CN105483090B - 分泌牛白细胞介素-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
分泌牛白细胞介素-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了分泌牛白细胞介素‑2(IL‑2)单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D8和6D7。本发明的分泌牛IL‑2单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体MAb3D8和MAb6D7具有效价高、特异性好、与天然IL‑2抗原亲和力强的优势，基于此建立的牛IL‑2双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)和流式细胞术(FCM)检测试剂盒，具有较好的灵敏度和特异性，可以用作重组表达牛IL‑2的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定等非诊断目的研究。
Description
技术领域
本发明涉及分泌牛白细胞介素-2(IL-2)单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其应用。
背景技术
1976年，Morgan等研究发现用丝裂原(PHA、ConA等)刺激淋巴细胞产生的一种促进T细胞生长的因子，被称为T细胞生长因子(TCGF)，并于1979年在第二届国际淋巴因子会议上正式命名为白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)。1986年，Cerretti等首次克隆了牛IL-2基因。作为一种具有多种生物学效应的细胞因子，IL-2在免疫系统中起到重要的调节作用，主要以刺激T细胞的增殖为主；并诱导B细胞由分泌IgM转换为分泌IgG2；此外，还具有上调NK细胞、CTL细胞和巨噬细胞等多种细胞活性的生物学功能。作为主要的Th1型细胞因子之一，体内的IL-2水平能反映机体的免疫状况，通过对IL-2的检测为评价机体免疫状态和诊断免疫相关疾病奠定了一定的基础。
IL-2的免疫学检测是在特异性抗IL-2单克隆抗体(MAb)的基础上建立的用于对样本中的IL-2进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，可建立多种检测方法，如酶免疫分析法(EIA)，酶联免疫吸附法(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay，简称ELISA)，酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，简称ELISPOT)，流式细胞术(Flow Cytometry，简称FCM)分析法等。
ELISA、ELISPOT和FCM具有高度的敏感性和应用广泛性，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等方面得到广泛应用。与传统的用于IL-2检测的刺激CTLL细胞增殖活性分析方法相比，新建立的IL-2检测方法具有更高的灵敏度和特异性，作为细胞免疫状态的重要指标之一，IL-2的双抗体夹心ELISA、ELISPOT和FCM检测方法将被广泛地用于研究基础和临床医学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种病原感染的诊断等。
但是，现有技术中制备的抗牛IL-2抗体，在应用于上述检测方法时往往遇到很大问题，特别是当用于检测天然牛IL-2时效果不佳。因此，获得一种可用于临床检测的，效价高、特异性好、与天然牛IL-2有抗原亲和力的牛IL-2单抗，对牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究具有重要的意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。
本发明一方面提供了一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株3D8,保藏名称为杂交瘤细胞株3D8，保藏号为CCTCC NO：C2015213；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
本发明第二方面提供了一种上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8。
本发明第三方面提供了一种牛IL-2的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为所述的杂交瘤细胞3D8株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8，所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应；所述捕获抗体包被在支持介质上或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
本发明第四方面提供了一种牛IL-2的ELISPOT检测试剂盒，所述ELISPOT检测试剂盒包括：支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为所述的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8，所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，其中，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应；所述捕获抗体包被在支持介质上或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
本发明第五方面提供了一种牛IL-2的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体，其中，所述异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体为牛所述IL-2单克隆抗体MAb3D8；优选地，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂：1)阻断剂Brefeldin(BFA)；2)APC标记针对牛CD4单抗；3)固定剂、破膜剂；以及4)洗涤液。
本发明第六方面提供了所述分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，以及所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。
本发明第七方面提供了所述试剂盒在用于非诊断目的检测牛IL-2中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛IL-2的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究。
本发明的技术效果：
本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然牛IL-2。
基于此建立的牛IL-2双抗体夹心ELISA检测试剂盒，既可以有效检测出大肠杆菌、毕赤酵母等多种表达系统表达的重组牛IL-2，也可用于分析牛外周血单核细胞培养上清和牛血浆中分泌的天然牛IL-2样品，具有较好的灵敏度和特异性。
同时，基于此建立的牛IL-2ELISPOT检测试剂盒，在检测牛外周血单核细胞样品和牛抗凝血时，可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IL-2的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性，并且可用于直接检测牛抗凝血，大大简化操作步骤，缩短检测时间，进步显著。
另外，基于此建立的牛IL-2FCM检测试剂盒，在检测牛外周血单核细胞样品时，可以检测出较高水平的分泌牛IL-2的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研究，用作牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。
附图说明
图1为本发明ELISPOT试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，B.ConA刺激牛外周血单核细胞检测结果；
