CN106248954B - 一种隐性乳房炎试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物医学检测领域，具体提供了一种隐性乳房炎试剂盒，通过检测与奶牛乳房炎相关的炎症因子IL‑1β、IL‑2、PGE2的变化来建立诊断奶牛隐性乳房炎的新方法，该方法通过定量检测牛奶中乳房炎相关炎症因子，与临界值进行比较，从而达到早发现早治疗，以减少乳房炎带来的经济损失的目的，适合工业化生产，保存期长。

Description

一种隐性乳房炎试剂盒
技术领域
本发明涉及动物医学检测领域，具体提供了一种隐性乳房炎试剂盒。
背景技术
乳房炎、蹄叶炎、子宫内膜炎被称为奶牛养殖业中的“三炎”，是奶牛养殖过程中最主要的三种疾病，一直困扰着我国乃至世界各地的奶牛养殖，制约奶牛养殖业的健康发展，给畜牧养殖业带来巨大的经济损失。其中乳房炎以其高发病率、低治愈率和复杂的发病机制而成为奶牛养殖中最为重要的疾病。传统的乳房炎检测方法主要是利用乳汁病原微生物检查、体细胞计数法等方法进行诊断，检测方法相对繁琐，结果判定主观性较强，准确度较低。
发明内容
本发明的发明人针对现有检测技术存在的诸多不足之处，提供了一种隐性乳房炎试剂盒，通过检测与奶牛乳房炎相关的炎症因子IL-1β、IL-2、PGE2的变化来建立诊断奶牛隐性乳房炎的新方法，该方法通过定量检测牛奶中乳房炎相关炎症因子，与临界值进行比较，从而达到早发现早治疗，以减少乳房炎带来的经济损失的目的，适合工业化生产，保存期长。
本发明的具体技术方案是：
一种隐性乳房炎试剂盒，试剂盒中包含有：预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体的酶标板，其中所述的与隐性乳房炎相关单克隆抗体为IL-1β或IL-2或PGE2。
除此之外，本发明所述试剂盒中还含有样品稀释液、标准品稀释液，酶标试剂，浓缩洗涤液，显色剂A液和显色剂B液以及终止液。
其中所述的预包被时采用的包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
样品稀释液和标准品稀释液为含有0.5wt％BSA的pH为7.4的0.01mol/L PBS缓冲液；
酶标试剂分别为辣根过氧化物酶标记的IL-1β或IL-2或PGE2抗体，如北京博奥森生物技术有限公司等。
浓缩洗涤液为含有体积浓度为0.5‰的吐温－20的0.02mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液；
原倍标准品分别为96ng/L的IL-1β、640ng/L的IL-2和1200ng/L的PGE2；
显色剂A液为双氧水；
显色剂B液为底物TMB；
终止液为4mol/L的硫酸。
本发明所述试剂盒的原理为：
白细胞介素1β(Interleukin 1β，IL-1β)由单核/巨噬细胞及上皮细胞、内皮细胞分泌，主要与巨噬细胞有关，能够增强和维持中性粒细胞的抗微生物能力，诱导Th1、Th2、Th17等CD4+细胞及γδT细胞活化。乳房炎症反应过程表现为发炎组织内中性粒细胞浸润、细胞因子释放、微循环损伤，而细胞因子在损伤中发挥重要的作用，其中以抗损伤因子IL-1β尤为重要，乳房炎后被激活的血液成分如凝血酶等使其增加；
白细胞介素2(Interleukin2，IL-2)主要是由奶牛胸腺T淋巴细胞所产生，最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖和分化，又称为T细胞生长因子，内源性IL-2的减少可引起免疫功能下降，继而引发疾病，高剂量的IL-2能引起单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的作用。同时，IL-2能够提高中性粒细胞和单核巨噬细胞等细胞的吞噬力，增强淋巴细胞的细胞毒性作用。妊娠最后6周和初乳中IL-2的活性较低，增加了分娩前后乳房炎的发病率；
前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)主要与中性白细胞有关，是炎症局部组织在炎症因子的刺激下产生的一种花生四烯酸代谢产物。能够扩张微血管，增强血管通透性；能够诱导中性粒细胞和嗜酸性粒细胞向炎症局部聚集；并且对机体有致热作用。当PGE2在一定范围内升高时能够适当加速炎症反应，快速消灭致炎因子，减少对炎症局部组织损伤。但当其浓度超过一定范围时，将加剧炎症反应，对局部组织造成更大的损伤；
