビ
ジン、ビオチン、抗原及び抗体からなる群より選ばれた
１種を固定化した捕捉相を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、簡便、迅速に被検
液中の被検物質の検出を行ないうる免疫測定法、それに
用いる試験片及びキットに関する。より詳細には、被検
液中に被検物質が高濃度で含まれる場合に見られるプロ
ゾーン現象（抗原過剰により測定結果が陰性や弱陽性と
なる現象）を抑制しうる免疫測定法、それに用いる試験
片及びキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】被検物質の免疫学的分析方法において、
迅速かつ簡便に検査を行なう方法として、免疫クロマト
グラフ法が挙げられる。前記免疫クロマトグラフ法は、
例えば以下のような工程で行なわれる。即ち、被検液中
の被検物質と特異的に結合しうる抗体を固定化した固定
相を有する吸水性基材からなる試験片の一端に、該被検
物質に特異的に結合しうる標識抗体と被検液との混合物
を供して展開し、ついで、該混合物中で形成された標識
抗体−被検物質複合体を、固定相上の抗体を介して捕捉
する。従って、固定相の抗体−標識抗体−被検物質複合
体のシグナルを測定することにより、被検液中の被検物
質を検出することができる。

【０００３】しかしながら、上記方法によると、被検液
中に高濃度で被検物質が含まれる場合には、吸水性基材
上の固定相の抗体と標識抗体との両方に被検物質が多数
結合するため、固定相で標識抗体が捕捉されにくくな
る。その結果、高濃度で被検物質を含む被検液の測定結
果が、陰性又は弱陽性と誤判定されることになる場合が
ある。したがって、簡便、迅速に被検液中の被検物質の
検出を行なうことができ、かつ被検液中に高濃度の被検
物質を含む場合でも良好に検出することが可能な免疫測
定法が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便、迅速
に被検液中の被検物質の検出を行なうことができ、かつ
被検液中に高濃度の被検物質を含む場合でも良好に検出
することが可能な免疫測定法、それに用いる免疫測定用
試験片及びキットを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 被検物質に結合しうる特異的結合物質を吸水性
基材上に固定化した固定相を少なくとも含有した試験片
に、着色粒子を担体として、該担体に被検物質の有する
抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有する物質を
結合した着色粒子標識免疫体と、被検物質を含有した被
検液とを展開させた後、固定相で捕捉されずに通過した
着色粒子標識免疫体のシグナルを測定することを特徴と
する、被検物質の免疫測定法、〔２〕 被検物質に結合
しうる特異的結合物質を吸水性基材上に固定化した固定
相並びに該固定相の下流側にアビジン、ビオチン、抗原
及び抗体からなる群より選ばれた１種を固定化した捕捉
相を含有してなる、前記免疫測定法に用いるための免疫
測定用試験片、〔３〕 着色粒子を担体として、該担体
に被検物質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決
定基を有する物質と、捕捉相に対応して、アビジン、ビ
オチン、抗原及び抗体からなる群より選ばれた１種とを
結合した着色粒子標識免疫体を水との接触によって吸水
性基材から脱離しうるように保持させた標識相を固定相
の上流側にさらに含有してなる、前記〔２〕記載の免疫
測定用試験片、〔４〕 着色粒子を担体として、該担体
に被検物質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決
定基を有する物質と、捕捉相に対応して、アビジン、ビ
オチン、抗原及び抗体からなる群より選ばれた１種とを
結合した着色粒子標識免疫体並びに前記〔２〕記載の試
験片を含有してなる免疫測定用キット、並びに〔５〕
前記〔３〕記載の試験片を含有してなる免疫測定用キッ
ト、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の被検物質の免疫測定法
は、被検物質に結合しうる特異的結合物質を吸水性基材
上に固定化した固定相を少なくとも含有した試験片に、
着色粒子を担体として、該担体に被検物質の有する抗原
決定基と実質的に同等な抗原決定基を有する物質を結合
した着色粒子標識免疫体と、被検物質を含有した被検液
とを展開させた後、固定相で捕捉されずに通過した着色
粒子標識免疫体のシグナルを測定することを１つの大き
な特徴とする。本発明の被検物質の免疫測定法によれ
ば、