图2为本发明ELISPOT试剂盒的牛抗凝血样品检测结果图：A.未刺激牛抗凝血检测结果，B.ConA刺激牛抗凝血检测结果；
图3为本发明FCM试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，B.ConA刺激牛外周血单核细胞检测结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的目的是提供一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。
本发明一方面提供了一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株3D8,保藏名称为杂交瘤细胞株3D8，保藏号为CCTCC NO：C2015213；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
本发明第二方面提供了一种本发明所述的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8。
本发明第三方面提供了一种牛IL-2的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，
其中，所述捕获抗体为所述的杂交瘤细胞3D8株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8，所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应；所述捕获抗体包被在支持介质中或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
所述ELISA检测试剂盒中，支持介质可以为酶标板。
所述酶标板可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供空白酶标板与捕获抗体，在检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被捕获抗体。
所述酶标板可为各种常见规格的酶标板，如96孔酶标板。
所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克隆抗体不同于前述捕获抗体。生物素标记牛IL-2单克隆抗体的方法采用常规。
作为本发明的一种实施方式，所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克隆抗体为由杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb6D7。
其中，所述杂交瘤细胞株6D7,保藏名称为杂交瘤细胞株6D7，保藏号为CCTCC NO：C2015212；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
作为本发明的一种实施方式，所述ELISA检测试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：
1)亲和素-辣根过氧化物酶结合物；
2)底物液；以及
3)洗涤液。
作为本发明的一种优选实施方式，所述ELISA检测试剂盒中还包括下列试剂：
1)亲和素-辣根过氧化物酶结合物；
2)底物液；以及
3)洗涤液。
上述试剂均为ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括亲和素-辣根过氧化物酶结合物、底物液和洗涤液。
所述底物液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用底物液，如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物液。
所述洗涤液可为ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISA检测所需通用试剂，如封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。
所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如FBS、BSA等。
通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
本发明进一步基于上述牛IL-2ELISA检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛IL-2的ELISA检测方法，用于检测牛IL-2含量，从而进行机体免疫状态评价。
本发明的ELISA检测试剂盒既可用于分析大肠杆菌、毕赤酵母等多种表达系统表达的重组牛IL-2样品，也可用于分析牛外周血单核细胞培养上清和牛血浆中分泌的天然牛IL-2样品。
利用本发明的ELISA检测试剂盒检测重组牛IL-2样品的检测方法包括下列步骤：
1)捕获抗体包被酶标板；
2)样品孵育及检测：
①在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL/孔，37℃反应2h；
②弃去样品，PBST洗3次，加入0.25μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育2h；
③弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物(SA-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；
④弃去SA-HRP，PBST洗6次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光反应10min；
⑤加入2M H2SO4，50μL/孔，使用酶标仪于OD450/550波长下测定吸光值。
利用本发明的ELISA检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：
1)捕获抗体包被酶标板；
2)制备牛外周血单核细胞悬液；
3)细胞孵育及检测：
①将2)所制备的细胞加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取培养上清作为检测样品；
②在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL/孔，37℃反应2h；
③弃去样品，PBST洗3次，加入0.25μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育2h；
④弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物(SA-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；
⑤弃去SA-HRP，PBST洗6次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光反应10min；
⑥加入2M H2SO4，50μL/孔，使用酶标仪于OD450/550波长下测定吸光值。
上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经ConA刺激的牛外周血单核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，并以纯化的所述杂交瘤细胞株3D8分泌的单抗为捕获抗体，以生物素标记的另一牛IL-2单抗为检测抗体，结果显示，该方法可以有效检测出牛IL-2。
利用本发明的试剂盒检测牛抗凝血样品的检测方法包括下列步骤：
1)捕获抗体包被酶标板；
2)抗凝血孵育及检测：
①无菌采取牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血，将血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取血浆作为检测样品；
②在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL/孔，37℃反应2h；
③弃去样品，PBST洗3次，加入0.25μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育2h；
④弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物(SA-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；