因此发明人发现IL-1β、IL-2和PGE2三种指标在奶牛患乳房炎后均出现明显波动，并且三种指标在患隐性乳房炎奶牛的牛奶中均比临床型乳房炎奶牛、健康奶牛的牛奶中要高，由此发明人决定通过试剂盒的方式检测牛奶中上述三者的含量指标来判定奶牛早期是否患有隐性乳房炎，并分别用三种纯化的抗体包被酶标板，制成固相抗体，之后往包被单抗的酶标板中依次加入待检奶样、三种对应的辣根过氧化物酶标记的抗体，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在2mol/L的H2SO4终止液的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-1β、IL-2、PGE2含量呈正相关。在终止反应后15min内，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，绘制标准曲线，计算样品中IL-1β、IL-2、PGE2浓度。发明人经过大量实验发现IL-1β、IL-2和PGE2的临界值分别为59ng/L、210ng/L和360ng/L，即当试剂盒所测样品三种指标中的任意两种高于临界值则判定为隐性乳房炎。
其中所述预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体IL-1β、IL-2和PGE2的酶标板，制备方法如下：
用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化的IL-2抗体稀释至蛋白质含量为2μg/ml，在8×12孔聚苯乙烯酶标板的反应孔中按照每孔0.1ml加入稀释后的抗体，4℃过夜孵育，弃去孔内溶液，用洗涤液(洗涤液为pH为7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐温-20)洗涤三次；用0.5％的牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭1小时，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，将包被好的酶标板干燥后放入密封袋或锡袋中备用；
所述IL-1β和PGE2的酶标板制备方法与IL-2酶标版相同，发明人在此不再赘述；
所采用的纯化的IL-1β、IL-2和PGE2抗体均采用现有技术获得或者市售可得；
而本发明所述检测试剂盒的使用方法，以IL-2为例步骤如下：
1、标准品的稀释：将已知浓度的原倍标准品(640ng/L的IL-2)用标准品稀释液(pH为7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)在无菌的1.5ml离心管中进行倍比稀释，稀释5个浓度梯度；
2、样品处理：将采集的牛奶样品放置于5ml离心管中，以8000rpm/min的转速，离心10分钟，除去脂肪和杂蛋白，收集上清用于检测；
3、加样：将包被并封闭好的酶标板分别设置2个空白对照孔(空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余各步操作相同)和5个标准品孔，其余孔为待测样品孔；分别向5个标准品孔中加入稀释好的5个浓度梯度的标准品各50μl；待测样品孔中先加样品稀释液(pH为7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)40μl，然后再加入步骤2中离心过后的牛奶上清10μl；加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
4、洗涤：弃去酶标板中的液体，甩干，每孔加满洗涤液(洗涤液为pH为7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐温-20)，静置30秒后弃去，重复5次，拍干，此步骤的目的是为了洗去板孔中没有与包被的IL-2固相抗体结合的物质；
5、加酶标抗体：每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IL-2抗体50μl，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃温育30分钟，此步骤中酶标抗体与结合在固相抗体上的IL-2结合；
6、洗涤：操作同步骤4，此步骤是为了洗去板孔中未结合的酶标抗体；
7、显色：每孔先加入显色剂A(H2O2)50μl，再加入显色剂B(底物TMB)50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟，此步骤中显色剂A与显色剂B与辣根过氧化物酶反应显蓝色；
8、终止：每孔加终止液(4mol/L的硫酸)50μl，终止反应(此时蓝色立即变为黄色)；
9、测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
计算与结果判定：以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
所述IL-1β和PGE2的检测方法与IL-2完全相同，发明人在此不再赘述；
当所测样品三种指标中的任意两种高于临界值(IL-1β、IL-2和PGE2的临界值分别为59ng/L、210ng/L和360ng/L)则判定为隐性乳房炎。