【０００７】本発明の免疫測定法は、大きく２つの態様
に分けられる。すなわち、 態様１：（Ａ）着色粒子を担体として、該担体に被検物
質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有
する物質を結合した着色粒子標識免疫体を水との接触に
よって吸水性基材から脱離しうるように保持させた標識
相と、該標識相の下流側に被検物質に結合しうる特異的
結合物質を吸水性基材上に固定化した固定相とを有した
試験片上の該標識相の上流側に設けた被検液受領部に被
検液を供し、展開させるステップ、並びに（Ｂ）ステッ
プ（Ａ）において、固定相で捕捉されずに通過した着色
粒子標識免疫体のシグナルを測定するステップ、を含
む、免疫測定法；並びに 態様２：（ａ）被検物質に結合しうる特異的結合物質を
吸水性基材上に固定化した固定相を有した試験片の前記
固定相の上流側に設けた被検液受領部に被検液を供する
ステップ、（ｂ）試験片上における被検液受領部の上流
側に、着色粒子を担体として、該担体に前記被検物質の
有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有する
物質を結合した着色粒子標識免疫体を含有した液を供し
て、展開するステップ、並びに（ｃ）ステップ（ｂ）に
おいて、固定相で捕捉されずに通過した着色粒子標識免
疫体のシグナルを測定するステップ、を含む、免疫測定
法が挙げられる。

【０００８】本発明の免疫測定法の１つの態様において
は、以下の反応が行われる。吸水性基材の一端、例え
ば、被検液受領部から被検液を吸水させると、標識相に
おいて溶出された着色粒子標識免疫体が液の移動ととも
に吸水性基材上を固定相に移動する。この時、被検液中
に被検物質がない場合は、着色標識免疫体の大部分は固
定相の抗体と結合して捕捉され、着色粒子をほとんど含
まない液のみが固定相を通過するので、固定相より下流
の吸水性基材（捕捉相を設けている場合には、捕捉相）
は着色されない。被検液中に被検物質が含まれている場
合は、固定相の抗体に被検物質が結合するために着色粒
子標識免疫体の一部が被検物質の結合していない抗体に
捕捉され、残りは固定相を通過するために固定相より下
流の吸水性基材は捕捉されなかった着色粒子標識免疫体
量に応じて着色される。さらに被検液中に大過剰の被検
物質が含まれている場合は、固定相の抗体の大部分が被
検物質と結合するために、ほとんどの着色粒子標識免疫
体は固定相で捕捉されずに固定相より下流（捕捉相を設
けている場合には、捕捉相）に移動し、強い発色を呈す
る。

【０００９】本発明の免疫測定法の別の態様としては、
吸水性基材の試薬受領部と固定相との間に被検液受領部
を配置し、該被検液受領部に被検液を供した後、試薬受
領部から着色粒子標識免疫体を含有した液を吸水させる
方法がある。

【００１０】本明細書において、「被検物質」は、通常
の免疫反応により検出可能な物質であればよく、タンパ
ク質、ウイルス抗原、細菌等が挙げられる。タンパク質
としては、例えば、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェ
リン、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）等が挙げられる。
ウイルス抗原としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのＨ
Ｂｓ抗原、ＨＢｅ抗原、ロタウイルス抗原、アデノウイ
ルス抗原等が挙げられる。細菌としては、例えば、大腸
菌Ｏ１５７、サルモネラ菌、黄色ブドウ球等が挙げられ
る。また、「被検液」とは、前記被検物質を含有した液
体試料をいう。かかる被検液としては、例えば、食品か
ら抽出された溶液又はその培養上清、血清又は血漿、血
液、尿、便、汗、唾液等、あるいはそれらを適切な希釈
溶媒 (例えば、緩衝液等) によって希釈した希釈液が挙
げられる。