⑤弃去SA-HRP，PBST洗6次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光反应10min；
⑥加入2M H2SO4，50μL/孔，使用酶标仪于OD450/550波长下测定吸光值。
本发明第四方面提供了牛IL-2的ELISPOT检测试剂盒，所述ELISPOT检测试剂盒包括：支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为所述的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8，所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，
其中，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应；所述捕获抗体包被在支持介质中或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
所述ELISPOT检测试剂盒中，所述支持介质可以为微孔滤膜板。
所述ELISPOT检测试剂盒中，微孔滤膜板可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供空白微孔滤膜板与捕获抗体，在检测前由操作者自行采用常规方法在微孔滤膜板上包被捕获抗体。
作为本发明的一种实施方式，所述捕获抗体包被在微孔滤膜板中。所述微孔滤膜板可为各种常见规格的微孔滤膜板，如96孔滤膜板。
所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克隆抗体不同于前述捕获抗体。生物素标记牛IL-2单克隆抗体的方法采用常规。
作为本发明的一种实施方式，所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体为由杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb6D7。
作为本发明的一种实施方式，所述ELISPOT检测试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：
1)亲和素-碱性磷酸酶结合物；
2)底物液；以及
3)洗涤液。
作为本发明的一种优选实施方式，所述ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂：
1)亲和素-碱性磷酸酶结合物；
2)底物液NBT/BCIP；以及
3)洗涤液。
上述试剂均为ELISOPT检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液和洗涤液。
所述底物液可为ELISPOT检测试剂盒中常用的通用底物液，如液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)底物液。
所述洗涤液可为ELISPOT检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISPOT检测所需通用试剂，如封闭液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。
所述封闭液可为包被微孔滤膜板常用的封闭液，如FBS、BSA等。
通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
本发明进一步基于上述牛IL-2ELISPOT检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛IL-2的ELISPOT检测方法，用于检测分泌牛IL-2的T淋巴细胞，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。
本发明的ELISPOT检测试剂盒既可用于分析牛外周血单核细胞样品，也可用于分析牛抗凝血样品。
利用本发明的ELISPOT检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：
1)捕获抗体包被微孔滤膜板；
2)制备牛外周血单核细胞悬液；
3)细胞孵育及检测：
①在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂：50μL细胞培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；
②弃培养上清，洗板后，加入1μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
③洗板后，加入稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
④每孔加入100μL底物液，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；
⑤使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛IL-2的T细胞；或将微孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。
上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经刀豆蛋白A刺激的牛外周血单核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，并以纯化的本发明所述杂交瘤细胞株3D8分泌的单抗为捕获抗体，以生物素标记的另一牛IL-2单抗为检测抗体，结果显示，该方法可以有效检测出分泌牛IL-2的T淋巴细胞。
利用本发明的ELISPOT检测试剂盒，检测牛抗凝血样品的检测方法包括下列步骤：
1)捕获抗体包被微孔滤膜板；
2)抗凝血孵育及检测：
①无菌采取1mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL牛抗凝血(与灭菌PBS 1：1稀释)，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；
③弃培养上清，洗板后，加入1μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
④洗板，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
⑤每孔加入100μL底物液，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；
⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛IL-2的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。
本发明第五方面提供了牛IL-2的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体，其中，所述异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体为牛所述IL-2单克隆抗体MAb3D8；优选地，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂的一种或多种：
1)阻断剂Brefeldin(BFA)；
2)APC标记针对牛CD4单抗；
3)固定剂、破膜剂；以及
4)洗涤液。
更优选地，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂：
1)阻断剂Brefeldin(BFA)；
2)APC标记针对牛CD4单抗；
3)固定剂、破膜剂；以及
4)洗涤液。
上述试剂均为FCM检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括阻断剂Brefeldin(BFA)、APC标记针对牛CD4单抗、固定剂、破膜剂和洗涤液。
所述洗涤液可为FCM检测试剂盒中常用的洗涤液，如含1％BSA的磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他FCM检测所需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲液等。
通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
本发明进一步基于上述牛IL-2FCM检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛IL-2的FCM检测方法，用于检测分泌牛IL-2的T淋巴细胞，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。
