CN107703311B

CN107703311B - 用于检测il-2的酶联免疫试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN107703311B
Application number: CN201711057189.8A
Authority: CN
Inventors: 程联胜; 娄阳; 王凤荣; 刘雯婷
Original assignee: Hefei Vast Ke Maibo Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Hefei Vast Ke Maibo Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN107703311A

Abstract

本发明公开了一种用于检测IL‑2的酶联免疫试剂盒及其制备方法。该试剂盒中包括IL‑2标准抗原、抗IL‑2的捕获抗体和抗IL‑2的检测抗体；捕获抗体为2H5抗体(重链的氨基酸序列为序列1，轻链的氨基酸序列为序列2)，检测抗体为经生物素标记的8G8抗体(重链的氨基酸序列为序列3，轻链的氨基酸序列为序列4)。本发明所提供的基于双抗夹心法检测IL‑2的酶联免疫试剂盒可实现对细胞培养上清或人血清中IL‑2含量的准确定量检测，该检测方法可以作为一种简便、经济、实用的免疫性疾病诊断治疗与预后判断的方法。

Description

用于检测IL-2的酶联免疫试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于检测IL-2的酶联免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)是免疫系统中的一类细胞生长因子，最初从T细胞培养上清中分离获得，能调控免疫系统中白血球细胞活性，激活T细胞，并维持T细胞分化与增殖，同时还参与炎症或自身免疫反应、造血和肿瘤监视，因此临床上已将IL-2作为遏制肿瘤细胞生长的免疫治疗药物。近年来，研究发现IL-2不仅能提升免疫反应，还能维持Treg细胞的稳定及其介导的免疫耐受，具有双向调节作用。因此，IL-2作为一种人体内重要的功能复杂的淋巴因子，其含量的变动与人体免疫功能状况关系密切。资料显示，癌症病人及病毒感染患者体内IL-2含量明显降低。因此，IL-2的含量与活性的测定对癌症及某些疾病的诊断与预后判断意义十分重要。

目前，IL-2的检测方法常用的主要有³H-TdR掺入法、MTT比色法和ELISA试剂盒检测法。³H-TdR掺入法主要是将³H-TdR作为DNA合成原料掺入增殖的细胞染色体中，掺入的³H-TdR的射线量与IL-2的分泌水平在一定范围内正相关。但该方法所用的试剂、设备成本高，操作复杂，试剂存在放射性污染。MTT比色法基于细胞内线粒体内琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，其显色程度可反映增殖细胞的活性。但是该方法不属于直接反映IL-2水平，精确度受限制。常规的ELISA检测方法，则标准不一，有的成本高，有的灵敏度欠缺。因此，开发一种简便、经济、实用的IL-2检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测IL-2。

本发明首先提供了一种用于检测IL-2的系统，所述系统包括抗IL-2的捕获抗体和抗IL-2的检测抗体；所述捕获抗体为2H5抗体，所述检测抗体为经生物素标记的8G8抗体；

所述2H5抗体的重链的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述2H5抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述8G8抗体的重链的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述8G8抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

上述系统中，所述2H5抗体可通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到。

进一步，所述2H5抗体的重链的编码基因和所述2H5抗体的轻链的编码基因是分别通过重组表达载体1和重组表达载体2导入所述哺乳动物细胞的；所述重组表达载体1具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述2H5抗体的重链的编码基因(序列5)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-2H5-1)；所述重组表达载体2具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述2H5抗体的轻链的编码基因(序列6)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-2H5-2)。其中，所述哺乳动物细胞具体可为CHO细胞。

更加具体的，所述2H5抗体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将等摩尔的所述pSecTag2A-2H5-1和所述pSecTag2A-2H5-2转入CHO细胞后，培养24小时，用选择培养基(含有0.3mg/mL Zeocin)筛选抗性克隆，将抗性克隆扩大培养，取培养上清先后进行Protein A亲和层析和S200分子筛层析，最后用30KDa超滤离心管浓缩，获得所述2H5抗体。

上述系统中，所述8G8抗体可通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到。

进一步，所述8G8抗体的重链的编码基因和所述8G8抗体的轻链的编码基因是分别通过重组表达载体3和重组表达载体4导入所述哺乳动物细胞的；所述重组表达载体3具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述8G8抗体的重链的编码基因(序列7)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-8G8-1)；所述重组表达载体4具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述8G8抗体的轻链的编码基因(序列8)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-8G8-2)。其中，所述哺乳动物细胞具体可为CHO细胞。