【００１１】本発明の免疫測定法に用いられる試験片
は、被検物質に結合しうる特異的結合物質を吸水性基材
上に固定化した固定相を含有した試験片である。例え
ば、態様１の方法には、着色粒子を担体として、該担体
に被検物質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決
定基を有する物質を結合した着色粒子標識免疫体を水と
の接触によって吸水性基材から脱離しうるように保持さ
せた標識相と、該標識相の下流側に被検物質に結合しう
る特異的結合物質を吸水性基材上に固定化した固定相と
を有した試験片を用いることができる。また、態様２の
方法には、被検物質に結合しうる特異的結合物質を吸水
性基材上に固定化した固定相を有した試験片を用いるこ
とができる。

【００１２】前記試験片は、被検液受領部、着色粒子標
識免疫体を含有した液等の試薬を供するための試薬受領
部、吸水用パッド（例えば、吸水用不織布レーヨン
等）、後述の捕捉相等をさらに含有していてもよい。

【００１３】前記試験片において、固定相に用いられる
特異的結合物質としては、免疫化学的反応により被検物
質に結合する物質であればよい。特異的結合物質として
は、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等由来のポリクローナル抗
体、マウス、ラット由来のモノクローナル抗体を使用す
ることができる。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）₂ 等の断片化された抗体であってもよい。

【００１４】本発明において特異的結合物質を吸水性基
材上に固定化する方法、即ち固定相の作製方法は、特に
限定されるものではないが、公知の物理吸着法及び共有
結合法が好適である。

【００１５】固定相における特異的結合物質の固定量
は、着色粒子標識免疫体すべてを固定相で捕捉できる量
以上である。かかる固定量は、着色粒子数、着色粒子に
結合した抗原量、着色粒子に結合した抗原との結合性等
を考慮して決められうる。固定量が少ない場合は、陰性
検体でも捕捉相で発色する。固定量を変化させることで
検出感度を調整することができる。固定量が多いと低感
度になる。

【００１６】固定相の大きさは、着色粒子標識免疫体を
捕捉できるものであればよいが、通常０．５〜５０ｍｍ
幅、好ましくは１〜２０ｍｍ幅である。

【００１７】前記試験片に用いられる吸水性基材は、被
検物質を含有する被検液又は該被検液を緩衝液によって
希釈した希釈液を吸収できるものであればよい。なお、
希釈液に使用される緩衝液としては、特に限定されない
が、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液等が挙げられる。

【００１８】本発明においては、迅速な測定が行なえ、
かつ固定相での捕捉を十分に行なうことができる程度の
吸水性を呈する吸水性基材であればよく、吸水性基材の
吸水の程度は５ｍｍ巾の短冊状に裁断した吸水性基材の
片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水距離が０．５
〜５ｃｍ程度のものが好ましい。

【００１９】好ましい具体例としては、例えば、ニトロ
セルロースフィルター、ガラス繊維濾紙、不織布、濾紙
等が挙げられる。さらに、本発明においては、吸水性基
材として同一材料からなる基材を用いても良いし、ある
いは異種の材料からなる基材を任意の接着手段によって
接合して得られた連続した基材を用いることもできる。

【００２０】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、吸水性基材の表面に親水性重合体、タンパク質
（例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン等）、界面活
性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０等）を被覆することも
でき、基材に親水性重合体、タンパク質、界面活性剤を
含浸させることもできる。

【００２１】親水性重合体としては、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキ
シエチルセルロース等が挙げられる。

【００２２】吸水性基材の形状は、被検液等の液体を展
開できる形状であればよく、例えば、矩形のシート状や
ロッド状等が好ましい。

【００２３】本発明の免疫測定法に用いられる着色粒子
標識免疫体は、前記したように、着色粒子を担体とし
て、該担体に被検物質の有する抗原決定基と実質的に同
等な抗原決定基を有する物質を結合した免疫体である。