本发明的FCM检测试剂盒可用于分析牛外周血单核细胞样品。
利用本发明的FCM检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：
1)制备牛外周血单核细胞悬液；
2)细胞孵育：
①在96孔细胞培养板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养8小时；
②加入细胞因子分泌阻断剂Brefeldin A(BFA)，再放入37℃、5％CO2培养箱培养16小时。
3)细胞因子检测：
①次日收集细胞，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清；
②使用1％BSA的PBS溶液将针对牛CD4分子单抗稀释至0.5μg/mL，室温避光染色20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；
③加固定剂，室温静置作用15min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min离心，弃上清，重复两次；
④使用破膜剂稀释FITC标记特异性针对牛IL-2单抗MAb3D8至0.5μg/mL，室温作用20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min离心，弃上清，重复两次；
⑤使用200μL PBS重悬细胞，进行FACS检测分泌牛IL-2的T淋巴细胞比例。
上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经刀豆蛋白A刺激的牛外周血单核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，以异硫氰酸荧光素标记的MAb3D8为检测抗体，FACS结果显示，该方法可以有效检测出分泌牛IL-2的T淋巴细胞比例。
本发明第六方面提供了本发明所述分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，以及根据权利要求2所述的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。
本发明第六方面提供了本发明上述试剂盒在用于非诊断目的检测牛IL-2中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛IL-2的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1杂交瘤细胞株的获得
保藏号为CCTCC NO：C2015213的杂交瘤细胞株及保藏号为CCTCC NO：C2015212的杂交瘤细胞株的获得。
1.动物免疫
具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组牛IL-2纯化蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔2周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7天后眼眶采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行尾静脉加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。
2.细胞融合
具体步骤如下：尾静脉加强免疫3天后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW4000)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、6％CO2培养箱中培养。5天后加入新鲜HAT培养基，10天后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。
3.间接ELISA检测方法的建立
采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原的包被浓度。
检测抗原用包被缓冲液横向梯度稀释，每孔50μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔50μL，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，OPD显色，酶联检测仪测定OD490的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。
根据方阵试验确定的检测抗原的包被浓度，将稀释后的检测抗原50μL/孔加入酶标板中，4℃过夜，PBST洗液洗涤3次，5min/次，用含10％小牛血清的PBST洗液4℃封闭过夜，洗涤，-20℃保存，用于筛选阳性细胞克隆。
4.筛选阳性克隆
采用建立好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，50μL/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体，50μL/孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，OPD显色10～15min，显色终止后酶标仪测定OD490读数。被测孔OD490读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的两株阳性克隆分别命名为3D8和6D7。
5.阳性杂交瘤细胞的克隆化
采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆3D8和6D7进行2～3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆3D8对应保藏号为CCTCC NO：C2015213的杂交瘤细胞株，阳性细胞克隆6D7对应保藏号为CCTCC NO：C2015212的杂交瘤细胞株。
实施例2：牛IL-2单抗制备
1.腹水制备
采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10～12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5mL/只，7～10天后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤细胞3D8和6D7，5×105个细胞/只；7天后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA法测定抗体效价，分装，-70℃保存。杂交瘤细胞株CCTCC NO：C2015213(对应杂交瘤细胞3D8)分泌的单抗记为MAb3D8，杂交瘤细胞株CCTCC NO：C2015212(对应杂交瘤细胞6D7)分泌的单抗记为MAb6D7。
2.抗体纯化
将制备的MAb3D8和MAb6D7腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化。
实施例3：单克隆抗体特性检测
1.单抗亚类的鉴定
按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。在已包被的酶标板内分别加入细胞培养上清50μL/孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入1:1000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚类抗体50μL/孔，37℃0.5h，每株单抗加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μL/孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加显色液邻苯二胺(OPD)溶液50μL/孔，37℃避光显色10～15min，2M H2SO4 50μL/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其它孔者所加亚类抗体为单抗亚类。
结果显示，单抗MAb3D8和MAb6D7亚类均为IgG1。
2.单抗腹水效价的测定
使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔50μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；将单抗腹水倍比稀释，每孔50μL，同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，OPD显色，酶联检测仪测定OD490的值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。