更加具体的，所述8G8抗体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将等摩尔的所述pSecTag2A-8G8-1和所述pSecTag2A-8G8-2转入CHO细胞后，培养24小时，用选择培养基(含有0.3mg/mL Zeocin)筛选抗性克隆，将抗性克隆扩大培养，取培养上清先后进行Protein A亲和层析和S200分子筛层析，最后用30KDa超滤离心管浓缩，获得所述8G8抗体。

上述系统中，所述检测抗体为将生物素标记所述8G8抗体得到的抗体。所述检测抗体具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将所述8G8抗体与活化的生物素按照摩尔比1：30混合，室温(25℃)放置半小时，随后过分子筛柱去除未结合的生物素，得到经生物素标记的8G8抗体即为所述检测抗体。

所述系统可为酶联免疫试剂盒。

除了上述物质，所述酶联免疫试剂盒中还可含有如下中的至少一种：IL-2标准抗原、96孔酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记亲和素、显色液和终止液。

在本发明中，所述IL-2标准抗原可为美国R&D公司产品。所述铺板缓冲液具体可为pH为7.0的磷酸盐缓冲液。所述洗涤液具体可为仅含有0.1％体积百分含量Tween20的pH为7.0的磷酸盐缓冲液。所述pH可为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mM，所述氯化钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mM，所述磷酸二氢钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mM，所述磷酸氢二钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mM。所述封闭液具体可为仅含有20g/L BSA的所述洗涤液。所述显色液具体可为四甲基联苯胺。所述终止液具体可为1M硫酸。

本发明还提供了下述X1)或X2)：

X1)成套试剂，由所述2H5抗体和所述8G8抗体组成；

X2)成套试剂，由序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因、序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因、序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因和序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因组成。

X1)所述成套试剂可用于检测IL-2。X2)所述成套试剂可用于检测IL-2和制备X1)所述成套试剂。

本发明还提供了下述任一产品：

P1)所述2H5抗体；

P2)与所述2H5抗体相关的生物材料，为A1)至A9)中的任一种：

A1)编码所述2H5抗体的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的细胞系；

P3)所述8G8抗体；

P4)与所述8G8抗体相关的生物材料，为B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述8G8抗体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的细胞系。

上述产品中，A1)所述核酸分子可为序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因和序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因。

B1)所述核酸分子可为序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因和序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因。

所述细胞系不包括繁殖材料。

本发明还提供了所述系统、或所述成套试剂、或所述产品在检测IL-2中的应用。

根据需要，所述应用可为免疫性疾病诊断治疗与预后判断的应用。

本发明还提供了所述系统、或所述成套试剂、或所述产品在如下(M)或(N)中的应用：

(M)制备用于监测免疫性疾病诊断治疗及预后进展的产品；

(N)用于监测免疫性疾病诊断治疗及预后进展。

其中，所述免疫性疾病可为炎症或自身免疫反应、造血系统疾病或肿瘤等。

本发明还提供了所述系统的制备方法，所述方法包括：

通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到2H5抗体；

通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到所述8G8抗体。

所述检测IL-2具体可为定量或定性检测IL-2。所述IL-2可为细胞培养上清液或人血清中IL-2。

实验证明，本发明所提供的检测IL-2的系统可实现对细胞培养上清或人血清中IL-2含量的准确定量检测，且稳定性好。该检测方法可以作为一种简便、经济、实用的免疫性疾病诊断治疗与预后判断的方法。

附图说明

图1为本发明ELISA夹心法试剂盒采用的抗IL-2抗体2H5和8G8抗体的SDS-PAGE电泳图。10％胶SDS-PAGE胶。(1)为8G8还原的样品，(2)为2H5还原的样品，(3)为8G8非还原的样品，(4)为2H5非还原的样品，分子量标准品(M)分子量大小自上而下为(kDa)：200，150，120，100，85，70，60，50，40，30，25；5μg样品/泳道。

图2为以梯度稀释的IL-2抗原标准品浓度为横坐标，本发明夹心法ELISA获得的吸光值为纵坐标，通过双对数坐标进行四参数非线性回归计算得到的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸，各氨基酸序列的第1位均为相应氨基酸序列的N端氨基酸。