【００２４】着色粒子としては、肉眼で着色が検出可能
なものであればよく、例えば、スダンブルー、スダンレ
ッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニザリーング
リーン等に代表される顔料、染料等で着色した水分散型
高分子粒子；金コロイド粒子等の金属コロイド粒子等が
挙げられる。

【００２５】前記水分散型高分子粒子は、例えば、不飽
和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合
によって調製される。かかる単量体としては、例えば、
エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量体、酢酸ビ
ニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチレン、メチ
ルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単量体、ア
クリル酸メチル等のメタクリル酸エステル系単量体、ブ
タジエン等のジエン系単量体等が用いられる。水分散型
高分子粒子は、上記単量体の単独重合体や共重合体のほ
か、得られる粒子に官能基やイオン性基を付与し、また
は粒子の水性媒体中での分散安定性を高める等の目的
で、改質用単量体を共重合することもできる。このよう
な改質用単量体としては、例えば、アクリル酸、メタク
リル酸、２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレー
ト等のフッ素化メタクリル酸エステル、アクリロニトリ
ル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、スチレンス
ルホン酸ナトリウム、スルホプロピル（メタ）アクリレ
ートナトリウム塩、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−
ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチル
メタクリレート、グリシジルメタクリレート等が用いら
れる。また本発明においては、市販されている種々の水
分散型高分子粒子も好適である。市販されている水分散
型高分子粒子としては、例えば、スチレンまたはその誘
導体、例えば、ｐ−クロロスチレンからなる単独重合体
や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン
−アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等の種々のス
チレン共重合体からなるエマルジョンを挙げることがで
きる。また、（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステ
ルやその誘導体からなる単独重合体や、これらと（メ
タ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グ
リシジル（メタ）アクリレート等との共重合体も本発明
において用いられる。上述したスチレンやその誘導体
と、（メタ）アクリレートエステルやその誘導体との共
重合体も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポリウレ
タン、微結晶質セルロースなども挙げられる。

【００２６】本発明に用いられる着色粒子としては、分
散安定性、検出感度の調節の容易性等の観点から、着色
した水分散型高分子粒子、好ましくは、着色ラテックス
粒子が望ましい。

【００２７】本発明に用いられる着色粒子の平均粒子径
は、発色の良好性の観点から、約０．０１μｍ以上、好
ましくは０．０５μｍ以上であり、着色粒子の僅かな凝
集に起因する吸水性基材の目詰まりを防ぐ観点から、約
３μｍ以下、好ましくは０．５μｍ以下であることが望
ましい。具体的には、約０．０１〜３μｍ、好ましく
は、約０．０５〜０．５μｍの範囲であることが望まし
い。

【００２８】本発明に用いられる「被検物質と実質的に
同等の抗原決定基を有する物質」としては、被検物質そ
のもの、又は、吸水性基材に固定相として固定させる抗
体と特異的に結合しうる物質である。例えば、被検物質
が、大腸菌Ｏ１５７の場合、大腸菌表面のリポ多糖を用
いることができる。

【００２９】着色粒子と実質的に同等の抗原決定基を有
する物質とを結合させる方法としては、公知の方法、例
えば、共有結合法や物理吸着法、イオン結合法等が挙げ
られるが、結合後の脱離がなく、安定である点から、共
有結合法が好ましい。

【００３０】本発明の態様１の免疫測定法において、標
識相とは、吸水性基材の被検液受領部と固定相との間に
設けられた、着色粒子標識免疫体を、水との接触によっ
て吸水性基材から脱離しうるように保持させた領域をい
う。

【００３１】標識相の作製方法としては特に制限はない
が、例えば、水溶性重合体もしくはサッカロース溶液中
に着色粒子標識免疫体を分散させ、該分散液を吸水性基
材上に塗布して乾燥させる方法が挙げられる。前記水溶
性重合体としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、セルロースエステル等が好ましく
用いられる。