结果显示，单抗MAb3D8和MAb6D7的效价均达到1：8192000。3.单抗特异性的鉴定
以Dot-ELISA鉴定单抗的特异性，具体步骤如下：剪取一定大小的NC膜，在去离子水中浸透后晾干；用移液器分别吸取工作浓度的大肠杆菌表达的rBoIL-2(R&D公司)、毕赤酵母表达的rBoIL-2(Pierce公司)、rHis-BoIL-2、rGST-BoIL-2、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声裂解液上清各5μL点于NC膜上，37℃30min干燥后，用含10％小牛血清的PBST封闭，室温轻摇过夜；PBST洗涤后，再将NC膜浸入细胞培养上清或稀释的腹水中，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，每次10min，再浸入工作浓度的羊抗鼠HRP-Ig(G+M)酶标抗体溶液中，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次10min，最后DAB显色，蒸馏水终止反应。
在Dot-ELISA试验中，单抗MAb3D8和MAb6D7只与rBoIL-2反应，而不与原核表达的上述其它重组细胞因子和对照菌反应，说明本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体MAb3D8和MAb6D7与真核表达BoIL-2抗原蛋白具有较好的反应性和亲和力。
4.流式细胞术鉴定单抗与天然抗原的反应性
无菌采取健康奶牛尾静脉血20mL加入含肝素钠的采血管中，将抗凝管上下颠倒混匀数次；在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温2000rpm离心25min；管内液体分成三层，在血清和淋巴细胞分离液之间有一层可见的外周血单个核细胞云雾状层为淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温2000rpm离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后，将细胞加入24孔板中，并分为2组，一组加入ConA刺激剂，终浓度为10μg/mL，另一组不加ConA刺激，置于37℃5％CO2培养箱培养24h。刺激培养8h后，加入BFA阻断；次日，2000rpm 10min离心，收集细胞；使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，2000rpm 10min，离心，弃上清；加固定剂，室温静置作用15min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；2000rpm 10min离心，弃上清；在空白对照、加入ConA和未加入ConA刺激的三组中分别加入SP2/0腹水和每株单抗的腹水。用破膜剂稀释SP2/0腹水和单抗腹水，2μL/样；室温作用20min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；2000rpm 10min离心，弃上清；加入用含1％BSA的PBS稀释至工作浓度的FITC标记羊抗鼠IgG，室温避光作用20min，用含1％BSA的PBS洗涤2次，2000rpm 10min离心，弃上清；使用200μL含1％BSA的PBS重悬细胞，进行FACS检测。
流式细胞术检测结果显示，ConA刺激剂和未刺激组之间存在一定的差异，表明MAb3D8和MAb6D7单抗可以识别牛天然BoIL-2。
实施例4：ELISA试剂盒的组装
ELISA试剂盒的组装步骤如下：
1)制备生物素标记牛IL-2单克隆抗体(命名为Bio-6D7)：
将纯化MAb6D7单抗采用标准生物素标记法进行标记。溶解2～10mg单抗MAb6D7蛋白于1mL的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100μL超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30mL PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5mL或1mL于单独的管中，以280nm的吸收值测定单抗蛋白含量。
2)将96孔酶标板、单抗MAb3D8、生物素标记牛IL-2单克隆抗体(Bio-6D7)分别包装组装成试剂盒。
进一步的，试剂盒中依据需要组装入：亲和素-辣根过氧化物酶结合物、TMB底物液、浓缩PBS缓冲液、封闭液、磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液中的一种或多种。
试剂盒中，酶标板、单抗MAb3D8也可采用包被牛IL-2单抗MAb3D8的酶标板替代。
包被牛IL-2单抗MAb3D8的酶标板的制备方法：
①96孔酶标板中加入2μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；
③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭4h；
④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板放于密封袋中，置4℃保存。
实施例5重组牛IL-2样品的检测
1.抗体包被
①96孔酶标板中加入2μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；
③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭4h；
④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。
2.样品孵育及检测
①在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL/孔，37℃反应2h；
②弃去样品，PBST洗3次，加入0.25μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体(Bio-6D7)，100μL/孔，37℃孵育2h；
③弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物(SA-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；
④弃去SA-HRP，PBST洗6次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光反应10min；
⑤加入2M H2SO4，50μL/孔，使用酶标仪于OD450/550波长下测定吸光值。实验结果参见表1，结果显示本ELISA方法对大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统表达的重组牛IL-2的最低检测限分别为0.03ng/mL和1ng/mL，表明该试剂盒可以有效检测出原核和真核两种表达系统表达的重组牛IL-2，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例6牛外周血单核细胞样品的检测
1.抗体包被
①96孔酶标板中加入2μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；
③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭4h；
④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。
2.制备牛外周血单核细胞悬液；
①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/mL。
3.细胞孵育及检测
①将2所制备的细胞加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A
(ConA)至终浓度为10μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取培养上清作为检测样品；
②在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL/孔，37℃反应2h；