CHO细胞：来自于中科院上海细胞库。

含2H5抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-2H5-1。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达2H5抗体的重链(序列1)，并且携带有Zeocin抗性基因。

含2H5抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-2H5-2。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达2H5抗体的轻链(序列2)，并且携带有Zeocin抗性基因。

含8G8抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-8G8-1。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达8G8抗体的重链(序列3)，并且携带有Zeocin抗性基因。

含8G8抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-8G8-2。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达8G8抗体的轻链(序列4)，并且携带有Zeocin抗性基因。

下述实施例中的血清专用样品稀释液为向封闭液中添加FBS得到的FBS质量百分比浓度为3％的液体。

实施例1、用于检测IL-2含量的酶联免疫试剂盒的制备及使用方法

一、用于检测细胞培养上清或人血清中IL-2含量的酶联免疫试剂盒的制备

本发明所提供的用于检测细胞培养上清或人血清中IL-2含量的酶联免疫试剂盒，包括IL-2标准抗原、抗IL-2的捕获抗体(2H5抗体)和抗IL-2的检测抗体(经生物素标记的8G8抗体)，以及酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记亲和素、显色液和终止液等。

(一)常规器材和试剂

1、96孔酶标板(Nunc公司)；

2、铺板缓冲液：pH为7.0的磷酸盐缓冲液；

3、洗涤液：仅含0.1％体积百分含量Tween 20的pH为7.0的磷酸盐缓冲液；

4、封闭液：仅含20g/L BSA的洗涤液；

5、辣根过氧化物酶标记亲和素；

6、显色底物：四甲基联苯胺；

7、终止液：1M硫酸。

其中，所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mM，所述氯化钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mM，所述磷酸二氢钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mM，所述磷酸氢二钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mM。

(二)两种抗IL-2抗体的制备

于6cm细胞培养皿中接种CHO细胞，细胞培养至90％密度时转染含2H5抗体编码基因的表达载体(等摩尔的pSecTag2A-2H5-1和pSecTag2A-2H5-2)或含8G8抗体编码基因的表达载体(等摩尔的pSecTag2A-8G8-1和pSecTag2A-8G8-2)。转染后培养24小时，胰酶消化传代至10块96孔细胞培养板，加入含有0.3mg/mL Zeocin(表达载体pSecTag2A骨架上含有Zeocin抗性基因)的选择性培养基筛选抗性克隆。待细胞克隆长出后(约2周)，根据不同上清中2H5抗体、8G8抗体的含量选出表达量最高的克隆(具体为取上清倍比稀释后，加入IL-2包被的酶标板，间接ELISA法显色后选取滴度最高的克隆)。将所得高表达的克隆逐级扩大培养，直至滚瓶培养。取滚瓶培养的上清液，第一步先用Protein A亲和层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡ProteinA柱(HiTrap rProtein A FF，GE公司)，然后培养上清过柱后，5-10个体积PBS洗去杂蛋白，加盐酸甘氨酸(配方：甘氨酸7.507g，用盐酸调pH至3.0，去离子水定容至500ml)洗脱目的蛋白，合并后继续下一步。第二步是S200分子筛层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡S200分子筛柱(SP Sepharose FF，GE公司)，然后加第一步纯化样品过柱，严密监测1个体积PBS洗脱后的流出液，待最大吸收峰(280nM紫外吸收器显示)出现后开始收集前3管(每管1ml样品)，合并后继续下一步。最后一步是用30KDa超滤离心管(Millipore公司)浓缩(浓缩前已经跑还原型SDS-PAGE电泳证实重链和轻链分子量无误，结果见图1)，浓缩后即得到纯化的2H5抗体、8G8抗体。

进一步将以上所得的纯化后的2H5、8G8进行N端和C端序列测定，结果显示纯化所得2H5序列与序列1和2相符；纯化所得8G8序列与序列3和4相符。

(四)检测抗体的生物素化标记

将上述步骤(三)制备的抗IL-2抗体8G8与活化的生物素(EZ-LinkNHS-PEG4-Biotin试剂盒，Pierce公司)按照摩尔比1：30混合，室温(20-25℃)放置半小时，随后过分子筛柱去除未结合的生物素(用的前述EZ-Link NHS-PEG4-Biotin试剂盒自带的分子筛柱)，即得到生物素标记的8G8检测抗体。