【００３２】本発明の免疫測定法においては、アビジン
又はビオチンの結合した着色粒子標識免疫体と、固定相
の下流側にビオチン又はアビジンを固定化した捕捉相を
含有した試験片とを用いることができる。この場合、固
定相で捕捉されずに通過した着色粒子標識免疫体はアビ
ジン−ビオチン結合により捕捉相に捕捉されるので、検
出がより明瞭になる。

【００３３】本発明の免疫測定法において用いられるビ
オチンは、アビジンと特異的に結合するものであればよ
く、ビオチン又はその誘導体であってもよい。ビオチン
の誘導体としては、ビオシチン、ビオチンメチルエステ
ル、ビオチノール、ビオチンＬ−スルホキシド等が挙げ
られる。また、本発明の免疫測定法において用いられる
アビジンとしては、ビオチンと特異的に結合できるもの
であればよく、卵白から単離した化合物、ストレプトマ
イセス・アビジニィ（Streptomyces avidinii）から単
離したストレプトアビジンが挙げられる。

【００３４】また、本発明において、着色粒子標識免疫
体に被検物質とは異なる抗原又は被検物質を特異的に結
合しない抗体を結合し、吸水性基材の固定相より下流の
任意の位置に前記抗体又は抗原を結合した捕捉相を設け
ることもできる。例えば、着色粒子標識免疫体にウサギ
ＩｇＧを結合し、捕捉相に抗ウサギＩｇＧ抗体を固定す
ることにより、固定相で捕捉されずに通過した着色粒子
標識免疫体はウサギＩｇＧ−抗ウサギＩｇＧ抗体の結合
により捕捉相に捕捉されるため、明瞭な検出ができる。

【００３５】前記免疫測定法に用いられる試験片も本発
明に含まれる。本発明の免疫測定用試験片は、用いられ
る免疫測定法の態様に応じて、（ｉ）着色粒子を担体と
して、該担体に被検物質の有する抗原決定基と実質的に
同等な抗原決定基を有する物質と、捕捉相に対応して、
アビジン、ビオチン、抗原及び抗体からなる群より選ば
れた１種とを結合した着色粒子標識免疫体を水との接触
によって吸水性基材から脱離しうるように保持させた標
識相を固定相の上流側にさらに含有した免疫測定用試験
片、又は（ｉｉ）被検物質に結合しうる特異的結合物質
を吸水性基材上に固定化した固定相並びに該固定相の下
流側にアビジン、ビオチン、抗原及び抗体からなる群よ
り選ばれた１種を固定化した捕捉相を含有した免疫測定
用試験片が挙げられる。（ｉ）の免疫測定用試験片は、
態様１の免疫測定法に好適であり、（ｉｉ）の免疫測定
用試験片は、態様２の免疫測定法に好適である。

【００３６】また、本発明の試験片により、本発明の免
疫測定法に好適な免疫測定法用キットが提供される。か
かるキットとしては、用いられる免疫測定法の態様に応
じて、（Ｉ）着色粒子を担体として、該担体に被検物質
の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有す
る物質と、捕捉相に対応して、アビジン、ビオチン、抗
原及び抗体からなる群より選ばれた１種とを結合した着
色粒子標識免疫体並びに前記（ｉ）の試験片を含有した
キットまたは（ＩＩ）前記（ｉｉ）の試験片を含有した
キットが挙げられる。（Ｉ）のキットは、態様１の免疫
測定法に好適であり、（ＩＩ）の免疫測定用試験片は、
態様２の免疫測定法に好適である。本発明のキットは、
さらに、展開用試薬等を含有してもよい。

【００３７】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げ、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。なお、以下、「％」は、特に明記しな
いかぎり、「重量％」を意味する。