综上所述，本发明提供了一种隐性乳房炎试剂盒，通过检测与奶牛乳房炎相关的炎症因子IL-1β、IL-2、PGE2的变化来建立诊断奶牛隐性乳房炎的新方法，该方法通过定量检测牛奶中乳房炎相关炎症因子，与临界值进行比较，从而达到早发现早治疗，以减少乳房炎带来的经济损失的目的，适合工业化生产，保存期长。
具体实施方式
下述实施例中除特殊注明外，其他均采用现有常规技术
实施例1
一种隐性乳房炎试剂盒，试剂盒中包含有：预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体的酶标板，其中所述的与隐性乳房炎相关单克隆抗体为IL-1β。
除此之外，本发明所述试剂盒中还含有样品稀释液、标准品稀释液，酶标试剂，浓缩洗涤液，显色剂A液和显色剂B液以及终止液。
其中所述的预包被时采用的包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3，；
样品稀释液和标准品稀释液为含有0.5wt％BSA的pH为7.4的0.01mol/L PBS缓冲液；
酶标试剂分别为辣根过氧化物酶标记的IL-1β抗体；
浓缩洗涤液为含有体积浓度为0.5‰的吐温－20的0.02mol/L及pH 7.4的磷酸盐缓冲液；
原倍标准品分别为96ng/L的IL-1β；
显色剂A液为双氧水；
显色剂B液为底物TMB；
终止液为4mol/L的硫酸。
实施例2
一种隐性乳房炎试剂盒，试剂盒中包含有：预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体的酶标板，其中所述的与隐性乳房炎相关单克隆抗体为IL-2抗体。
除此之外，本发明所述试剂盒中还含有样品稀释液、标准品稀释液，酶标试剂，浓缩洗涤液，显色剂A液和显色剂B液以及终止液。
其中所述的预包被时采用的包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
样品稀释液和标准品稀释液为含有0.5wt％BSA的pH为7.4的0.01mol/L PBS缓冲液；
酶标试剂分别为辣根过氧化物酶标记的IL-2抗体；
浓缩洗涤液为含有体积浓度为0.5‰的吐温－20的0.02mol/L及pH 7.4的磷酸盐缓冲液；
原倍标准品为640ng/L的IL-2；
显色剂A液为双氧水；
显色剂B液为底物TMB；
终止液为4mol/L的硫酸。
实施例3
一种隐性乳房炎试剂盒，试剂盒中包含有：预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体的酶标板，其中所述的与隐性乳房炎相关单克隆抗体为PGE2抗体。
除此之外，本发明所述试剂盒中还含有样品稀释液、标准品稀释液，酶标试剂，浓缩洗涤液，显色剂A液和显色剂B液以及终止液。
其中所述的预包被时采用的包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
样品稀释液和标准品稀释液为含有0.5wt％BSA的pH为7.4的0.01mol/L PBS缓冲液；
酶标试剂分别为辣根过氧化物酶标记的PGE2抗体；
浓缩洗涤液为含有体积浓度为0.5‰的吐温－20的0.02mol/L及pH 7.4的磷酸盐缓冲液；
原倍标准品为1200ng/L的PGE2；
显色剂A液为双氧水；
显色剂B液为底物TMB；
终止液为4mol/L的硫酸。
实施例4
预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体IL-1β、IL-2和PGE2的酶标板，以IL-2为例，制备方法如下：
用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化的IL-2抗体稀释至蛋白质含量为2μg/ml，在8×12孔聚苯乙烯酶标板的反应孔中按照每孔0.1ml加入稀释后的抗体，4℃过夜孵育，弃去孔内溶液，用洗涤液(洗涤液为pH为7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐温-20)洗涤三次；用0.5％的牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭1小时，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，将包被好的酶标板干燥后放入密封袋或锡袋中备用；
所述IL-1β和PGE2的酶标板制备方法与IL-2酶标版相同，发明人在此不再赘述。
实施例5
一种隐性乳房炎试剂盒的使用方法，以IL-2为例步骤如下：
1、标准品的稀释：将已知浓度的原倍标准品(640ng/L的IL-2)用标准品稀释液(pH为7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)在无菌的1.5ml离心管中进行倍比稀释，稀释5个浓度梯度；
2、样品处理：将采集的牛奶样品放置于5ml离心管中，以8000rpm/min的转速，离心10分钟，除去脂肪和杂蛋白，收集上清用于检测；