二、步骤一制备的用于检测IL-2含量的酶联免疫试剂盒的使用方法

1、采用IL-2标准

将步骤一制备所得的抗IL-2的2H5抗体用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到1μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将美国R&D公司的浓度为0.1mg/ml的IL-2标准抗原用含20g/L BSA的血清专用样品稀释液稀释到500pg/ml，再用8个Ep管倍比稀释成梯度溶液(表1)，然后按每个浓度两个复孔，每孔100μl加入板内，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，加2％(20g/L)BSA(溶剂是洗涤液)稀释至0.25μg/ml的步骤一制备的经生物素标记的8G8抗体，每孔100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加2％(20g/L)BSA(溶剂是洗涤液)稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl，避光显色5分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEK ELX-800酶标仪在450nm下读板。

各浓度的IL-2标准抗原的吸光值(OD450)如表1所示。以IL-2标准抗原的浓度的对数(以10为底)为横坐标，以OD450值为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线如图2所示。进一步，将各浓度的IL-2标准抗原的吸光值(OD450)代入上述标准曲线，即得各IL-2标准抗原浓度下对应的表观浓度，用表观浓度比上对应的实际浓度即得回收率。经计算，各浓度的IL-2标准抗原对应的表观浓度及回收率参见表1。

表1不同浓度IL-2标准抗原的吸光值及其换算后的表观浓度与回收率

IL-2标准抗原	浓度(pg/ml)	吸光值(OD450)	表观浓度(pg/ml)	回收率(％)
					S1	500.0	2.226	491.6	98
S2	250.0	1.791	257.2	103
					S3	125.0	1.186	122.4	98
S4	62.5	0.716	62.7	100
					S5	31.3	0.395	31.7	101
S6	15.6	0.203	15.4	98
					S7	7.8	0.109	7.9	101
S8	3.9	0.057	3.9	100
					S9	0.0	0.015		-

2、待测细胞培养上清或人血清中IL-2含量的测定

将步骤1中的IL-2标准抗原替换为待测细胞培养上清或人血清样本，将所得的OD450值代入步骤1所得的标准曲线方程，从而获得待测细胞培养上清或人血清样本中IL-2的含量。

实施例2、实施例1制备的用于检测IL-2含量的酶联免疫试剂盒的回收率测定

本发明的发明人进一步采用添加标准抗原的细胞培养上清或正常人血清作为待测样品，测定了实施例1制备的用于检测IL-2含量的酶联免疫试剂盒的回收率。其中细胞上清设置了中、低两个不同浓度的标准抗原，正常人血清设置了高、中、低三个不同浓度的标准抗原。

供试的细胞上清样本为本实验室培养的BT474细胞上清，正常人血清样本来自本实验室，健康志愿者自愿并知情。

将步骤一制备所得的抗IL-2的2H5抗体用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到1μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次。将细胞上清或人血清用血清专用样品稀释液稀释5倍，每孔加50μl，再将浓度为0.1mg/ml的美国R&D公司的IL-2标准抗原用血清专用样品稀释液(同上)，稀释至250、62.5、7.8pg/ml，分别对应以上各孔，按每个样品两个复孔，每孔50μl加入板内，振荡孵育1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，加2％(20g/L)BSA(溶剂是洗涤液)稀释至0.25μg/ml的步骤一制备的经生物素标记的8G8抗体，每孔100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加2％(20g/L)BSA(溶剂是洗涤液)稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl。避光显色5分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEK ELX-800酶标仪在450nm下读板。将所得的OD450值代入实施例1所得的标准曲线方程，从而获得各样本中IL-2的实测含量，用实测含量减去细胞上清或人血清中IL-2本底含量后再比上实际添加的IL-2标准抗原的浓度即为回收率(也就是用加IL-2之后的样品的测得值减去未加IL-2的测得值，然后除以添加的IL-2量得到回收率)。

结果参见表2。平均回收率高达101.8％。该结果表明采用本发明的试剂盒在夹心法ELISA检测中可以得到让人满意的回收率。

表2本发明试剂盒做细胞培养上清或正常人血清抗原回收率测试结果

<110> 合肥瀚科迈博生物技术有限公司

<120> 用于检测IL-2的酶联免疫试剂盒及其制备方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Thr Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Lys Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val