【００３８】実施例１ (1) 着色粒子標識免疫体含有液の作製 スチレン／アクリル酸共重合体からなるラテックス粒子
をスダンブルーで着色し、着色粒子（平均粒子径約０．
２μｍ、粒子表面カルボキシル基量５μｍｏｌ／ｍ² ）
を得、ついで該着色粒子を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に固形分濃度５重量％となるように懸濁して、
着色粒子分散液を得た。

【００３９】得られた着色粒子分散液３ｍｌに、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと、ヒトアル
ブミン（シグマ社製）の１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ
７．５）溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌと、ビオシチン
０．５ｍｇとを添加して、混合液を得た。得られた混合
液を１０℃で５時間反応させた。得られた反応物を１０
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）で遠心洗浄し、固形分
濃度５重量％になるよう調整し、共有結合によりヒトア
ルブミンとビオシチンとを固定化した着色粒子標識免疫
体含有液を得た。

【００４０】(2) 試験片作製 前記(1) で得られた着色粒子標識免疫体含有液１μｌと
２０％サッカロース水溶液１５μｌとを混合した液をレ
ーヨン不織布（５×１０ｍｍ）に塗布し、３７℃にて１
２時間乾燥させ、標識相を得た。

【００４１】抗ヒトアルブミン−ヤギＩｇＧ抗体（日本
バイオテスト研究所製）の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１０μｌをニトロセルロ
ース膜（ワットマン社製、孔径約３μｍ、支持体付き、
５×４０ｍｍ）の一端から５〜１５ｍｍの部位に面状に
塗布し、固定相を設けた。得られた膜の一端から２０ｍ
ｍの部位にアビジンの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）をライン状に塗布し、捕捉相
を設けた。得られた膜を３７℃で３時間乾燥させた後、
０．５％スキムミルクと０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０とを
含む溶液に１０分間浸漬し、ついで３７℃で３時間乾燥
させた。得られた膜の固定相側の一端に前記標識相を１
ｍｍ重なるように連結し、さらに標識相の別の一端に吸
水用レーヨン不織布（５×１０ｍｍ）を１ｍｍ重なるよ
うに連結して試験片を得た。

【００４２】(3) ヒトアルブミンの検出 ヒトアルブミンを表１に示す濃度で生理食塩水に溶解さ
せた被検液５０μｌを前記試験片の吸水用レーヨン不織
布に滴下して展開させ、１０分後の捕捉相における発色
を目視で観察した。結果を表１に示す。判定基準は、以
下の通りである。

【００４３】判定基準： ＋：強い発色が見られる。 ＋ｗ：弱い発色が見られる。 −：発色が見られない。

【００４４】

【表１】

【００４５】表１に示すように、高濃度のヒトアルブミ
ンを含む被検液を供した場合においても、発色が弱くな
らないため、プロゾーン現象が抑制されることが示唆さ
れる。

【００４６】実施例２ (1) 着色試薬の作製 実施例１と同じ着色粒子分散液３ｍｌに、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと、ヒトトランスフ
ェリン（和光純薬社製）の１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ
７．５）溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌと、ヤギＩｇＧ
（シグマ社製）の１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶液（２ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌとを添加し、１０℃で５時
間反応させた。得られた反応物を１０ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で遠心洗浄し、固形分濃度５重量％にな
るよう調整し、共有結合でヒトトランスフェリンとヤギ
ＩｇＧとを固定化した着色粒子標識免疫体含有液を得
た。

【００４７】得られた着色粒子標識免疫体含有液を１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９％ＮａＣｌ含
有）で希釈し、固形分濃度０．０５重量％の着色試薬を
得た。

【００４８】(2) 試験片作製 抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社
製）の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（４ｍ
ｇ／ｍｌ）１０μｌを、ニトロセルロース膜（ワットマ
ン社製、孔径約３μｍ、支持体付き、５×６０ｍｍ）の
一端から２５〜３５ｍｍの部位に面状に塗布し、固定相
を設けた。得られた膜の一端から４０ｍｍの部位に抗ヤ
ギＩｇＧ抗体（ダコ社製）の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）をライン状に２μｌ塗
布し、捕捉相を設けた。この膜を３７℃で３時間乾燥さ
せた後、０．５％スキムミルクと０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０とを含む溶液に１０分間浸漬し、３７℃で３時間乾
燥させた。得られた膜の抗体固定相側の一端に吸水用レ
ーヨン不織布（５×２０ｍｍ）を１ｍｍ重なるように連
結して試験片を得た。