3、加样：将包被并封闭好的酶标板分别设置2个空白对照孔(空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余各步操作相同)和5个标准品孔，其余孔为待测样品孔；分别向5个标准品孔中加入稀释好的5个浓度梯度的标准品各50μl；待测样品孔中先加样品稀释液(pH为7.4的0.01mol/L PBS+0.5％BSA)40μl，然后再加入步骤2中离心过后的牛奶上清10μl；加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
4、洗涤：弃去酶标板中的液体，甩干，每孔加满洗涤液(洗涤液为pH为7.4的0.02mol/L PBS+0.05％吐温-20)，静置30秒后弃去，重复5次，拍干，此步骤的目的是为了洗去板孔中没有与包被的IL-2固相抗体结合的物质；
5、加酶标抗体：每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IL-2抗体(市购)50μl，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃温育30分钟，此步骤中酶标抗体与结合在固相抗体上的IL-2结合；
6、洗涤：操作同步骤4，此步骤是为了洗去板孔中未结合的酶标抗体；
7、显色：每孔先加入显色剂A(H2O2)50μl，再加入显色剂B(底物TMB)50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟，此步骤中显色剂A与显色剂B与辣根过氧化物酶反应显蓝色；
8、终止：每孔加终止液(4mol/L的硫酸)50μl，终止反应(此时蓝色立即变为黄色)；
9、测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
计算与结果判定：以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
所述IL-1β和PGE2的检测方法与IL-2完全相同，发明人在此不再赘述；
当所测样品三种指标中的任意两种高于临界值(IL-1β、IL-2和PGE2的临界值分别为59ng/L、210ng/L和360ng/L)则判定为隐性乳房炎。
发明人进一步利用现有技术于本发明进行了比较，结果发现显微镜镜检牛奶中体细胞数的方法可以间接检测奶牛是否患有隐性乳房炎，可与采用本发明检测的结果相互应征，但是虽然其检测结果较准确，但是制备样品计数、镜检费时费力，不适合于大规模的样品批量检测；
而对于CMT法检测而言，则存在结果判断主观性较强，结果准确度不高的缺陷，与本发明的技术方案相比，本发明所提供的技术方案更加简单可行，且准确度极高，好于现有技术的相关技术方案。

Claims (1)

1.IL-1β或IL-2或PGE2的单克隆抗体在制备检测隐性乳房炎试剂盒中的应用，其特征在于：试剂盒中包含有：预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体的酶标板，其中所述的与隐性乳房炎相关单克隆抗体为IL-1β或IL-2或PGE2的抗体，
所述预包被与隐性乳房炎相关单克隆抗体的酶标板，制备方法如下：
用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化的IL-1β或IL-2或PGE2抗体稀释至蛋白质含量为2μg/ml，在8×12孔聚苯乙烯酶标板的反应孔中按照每孔0.1ml加入稀释后的抗体，4℃过夜孵育，弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤三次；用0.5%的牛血清白蛋白37℃封闭1小时，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，将包被好的酶标板干燥后放入密封袋或锡袋中备用；
所述试剂盒中还含有包被缓冲液、样品稀释液、标准品稀释液，酶标试剂，浓缩洗涤液，原倍标准品，显色剂A液和显色剂B液以及终止液；
所述的预包被时采用的包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，其1L溶液中含1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3；
样品稀释液和标准品稀释液为含有0.5wt%BSA的pH为7.4的0.01mol/L PBS缓冲液；
酶标试剂分别为辣根过氧化物酶标记的IL-1β或IL-2或PGE2抗体；
浓缩洗涤液为含有体积浓度为0.5‰的吐温－20的0.02mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液；
原倍标准品分别为96ng/L的IL-1β、640ng/L 的IL-2和1200ng/L的PGE2；
显色剂A液为双氧水；
显色剂B液为底物TMB；
终止液为4 mol/L的硫酸。
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