③弃去样品，PBST洗3次，加入0.25μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体(Bio-6D7)，100μL/孔，37℃孵育2h；
④弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物(SA-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；
⑤弃去SA-HRP，PBST洗6次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光反应10min；
⑥加入2M H2SO4，50μL/孔，使用酶标仪于OD450/550波长下测定吸光值。实验结果参见表1，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛外周血中的牛IL-2，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例7牛抗凝血样品的检测
1.抗体包被
①96孔酶标板中加入2μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；
③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭4h；
④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。
2.抗凝血孵育及检测
①无菌采取牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血，将血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取血浆作为检测样品；
②在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL/孔，37℃反应3h；
③弃去样品，PBST洗3次，加入0.25μg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体(Bio-6D7)，100μL/孔，37℃孵育2h；
④弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物(SA-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；
⑤弃去SA-HRP，PBST洗6次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光反应10min；
⑥加入2M H2SO4，50μL/孔，使用酶标仪于OD450/550波长下测定吸光值。实验结果参见表1，结果显示在检测牛血浆样品时，该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛血浆中的牛IL-2，具有较好的灵敏度和特异性，可用于在牛血浆中有效检测分泌的天然牛IL-2。
表1重组牛IL-2样品、牛外周血单核细胞样品和牛血浆样品检测结果
(大肠杆菌
注释：“－”代表未能检出，“无”代表没有对应浓度样品。
实施例8ELISPOT试剂盒的组装
ELISPOT试剂盒的组装步骤如下：
1)制备生物素标记牛IL-2单克隆抗体(命名为Bio-6D7)：
将纯化MAb6D7单抗采用标准生物素标记法进行标记。溶解2～10mg单抗MAb6D7蛋白于1mL的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100μL超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30mL PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5mL或1mL于单独的管中，以280nm的吸收值测定单抗蛋白含量。
2)将96孔滤膜板、单抗3D8、生物素标记牛IL-2单克隆抗体Bio-6D7分别包装组装成试剂盒。
进一步的，试剂盒中依据需要组装入：亲和素-碱性磷酸酶结合物、NBT/BCIP底物液、浓缩PBS缓冲液、封闭液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液中的一种或多种。
试剂盒中，微孔滤膜板、单抗MAb3D8也可采用包被牛IL-2单抗MAb3D8的微孔滤膜板替代。
包被牛IL-2单抗MAb3D8的微孔滤膜板的制备方法：
①96孔滤膜板中加入2.5 μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；
③加入含10％胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；
④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板放于密封袋中，置4℃保存。
实施例9牛外周血单核细胞样品的ELISPOT检测
1.抗体包被
①96孔滤膜板中加入2.5μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；
③加入含10％胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；
④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。
2.制备牛外周血单核细胞
①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/mL。
3.细胞孵育及检测
①在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；
②将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛IL-2检测抗体Bio-6D7，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
③用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
④每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；
⑤使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛IL-2的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。
试验结果参见图1，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔(B)中出现的特异性斑点数显著多于对照样品孔(A)，这表明该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IL-2的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例10牛抗凝血样品的ELISPOT检测
1.抗体包被
①96孔滤膜板中加入2.5μg/mL的捕获牛IL-2抗体MAb3D8，100μL/孔，4℃过夜包被；
②弃包被液，使用含有0.05％吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；
③加入含10％胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；
④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。
2.抗凝血孵育及检测
①无菌采取1mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL牛抗凝血(与灭菌PBS 1：1稀释)，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；
③将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛IL-2检测抗体Bio-6D7，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
④用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；
⑤每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；
⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛IL-2的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。