【００４９】(3) ヒトトランスフェリンの検出 ヒトトランスフェリンを表２に示す濃度で生理食塩水に
溶解させた被検液２０μｌを前記試験片の吸水用レーヨ
ン不織布とヒトトランスフェリン固定相との中間部に滴
下し、直ちに、着色試薬５０μｌを吸水用レーヨン不織
布に滴下し、展開させた。１０分後の捕捉相における発
色を目視で観察した。結果を表２に示す。なお、判定基
準は、表１と同様である。

【００５０】

【表２】

【００５１】表２に示すように、高濃度のヒトトランス
フェリンを含む被検液を供した場合においても、発色が
弱くなることはなく、プロゾーン現象が抑制されること
が示唆される。

【００５２】比較例１ (1) 着色粒子標識免疫体の作製 実施例１と同じ着色粒子分散液３ｍｌに、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと、抗ヒトアルブミ
ン−ヤギＩｇＧ抗体（日本バイオテスト研究所製）の１
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液（４ｍｇ／ｍ
ｌ）２ｍｌとを添加し、１０℃で５時間反応させた。得
られた反応物を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
遠心洗浄し、固形分濃度５重量％になるように調整し、
共有結合でヒトアルブミン抗体を固定化した着色粒子標
識免疫体含有液を得た。

【００５３】(2) 試験片の作製 得られた着色粒子標識免疫体含有液１μｌと、３０％サ
ッカロース水溶液１０μｌと、抗ヒトアルブミン−ヤギ
ＩｇＧ抗体溶液（２ｍｇ／ｍｌ）５μｌとを混合した液
をレーヨン不織布（５×１０ｍｍ）に塗布し、３７℃に
て１２時間乾燥させ、標識相を得た。

【００５４】抗ヒトアルブミン−ヤギＩｇＧ抗体（日本
バイオテスト研究所製）の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）２μｌを、ニトロセルロ
ース膜（ワットマン社製、孔径３μｍ、支持体付き、５
×４０ｍｍ）の一端から２０ｍｍの部位にライン状に塗
布し、固定相を設けた。得られた膜を３７℃で３時間乾
燥させた後、０．５％スキムミルクと０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ ２０とを含む溶液に１０分間浸漬し、３７℃で３時
間乾燥させた。得られた膜の一端に前記標識相を１ｍｍ
重なるように連結し、さらに標識相の別の一端に吸水用
レーヨン不織布（５×２０ｍｍ）を１ｍｍ重なるように
連結して試験片を得た。

【００５５】(3) ヒトアルブミンの検出 ヒトアルブミンを表３に示す濃度で生理食塩水に溶解さ
せた被検液５０μｌを前記試験片の吸水用レーヨン不織
布に滴下し、１０分後に試験片の捕捉相における発色を
目視で観察した。結果を表３に示す。なお、判定基準
は、表１と同様である。

【００５６】

【表３】

【００５７】表３に示すように、従来の免疫測定法によ
れば、３１３μｇ／ｍｌを超える高濃度のヒトアルブミ
ンを供した場合、発色が弱いか、あるいは発色が見られ
なかった。