20 25 30

Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser

35 40 45

Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Val Thr Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Thr Arg Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Val

115 120 125

Ala Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys

145 150 155 160

Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys

165 170 175

Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu

180 185 190

Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu

195 200 205

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val

210 215 220

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr

225 230 235 240

Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu

245 250 255

Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu

290 295 300

Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser

305 310 315 320

Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro

355 360 365

Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser

450 455 460

Arg Ser Pro Gly Lys Trp Ile Leu Ala Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln

465 470 475 480

Gly Leu Glu Leu Thr Leu Leu

485

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro

20 25 30

Val Ser Ala Thr Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser

35 40 45

Pro Ser Ile Tyr Val Asp Tyr Phe Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

100 105 110

Gly Gly Tyr Thr Asn Gly Glu Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val

115 120 125

Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala

145 150 155 160

Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr

165 170 175

Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala

180 185 190

Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln

195 200 205

Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr

210 215 220

Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 3

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Thr Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Lys Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val

20 25 30

Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser

35 40 45

Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Ser Ile Gly Asp Ser Arg Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val

85 90 95

Asp Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe

100 105 110

Cys Ala Arg Asp Arg Val Pro Gly Tyr Ile Ala Asp Thr Phe Asp Leu

115 120 125

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser

145 150 155 160

Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe

180 185 190

Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser

225 230 235 240

Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val

275 280 285

Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro

290 295 300

Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr

305 310 315 320

Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys

325 330 335

Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro

355 360 365

Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

370 375 380

Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly

385 390 395 400

Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp

420 425 430

Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys Trp Ile

450 455 460

Leu Ala Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Leu Thr Leu Leu

465 470 475 480

<210> 4

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala

20 25 30

Ser Val Ser Glu Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala

35 40 45

Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Gly Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys

145 150 155 160

Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp

165 170 175

Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn

180 185 190

Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser

195 200 205

Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly

210 215 220

Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcaccatgg aaactgggct tcgctggctt ctcctggtcg ctgtgctcaa aggtgtccag 60

tgtcagtcgg tggaggagtc cgggggtcgc ctggtaacgc ctgggacacc cctgacactc 120

acctgcaaag tctctggatt ctccctcagc agctacgaca tgagctgggt ccgccaggct 180

ccagggaagg ggctggaatg gatcggaatc attgttacta gtgacaatac ttactacgcg 240

agctgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt ggatctgaaa 300

atgaccagtc tgacaaccga ggacacggcc acctatttct gtgccagaac ccgttatagt 360

agttatggtg gatatggtta tgttgccgtt gatgggttgg atctctgggg ccagggcacc 420

ctggtcaccg tctcctcagg gcaacctaag gctccatcag tcttcccact ggccccctgc 480

tgcggggaca cacccagctc cacggtgacc ctgggctgcc tggtcaaagg ctacctcccg 540

gagccagtga ccgtgacctg gaactcgggc accctcacca atggggtacg caccttcccg 600

tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc 660

agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc 720

gttgcgccct cgacatgcag caagcccatg tgcccacccc ctgaactccc ggggggaccg 780

tctgtcttca tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcacg cacccccgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag gatgaccccg aggtgcagtt cacatggtac 900

ataaacaacg agcaggtgcg caccgcccgg ccgccgctac gggagcagca gttcaacagc 960

acgatccgcg tggtcagcac cctccccatc gcgcaccagg actggctgag gggcaaggag 1020

ttcaagtgca aagtccacaa caaggcactc ccggccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccagagggc agcccctgga gccgaaggtc tacaccatgg gccctccccg ggaggagctg 1140

agcagcaggt cggtcagcct gacctgcatg atcaacggct tctacccttc cgacatctcg 1200

gtggagtggg agaagaacgg gaaggcagag gacaactaca agaccacgcc gaccgtgctg 1260

gacagcgacg gctcctactt cctctacagc aagctctcag tgcccacgag tgagtggcag 1320

cggggcgacg tcttcacctg ctccgtgatg cacgaggcct tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagtccatct cccgctctcc gggtaaatgg atcctcgcaa tccctaggag gattaggcaa 1440

gggcttgagc tcacgctctt gtga 1464

<210> 6

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgccg ccgtgctgac ccagactcca tctcccgtgt ctgcaactgt gggaggcaca 120