结果如图2所示。结果显示在检测牛抗凝血样品时，阳性样品孔(B)中出现的特异性斑点数显著多于对照样品孔(A)，结果表明本发明的试剂盒也可用于对牛抗凝血进行直接检测，结果同样可以有效检测出ConA刺激牛抗凝血中分泌牛IL-2的T淋巴细胞，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。
实施例11FCM试剂盒的组装
FCM试剂盒的组装步骤如下：
1)制备异硫氰酸荧光素标记牛IL-2单克隆抗体(命名为FITC-3D8)：
将纯化MAb3D8单抗采用标准异硫氰酸荧光素标记法进行标记。将待交联单抗MAb3D8(浓度≥1mg/ml)对交联反应液4℃透析三次，至pH为9.0；将新鲜配制的FITC(浓度为1mg/mL)溶于DMSO中；按P：F(蛋白质：FITC)＝1mg：150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h；将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮；进行交联物蛋白浓度、F/P比例的鉴定；FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN3、1％BSA，4℃避光保存。
2)将异硫氰酸荧光素标记牛IL-2单克隆抗体、分别包装组装成试剂盒。
进一步的，试剂盒中依据需要组装入：阻断剂Brefeldin(BFA)、针对牛CD4分子单抗、固定剂、破膜剂、细胞培养液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
实施例12牛外周血单核细胞样品的FCM检测
1.制备牛外周血单核细胞
①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/mL。
2.细胞孵育
①在96孔细胞培养板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养16小时；
②加入细胞因子分泌阻断剂Brefeldin A(BFA)，再放入37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时
3.细胞因子检测
①次日收集细胞，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清；
②使用1％BSA的PBS溶液将针对牛CD4分子单抗稀释至0.5μg/mL，室温避光染色20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；
③加固定剂，室温静置作用15min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min离心，弃上清，重复两次；
④使用破膜剂稀释特异性针对牛IL-2分子单抗FITC-3D8至0.5μg/mL，室温作用20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min离心，弃上清，重复两次；
⑤使用200μL PBS重悬细胞，进行FACS检测分泌牛IL-2的T淋巴细胞比例。
结果见图3，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔(B)中分泌牛IL-2的T淋巴细胞比例显著高于对照样品孔(A)，这表明该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IL-2的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (12)
1.一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株3D8,保藏名称为杂交瘤细胞株3D8，保藏号为CCTCC NO：C2015213；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
2.一种根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8。
3.一种牛IL-2的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，
其中，所述捕获抗体为根据权利要求2所述的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8，所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应；所述捕获抗体包被在支持介质中或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
4.根据权利要求3所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克隆抗体为由杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb6D7，所述杂交瘤细胞株6D7,保藏名称为杂交瘤细胞株6D7，保藏号为CCTCC NO：C2015212；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
5.根据权利要求3-4任一项所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂：
1）亲和素-辣根过氧化物酶结合物；
2）底物液TMB；以及
3）洗涤液。
6.一种牛IL-2的ELISPOT检测试剂盒，所述ELISPOT检测试剂盒包括：支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为根据权利要求2所述的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8，所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，
其中，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应；所述捕获抗体包被在支持介质中或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
7.根据权利要求6所述ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体为由杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb6D7，所述杂交瘤细胞株6D7,保藏名称为杂交瘤细胞株6D7，保藏号为CCTCC NO：C2015212；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
8.根据权利要求6-7任一项所述ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂：
1）亲和素-碱性磷酸酶结合物；
2）底物液NBT/BCIP；以及
3）洗涤液。
9.一种牛IL-2的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体，其中，所述异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体为根据权利要求2所述的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8。
10.根据权利要求9所述FCM检测试剂盒，其特征在于，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂：
1）阻断剂Brefeldin A（BFA）；
2）APC标记针对牛CD4单抗；
3）固定剂、破膜剂；以及
4）洗涤液。
11.根据权利要求1所述分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，以及根据权利要求2所述的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。
12.权利要求3-10任一项所述试剂盒在用于非诊断目的检测牛IL-2中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛IL-2的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定。
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