【００５８】

【発明の効果】本発明の免疫測定法によれば、簡便、迅
速に被検液中の被検物質の検出を行なうことができ、か
つ被検液中に高濃度の被検物質を含む場合でも良好に被
検物質を検出することができるという優れた効果を奏す
る。また本発明の試験片及びキットは、本発明の免疫測
定法に好適であり、被検液中に高濃度の被検物質を含む
場合でも良好な免疫測定法を可能にする。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検物質に結合しうる特異的結合物質を
   吸水性基材上に固定化した固定相を少なくとも含有した
   試験片に、着色粒子を担体として、該担体に被検物質の
   有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有する
   物質を結合した着色粒子標識免疫体と、被検物質を含有
   した被検液とを展開させた後、固定相で捕捉されずに通
   過した着色粒子標識免疫体のシグナルを測定することを
   特徴とする、被検物質の免疫測定法。
2. 【請求項２】 （Ａ）着色粒子を担体として、該担体に
   被検物質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定
   基を有する物質を結合した着色粒子標識免疫体を水との
   接触によって吸水性基材から脱離しうるように保持させ
   た標識相と、該標識相の下流側に被検物質に結合しうる
   特異的結合物質を吸水性基材上に固定化した固定相とを
   有した試験片上の該標識相の上流側に設けた被検液受領
   部に被検液を供し、展開させるステップ、並びに（Ｂ）
   ステップ（Ａ）において、固定相で捕捉されずに通過し
   た着色粒子標識免疫体のシグナルを測定するステップ、
   を含む、請求項１記載の免疫測定法。
3. 【請求項３】 （ａ）被検物質に結合しうる特異的結合
   物質を吸水性基材上に固定化した固定相を有した試験片
   の前記固定相の上流側に設けた被検液受領部に被検液を
   供するステップ、（ｂ）試験片上における被検液受領部
   の上流側に、着色粒子を担体として、該担体に前記被検
   物質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を
   有する物質を結合した着色粒子標識免疫体を含有した液
   を供して、展開するステップ、並びに（ｃ）ステップ
   （ｂ）において、固定相で捕捉されずに通過した着色粒
   子標識免疫体のシグナルを測定するステップ、を含む、
   請求項１記載の免疫測定法。
4. 【請求項４】 アビジン又はビオチンの結合した着色粒
   子標識免疫体と、固定相の下流側にビオチン又はアビジ
   ンを固定化した捕捉相を含有した試験片とを用いて、ア
   ビジン−ビオチン反応により固定相で捕捉されずに通過
   した着色粒子標識免疫体を該捕捉相で捕捉する、請求項
   １〜３いずれか記載の免疫測定法。
5. 【請求項５】 被検物質とは異なる抗原又は該抗原を認
   識する抗体を結合した着色粒子標識免疫体と、固定相の
   下流側に前記抗体又は抗原を固定化した捕捉相を含有し
   た試験片とを用いて、抗原抗体反応により固定相で捕捉
   されずに通過した着色粒子標識免疫体を該捕捉相で捕捉
   する、請求項１〜３いずれか記載の免疫測定法。
6. 【請求項６】 被検物質に結合しうる特異的結合物質を
   吸水性基材上に固定化した固定相並びに該固定相の下流
   側にアビジン、ビオチン、抗原及び抗体からなる群より
   選ばれた１種を固定化した捕捉相を含有してなる、請求
   項１記載の免疫測定法に用いるための免疫測定用試験
   片。
7. 【請求項７】 着色粒子を担体として、該担体に被検物
   質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有
   する物質と、捕捉相に対応して、アビジン、ビオチン、
   抗原及び抗体からなる群より選ばれた１種とを結合した
   着色粒子標識免疫体を水との接触によって吸水性基材か
   ら脱離しうるように保持させた標識相を固定相の上流側
   にさらに含有してなる、請求項６記載の免疫測定用試験
   片。
8. 【請求項８】 着色粒子を担体として、該担体に被検物
   質の有する抗原決定基と実質的に同等な抗原決定基を有
   する物質と、捕捉相に対応して、アビジン、ビオチン、
   抗原及び抗体からなる群より選ばれた１種とを結合した
   着色粒子標識免疫体並びに請求項６記載の試験片を含有
   してなる免疫測定用キット。
9. 【請求項９】 請求項７記載の試験片を含有してなる免
   疫測定用キット。