gtcaccatca attgccagtc cagtccgagt atctatgttg actacttctc ctggtatcag 180

ctgaaaccag ggcagcctcc caagctcctg atctattctg catccactct ggcatctggg 240

gtcccatcgc gcttcaaagg cagtggatct gggacacagt tcactctcac catcagcgac 300

gtgcagtgtg acgatgctgc cacttactac tgtgcaggcg gttatacgaa cggtgagaat 360

gttttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 420

atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 480

aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 540

ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 600

actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 660

cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttag 708

<210> 7

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcaccatgg agactgggct gcgctggctt ctcctggtcg ctgtgctcaa aggtgtccag 60

tgtcagtcgg tggaggagtc cgggggtcgc ctggtcacgc ctgggacacc cctgacactc 120

acctgcacat tctctggatt ctccctcagt agctatgcaa tgagctgggt ccgccaggct 180

ccagggaagg ggctggaatg gatcggaacc attagtattg gtgatagcag atactacgcg 240

aactgggcga aaggccgatt cgccatctcc aaaacctcga ccacggtgga tctgaaaatc 300

accagtccga caaccgagga cacggccgcc tatttctgtg ccagagatcg ggtgcctggt 360

tatattgctg atacttttga tctctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggg 420

caacctaagg ctccatcagt cttcccactg gccccctgct gcggggacac acccagctcc 480

acggtgaccc tgggctgcct ggtcaaaggc tacctcccgg agccagtgac cgtgacctgg 540

aactcgggca ccctcaccaa tggggtacgc accttcccgt ccgtccggca gtcctcaggc 600

ctctactcgc tgagcagcgt ggtgagcgtg acctcaagca gccagcccgt cacctgcaac 660

gtggcccacc cagccaccaa caccaaagtg gacaagaccg ttgcgccctc gacatgcagc 720

aagcccatgt gcccaccccc tgaactcccg gggggaccgt ctgtcttcat cttcccccca 780

aaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840

gtgagccagg atgaccccga ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgc 900

accgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt ggtcagcacc 960

ctccccatcg cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac 1020

aaggcactcc cggcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccagagggca gcccctggag 1080

ccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctg 1140

acctgcatga tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacggg 1200

aaggcagagg acaactacaa gaccacgccg accgtgctgg acagcgacgg ctcctacttc 1260

ctctacagca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgc 1320

tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 1380

ggtaaatgga tcctcgcaat ccctaggagg attaggcaag ggcttgagct cacgctcttg 1440

tga 1443

<210> 8

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgccc aaattgtgat gacccagact ccagcctccg tgtctgaacc tgtgggaggc 120

acggtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcattagta gttacttatc ctggtatcag 180

cagaaaccag ggcagcgtcc caagctcctg atctacaggg catccactct ggcatctggg 240

gtctcatcgc ggttcaaagg cagtggatct gggacacagt tcactctcac catcagcggc 300

gtggagtgtg ccgatgctgc cacttactac tgtcaacagg gttatagtag tagtaatgtt 360

gataatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaag gtgatccagt tgcacctact 420

gtcctcatct tcccaccagc tgctgatcag gtggcaactg gaacagtcac catcgtgtgt 480

gtggcgaata aatactttcc cgatgtcacc gtcacctggg aggtggatgg caccacccaa 540

acaactggca tcgagaacag taaaacaccg cagaattctg cagattgtac ctacaacctc 600

agcagcactc tgacactgac cagcacacag tacaacagcc acaaagagta cacctgcaag 660

gtgacccagg gcacgacctc agtcgtccag agcttcaata ggggtgactg ttagtag 717

Claims

1.一种用于检测IL-2的系统，包括抗IL-2的捕获抗体和抗IL-2的检测抗体；所述捕获抗体为2H5抗体，所述检测抗体为经生物素标记的8G8抗体；

所述8G8抗体的重链的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述8G8抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

所述2H5抗体是通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到的；

所述8G8抗体是通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到的。

2.下述X1）或X2）：

X1）成套试剂，由权利要求1中所述2H5抗体和所述8G8抗体组成；

X2）成套试剂，由序列表中序列5所示的2H5抗体的重链的编码基因、序列6所示的2H5抗体的轻链的编码基因、序列7所示的8G8抗体的重链的编码基因和序列8所示的8G8抗体的轻链的编码基因组成。